The inhibitory effects of NaCl, L- and D-asparagine, and asparagine substrate analogs, beta-aspartyl hydroxamate (AAH) and albizziin, alone or in combination on Columbia Arabidopsis seed germination and seedling survival were characterized under aseptic conditions. Germination on an agar medium supplemented with inorganic nutrients was prevented by 200 mM NaCl, 20 mM L-asparagine, 60 mM D-asparagine, 1.4 mM AAH, or 8 mM albizziin. Established seedlings were generally more tolerant to these chemicals than germinating seeds. Exogenous L- and D-asparagine partly reversed the inhibitory effects of NaCl on seed germination. L-asparagine also partly reversed AAH inhibition of germination. A M2 seed bank was created from the self-pollinated progeny of ethyl methane sulfonate treated seeds. Arabidopsis mutants having increased tolerance to NaCl and AAH, but not albizziin, were successfully selected from this seed bank.

published_or_final_version / Biochemistry / Master / Master of Philosophy

Univ., Diss.--Münster, 1995.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437677-Texto+Completo-0.pdf: 769775 bytes, checksum: c4cb9d9a52d21b8a9826564fdceb6ea8 (MD5) Previous issue date: 2011 / Biopharmaceutical drugs are mainly recombinant proteins produced by biotechnological tools. Currently on the market L-asparaginase preparations, derived either from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi, have been used as a therapeutic agent on the effective treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. The interest in Erwinia carotovora L-asparaginase type II stems from its significantly lower glutaminase- and similar asparaginase-activity compared to current therapeutic preparations, this is particularly important since the glutaminase-activity has been implicated in causing serious side effects. The aim of this work is to apply a combination of technologies to develop a productive and simplified process for production of homogeneous and active recombinant L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII) in E. coli as host cells. The shake flasks and bioreactor conditions for productive rErAII expression are described, as well as a one-step ion-exchange liquid chromatography purification protocol followed by enzyme kinetics and thermodynamics through isothermal titration calorimetry (ITC).By using a robust fed-batch technique with pre-determined exponential feeding rates the bioreactor culture system yielded 30. 7 gram of dry cell weight and 0. 9 gram of recombinant rErAII protein in soluble form per liter of culture broth. This was achieved in cultures maintained at 30 ºC, in Terrific Broth medium under isopropil β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) induction and using E. coli C43 (DE3) as a host cell. The established one-step purification protocol yielded more than 5 mg of homogeneous rErAII per gram of dry cell weight, corresponding to 168 mg of rErAII protein per culture liter. The work shows that it is possible to produce an active homogeneous rErAII enzyme in the soluble cell fraction through IPTG-induced E. coli fed-batch cultivation. The rErAII proved to be a promising alternative therapy in the treatment of ALL, due to its lower glutaminase activity. When compared to well-established spectrophotometric assays, the straightforward calorimetric techniques for enzyme kinetics determination are accurate and precise either for purified enzymes or crude extracts. These data will contribute to biopharmaceutical companies interested in developing biosimilars, to healthcare policies, and quality control improvement. / Biofármacos são, na sua maioria, proteínas recombinantes produzidas por ferramentas biotecnológicas. Preparações de L-asparaginase que atualmente estão no mercado, derivadas de Escherichia coli ou Eravinia chrysanthemi, têm sido utilizadas como agentes terapêuticos no tratamento efetivo de leucemia linfoblástica aguda (ALI-) por mais de 40 anos. O interesse em L-asparaginase tipo 11 de Ertivinicr carotovora decorre da sua atividade de glutaminase reduzida e sua atividade de asparaginase similar quando comparada a preparações terapêuticas atualmente em uso. Isso é particularmente importante uma vez que a atividade de glutaminase foi relacionada a sérios efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho é aplicar uma combinação de tecnologias para desenvolver um processo simplificado e produtivo para a produção de L-asparaginase II recombinante homogênea e ativa de Envinia carolovora (rErAll) em células hospedeiras de E. coli. Neste trabalho são descritas as condições para a expressão produtiva de rErAll em agitador orbital e em biorreator, assim como um protocolo de purificação em uma única etapa, por cromatografia líquida de troca fônica, seguida pela determinação dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos da enzima através de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Usando uma técnica robusta de batelada alimentada, com vazão em perfil exponencial pré-determinado, o sistema de cultivo em biorreator rendeu 30,7 gramas de células secas e 0,9 gramas de proteína rErAll na fração solúvel por litro de meio de cultivo. Os resultados foram atingidos em cultivos mantidos a 30°C, em meio de cultura Terrific Broth sob indução de isopropil 0-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e utilizando E. coli C43 (DE3) como célula hospedeira.O protocolo de purificação de uma única etapa rendeu aproximadamente 5 mg de rErAll homogênea por grama de célula seca, correspondendo a 168 mg de proteína rErAll por litro de meio de cultura. O trabalho demonstra que é possível produzir na fração celular solúvel a enzima rErAII ativa e homogênea, por meio de cultivos de E. coli em batelada alimentada sob a indução de IPTG. A rErAll mostrou ser uma terapia alternativa promissora para o tratamento de ALL devido a sua atividade de glutaminase reduzida. Quando comparada a ensaios espectrofotornétricos bem estabelecidos, as técnicas calorimétricas diretas para determinação de cinética enzimática são exatas e precisas, tanto para enzimas purificadas quanto para extratos brutos. Esses dados poderão contribuir para indústrias farmacêuticas interessadas em desenvolver biosimilares. para políticas de saúde e para o melhoramento do controle de qualidade de enzimas terapêuticas.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-05-03T15:15:54Z No. of bitstreams: 1 Sheylla Araujo da Silva.pdf: 1281249 bytes, checksum: 35ab93d3a30418140a86454d6ccdb6cd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-03T15:15:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sheylla Araujo da Silva.pdf: 1281249 bytes, checksum: 35ab93d3a30418140a86454d6ccdb6cd (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Because biodiversity of the Amazon region and the enzyme potential of yeasts, this study aimed to select a producing yeast L-asparaginase, identify and assess the production parameters. In addition to analyzing the isolated influence of glucose in the biomass and L-asparaginase, biochemically characterize the enzymatic activity, perform pre-purification and to assess the degree of purity of the enzyme and its potential as an agent antiacrilamida. There were used 21 strains of yeasts and yeast with increased L-asparaginase activity was identified by DNA sequencing using NL-1 and NL-4 primers and used for evaluation of production parameters using two statistical planning, Plackett-Burman (PB) and Composite Central (CCD) . Glucose was evaluated by varying the concentration in the medium (0.5%, 1.0% and 5.0%) and through a factorial design 22 having as variables glucose (%) and aeration (%). A pre- purification was performed with ammonium sulfate evaluated on SDS-PAGE 12.5%. The test agent was aintiacrilamida as by inhibiting the formation of a polyacrylamide of 30% acrylamide solution. The selected yeast was identified as Tilletiopsis minor and the significant variables were presented by PB L- asparagine, yeast extract and MgSO4 , presenting 1975.67 U.mL-1 through L- aspraginase CCD 25 g.L-1 of L-asparagine, 40 g.L-1 yeast extract, 0.35 g.L-1 MgSO4 with medium adjusted to pH 5.0 at 28 °C for 72 hours. The results on the influence of glucose alone revealed that high levels of glucose decrease the production of L-asparaginase obtained with maximal activity at 1.0% glucose and aeration of 40%. The pH and optimum temperature of the enzyme was 7.0 and 50 °C respectively, and the Na+ ion with higher inhibitory effect on the L-asparaginase activity. The L-asparaginase produced showed a 7.8 purification factor in the fraction of 20-40% ammonium sulfate and 100% inhibited the formation of polyacrylamide . The electrophoretic profile showed a sharper band 80.5 kDa . The results show the Tilletiopsis minor studied as new producer of L-asparaginase source with potential for applications in the food industry. / Devido a biodiversidade da Região Amazônica e ao potencial enzimático das leveduras, o presente trabalho visou O presente trabalho buscou selecionar uma levedura produtora de L-asparaginase, identificar e avaliar os parâmetros de produção. Além de analisar a influência isolada da glicose na produção de biomassa e de L-asparaginase, caracterizar bioquimicamente a atividade enzimática, realizar pré-purificação e avaliar o grau de pureza da enzima e seu potencial como agente antiacrilamida Foram utilizadas 21 linhagens de leveduras e a levedura com maior atividade de L-asparaginase foi identificada por sequenciamento de DNA utilizando os primers NL-1 e NL-4 e utilizada para a avaliação dos parâmetros de produção através de dois planejamentos estatísticos, Plackett-Burman (PB) e Central Composto (CCD). A glicose foi avaliada variando a concentração no meio (0,5%, 1,0% e 5,0%) e através de planejamento fatorial 22 tendo como variáveis glicose (%) e aeração (%). A pré-purificação foi realizada com sulfato de amônia avaliada em SDS-PAGE 12,5%. O Teste como agente aintiacrilamida foi mediante a inibição da formação de poliacrilamida de uma solução de acrilamida a 30%. A levedura selecionada foi identificada como Tilletiopsis minor e as variáveis significativas apresentadas pelo PB foram L-asparagina, extrato de levedura e MgSO4, apresentando 1975,67 U.mL-1 de L-aspraginase através do CCD com 25 g.L-1 de L-asparagina, 40 g.L-1 de extrato de levedura, 0,35 g.L-1 de MgSO4 com meio ajustado para pH 5,0, a 28°C, durante 72 horas. Os resultados obtidos sobre a influência isolada da glicose revelaram que altos níveis de glicose diminuem a produção de L-asparaginase obtendo atividade máxima com glicose a 1,0% e aeração de 40%. O pH e temperatura ótima da enzima foi 7,0 e 50°C, respectivamente, sendo o Na+ o íon com maior efeito inibitório na atividade de L-asparaginase. A L-asparaginase produzida apresentou um fator de purificação de 7,8 na fração de 20-40% de sulfato de amônio e inibiu 100% a formação de poliacrilamida. O perfil eletroforético demonstrou uma banda mais acentuada de 80,5kDa. Os resultados obtidos evidenciam a Tilletiopsis minor estudada como nova fonte produtora de L-asparaginase.com potencial para aplicações na indústria de alimentos.

The diploma thesis deals with the Influence of the Enzyme L-asparagine and the Inorganic salts (NaCl, CaCl2, NaHCO3 and NH4HCO3) on the elimination of the acrylamide in food-stuffs and a simulated model cereal matrix. The acrylamide belongs to the probable carcinogenic compounds which is incipient in the course of thermal processing of food, which are rich in the reducing sugars and amino acids as L-asparagine. Because of L-asparagine is the natural component of cereals and simultaneously is dominant antecedent incipient acrylamide, the way of the elimination by enzyme L-asparaginase (or the combination of L-asparaginase and salt) leads to the reduced level of acrylamide in a final product. The L- asparagine and salts were used on food-stuffs and a simulated model cereal matrix. It was found that individual used substances (except for NH4HCO3) cause the reduction of acrylamide production even about 90 % without change in the sensory properties of final product.

Orientador: Lara Durães Sette / Banca: André Rodrigues / Banca: Rafaella Costa Bonugli Santos / Resumo: As coleções de culturas de micro-organismos apresentam importante contribuição para a preservação, manutenção e disponibilização de material microbiológico para uso acadêmico e em pesquisa. A Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP) tem como missão dar suporte ao conhecimento da biodiversidade microbiana, bem como ao desenvolvimento científico e tecnológico, apoiando projetos de relevância. A CRM-UNESP possui um acervo associado de fungos filamentosos e leveduras de ambientes incomuns e/ou extremos. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo reorganizar o acervo de fungos marinhos da costa brasileira, marinhos e terrestres da Antártica e prospectar as enzimas xilanase e L-asparaginase. Para tanto, cerca de 696 fungos marinhos oriundos da costa brasileira e 185 fungos isolados de ambientes antárticos foram avaliados quanto à viabilidade e pureza, fotografados e preservados por dois métodos distintos: criopreservação e Castellani. Destes, 71% dos isolados foram considerados puros e viáveis e submetidos às triagens quantitavas e qualitativas para enzima xilanase e L-asparaginase. Na triagem qualitativa (meio sólido) 112 fungos produtores de xilanase foram isolados de ambiente marinho da costa brasileira e 19 de ambiente antártico. Estes foram submetidos à triagem quantitativa (meio liquído), na qual, o fungo LAMAI 31 identificado como Aspergillus tubingensis apresentou o melhor resultado de produção enzimática (49,41 U/mL). Para a enzima L-asparaginase além dos 622 isolados, 17 fungos filamentosos adicionais foram analisados na triagem qualitativa, totalizando 510 de origem marinha da costa brasileira e 129 de origem Antártica. Dentre estes, 407 fungos foram positivos para L-asparaginase em meio sólido e foram submetidos à triagem em meio liquido. A L-asparaginase foi produzida na faixa de 0,02 a 1,65 U/mL por 103 isolados. Delineamentos experimentais foram aplicados aos isolados que... / Abstract: Microbial culture collections have an important contribution to the preservation, maintenance, and availability of the microbial material for academic and research pourpose. The mission of the Central of Microbial Resources of the UNESP (CRM-UNESP) is to provide support for the knowledge of the microbial biodiversity, as well as for the scientific and technological development, supporting relevant projects. CRM-UNESP has an associated collection of filamentous fungi and yeast from uncommon and/or extreme environments. In this context, the present study aims to reorganize the marine-derived fungal collection from brasilian coast and the marine and terrestrial collection from Antarctica and to prospect the enzymes xylanase and L-asparaginase. For that end, about 696 marine fungi originating from brasilian coast and 185 isolated from antarctic environments had their viability and purity assessed and were photographed and preserved by two different methods: criopreservation and Castellani. Among them, 71% isolated were considered pure and viable and were submitted to the quantitative and qualitative screening for the production of xylanase and L-asparaginase. In the qualitative quantitative screening (solid medium) 112 filamentous fungi able to produce xilanases were isolated from marine environment (brasilian coast) and 19 from the antartic environment. These isolates were submitted to quantitative screening (liquid medium), in which, the fungus LAMAI 31 indentified as Aspergillus tubingensis presented the best result of enzymatic production (49.41 U/mL). For L-asparaginase besides the 622 isolates, 17 additional filamentous fungi were analysed, being 510 originated from the brasilian marine coast and 129 from Antarctica. Among them, 407 fungi were positive for L-asparaginase in solid medium and were submitted to the screening in liquid medium. L-asparaginase was produced in a range of 0.02 to 1.65 U/mL by 103 isolated. Experimental designs ... / Mestre

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23608号 / 医博第4795号 / 新制||医||1055(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 中島 貴子, 教授 戸井 雅和 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La L-asparaginase est une enzyme d’intérêt thérapeutique pour le traitement des leucémies aigües lymphoblastiques participant à l’hydrolyse de son substrat naturel L-asparagine conduisant à l’apoptose des cellules cancéreuses. À ce jour, la L-asparaginase d’origine bactérienne fait partie intégrante des formulations car possédant des activités catalytiques élevées mais provoquant de nombreux effets secondaires liés à une immunogénicité. Trois enzymes avec une activité Lasparaginase produites chez l’homme ont été découvertes récemment mais possèdent des activités catalytiques qui sont 1000 à 2000 fois inférieures aux enzymes d’origine bactérienne. Augmenter l’activité catalytique de ces enzymes par évolution dirigée pourraient permettre leurs utilisations en thérapeutique en plus de potentiellement participer à la réduction de l’immunogénicité chez les patients. Ces travaux de doctorat décrivent le développement d’outils pour l’expression etla détection de l’activité L-asparaginase à l’échelle d’une cellule individuelle. La L-asparaginase d’E. coli, utilisée en thérapeutique, a servi de référence et a permis de démontrer que le test AUR est le plus adapté pour la mesure de l’activité en microfluidique. L’expression de l’enzyme à partir de différents vecteurs d’expression a montré que l’expression périplasmique semble la plus adaptée pour le ciblage permettant un bon rendement et une bonne accessibilité pour le substrat. La viabilité des cellules à l’issu des mesures a été aussi démontrée. Ces outils pourront être directement utilisés pour le criblage de banques de mutants de L-asparaginase d’origine humaine en microfluidique. Les propriétés de la L-asparaginase ont aussi été utilisées pour démontrer la potentielle utilisation de billes de silice en tant que biocatalyseurs où sont confinées des bactéries. Ces billes sont des excellents supports pour la croissance de microorganismes qui peuvent rester viables au-delà d’une semaine. L’expression d’enzymes peut être induite et l’activité catalytique être aisément contrôlée en faisant varier la concentration bactérienne au sein du matériau. La combinaison de différentes populations bactériennes offre la possibilité d’effectuer des réactions en cascade. Le recyclage de ces billes pour différents cycles de réactions a également été démontré. Ces matériaux bioactifs peuvent avoir de nombreuses applications dans le domaine des biotechnologies. / L-asparaginase is an enzyme of therapeutic value for the treatment of acute lymphoblastic leukemia. Ths enzyme catalyzes the hydrolysis of L-asparagine conducting to apoptosis of cancer cells. To date, L-asparaginase of bacterial origine is used in the treatments due to high catalytic activities but causing a number of side effects linked with an immunogenicity. The human produces three enzymes with L-asparaginase activity but their catalytic activities are 1000 to 2000 times lower than the bacterial enzymes. Increase the catalytic activity of these enzymes by directed evolution could allow their uses in therapeutic in addition to potentially reduce immunogenicity in patients. This PhD work describes the development of tools for expression and detection of L-asparaginase at the single cell level for their applications in the screening of human L-asparaginase libraries in microfluidic. E. coli L-asparaginase, used in therapy, served as a reference and allowed to demonstrate that AUR assay is most suitable for measuring activity in microfluidic. Expression of the enzyme from different expression vectors showed that the periplasmic expression seems to be the most successful for screening enabling a good yield and good accessibility for the substrate. The viability of the cells following the measures has been shown. These tools might be used for the screening of mutants libraries of human L-asparaginases in microfluidic. The properties of L-asparaginase were also used to demonstrate the potential use of silica beads as biocatalysts in which bacteria are confined. These beads are excellent supports for the growth of microorganisms which may remain viable beyond one week. The expression of the enzymes may be induced and the catalytic activity can be reliably controlled by varying the concentration of bacteria within the material. The combination of various bacterial populations provides the possibility to carry out cascades reactions. The recycling of these beads for several cycles of reactions was also demonstrated. These bioactive materials have many potential applications in the field of biotechnologies.

Utilizada amplamente como agente terapêutico no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), a L-Asparaginase II (ASNase) é uma enzima que atua diminuindo a concentração de asparagina livre no plasma. Dessa forma, impede o fornecimento de asparagina para a proliferação de células malignas, as quais ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar a asparagina. A ASNase utilizada atualmente no Brasil é importada, o que gera problemas com custo e abastecimento. Sendo assim, é notavelmente atrativa a procura por sistemas que apresentem níveis elevados de expressão de asparaginase e o encontro de formas de produzir tal enzima para um fácil acesso e, se possível, com menor potencial alérgico. Isso nos incentiva a estudar a produção biotecnológica de ASNase produzida em Escherichia coli BL21 (DE3) recombinante que super expressa esta enzima. O objetivo deste trabalho foi estabelecer, em agitador orbital e sistema descontínuo, os parâmetros do cultivo e indução da bactéria Escherichia coli BL21 visando à produção de ASNase, os quais serão úteis para futuros estudos em sistema descontínuo-alimentado. Nosso trabalho avaliou fatores que influenciam a fase de crescimento e/ou a fase de indução da E. coli BL21 (DE3): meio de cultivo baseado na composição elementar, controle do pH, uso de glicose ou glicerol como fonte de carbono, formação de acetato, tempo inicial e final da indução, permeabilização celular para secreção da ASNase, concentração de indutor, temperatura de pós-indução. Nós apresentamos uma estratégia para produção extracelular de ASNase em E. coli BL21 (DE3) pelo crescimento em meio Luria Bertani (LB) modificado para permeabilização celular. A produtividade volumétrica de ASNase extracelular foi 484 IU L h-1 em agitador orbital, correspondendo a 89 % de secreção após 24h de pós-indução com IPTG a 37 ºC. Isto representou rendimento 50 % maior para a ASNase total e 15,5 vezes mais secreção de ASNase em relação ao uso do meio LB modificado. Entretanto no cultivo em biorreator de 3 L nas mesmas condições (exceto a forma de aeração: 500 rpm de agitação e 1 vvm de vazão de ar, kLa = 88 h-1) operado em regime descontínuo foram obtidos resultados semelhantes aos cultivos em agitador orbital, sendo a produtividade volumétrica da ASNase extracelular igual a 525 IU L h-1 após 20 h de pós-indução. A biomassa obtida para agitador orbital e biorreator foi 3,26 e 2,63 g L-1, respetivamente. Por esse motivo, esses resultados foram considerados promissores para aumentar a produtividade nos futuros ensaios em biorreator operado em regime descontinuo-alimentado. / Widely used as a therapeutic agent in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), L-Asparaginase II (ASNase) is an enzyme that works by reducing the concentration of free asparagine in plasma. Thus, it prevents the delivery of asparagine to the proliferation of malignant cells, which unlike healthy cell, cannot synthesize asparagine. ASNase currently used in Brazil is imported, which causes problems with cost and supply. Thus, the search for systems with high levels of asparaginase expression and the finding of ways to produce this enzyme for easy access and, if possible, with a lower allergic potential, are strikingly attractive. This encourages us to study the biotechnological production of ASNase in recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) which super expresses this enzyme. The objective of this work was to establish, in shaker and batch bioreactor system, growth and induction parameters of the Escherichia coli BL21 aiming the production of ASNase, which will be useful for future studies in a fed-batch system. Our work evaluated factors that influenced the growth and induction phase of E. coli BL21 (DE3): culture medium based on elemental composition, pH control, use of glucose or glycerol as carbon source, formation of acetate, initial and final induction time, cellular permeabilization for ASNase secretion, inducer concentration, post-induction temperature. We performed a strategy for extracellular production of ASNase in E. coli BL21 (DE3) by growing in modified Luria Bertani (LB) medium for cell permeabilization. The volumetric productivity of extracellular ASNase was 484 IU L h-1 on shaker, which reached 89% secretion at 24 h of post-induction with IPTG at 37°C. This represented an increase yield of 50 % regarding to the total ASNase formed and 15.5 times the ASNase secretion as compared to that attained with LB modified. While in batch 2L-bioreactor cultivation under the same conditions (except for the aeration employed: 500 rpm of stirring and 1 vvm of air flow, kLa = 88 h-1) it was obtained similar results in relation to shaker cultures. The volumetric productivity of extracellular ASNase was 525 IU L h-1 at 20 h of post-induction. The biomass obtained for shaker and bioreactor were 3.26 and 2.63 g L-1, respectively. For this reason, we consider these promising results to increase productivity in future studies in bioreactor operated as fed-batch regimen.