Cette thèse porte sur la catalyse supportée sur nanotubes de carbone. Plusieurs aspects ont été étudiés, électrocatalyse pour la production d'hydrogène à partir d'eau, catalyse pour la synthèse organique et électrocatalyse de la réaction de réduction de l'oxygène. Différents catalyseurs ont été synthétisés à partir d'assemblages supramoléculaires de molécules amphiphiles autour de nanotubes de carbone ou d'adhésion de molécules polyaromatiques à la surface des nanotubes et ont impliqué l'utilisation de catalyseur moléculaire ou nanoparticulaire. L'utilisation de ces catalyseurs pour les différents types de réactions mentionnés plus haut ont abouti à des résultats intéressants. / This PhD thesis deals with the catalysis supported on carbon nanotubes. Several aspects have been studied such as electrocatalysis for hydrogen production form water, catalysis for organic synthesis and electrocatalysis of the oxygen reduction reaction. Many different catalysts have been synthesized based on supramolecular assembly of amphiphilic molecules around carbon nanotubes or assembly of polyaromatic molecules at the surface of the nanotubes. These catalysts are made of metallic complexes or metallic nanoparticles. These catalysts have been successfully used to perform the reactions mentioned above.

Le but de ces travaux était de développer des membranes conductrices protoniques de type phosphonique par PECVD radio-fréquence en décharges continue et pulsée à partir du mono-précurseur diméthyl allylphosphonate. De telles membranes sont pressenties comme pouvant avantageusement remplacer la membrane Nafion® ou les membranes conventionnelles de type sulfonique ou phosphonique classiquement utilisées dans les dispositifs piles à combustible ou électrolyseur de type PEM. Ainsi, une étude paramétrique visant à établir des corrélations entre les propriétés des films et les paramètres de dépôt a été menée. Il ressort de cette étude paramétrique que l’utilisation d’une décharge pulsée est favorable à une vitesse de croissance plus élevée et une densité des films plus faible que le mode de décharge continue, favorisant ainsi la conduction protonique. Nous avons également démontré que les dépôts réalisés en mode de décharge pulsée présentent de meilleures capacités de sorption et de rétention d’eau, ce qui est bénéfique pour l’application visée qui est la (photo-)électrolyse de l’eau. Par ailleurs toutes les membranes phosphoniques plasma préparées sont stables d’un point de vue rétention d’eau et réseau covalent jusqu’à au moins 250 °C, ce qui garantit leur utilisation dans des systèmes pouvant fonctionner jusqu’à 120 °C. Par la suite les membranes phosphoniques plasma ont été intégrées en cellule d’électrolyse de l’eau, associées au Nafion® en tant qu’électrolyte. Les caractérisations électrochimiques en cellule ont montré que les membranes phosphoniques plasma sont suffisamment compétitives pour être envisagées dans le futur comme électrolytes solides à part entière dans des AME « tout solide ». / The purpose of this work was to develop phosphonic-type proton conductive membranes by radio-frequency PECVD in a continuous or pulsed discharge from the single precursor dimethyl allylphosphonate. Such membranes could advantageously replace the Nafion® membrane or conventional sulfonic-type or phosphonic acid-type membranes, more classically used in PEM fuel cells and electrolysis devices. A parametric study was carried out in order to establish correlations between the properties of the films and the deposition parameters. It appears that the use of a pulsed discharge promotes better films properties, namely higher growth rate and lower density, than the continuous discharge, thus promoting proton conduction. It was also noticed that the deposits prepared in a pulsed discharge have the highest sorption and water retention capacities, which is particularly beneficial for the intended application i.e. the (photo-) electrolysis of water. Furthermore, all the plasma phosphonic membranes prepared are stable in terms of water retention and covalent network up to at least 250 °C, which ensures their use in systems able to operate up to 120 °C. Subsequently the plasma phosphonic membranes, deposited on the Nafion® as mechanical support, were integrated as electrolyte membrane into a water electrolysis cell. It turns out that plasma phosphonic membranes are competitive enough to be envisaged in the future as integral solid electrolytes in solid membrane-electrodes assemblies.

L’économie actuelle repose sur l’utilisation d’énergies fossiles dont les réserves sont limitées. En plus, l’utilisation de ces ressources a un impact négatif sur l’environnement dû à l’émission des gaz polluants et du CO2. Il est donc nécessaire de remplacer les ressources fossiles par les énergies renouvelables. Les énergies renouvelables peuvent être facilement converties en électricité pour une utilisation directe, mais l’électricité ne peut pas être stockée en grande quantité. Dans ce contexte, l’hydrogène pourrait servir de vecteur énergétique. Il est possible de produire de l’hydrogène par électrolyse de l’eau. L’hydrogène sera ensuite utilisé via une pile à combustible pour fournir de l’électricité et de la chaleur. Ce procédé ne produit que de l’eau qui va être re-consommé ensuite par l’électrolyse.Ce travail de thèse est axé sur la production d’hydrogène par électrolyse de l’eau en milieu acide par la technologie PEM (proton exchange membrane). L’objectif est de remplacer le platine, catalyseur de la réduction à la cathode par des complexes de cobalt de type cobalt-oxime.Le premier chapitre traite différents aspects de l’électrolyse de l’eau et différents catalyseurs étudiés dans la littérature.Le second chapitre décrit différentes techniques expérimentales utilisées pour caractériser les complexes étudiés.Le chapitre trois décrit la synthèse et l’activité catalytique des complexes de cobalt-oxime en solution dans l’acétonitrile vis-à-vis de la réduction des protons en hydrogène.Le chapitre quatre présente les premiers travaux obtenus en utilisant les complexes de cobalt-oxime à la place du platine dans les électrolyseurs PEM. / Today's economy is base on the use of fossil fuels, whose reserves are limited. In addition, the use of these resources has a negative impact on the environment due to the emission of polluting gases and CO2. Therefore it is necessary to replace fossil fuels by renewable energy. Renewable energy can be easily converted to electricity to direct use, but electricity can not be stored in large quantities. In this context, hydrogen could be used as an energy carrier. It is possible to produce hydrogen by electrolysis of water. Hydrogen is then used via a fuel cell to supply electricity and heat. This process produces only water which will then be re-used by the electrolysis.This thesis focuses on hydrogen production by water electrolysis in acidic medium by the PEM (proton exchange membrane) technology. The goal is to replace the platinum, catalyst for proton reduction at the cathode by cobalt-oxime complexes.The first chapter describes various aspects of water electrolysis and different catalyst studied in the literature.The second chapter describes different characterization techniquesChapter three describes the synthesis and catalytic activity of the complexes of cobalt-oxime in solution in acetonitrile towards proton reduction into hydrogen.Chapter four presents the early work obtained using cobalt complexes oxime instead of platinum in PEM electrolyzers.

Dans le but de développer de nouveaux catalyseurs pour améliorer la production d'H2 à partir de l'eau et faire de l'hydrogène un vecteur d'énergie alternatif aux combustibles fossiles, l'étude de nanocatalyseurs pour les réactions d'évolution de l'hydrogène et de l'oxygène laisse entrevoir des perspectives prometteuses. Le Pt et l'Ir sont les principaux métaux des catalyseurs HE et OE. Mais un effort considérable est dévolu à comprendre les étapes mécanistiques qui gouvernent les deux demi-réactions impliquées afin de mettre à profit les connaissances acquises pour l'utilisation d'autres métaux plus abondants et moins coûteux. Le Ru apparaît un candidat idéal, étant un métal très polyvalent qui montre des activités similaires à celles du Pt et de l'Ir et pouvant être étudié par un large éventail de techniques analytiques. En outre, le Ru est quatre fois moins cher que le Pt qui est la référence aujourd'hui. Le développement de nanocatalyseurs précisément contrôlés pour leur application à la production d'H2 par dissociation électrocatalytqiue de l'eau figure parmi nos intérêts de recherche. Le but de ce travail de thèse est de développer des nanocatalyseurs à base de Ru pour les réactions HER et OER, et d'étudier les caractéristiques qui induisent une réponse catalytique spécifique. La synthèse suivie dite par approche organométallique permet de disposer de nanoparticules (NPs) avec un contrôle fin de leurs propriétés (taille, état de surface, dispersion, etc.). Les ligands organiques utilisés comme agents stabilisants permettent de stopper la nucléation des atomes métalliques et d'obtenir de très petites NPs avec une distribution en taille étroite. Ils peuvent aussi influer sur les propriétés chimiques de la surface des NPs, une caractéristique clé dans les processus catalytiques. Cette méthode permet également la préparation de NPs métalliques sur supports solides. Ce manuscrit est structuré en cinq chapitres: 1. Une introduction générale qui présente tout d'abord l'intérêt d'utiliser l'hydrogène comme combustible chimique, comparativement à d'autres sources d'énergie renouvelables et non renouvelables, et décrit les voies de production d'H2 à partir d'autres matières premières ainsi que les techniques pour son stockage et son utilisation de manière sûre et efficace. Viennent ensuite une description du concept de dissociation de l'eau et un parallèle avec la photosynthèse naturelle utilisée comme source d'inspiration, puis une mise au point bibliographique sur les catalyseurs pour les deux demi-réactions redox impliquées. Ce chapitre se termine par une brève description de l'approche organométallique pour la synthèse de nanocatalyseurs. 2. Sur la base d'une étude bibliographique, nos objectifs en lien avec la synthèse, la caractérisation et l'évaluation en catalyse de RuNPs sont ensuite présentés. 3. Le troisième chapitre décrit la synthèse et la caractérisation de NPs de Ru stabilisées par des molécules organiques, et leur évaluation en tant que catalyseurs dans la réaction d'évolution d'H2. / The study of nanoparticulate systems for the hydrogen evolution (HER) and oxygen evolution (OER) reactions allows to rationally developing new catalysts that enhance the water splitting process for obtaining H2, and thus making it a suitable alternative to fossil fuels as energy carriers. Nowadays Pt and Ir are the leading metals in HE and OE catalysts, respectively, but a huge effort is being devoted to understand the mechanistic pathways that rule both semi-reactions in order to transfer the knowledge to other metals which can be more abundant and thus cheaper. Ru appears as a feasible alternative to deeply explore the reaction steps involved in the process, because it is a highly- versatile metal which shows similar activities than Pt/Ir and which can be studied by a wide range of analytical techniques as a result of its properties. In addition, Ru is four times cheaper than the state-of-the-art Pt. The development of precisely controlled nanocatalysts for their application in challenging catalysis like the production of H2 by water-splitting lies among our research interests. This PhD work aims to develop Ru-based nanocatalysts for both HER and OER, and study the characteristics that induce a specific catalytic response. The use of the organometallic approach as synthetic methodology allows to finely controlling the properties of the NPs, e.g. size, surface environment, dispersion, etc. In this synthetic procedure, organic ligands can be added as stabilizing agents to halt the nucleation of metal atoms leading to the formation of the nanosized systems. These ligands can alter the chemical properties of the surface of the nanoparticles, a key feature in the catalytic processes. This methodology allows as well the preparation of metal nanoparticles onto the surface of solid supports.

Les hydrogénases NiFe sont des métalloenzymes capables de catalyser efficacement la production et l'oxydation du dihydrogène à des potentiels proches de l'équilibre thermodynamique. Leur site actif est constitué d'un complexe hétérobimétallique comportant un atome de nickel en environnement soufré relié par deux ponts thiolates à un motif organométallique fer-cyano-carbonyle. Afin d'obtenir des catalyseurs de production d'hydrogène alternatifs au platine actuellement utilisé dans les électrolyseurs et pour approfondir la compréhension du mécanisme catalytique de l'enzyme, nous avons élaboré plusieurs modèles de faible poids moléculaire inspirés de la structure du site actif de ces enzymes : il s'agit de complexes dinucléaires possédant le motif papillon Ni(µ-S2)M (M= Ru, Mn et Fe). Les propriétés électrocatalytiques de ces composés ont été évaluées : ils s'avèrent tous actifs en production d'hydrogène. La modification de la densité électronique et de l'encombrement stérique au niveau du centre ruthénium des complexes Ni-Ru synthétisés a permis d'optimiser les performances de ces catalyseurs en termes de stabilité, de vitesse de catalyse et de surtension. Une étude mécanistique du cycle catalytique des complexes Ni-Ru a également été menée : en combinant mesures électrochimiques et calculs théoriques (DFT), elle a permis de proposer un intermédiaire catalytique hydrure de nature pontante entre les deux métaux Ni et Ru. Enfin, le complexe dinucléaire Ni-Fe synthétisé constitue l'un des premiers modèles à la fois structural et fonctionnel des hydrogénases NiFe.

L'économie actuelle repose sur l'utilisation d'énergies fossiles dont les réserves sont limitées. En plus, l'utilisation de ces ressources a un impact négatif sur l'environnement dû à l'émission des gaz polluants et du CO2. Il est donc nécessaire de remplacer les ressources fossiles par les énergies renouvelables. Les énergies renouvelables peuvent être facilement converties en électricité pour une utilisation directe, mais l'électricité ne peut pas être stockée en grande quantité. Dans ce contexte, l'hydrogène pourrait servir de vecteur énergétique. Il est possible de produire de l'hydrogène par électrolyse de l'eau. L'hydrogène sera ensuite utilisé via une pile à combustible pour fournir de l'électricité et de la chaleur. Ce procédé ne produit que de l'eau qui va être re-consommé ensuite par l'électrolyse.Ce travail de thèse est axé sur la production d'hydrogène par électrolyse de l'eau en milieu acide par la technologie PEM (proton exchange membrane). L'objectif est de remplacer le platine, catalyseur de la réduction à la cathode par des complexes de cobalt de type cobalt-oxime.Le premier chapitre traite différents aspects de l'électrolyse de l'eau et différents catalyseurs étudiés dans la littérature.Le second chapitre décrit différentes techniques expérimentales utilisées pour caractériser les complexes étudiés.Le chapitre trois décrit la synthèse et l'activité catalytique des complexes de cobalt-oxime en solution dans l'acétonitrile vis-à-vis de la réduction des protons en hydrogène.Le chapitre quatre présente les premiers travaux obtenus en utilisant les complexes de cobalt-oxime à la place du platine dans les électrolyseurs PEM.

L'hydrogène a révélé un grand potentiel en tant que vecteur d'énergie du futur polyvalent et non polluant, offrant une densité d'énergie élevée et une conversion efficace en puissance utilisable. La fermentation noire est l'un des procédés de production biologique les plus prometteurs, mais doit encore surmonter des défis majeurs, notamment des taux de production d'hydrogène faibles (HPR) et des rendements en hydrogène (HY), avant que son application industrielle ne devienne économe en énergie et en coûts. Dans ce travail, nous avons cherché à optimiser la production d’hydrogène par fermentation noire de Thermotoga neapolitana. Les principaux objectifs étaient d'améliorer le HPR et de maintenir une HY élevée en utilisant différentes approches pour contrecarrer les limitations des processus et prévenir les inhibitions les plus pertinentes. En outre, un développement du procédé à flux continu privilégié par l'industrie a été prévu. Une augmentation de la concentration de biomasse initiale de 0,46 à 1,74 g CDW / L dans les essais biologiques en lots a entraîné une augmentation de plus de 2 fois de la HPR jusqu'à 654 (± 30) mL / L / h sans affecter négativement l'HY. Cependant, alors que la productivité volumétrique augmentait, le HPR spécifique (par unité de biomasse) était négativement corrélé avec le HPR et la concentration de biomasse. Par la suite, nous avons étudié la sursaturation en hydrogène de la phase liquide (H2aq) dans des essais biologiques par lots. À 100 tr / min d'agitation, H2aq est sursaturé jusqu'à 3 fois la concentration à l'équilibre. L'augmentation de la vitesse d'agitation diminuait l'accumulation de H2aq jusqu'à atteindre un équilibre entre l'hydrogène en phase gazeuse et liquide en agitation à 500 tr / min à de faibles concentrations cellulaires. Une augmentation de 200 à 600 tr / min a réduit progressivement l'H2aq de 21,9 (± 2,2) à 8,5 (± 0,1) mL / L et a presque doublé le HPR, révélant une corrélation directe entre les deux paramètres. De même, l’ajout de supports K1 et de recirculation de biogaz riche en H2 (GaR) a permis de contrecarrer l’accumulation de H2aq. En accélérant le processus en augmentant la concentration de biomasse dans les réacteurs jusqu'à 0,79 g CDW / L, le GaR s'est révélé plus efficace pour éliminer l'H2aq que l'agitation à 500 tr / min. L'application de GaR à 300 et 500 tr / min a augmenté le HPR d'environ 260% à 850 (± 71) mL H2 / h / L, par rapport à une agitation à 300 tr / min, atteignant une HY de 3,5 mol / mol de glucose. Nous avons démontré qu'un transfert de masse gaz-liquide insuffisant conduit à une accumulation de H2aq qui inhibe le rendement, mais plus encore le taux de fermentation à l'obscurité. Dans la phase finale de ce projet, nous avons réussi à maintenir la production d'hydrogène à débit continu. L'augmentation de la concentration en glucose de l'alimentation, de 11,1 à 41,6 mM, a entraîné une diminution de l'HY de 3,6 (± 0,1) à 1,4 (± 0,1) mol H2 / mol de glucose. L’HPR a augmenté simultanément jusqu’à environ 55 ml / L / h à 27,8 mM de glucose, tandis qu’une augmentation supplémentaire du glucose dans l’alimentation animale à 41,6 mM n’a pas augmenté les concentrations en HPR et en AA. Pour rechercher si des taux élevés d'AA limitaient le processus, la concentration en AA de l'alimentation a été progressivement augmentée. Cependant, cela n'a révélé aucun effet négatif sur la fermentation à l'obscurité en continu jusqu'à 240 mM de nourriture AA et, tout au long des 110 jours de fermentation en continu, l'HY a augmenté de 47%. La réduction du THS de 24 à 7 h a également entraîné une augmentation du taux de HPR de 82 (± 1) à 192 (± 4) mL / L / h, tout en diminuant le HY. De manière concomitante, le H2aq accumulé est directement corrélé au HPR atteignant 15,6 mL / L pour un THS de 7 h et à une agitation de 500 tr / min. L'application de GaR a efficacement neutralisé la sursaturation en H2aq et a permis d'obtenir le HPR le plus élevé de 277 mL / L à un THS de 5 h / Hydrogen has revealed a great potential as a versatile and non-polluting energy carrier of the future providing a high energy density and an efficiently conversion to usable power. Dark fermentation is one of the most promising biological production processes, but still has to overcome major challenges, most importantly low hydrogen production rates (HPRs) and hydrogen yields (HYs), before its industrial application becomes cost- and energy-efficient.In this work, we aimed to optimize the hydrogen production via dark fermentation by Thermotoga neapolitana. The main objectives were to enhance the HPR and maintaining a high HY using different approaches to counteract process limitations and prevent the most relevant inhibitions. Furthermore, a development of the industrially preferred continuous-flow process was projected. An increase of the initial biomass concentration from 0.46 to 1.74 g CDW/L in batch bioassays resulted in a more than 2-fold enhancement of the HPR up to 654 (±30) mL/L/h without negatively affecting the HY. However, while the volumetric productivity increased the specific HPR (per unit of biomass) was negatively correlated with the HPR and the biomass concentration. Subsequently, we investigated the supersaturation of hydrogen in the liquid phase (H2aq) in batch bioassays. At 100 rpm agitation H2aq supersaturated up to 3 times the equilibrium concentration. Increasing the agitation speed diminished the accumulation of H2aq until an equilibrium between the gas and liquid phase hydrogen was reached with 500 rpm agitation at low cell concentrations. A raise from 200 to 600 rpm gradually reduced H2aq from 21.9 (± 2.2) to 8.5 (± 0.1) mL/L and approximately doubled the HPR, revealing a direct correlation between the two parameters. Similarly, the addition of K1 carrier and H2-rich biogas recirculation (GaR) successfully counteracted the accumulation of H2aq. Accelerating the process by increasing the reactors biomass concentration up to 0.79 g CDW/L, GaR revealed to be more efficient in removing H2aq than 500 rpm agitation. The application of GaR at 300 and 500 rpm enhanced the HPR by approximately 260% up to 850 (± 71) mL H2/h/L, compared to a sole 300 rpm agitation, reaching a HY of 3.5 mol/mol glucose. We demonstrated that an insufficient gas-liquid mass transfer leads to the accumulation of H2aq which inhibits the yield but even more so the rate of dark fermentation. In the final phase of this project we successfully maintained continuous-flow hydrogen production. Increasing the feed glucose concentration from 11.1 to 41.6 mM diminished the HY from 3.6 (± 0.1) to 1.4 (± 0.1) mol H2/mol glucose. The HPR increased concomitantly up to approximately 55 mL/L/h at 27.8 mM of glucose, whereas a further increase of feed glucose to 41.6 mM did not enhance the HPR and the AA concentration. To investigate whether high levels of AA limited the process, the feed AA concentration was gradually increased. However, this revealed no negative effect on continuous dark fermentation up to 240 mM of feed AA and, throughout the 110 days of continuous fermentation, the HY increased by 47%. Decreasing the HRT from 24 to 7 h also led to a HPR enhancement from 82 (± 1) to 192 (± 4) mL/L/h, while decreasing the HY. Concomitantly, the H2aq accumulated, directly correlated to the HPR reaching 15.6 mL/L at an HRT of 7 h and 500 rpm agitation. The application of GaR efficiently counteracted the supersaturation of H2aq and allowed the highest HPR of 277 mL/L at a HRT of 5 h

Ce travail est lié au sujet "Energies Propres". Le diméthoxyméthane (DMM) a un fort potentiel de stockage d'hydrogène comme source pour des applications mobiles du fait de son contenu élevé en hydrogène et de sa non toxicité. Il a été montré que le DMM peut être reformé à 100% pour produire de l'hydrogène sur un catalyseur complexe formé d'un solide acide tel que Nb2O5 ou du phosphate de niobium (NbP) associé à un catalyseur de type CuZnO/Al2O3. D'autre part, des catalyseurs V2O5/NbP et V2O5/TiO2–SO42- ont été préparés et évalués dans la réaction d'oxydation sélective du méthanol en DMM. Les propriétés acides et redox de surface de ces catalyseurs ont été corrélées à leur performance catalytique. Les propriétés d'adsorption de Nb2O5 et NbP, testés en réaction de déshydratation du méthanol, ont été aussi évaluées.

La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.

Les défis conjoints du changement climatique d'origine anthropique et la diminution des réserves de combustibles fossiles sont le moteur de recherche intense pour des sources d'énergie alternatives. Une avenue attrayante est d'utiliser un processus biologique pour produire un biocarburant. Parmi les différentes options en matière de biocarburants, le bio-hydrogène gazeux est un futur vecteur énergétique attrayant en raison de son efficacité potentiellement plus élevé de conversion de puissance utilisable, il est faible en génération inexistante de polluants et de haute densité d'énergie. Cependant, les faibles rendements et taux de production ont été les principaux obstacles à l'application pratique des technologies de bio-hydrogène. Des recherches intensives sur bio-hydrogène sont en cours, et dans les dernières années, plusieurs nouvelles approches ont été proposées et étudiées pour dépasser ces inconvénients. À cette fin, l'objectif principal de cette thèse était d'améliorer le rendement en hydrogène moléculaire avec un accent particulier sur l'ingénierie métabolique et l’utilisation de bioprocédés à variables indépendantes. Une de nos hypothèses était que la production d’hydrogène pourrait être améliorée et rendue plus économiquement viable par ingénierie métabolique de souches d’Escherichia coli producteurs d’hydrogène en utilisant le glucose ainsi que diverses autres sources de carbone, y compris les pentoses. Les effets du pH, de la température et de sources de carbone ont été étudiés. La production maximale d'hydrogène a été obtenue à partir de glucose, à un pH initial de 6.5 et une température de 35°C. Les études de cinétiques de croissance ont montré que la μmax était 0.0495 h-1 avec un Ks de 0.0274 g L-1 lorsque le glucose est la seule source de carbone en milieu minimal M9. .Parmi les nombreux sucres et les dérivés de sucres testés, les rendements les plus élevés d'hydrogène sont avec du fructose, sorbitol et D-glucose; 1.27, 1.46 et 1.51 mol H2 mol-1 de substrat, respectivement. En outre, pour obtenir les interactions entre les variables importantes et pour atteindre une production maximale d'hydrogène, un design 3K factoriel complet Box-Behnken et la méthodologie de réponse de surface (RSM) ont été employées pour la conception expérimentale et l'analyse de la souche d'Escherichia coli DJT135. Le rendement en hydrogène molaire maximale de 1.69 mol H2 mol-1 de glucose a été obtenu dans les conditions optimales de 75 mM de glucose, à 35°C et un pH de 6.5. Ainsi, la RSM avec un design Box-Behken était un outil statistique utile pour atteindre des rendements plus élevés d'hydrogène molaires par des organismes modifiés génétiquement. Ensuite, l'expression hétérologue de l’hydrogénases soluble [Ni-Fe] de Ralstonia eutropha H16 (l'hydrogénase SH) a tenté de démontrer que la mise en place d'une voie capable de dériver l'hydrogène à partir de NADH pourrait surpasser le rendement stoechiométrique en hydrogène.. L’expression a été démontrée par des tests in vitro de l'activité enzymatique. Par ailleurs, l'expression de SH a restaurée la croissance en anaérobie de souches mutantes pour adhE, normalement inhibées en raison de l'incapacité de réoxyder le NADH. La mesure de la production d'hydrogène in vivo a montré que plusieurs souches modifiées métaboliquement sont capables d'utiliser l'hydrogénase SH pour dériver deux moles d’hydrogène par mole de glucose consommé, proche du maximum théorique. Une autre stratégie a montré que le glycérol brut pourrait être converti en hydrogène par photofermentation utilisant Rhodopseudomonas palustris par photofermentation. Les effets de la source d'azote et de différentes concentrations de glycérol brut sur ce processus ont été évalués. À 20 mM de glycérol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus dans des conditions optimales, un rendement de 87% de la théorie, et significativement plus élevés que ce qui a été réalisé auparavant. En prolongement de cette étude, l'optimisation des paramètres a également été utilisée. Dans des conditions optimales, une intensité lumineuse de 175 W/m2, 30 mM glycérol et 4.5 mM de glutamate, 6.69 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus, soit un rendement de 96% de la valeur théorique. La détermination de l'activité de la nitrogénase et ses niveaux d'expression ont montré qu'il y avait relativement peu de variation de la quantité de nitrogénase avec le changement des variables alors que l'activité de la nitrogénase variait considérablement, avec une activité maximale (228 nmol de C2H4/ml/min) au point central optimal. Dans la dernière section, la production d'hydrogène à partir du glucose via la photofermentation en une seule étape a été examinée avec la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). La méthodologie de surface de réponse avec Box-Behnken a été utilisée pour optimiser les variables expérimentales de façon indépendante, soit la concentration de glucose, la concentration du glutamate et l'intensité lumineuse, ainsi que d'examiner leurs effets interactifs pour la maximisation du rendement en hydrogène moléculaire. Dans des conditions optimales, avec une intensité lumineuse de 175 W/m2, 35 mM de glucose, et 4.5 mM de glutamate,, un rendement maximal d'hydrogène de 5.5 (± 0.15) mol hydrogène /mol glucose, et un maximum d'activité de la nitrogénase de 246 (± 3.5) nmol C2H4/ml/min ont été obtenus. L'analyse densitométrique de l'expression de la protéine-Fe nitrogenase dans les différentes conditions a montré une variation significative de l'expression protéique avec un maximum au point central optimisé. Même dans des conditions optimales pour la production d'hydrogène, une fraction significative de la protéine Fe a été trouvée dans l'état ADP-ribosylée, suggérant que d'autres améliorations des rendements pourraient être possibles. À cette fin, un mutant amtB dérivé de Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) a été créé en utilisant le vecteur de suicide pSUP202. Les résultats expérimentaux préliminaires montrent que la souche nouvellement conçue métaboliquement, R. capsulatus DG9, produit 8.2 (± 0.06) mol hydrogène / mole de glucose dans des conditions optimales de cultures discontinues (intensité lumineuse, 175 W/m2, 35 mM de glucose et 4.5 mM glutamate). Le statut d'ADP-ribosylation de la nitrogénase-protéine Fe a été obtenu par Western Blot pour la souche R. capsulatus DG9. En bref, la production d'hydrogène est limitée par une barrière métabolique. La principale barrière métabolique est due au manque d'outils moléculaires possibles pour atteindre ou dépasser le rendement stochiométrique en bio-hydrogène depuis les dernières décennies en utilisant les microbes. À cette fin, une nouvelle approche d’ingénierie métabolique semble très prometteuse pour surmonter cette contrainte vers l'industrialisation et s'assurer de la faisabilité de la technologie de la production d'hydrogène. Dans la présente étude, il a été démontré que l’ingénierie métabolique de bactéries anaérobiques facultatives (Escherichia coli) et de bactéries anaérobiques photosynthétiques (Rhodobacter capsulatus et Rhodopseudomonas palustris) peuvent produire de l'hydrogène en tant que produit majeur à travers le mode de fermentation par redirection métabolique vers la production d'énergie potentielle. D'autre part, la méthodologie de surface de réponse utilisée dans cette étude représente un outil potentiel pour optimiser la production d'hydrogène en générant des informations appropriées concernant la corrélation entre les variables et des producteurs de bio-de hydrogène modifiés par ingénierie métabolique. Ainsi, un outil d'optimisation des paramètres représente une nouvelle avenue pour faire un pont entre le laboratoire et la production d'hydrogène à l'échelle industrielle en fournissant un modèle mathématique potentiel pour intensifier la production de bio-hydrogène. Par conséquent, il a été clairement mis en évidence dans ce projet que l'effort combiné de l'ingénierie métabolique et la méthodologie de surface de réponse peut rendre la technologie de production de bio-hydrogène potentiellement possible vers sa commercialisation dans un avenir rapproché. / The joint challenges of anthropogenic climate change and dwindling fossil fuel reserves are driving intense research into alternative energy sources. One attractive avenue is to use a biological process to produce a biofuel. Among the various biofuel options, biohydrogen gas is an attractive future energy carrier due to its potentially higher efficiency of conversion to usable power, low to non-existent generation of pollutants and high energy density. However, low yields and production rates have been major barriers to the practical application of biohydrogen technologies. Intensive research on biohydrogen is underway, and in the last few years several novel approaches have been proposed and studied to surpass these drawbacks. To this end the main aim of this thesis was to improve the molar hydrogen yield with special emphasis of metabolic engineering using the interactive effect with bioprocess independent variable. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economically viable by metabolic engineering on the facultative hydrogen producer Escherichia coli from glucose as well as various other carbon sources, including pentoses. The effects of pH, temperature and carbon source were investigated in batch experiments. Maximal hydrogen production from glucose was obtained at an initial pH of 6.5 and temperature of 35°C. Kinetic growth studies showed that the μmax was 0.0495 h−1 with a Ks of 0.0274 g L−1 when glucose was the sole carbon source in M9 (1X) minimal medium. Among the many sugar and sugar derivatives tested, hydrogen yields were highest with fructose, sorbitol and d-glucose; 1.27, 1.46 and 1.51 mol H2 mol−1 substrate respectively. In addition, to obtain the interactions between the variables important for achieving maximum hydrogen production, a 3K full factorial Box–Behnken design and response surface methodology (RSM) were employed for experimental design and analysis on a metabolically engineered Escherichia coli strain, DJT135. A maximum molar hydrogen yield of 1.69 mol H2 mol−1 glucose was obtained under the optimal conditions of 75 mM glucose, 35°C and pH 6.5. Thus, RSM with Box–Behnken design was a useful statistical tool for achieving higher molar hydrogen yields by metabolically engineered organisms. Furthermore, the heterologous expression of the soluble [Ni-Fe] hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 (the SH hydrogenase) was attempted to demonstrate the introduction of a pathway capable of deriving hydrogen from NADH to surpass the stoichiometric molar hydrogen yield. Successful expression was demonstrated by in vitro assay of enzyme activity. Moreover, expression of SH restored anaerobic growth on glucose to adhE strains, normally blocked for growth due to the inability to re-oxidize NADH. Measurement of in vivo hydrogen production showed that several metabolically engineered strains were capable of using the SH hydrogenase to derive 2 mol H2 per mol of glucose consumed, close to the theoretical maximum. Using another strategy, it was shown that crude glycerol could be converted to hydrogen, a possible future clean energy carrier, by photofermentation using Rhodopseudomonas palustris through photofermentation. Here, the effects of nitrogen source and different concentrations of crude glycerol on this process were assessed. At 20 mM glycerol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained under optimal conditions, a yield of 87% of the theoretical, and significantly higher than what was achieved previously. As a continuation of this study, multiprocess parameter optimization was also involved. Under optimal conditions, a light intensity of 175 W/m2, 30 mM glycerol, and 4.5 mM glutamate, 6.69 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained, a yield 96% of theoretical. Determination of nitrogenase activity and expression levels showed that there was relatively little variation in levels of nitrogenase protein with changes in process variables whereas nitrogenase activity varied considerably, with maximal nitrogenase activity (228 nmol of C2H4/ml/min) at the optimal central point. In the final section, hydrogen production from glucose via single-stage photofermentation was examined with the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). Response surface methodology with Box–Behnken design was used to optimize the independent experimental variables of glucose concentration, glutamate concentration and light intensity, as well as examining their interactive effects for maximization of molar hydrogen yield. Under optimal condition with a light intensity of 175 W/m2, 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate, a maximum hydrogen yield of 5.5 (±0.15) mol H2/mol glucose, and a maximum nitrogenase activity of 246 (±3.5) nmol C2H4/ml/min were obtained. Densitometric analysis of nitrogenase Fe-protein expression under different conditions showed significant variation in Fe-protein expression with a maximum at the optimized central point. Even under optimum conditions for hydrogen production, a significant fraction of the Fe-protein was found in the ADP-ribosylated state, suggesting that further improvement in yields might be possible. To this end an AmtB- derivative of Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) was created by conjugating in amtB::Km using the suicide vector pSUP202. Preliminary experimental results showed that the newly metabolically engineered strain, R. capsulatus DG9, produced 8.2 (±0.06) mol hydrogen/mole of glucose under optimal conditions in batch cultures (light intensity, 175 W/m2; 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate). Western blot analyses of the ADP-ribosylation status of the nitrogenase Fe-protein were investigated on metabolically engineered strain R. capsulatus DG9. In brief, the progress on hydrogen production technology has been limited due to the metabolic barrier. The major metabolic barrier is due to lacking of potential consistent molecular tools to reach or surpass the stochiometric biohydrogen yield since last decades using microbes. To this end a novel approach “metabolic engineering” seems very promising to overcome this constraint towards industrialization to ensure the feasibility of hydrogen production technology. In this present study it has been shown that metabolically engineered facultative (Escherichia coli) anaerobe and photosynthetic bacteria (Rhodobacter capsulatus and Rhodopseudomonas palustris) can produce hydrogen as a major product through fermentative mode by metabolic redirection toward potential energy generation. On the other hand, response surface methodology has depicted in this study as another potential tool to statistically optimize the hydrogen production by generating suitable information concerning interactive correlation between process variables and metabolically engineered biohydrogen producers. Thus, multi process parameter optimization tool has been creating a novel avenue to make a crosslink between lab scale and pilot scale hydrogen production by providing potential mathematical model for scaling up biohydrogen production using metabolically engineered biohydrogen producers. Therefore, it has been clearly revealed in this project that combined effort of metabolic engineering and response surface methodology can make biohydrogen production technology potentially feasible towards its commercialization in near future.