Pendant la régénération musculaire, les cellules souches musculaires (dites satellites) prolifèrent de manière symétrique et asymétrique. La ségrégation non aléatoire des brins d'ADN est un mécanisme associé à la division asymétrique, souvent en lien avec des destins cellulaires distincts. Quand ce phénomène apparaît et comment il est régulé durant la régénération musculaire sont des points clés sur lesquels je me suis focalisée durant ma thèse. Afin d'étudier le rôle de signaux extracellulaires dans les décisions du type de division, nous avons utilisé des micropatrons de motifs symétrique et asymétrique recouverts de matrice extracellulaire. Nous avons alors montré que les fréquences de divisions asymétriques peuvent être modulées selon la forme du motif. En outre, nous décrivons une fenêtre de temps in vivo au cours de la régénération musculaire où une sous population de cellules satellites peut passer d'une division symétrique à asymétrique. Une analyse transcriptionnelle de ces cellules a permis d'identifier des gènes candidats potentiellement impliqués dans la régulation de cette transition. Nous avons testé l'effet de quelques protéines associées à ces gènes incorporées dans des niches artificielles 2D. Des données préliminaires suggérèrent que des signaux extrinsèques (protéine de la matrice extracellulaire et rigidité du substrat) combinés à une signalisation intracellulaire peuvent réguler la balance entre prolifération et différentiation. L'ensemble de ces données de thèse montre l'importance d'un dialogue entre le microenvironnement et les signaux intracellulaires dans la régulation du comportement des cellules souches. / During muscle regeneration, muscle stem (satellite) cells proliferate symmetrically and asymmetrically. Non-random segregation of old and new template DNA strands (NRDS) is one mechanism associated with an asymmetric cell division, and this is often linked with distinct daughter cell fates. How this frequency is modulated and when during tissue remodelling are key questions that are the focus of my thesis project. To address the role of extrinsic cues in NRDS and cell fate decisions, we used micropatterns coated with extracellular matrix and designed with symmetric and asymmetric topological motifs. We show that the frequency of NRDS and transcription factors asymmetry (Pax7, stem; Myogenin, differentiated) can be modulated depending on the topology of the adhesion cues of the micropattern. Moreover, we show that a temporal switch occurs in vivo during early muscle regeneration from symmetric to asymmetric DNA segregation in a subpopulation of satellite cells. Gene expression profiling of symmetrically and asymmetrically dividing cells allowed the identification of candidate regulators that might impinge on this regulatory transition. Some candidate genes were assayed in a high throughput screen that was on 2D artificial stem-cell niches. Preliminary data show that extrinsic cues (ECM protein and substrate stiffness) combined with signalling pathways can regulate the balance between proliferation and differentiation in a context dependent manner. Taken together, this thesis project shows that the interplay between microenvironment and intracellular signalling impacts on the regulation of stem cell behaviour.

L'optimisation difficile représente une classe de problèmes dont la résolution ne peut être obtenue par une méthode exacte en un temps polynomial.Trouver une solution en un temps raisonnable oblige à trouver un compromis quant à son exactitude.Les métaheuristiques sont une classe d'algorithmes permettant de résoudre de tels problèmes, de manière générique et efficiente (i.e. trouver une solution satisfaisante selon des critères définis: temps, erreur, etc.).Le premier chapitre de cette thèse est notamment consacré à la description de cette problématique et à l'étude détaillée de deux familles de métaheuristiques à population, les algorithmes évolutionnaires et les algorithmes d'intelligence en essaim.Afin de proposer une approche innovante dans le domaine des métaheuristiques, ce premier chapitre présente également la notion d'analyse de sensibilité.L'analyse de sensibilité permet d'évaluer l'influence des paramètres d'une fonction sur son résultat.Son étude caractérise globalement le comportement de la fonction à optimiser (linéarité, influence, corrélation, etc.) sur son espace de recherche.L'incorporation d'une méthode d'analyse de sensibilité au sein d'une métaheuristique permet d'orienter sa recherche le long des dimensions les plus prometteuses.Deux algorithmes réunissant ces notions sont proposés aux deuxième et troisième chapitres.Pour le premier algorithme, ABC-Morris, la méthode de Morris est introduite dans la métaheuristique de colonie d'abeilles artificielles (ABC).Cette inclusion est dédiée, les méthodes reposant sur deux équations similaires.Afin de généraliser l'approche, une nouvelle méthode, NN-LCC, est ensuite développée et son intégration générique est illustrée sur deux métaheuristiques, ABC avec taux de modification et évolution différentielle.L'efficacité des approches proposées est testée sur le jeu de données de la conférence CEC 2013. L'étude se réalise en deux parties: une analyse classique de la méthode vis-à-vis de plusieurs algorithmes de la littérature, puis vis-à-vis de l'algorithme d'origine en désactivant un ensemble de dimensions, provoquant une forte disparité des influences / Hard optimization stands for a class of problems which solutions cannot be found by an exact method, with a polynomial complexity.Finding the solution in an acceptable time requires compromises about its accuracy.Metaheuristics are high-level algorithms that solve these kind of problems. They are generic and efficient (i.e. they find an acceptable solution according to defined criteria such as time, error, etc.).The first chapter of this thesis is partially dedicated to the state-of-the-art of these issues, especially the study of two families of population based metaheuristics: evolutionnary algorithms and swarm intelligence based algorithms.In order to propose an innovative approach in metaheuristics research field, sensitivity analysis is presented in a second part of this chapter.Sensitivity analysis aims at evaluating arameters influence on a function response. Its study characterises globally a objective function behavior (linearity, non linearity, influence, etc.), over its search space.Including a sensitivity analysis method in a metaheuristic enhances its seach capabilities along most promising dimensions.Two algorithms, binding these two concepts, are proposed in second and third parts.In the first one, ABC-Morris, Morris method is included in artificial bee colony algorithm.This encapsulation is dedicated because of the similarity of their bare bone equations, With the aim of generalizing the approach, a new method is developped and its generic integration is illustrated on two metaheuristics.The efficiency of the two methods is tested on the CEC 2013 conference benchmark. The study contains two steps: an usual performance analysis of the method, on this benchmark, regarding several state-of-the-art algorithms and the comparison with its original version when influences are uneven deactivating a subset of dimensions

Les lymphocytes T (LT) CD4+ auxiliaires soutiennent l‘action des LT CD8+ cytotoxiques (LTC) au cours des réponses immunitaires anti-tumorales. Des protocoles d‘immunothérapie cellulaire adoptive (ICA) basés sur l‘injection d‘effecteurs T CD4+ ont donc été développés pour traiter les cancers, et ils ont montré une efficacité thérapeutique. Cependant, la difficulté de disposer de cellules présentatrices d‘antigène (CPA) autologues permettant de générer un nombre suffisant de LT CD4+ spécifiques fonctionnels in vitro dans un court délai représente un obstacle majeur au développement de telles approches. Pour contourner cette difficulté, notre groupe a précédemment développé des cellules présentatrices d‘antigène artificielles (CPAA) dérivant de fibroblastes murins NIH/3T3 et exprimant les molécules nécessaires pour activer des LT CD4+ humains : une molécule HLA (Human Leucocyte Antigen) de classe II (ici HLA-DR1), la molécule de costimulation CD80 et les molécules d‘adhérence CD54 et CD58. Dans ce travail, nous avons cherché à optimiser nos CPAA DR1+ (CPAADR1) en permettant une expression endogène et constitutive de l‘antigène d‘intérêt (ici l‘hémagglutinine, HA), sous forme de peptide ou de protéine, au niveau des compartiments cellulaires impliqués dans la présentation des antigènes par les molécules HLA-II. Nous avons montré que les CPAADR1 « endogènes » exprimant le peptide HA au niveau du réticulum endoplasmique (RE) ou la protéine HA à la membrane plasmique, possédaient les meilleures capacités de présentation de l‘antigène. En stimulation primaire, ces deux lignées de CPAADR1 activaient des LT CD4+ spécifiques de HA, mais avec une capacité moindre que des CPA autologues. En revanche, en restimulation, les CPAADR1 exprimant le peptide HA dans le RE étaient même plus efficaces pour amplifier des LT CD4+ spécifiques fonctionnels que des CPAADR1 ou des CPA autologues chargées avec le peptide d‘intérêt. Les LT obtenus étaient des cellules Th1 mémoires exprimant du granzyme B et produisant de l‘IFN-γ et du TNF-α. C‘est la première fois à notre connaissance qu‘un antigène exprimé de façon endogène dans une lignée cellulaire peut-être présenté de façon efficace sur une molécule HLA de classe II. Nos CPAA « endogènes » constituent donc un nouvel outil unique pour générer de façon reproductible et standardisable des réponses T CD4+ spécifiques, et pourraient déboucher sur le développement de nouvelles approches d‘ICA / CD4+ helper T lymphocytes (TLs) sustain CD8+ cytotoxic TL (CTL) activity during anti-tumor immune responses. Adoptive cell immunotherapy (ACI) protocols based on the injection of CD4+ T-effectors have therefore been developed to treat cancers, and they have proven therapeutic efficacy. However, the difficulty of obtaining autologous antigen presenting cells (APCs) for generating a sufficient number of functional specific CD4+ TLs in a short time in vitro is a major obstacle to the development of such approaches. To bypass this difficulty, our group has previously developed artificial antigen presenting cells (AAPCs) derived from NIH/3T3 murine fibroblasts expressing molecules necessary to activate human CD4+ TLs: an HLA (Human Leucocyte Antigen) class II molecule (in this study HLA-DR1), CD80 costimulatory molecule, and CD54 and CD58 adhesion molecules. In this work, we sought to optimize our DR1+ AAPCs (AAPCDR1) by allowing an endogenous and constitutive expression of the antigen of interest (in this study hemagglutinin, HA), as a peptide or a whole protein, in different cell compartments involved in antigen presentation by HLA-II molecules. We have shown that ―endogenous‖ AAPCDR1 expressing HA peptide in the endoplasmic reticulum (ER) or HA protein at the plasma membrane had the best antigen presentation abilities. In a first stimulation, both AAPCDR1cell lines activated HA-specific CD4+ TLs, but to a lower extent than autologous APCs. However, in a second stimulation, AAPCDR1 expressing HA peptide in the ER were even more effective for amplifying functional specific CD4+ TLs than AAPCDR1 or autologous APCs loaded with the peptide of interest. Obtained TLs were memory Th1 cells expressing granzyme B and producing IFN-γ and TNF-α. This is the first time to our knowledge that an antigen expressed endogenously in a cell line can be efficiently presented on an HLA class II molecule. Our ―endogenous‖ AAPCs represent therefore a new and unique tool for reproducible and standardizable generation of specific CD4+ T responses, and could lead to the development of new ACI approaches.

Les réseaux de neurones artificiels, dont le concept s'inspire du fonctionnement des cerveaux biologiques et de leurs capacités d'apprentissage, sont une approche prometteuse pour répondre aux nouveaux usages informatiques dits « cognitifs », tels que la reconnaissance d'images ou l'interaction en langage naturel. Néanmoins, leur mise en œuvre par des ordinateurs conventionnels est peu efficace. Une solution à ce problème est le développement de puces d'accélération matérielle spécialisées qui comportent :- des neurones, unités de traitement de l'information, pour lesquelles des circuits électroniques efficaces existent ;- des synapses, reliant les neurones mais aussi support matériel de l'apprentissage, par le biais de la modulation de leur conductance électrique (qualifiée de « plasticité synaptique »). Réaliser des synapses artificielles intégrables densément et capables d'apprendre in situ reste aujourd'hui un défi majeur.Ces travaux de thèse portent sur l'utilisation synaptique de nanocomposants mémoires innovants, dont certains comportements plastiques riches et intrinsèques sont analogues aux fonctionnalités que nous recherchons.Nous nous intéressons tout d'abord aux jonctions tunnel magnétiques à transfert de spin, développées dans l'industrie pour concevoir de nouvelles mémoires informatiques non volatiles. Nous montrons qu'il est aussi possible d'en faire des synapses artificielles binaires. Après la modélisation analytique de leur comportement naturellement stochastique, nous présentons comment exploiter ce dernier pour faciliter la mise en œuvre in situ d'une règle d'apprentissage probabiliste. À l'aide d'outils de simulation développés au laboratoire, nous étudions l'influence du régime de programmation sur la robustesse d'un système à la variabilité de telles synapses et sur leur consommation énergétique.Nous nous tournons ensuite vers des cellules électrochimiques métalliques Ag2S, d'autres nanocomposants mémoires innovants fabriqués et étudiés par des collaborateurs de l'Université de Lille I, qui y ont déjà observé plusieurs comportements plastiques. Nous avons découvert une plasticité supplémentaire, proche d'un comportement observé en neurosciences. Grâce à un modèle analytique simple permettant de comprendre les relations entre les différentes plasticités, nous montrons en simulation une preuve de concept d'apprentissage non supervisé qui repose sur l'interaction de ces multiples comportements.Pour finir, nous soulevons des pistes de réflexion sur les défis posés par les circuits nécessaires au bon fonctionnement d'un système utilisant comme synapses artificielles les nanocomposants étudiés, notamment lors de la lecture ou de l'écriture de ces derniers.Les résultats de cette thèse ouvrent la voie à la conception de systèmes neuro-inspirés capables d'apprendre en s'appuyant sur la richesse de comportements plastiques offerte par les nanocomposants mémoires innovants. / Artificial neural networks, which take some inspiration from the behavior of biological brains and their learning capabilities, are promising tools to address emerging computing uses known as “cognitive” tasks like classifying images or natural language interaction. However, implementing them on conventional computers is poorly efficient. A solution to this problem is to develop specialized acceleration chips which feature:• neurons, the information processing units, which can be implemented efficienctly with current electronic technologies;• synapses, the connections between the neurons which also support the learning process by adjusting their electrical conductance (“synaptic plasticity”). Implementing artificial synapses with high integration and on-line learning capabilities is still a challenge.This thesis explores the use of innovative memory nanodevices as artificial synapses: some of their rich plastic behaviors naturally implement features that are difficult to access with other devices.First, we investigate spin-transfer torque magnetic tunnel junctions, that are currently develop in industry as a new non volatile memory technology. We show that they can also be used as binary artificial synapses. After modeling their intrinsic stochastic behavior analytically, we describe how to harness this behavior to facilitate the implementation of an on-line probabilistic learning rule. With simulations tools developped in the laboratory, we detail the impact of the programming regime on the resilience of a system that uses such synapses, as well as on the system's power consumptionWe then investigate Ag2S electrochemical metalization cells, another type of innovative memory nanodevices fabricated and characterized by collaborators from Université de Lille I, who had already observed the existence of several plastic behaviors. We discovered an additional plasticity, close to a behavior known in neurosciences. With a simple analytical model that allows a better understanding of the relationships between theses plasticities, we show by simulations means a proof of concept of an unsupervised learning that relies on the interaction of the plastic behaviors theses nanodevices feature.Finally, we consider the challenges arising from the circuits that are required to read and write such artificial synapses in a neuro-inspired system.The results of this Ph.D. work pave the way for the design of neuro-inspired systems that can learn by harnessing the rich plastic behaviors that are featured by innovative memory nanodevices.

Les cavités artificielles funéraires sont à la fin de la Préhistoire en Méditerranée occidentale un type d’architecture privilégié. La compréhension de la chaîne opératoire de construction des hypogées est essentielle afin de déterminer quelles techniques et stratégies entrent en jeu dans la mise en place de ces architectures souterraines. C’est dans le cadre de cette thèse qu’une méthode a été développée sur le sujet. Celle-ci se présente en trois axes : l’étude technologique du macro-outillage de creusement, l’analyse à l’aide de la photogrammétrie des traces présentes sur les parois des hypogées et l’expérimentation permettant de confirmer ou d’infirmer les hypothèses émises. Ces trois axes ont été développés dans des contextes différents, en France dans les Bouches-du-Rhône avec l’ensemble monumental de Fontvieille et en Sardaigne avec notamment la nécropole à domus de janas de S’Elighe Entosu. Ces deux contextes offrent la possibilité d’étudier des hypogées possédant des caractéristiques différentes. La comparaison entre les divers contextes sélectionnés en Méditerranée occidentale permet d’entrevoir les différences et similitudes présentes dans les chaînes opératoires de creusement et les choix effectués par les différents groupes humains. Au-delà de la connaissance des techniques employées pour le creusement de ces architectures, cette étude permet également de s’interroger sur le rôle de celles-ci au sein de la communauté par l’investissement que leur mise en place engendre. / At the end of Prehistory in the Western Mediterranean, the rock-cut tombs are a privileged type of architecture. The understanding of the hypogea’s digging process is essential In order to determine which techniques and strategies come into play in the establishment of these structures. In the context of a PhD research work, a method has been developed on the subject. It is presented in three lines of reflection: the technological study of digging macro-tools, the analysis of the traces which are present on the walls of hypogea using photogrammetry, and an experimentation to confirm or refute the assumptions made during the first two axes of the study. These three axes were developed in different contexts, the monumental context of Fontvieille, located in the geographical area of the Bouches-du-Rhône administrative department in France and the necropolis of S'Elighe Entosu in Sardinia, Italy. These two fieldworks allows us to study the different characteristics of the hypogea. The comparison between the various contexts selected in the western Mediterranean allows us to glimpse the differences and similarities present in the digging process chains and the choices made by the different human groups. Beyond the knowledge of the techniques used for the digging of these architectures, this study also makes it possible to question the role of these in the community by the investment that their establishment generates.

La matrice extracellulaire (MEC) intervient dans de nombreux processus biologiques tels que la migration, la différentiation ou l’adhésion cellulaire. Elle est également associée à plusieurs évènements pathologiques. La cohésion de la MEC est assurée par un réseau organisé et complexe de protéines présent au voisinage immédiat des cellules. Ce projet a pour objectif de contribuer à la caractérisation structurale et fonctionnelle de certaines de ces complexes protéiques. Le Gelatin Binding Domain (GBD) (⁶FI¹²FII ⁷⁸⁹FI), localisé dans la région N-terminale de la fibronectine est connu pour interagir avec la transglutaminase 2 (TG2), le collagène de type I, ou encore des protéines d’adhésion bactériennes tel que la FNE (protéine de Streptococcus equi). Mes travaux de thèse portent donc sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de ces interactions par des approches biophysiques et biochimiques. Ce travail a permis de cartographier les régions d’interactionentre la TG2 et le GBD d’une part et la FNE et le GBD d’autre part. Nous avons par la suite entrepris une étude par SAXS des complexes TG2/GBD et FNE/GBD et réussi à établir des modèles structuraux d’interaction entre (1) le GBD et le domaine N-terminal de la TG2 et (2) entre la FNE et le sous fragment ⁷⁸⁹FI du GBD. La structure tridimensionnelle de la protéine FNE a été résolue par cristallographie aux rayons X grâce à l’utilisation d’un outil original facilitant l’obtention de cristaux. / The extracellular matrix (ECM) is involved in a number of biological pathways associated with the cell migration, differentiation, adhesion and is also implicated in several pathological events. The cohesion of the ECM is accomplished by a highly organized protein complex network on the cell surface. The Gelatin Binding Domain (GBD) (⁶FI¹²FII ⁷⁸⁹FI) of the N-terminal region of fibronectin is found to interact with the transglutaminase 2 (TG2), collagen type I and the bacterial adhesion protein FNE. In this study, we conducted the structural and functional characterization of the protein complexes involved in the cohesion of ECM. The interactions between either TG2 or FNE and GBD have been characterized and the regions responsible for the interactions have also been mapped. Furthermore, we studied TG2/GBD and FNE/GBD complex by SAXS and built two models underscoring the interactions between (1), the GBD and the Nterminus of TG2 and (2), FNE and the sub-fragment ⁷⁸⁹FI of GBD providing insights on mechanistically elucidating the protein interactions during the cohehsion of ECM. The X-ray structure of the protein FNE of Streptococcus equi has been determined at 1.8 Å, by using an original tool that facilitates obtaining crystals.

Deux exemples de tunnels optiques sont étudiés par des méthodes de l'optique femtoseconde pour leurs propriétés propagatives. Le premier est une opale artificielle : un matériau de la famille des cristaux photoniques aux propriétés analogues dans le domaine optique à celles des semiconducteurs. Ils possèdent une bande interdite photonique (BIP) empêchant pour toutes les directions la propagation de photons dont l'énergie se trouve dans cette bande. Le second système est un bi-prisme en réflexion totale.<br> La première partie est consacrée aux opales : empilements réguliers de sphères de silice submicrométriques. Chaque phase de l'élaboration est en revue. Une description théorique des propriétés des cristaux photoniques est faite pour plusieurs structures. On en déduit que les opales n'ont pas de BIP mais une "stop-band" inhibant la transmission des photons dont la bande d'énergies dépend de la direction. Les caractéristiques structurelles, mises en relation avec les propriétés spectrales, sont abordées par des méthodes microscopiques et optiques. Un dispositif de temps de vol a été réalisé pour déterminer les propriétés propagatives d'opales sondées par un continuum en utilisant un fenêtrage temporel par absorption à deux photons dans du ZnS. Après des corrections en fréquence et en temps, on dispose du profil spectral de vitesse de groupe. Celui-ci est expliqué par un modèle basé sur la relation de Kramers-Krönig. Cela permet de décrire la "stop-band" comme un système à "deux niveaux photoniques".<br> La dernière partie est dédiée à l'étude de la transposition en optique d'un nouvel effet prédit dans les conditions de l'effet tunnel : "l'évaporation quantique". Il se manifeste par l'augmentation drastique de la transmission d'un paquet d'onde. Il se produit en transférant à l'instant de la réflexion une petite quantité de mouvement au paquet d'onde. Un bi-prisme en réflexion totale séparé par une lame d'air est employé pour reproduire les conditions de cet effet. On utilise une technique pompe-sonde qui simule le transfert de moment par effet Kerr. Après analyse des effets en compétition avec l'évaporation quantique, nous observons des signaux qui, une fois traités selon des critères précis, ont les caractéristiques de l'effet recherché. Ceci constitue une présomption de la première observation en optique de ce nouvel effet.

Dans ce travail de thèse, nous présentons plusieurs contributions visant à améliorer l'utilisation des modèles de Markov cachés (MMC) dans les systèmes d'intelligence artificielle. Nous nous sommes concentrés sur trois objectifs : l'amélioration de l'apprentissage de MMC, l'expérimentation d'un nouveau type de MMC et la visualisation de dissimilarité pour mieux comprendre les interactions entre MMC. Dans la première partie, nous proposons, évaluons et comparons plusieurs nouvelles applications<br />de métaheuristiques biomimétiques classiques (les algorithmes génétiques, l'algorithme de fourmis artificielles API et l'optimisation par essaim particulaire) au problème de l'apprentissage de MMC. Dans la<br />deuxième partie, nous proposons un nouveau type de modèle de Markov caché, appelé modèle Markov caché à substitutions de symboles (MMCSS). Un MMCSS permet d'incorporer des connaissances a priori dans le processus d'apprentissage et de reconnaissance. Les premières expérimentations de ces modèles sur des images démontrent leur intérêt. Dans la troisième partie, nous proposons une nouvelle méthode de représentation de dissimilarité appelée matrice de scatterplots pseudo-euclidienne (MSPE), permettant de mieux comprendre les interactions entre des MMC. Cette MSPE est construite à partir<br />d'une technique que nous nommons analyse en composantes principales à noyau indéfini (ACPNI). Nous terminons par la présentation de la bibliothèque HMMTK, développée au cours de ce travail. Cette dernière intègre des mécanismes de parallélisation et les algorithmes développés au cours de la thèse.

A l'heure actuelle la recherche de nouvelles ressources énergétiques est un domaine en plein développement. Dans ce cadre, l'hydrogène moléculaire y a toute sa place et sera un vecteur énergétique majeur du XXIème siècle en permettant le stockage des énergies renouvelables. Cependant son utilisation est pour l'instant limitée à cause du coût élevé de sa production, industriellement basée sur le platine comme catalyseur. Un des enjeux majeurs de ce siècle est donc de trouver de nouveaux catalyseurs performants pour la production d'hydrogène et dont le coût soit suffisamment faible pour permettre un développement industriel. Les hydrogénases sont des enzymes catalysant la réduction de protons en hydrogène avec une grande efficacité et en conditions douces. Leurs sites actifs sont basés sur des métaux abondants comme le nickel ou le fer et ont des activités similaires au platine dans certaines conditions. Cependant quelques inconvénients, comme leur inactivation par l'oxygène ou encore le fait qu'il soit assez difficile de les produire sous forme active, limitent leur utilisation technologique. Dans ce contexte, la chimie bio-inspirée et la chimie biomimétique sont particulièrement prometteuses : prenant exemple sur la nature et plus particulièrement sur les sites actifs enzymatiques, elles permettent de développer de nouvelles familles de catalyseurs. On a pu ainsi développer des complexes dinucléaire nickel-fer ou encore des complexes de cobalt ayant une activité dans la catalyse de réduction de protons. Certains complexes de cobalt, les cobaloximes et les complexes diimine dioxime de cobalt ont ainsi montré de bonnes activités dans la réduction de protons en milieux organiques ou mixtes organiques/eau. Jusqu'alors cependant peu d'études ont été effectuées en milieux complétement aqueux. Nous pouvons aller plus loin dans cette démarche via une approche dite biosynthétique, qui vise à incorporer des catalyseurs inorganiques dans des enveloppes protéiques. Ces enveloppes protéiques peuvent, par différentes interactions, potentiellement améliorer la solubilité et la stabilité dans l'eau des catalyseurs inorganiques. La thèse qui suit se concentre sur cette approche et plus particulièrement sur la production, la caractérisation et l'étude de nouveaux hybrides entre différentes hémoprotéines (myoglobine et hème oxygénase en particulier) et différents complexes de cobalt (cobaloximes et complexe diimine dioxime de cobalt). Après avoir mis au point un protocole pour la production et la purification de la myoglobine de cachalot sans son cofacteur héminique, nous nous sommes intéressés à préparer et caractériser différents hybrides. Nous avons pu montrer par ce travail que les hémoprotéines dépourvues de leur cofacteur biologique ont une affinité particulière pour les complexes de cobalt et que la coordination de ces complexes inorganiques se fait via une seule histidine de la protéine hôte. Les hybrides ainsi obtenus ont montré une grande stabilité en solution. En plus de l'ajout d'un ligand histidine en axial du cobalt, l'enveloppe protéique permet de moduler la seconde sphère de coordination. Nous avons pu montrer au cours de ce projet que la nature de la protéine hôte module les caractéristiques spectroscopiques et électrochimiques du complexe de cobalt. Enfin ces hybrides ont montré d'une manière générale une activité catalytique pour la production et la photoproduction d'hydrogène dans l'eau, là encore avec une nette influence de la protéine hôte sur l'activité du complexe. Nous avons donc au cours de cette thèse préparé et caractérisé des systèmes hybrides pouvant être qualifiés d'hydrogénases artificielles.

Les protéines à radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM) utilisent un centre [Fe4S4] réduit pour initier le clivage réductive homolytique de la SAM et la formation d'une espèce hautement réactive - le radical 5'-déoxyadénosyl ou 5'-dA•. Dans la quasi-totalité de cas ce radical alkyl va arracher un atome d'hydrogène sur le substrat et déclencher ainsi sa conversion en produit. On trouve ces enzymes au niveau d'étapes clé de la synthèse de certaines vitamines, antibiotiques, précurseurs de l'ADN ou encore cofacteurs protéiques où elles sont souvent impliquées dans le clivage ou la formation des liaisons C-C, C-N, C-S ou encore C-P. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont été focalisés sur l'étude structurale et fonctionnelle de la protéine HydE ; une enzyme à radical SAM, qui intervient dans la biosynthèse du site actif organométallique de l'hydrogénase à [FeFe]. L'objectif principal était d'identifier le substrat de HydE et d'étudier les détails du fonctionnement d'une protéine à radical SAM. Nous avons réussi à identifier un groupe de molécules, dérivées de la cystéine, contentant un cycle thiazolidine avec un ou deux groupements carboxylates, qui ont une très bonne affinité pour le site actif de HydE. Certains de ces ligands se sont montrés d’être des substrats non physiologiques de l’enzyme. Grâce à ces substrats nous avons pu mettre en évidence un nouveau mécanisme d’attaque radicalaire dans les protéines à radical SAM. En effet, dans HydE nous avons observé une attaque directe du radical 5'-dA• sur l’atome soufre du thioéther appartenant au cycle thiazolidine. Cette réaction constitue un exemple pas comme les autres d’une insertion d’un atome de soufre (ou de sélénium) catalysée par une enzyme à radical SAM. Il s'agit également d'une première observation d'une réaction radicalaire dans les cristaux protéiques d'une enzyme à radical SAM et également un premier suivi en temps réel par la RMN du 13C et 1H de l'accumulation d'un des produits de la réaction catalysée par ces enzymes. Les résultats de calculs théoriques basés sur nos structures cristallographiques de haute résolution suggèrent que dans le cas de cette superfamille de protéines le radical 5'-dA• serait plutôt un état de transition et donc pas une espèce intermédiaire isolable. / Radical S-adenosyl-L-methionine (SAM) proteins use a reduced [Fe4S4] cluster to initiate homolytic reductive cleavage of SAM, which leads to the formation of highly reactive 5'-deoxyadenosyl radical species or 5'-dA•. In almost all cases this alkyl radical will abstract a hydrogen atom from the substrate and thus trigger its conversion into product. These enzymes are found in key steps of the synthesis of certain vitamins, antibiotics, DNA precursors or protein cofactors. They are often involved in the cleavage or formation of C-C, C-N, C-S or C-P bonds. The present thesis work has been focused on the structural and functional study of HydE protein; a radical SAM enzyme, involved in the biosynthesis of the organometallic active site of [FeFe]-hydrogenase. The main goal was to identify the substrate of HydE and to study details of how radical SAM proteins control the highly oxidizing 5'-dA• species. We managed to identify a group of molecules, derived from cysteine, containing a thiazolidine ring with one or two carboxylate groups, which have a very good affinity for the active site of HydE. We have demonstrated some of these ligands are non-physiological substrates of the enzyme. With these substrates we could highlight a new radical attack mechanism in radical SAM proteins. Indeed, in HydE we observed a direct attack on the 5'-dA • radical on the sulfur atom of the thioether belonging to the thiazolidine ring. This is an unprecedented reaction that contrasts with sulfur (or selenium) atom insertion reactions catalysed by some radical SAM enzymes. This is also the first observation of a radical reaction in the protein crystal of a radical SAM enzyme and also the first real-time monitoring by 1H- & 13C-NMR spectroscopy of the accumulation of products of the reaction catalysed by these enzymes. Theoretical calculations based on our high-resolution crystal structures suggest that in the case of this protein superfamily the 5'-dA• radical, which triggers the reaction in radical SAM enzymes, is a transition state and therefore not an isolable intermediate species.