A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 µM respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 µM respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common malignant dise- ase in children. Despite great advancements in treatment of this disease, around 15-20 % of patients suffer a relapse. One of the possible reasons for relapse is developed resistance to cytostatic drugs. L-asparaginase is an im- portant chemotherapy component for childhood ALL and resistance to this drug often complicates treatment. To date, causes of developing resistance have not been sufficiently described. This thesis is a part of a greater research project focusing on mechanisms of L-asparaginase's activity and reasons for developing resistance to this chemotherapeutic agent. Differential metabolic requirements of cancerous cells have been described as early as 1924 by O. H. Warburg and they have been subject to scientific inquiry since. This study aimed to describe the relationship between basal metabolic determinants of leukemia cells and their sensitivity to L-asparaginase. For this reason, two metabolic pathways, glycolysis and oxidative phosphorylati- on, were studied in detail using a Seahorse Bioanalyzer. Further, expression of specific genes involved in glycolysis was detected. Content of mitochon- drial reticulum in cells, expression of the asparagine synthetase gene, and cell size were also studied. Experiments were...

Um dos maiores problemas encontrados em terapias anti-retrovirais contra AIDS é a emergência de variantes virais que exibem resistência aos fármacos disponíveis e subtiposvirais naturalmente mais suscetíveis ao desenvolvimento de falha terapêutica. Neste trabalho nós resolvemos as estruturas cristalográficas de quatro proteases de HIV-1 complexadas com o inibidor universal C2 simétrico TL-3. As proteases utilizadas foram extraídas de pacientes com AIDS, uma do subtipo B selvagem (Bwt), uma do subtipo F selvagem (Fwt), e um mutante de cada um dos subtipos (Bmut e Fmut), esses dois últimos de pacientes apresentando falha terapêutica. As proteínas foram produzidas por expressão heteróloga em bactérias Escherichia coli, purificadas à partir das proteínas dos corpos de inclusão, e reenoveladas. Os dados coletados foram processados à uma resolução de 2.1 A para o complexo Bwt:TL-3, 1.75 A para Bmut:TL-3, 2.1 A para Fwt:TL-3 e 2.8 A para Fmut:TL-3. Esses dados foram inicialmente processados em P6122 e, posteriormente, reprocessados em P6i. As estruturas foram resolvidas por substituição molecular utilizando a estrutura de uma protease de HIV-1 publicada como modelo. A análise dessas quatro estruturas mostrou que o inibidor TL-3 liga-se de maneira muito próxima em todas elas. Nas proteases Bmut e Fmut a mutação V82A causa um reempacotamento do bolsão SI\', que se reflete num rearranjo da cadeia lateral do inibidor em Pl\'. Nossas análises indicaram, ainda, que algumas substituições polimórficas entre os subtipos B e F podem levar à maior estabilização de regiões naturalmente flexíveis nas proteases do subtipo F, originando uma enzima intrinsicamente menos ativa e resistente à alguns inibidores. Nas proteases Fwt e Fmut, a substituição polimorfica M36I causa um deslocamento do loop entre os resíduos 35-41, que levaria à perda de flexibilidade dos fiaps e do loop 76-83 no sítio ativo. Nossas comparações indicaram também que a substituição L89M nos subtipos não B pode ser equivalente à mutação de resistência L90M em subtipos B. Por fim, esses dados estruturais nos permitiram sugerir modificações na estrutura do inibidor TL-3 que poderiam levar à um aumento da sua potência. Nesta tese também apresentamos os dados de resolução e análise estruturais da L-asparaginase de Escherichia coli, resolvida à uma resolução de 1.95 A no grupo espacial C2. Baseados em dados estruturais e cinéticos propusemos um mecanísmo de reação geral para as amidohidrolases, que incluem as L-asparaginases, através da formação de duas tríades catalíticas Thr-Tyr-Glu e Thr-Lys-Asp, envolvendo as duas treoninas no sítio ativo. Nossas análises do volume da cavidade catalítica de três amidohidrolases também indicam que o aumento da atividade L-glutaminase em algumas enzimas é diretamente proporcional ao aumento do volume dessa cavidade. / One of the major problems faced in antiviral therapy against AIDS is the emergence of viral variants that exhibit drug resistance, as well as viral subtypes naturally more liable to development of therapeutic failure. In this work we solved the crystal structure of four HIV-1 proteases complexed with the universal C2 symmetry-based inhibitor TL-3. These proteases where obtained from patients with AIDS: one of the subtype B wild type (Bwt), one of the subtype F wild type (Fwt), and a mutant of each subtype (Bmut and Fmut), these last two out of patients showing therapeutic failure. The proteins were produced by Escherichia coli bacteria heterologous expression, purified out of the inclusion bodies, and refolded. The collected diffraction data were processed to 2.1 A resolution for the Bwt:TL-3 complex, 1.75 A for Bmut:TL-3, 2.1 A for Fwt:TL-3 and 2.8 A for Fmut:TL-3. These data were initially processed in the P6122 space group and latter reprocessed in P6i. The four structures were solved by molecular replacement using a published HIV-1 protease structure as a model. The structural analysis shown that the TL-3 inhibitor binds in a similar fashion in the active site of all four structures. On the proteases Bmut and Fmut the mutation V82A causes a repacking of the SI\' pocket which rerranges the inhibitor\'s side chain at P1\' subsite. Our analysis further indicate that some polymorphic substitutions between subtypes B and F could lead to a stabilization of naturally flexible regions on subtype F proteases, creating a intrinsically less active resistant enzyme. On the proteases Fwt and Fmut the polymorphic substitution M36I leads to the displacement of the loop between residues 35-41, which would cause a flexibility loss of the flaps and of the loop 76-83 in the active site. Our comparisons further indicate that the polymorphic substitution L89M on non-B subtypes could be equivalent to the L90M resistance mutation on subtype B proteases. Lastly, based on these structural data we were able to suggest a few structural modifications on the TL-3 inhibitor that could furnish a more potent inhibitor. On this thesis we also present the data of structural solution and analysis of the Escherichia coli L-asparaginase solved at 1.95 A resolution in C2 space group. Based on structural and kinetical data we proposed a general reaction mechanism for amidohidrolases, which include L-asparaginases, involving the formation of two catalytic triads Thr-Tyr-Glu and Thr-Lys-Asp, which acounts for the two threonines in the active site. Our cavity volume analysis of three amidohidrolases also indicate that the increasing in the L-glutaminase activity in some enzimes is directly proportional to the increase in the cavity volume.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437677.pdf: 769775 bytes, checksum: c4cb9d9a52d21b8a9826564fdceb6ea8 (MD5) Previous issue date: 2012-01-13 / Biopharmaceutical drugs are mainly recombinant proteins produced by biotechnological tools. Currently on the market L-asparaginase preparations, derived either from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi, have been used as a therapeutic agent on the effective treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. The interest in Erwinia carotovora L-asparaginase type II stems from its significantly lower glutaminase- and similar asparaginase-activity compared to current therapeutic preparations, this is particularly important since the glutaminase-activity has been implicated in causing serious side effects. The aim of this work is to apply a combination of technologies to develop a productive and simplified process for production of homogeneous and active recombinant L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII) in E. coli as host cells. The shake flasks and bioreactor conditions for productive rErAII expression are described, as well as a one-step ion-exchange liquid chromatography purification protocol followed by enzyme kinetics and thermodynamics through isothermal titration calorimetry (ITC). By using a robust fed-batch technique with pre-determined exponential feeding rates the bioreactor culture system yielded 30.7 gram of dry cell weight and 0.9 gram of recombinant rErAII protein in soluble form per liter of culture broth. This was achieved in cultures maintained at 30 ?C, in Terrific Broth medium under isopropil ?-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) induction and using E. coli C43 (DE3) as a host cell. The established one-step purification protocol yielded more than 5 mg of homogeneous rErAII per gram of dry cell weight, corresponding to 168 mg of rErAII protein per culture liter. The work shows that it is possible to produce an active homogeneous rErAII enzyme in the soluble cell fraction through IPTG-induced E. coli fed-batch cultivation. The rErAII proved to be a promising alternative therapy in the treatment of ALL, due to its lower glutaminase activity. When compared to well-established spectrophotometric assays, the straightforward calorimetric techniques for enzyme kinetics determination are accurate and precise either for purified enzymes or crude extracts. These data will contribute to biopharmaceutical companies interested in developing biosimilars, to healthcare policies, and quality control improvement. / Biof?rmacos s?o, na sua maioria, prote?nas recombinantes produzidas por ferramentas biotecnol?gicas. Prepara??es de L-asparaginase que atualmente est?o no mercado, derivadas de Escherichia coli ou Eravinia chrysanthemi, t?m sido utilizadas como agentes terap?uticos no tratamento efetivo de leucemia linfobl?stica aguda (ALI-) por mais de 40 anos. O interesse em L-asparaginase tipo 11 de Ertivinicr carotovora decorre da sua atividade de glutaminase reduzida e sua atividade de asparaginase similar quando comparada a prepara??es terap?uticas atualmente em uso. Isso ? particularmente importante uma vez que a atividade de glutaminase foi relacionada a s?rios efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho ? aplicar uma combina??o de tecnologias para desenvolver um processo simplificado e produtivo para a produ??o de L-asparaginase II recombinante homog?nea e ativa de Envinia carolovora (rErAll) em c?lulas hospedeiras de E. coli. Neste trabalho s?o descritas as condi??es para a express?o produtiva de rErAll em agitador orbital e em biorreator, assim como um protocolo de purifica??o em uma ?nica etapa, por cromatografia l?quida de troca f?nica, seguida pela determina??o dos par?metros cin?ticos e termodin?micos da enzima atrav?s de calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). Usando uma t?cnica robusta de batelada alimentada, com vaz?o em perfil exponencial pr?-determinado, o sistema de cultivo em biorreator rendeu 30,7 gramas de c?lulas secas e 0,9 gramas de prote?na rErAll na fra??o sol?vel por litro de meio de cultivo. Os resultados foram atingidos em cultivos mantidos a 30?C, em meio de cultura Terrific Broth sob indu??o de isopropil 0-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e utilizando E. coli C43 (DE3) como c?lula hospedeira. O protocolo de purifica??o de uma ?nica etapa rendeu aproximadamente 5 mg de rErAll homog?nea por grama de c?lula seca, correspondendo a 168 mg de prote?na rErAll por litro de meio de cultura. O trabalho demonstra que ? poss?vel produzir na fra??o celular sol?vel a enzima rErAII ativa e homog?nea, por meio de cultivos de E. coli em batelada alimentada sob a indu??o de IPTG. A rErAll mostrou ser uma terapia alternativa promissora para o tratamento de ALL devido a sua atividade de glutaminase reduzida. Quando comparada a ensaios espectrofotorn?tricos bem estabelecidos, as t?cnicas calorim?tricas diretas para determina??o de cin?tica enzim?tica s?o exatas e precisas, tanto para enzimas purificadas quanto para extratos brutos. Esses dados poder?o contribuir para ind?strias farmac?uticas interessadas em desenvolver biosimilares. para pol?ticas de sa?de e para o melhoramento do controle de qualidade de enzimas terap?uticas.

<p>Bacterial L-asparaginases (E.C.3.5.1.1) are enzymes that catalyze the hydrolysis of L-asparagine to aspartic acid. For the past 30 years these enzymes have been used as therapeutic agents in the treatment of acute childhood lymphoblastic leukemia. The presence of a low rate glutaminase activity however causes serious side-effects to patients in treatment, as glutamine depletion give rise to neurotoxicity, anaphylaxis, and other hypersensitivity reactions. The interest in the enzyme from Erwinia carotovora originates from the fact that it shows a decreased glutaminase activity, and therefore the enzyme is expected to exhibit fewer side effects when used in therapy.</p><p>The main focus of this thesis is the crystal structure determination of L-asparaginase from Erwinia carotovora in the presence of aspartic acid at 2.5 Å resolution. The structure was refined to an R/Rfree factor of 19.9/28.6 with good stereochemistry.</p><p>L-Asparaginases are homotetrameric enzymes with a known 222 symmetry and an identical fold. The Erwinia carotovora asparaginase consists of eight monomers of 330 amino acid residues each. In this case the enzyme is active as a dimer of tetramers. The two tetramers have an inner twofold non-crystallographic symmetry. Each monomer forms two identifiable domains a large N-domain and a small C-domain. The active sites are found at a topological switch-point between those domains.</p>

Dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), l'activation anormale de nombreuses voies de signalisation intracellulaires favorise la croissance et la survie des cellules tumorales. L'amélioration des connaissances biologiques de ces pathologies hétérogènes, dont le pronostic est réservé, devrait permettre le développement de thérapies ciblées. La kinase oncogénique mTOR est présente au sein de deux complexes, parmi lesquels mTORC1, activé constitutivement dans la majorité des blastes primaires de patients porteurs de LAM, qui contrôle la synthèse protéique, et mTORC2 activé constitutivement dans 50% des LAM. Les inhibiteurs allostériques de mTORC1 (la rapamycine et ses dérivés) n'inhibent pas la phosphorylation du répresseur traductionnel 4E-BP1, ne diminuent pas la traduction et induisent peu d'apoptose in vitro dans les LAM. Utilisés en monothérapie, leur effet est décevant. De plus ces inhibiteurs n'agissent pas sur le complexe mTORC2. J'ai étudié l'effet d'un inhibiteur catalytique de mTOR, l'AZD8055, actif sur les deux complexes. In vitro, l'AZD8055 inhibe efficacement la signalisation en aval de mTORC1 et de mTORC2, dont les sites de phosphorylation de 4E-BP1 résistants à la rapamycine, ainsi que la synthèse protéique. Il diminue la prolifération, bloque le cycle cellulaire en phase G0G1 et induit une apoptose caspase-dépendante dans les blastes primaires de LAM. Il diminue également la clonogénicité des progéniteurs leucémiques, sans affecter celle des cellules CD34+ normales. Dans un modèle murin de xéno-transplantation, l'AZD8055 inhibe la croissance tumorale et améliore la survie des souris traitées. Je me suis également intéressée à la régulation de l'activité de mTORC1 par les acides aminés. Dans les cellules de mammifères, l'activation de mTORC1 nécessite la présence de glutamine et de leucine qui agissent en coopération via deux transporteurs membranaires, SLC1A5 et SLC7A5/SLC3A2. J'ai montré que la privation en glutamine, obtenue par l'activité glutaminase de la drogue L-asparaginase ou par l'utilisation de milieux de culture spécifiques dépourvus sélectivement en acides aminés, inhibe l'activation de mTORC1 et induit de l'apoptose dans diverses lignées leucémiques et dans les blastes primaires de LAM. La L-asparaginase inhibe la synthèse protéique et ses effets fonctionnels sont liés à son activité glutaminase. J'ai pu également constater une augmentation de l'expression protéique de la glutamine synthase induite par la Lasparaginase, dont l'inhibition majore l'apoptose induite par la L-asparaginase dans certaines lignées leucémiques. J'ai également étudié l'effet de l'inhibition spécifique par un shARN inductible du transporteur SLC1A5, qui permet l'import de glutamine. L'inhibition de SLC1A5 bloque la réactivation de mTORC1 par l'association leucine/glutamine après privation et induit de l'apoptose dans la lignée leucémique MOLM14. Cette inhibition diminue la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe

Bacterial L-asparaginases (E.C.3.5.1.1) are enzymes that catalyze the hydrolysis of L-asparagine to aspartic acid. For the past 30 years these enzymes have been used as therapeutic agents in the treatment of acute childhood lymphoblastic leukemia. The presence of a low rate glutaminase activity however causes serious side-effects to patients in treatment, as glutamine depletion give rise to neurotoxicity, anaphylaxis, and other hypersensitivity reactions. The interest in the enzyme from Erwinia carotovora originates from the fact that it shows a decreased glutaminase activity, and therefore the enzyme is expected to exhibit fewer side effects when used in therapy. The main focus of this thesis is the crystal structure determination of L-asparaginase from Erwinia carotovora in the presence of aspartic acid at 2.5 Å resolution. The structure was refined to an R/Rfree factor of 19.9/28.6 with good stereochemistry. L-Asparaginases are homotetrameric enzymes with a known 222 symmetry and an identical fold. The Erwinia carotovora asparaginase consists of eight monomers of 330 amino acid residues each. In this case the enzyme is active as a dimer of tetramers. The two tetramers have an inner twofold non-crystallographic symmetry. Each monomer forms two identifiable domains a large N-domain and a small C-domain. The active sites are found at a topological switch-point between those domains.

Um dos maiores problemas encontrados em terapias anti-retrovirais contra AIDS é a emergência de variantes virais que exibem resistência aos fármacos disponíveis e subtiposvirais naturalmente mais suscetíveis ao desenvolvimento de falha terapêutica. Neste trabalho nós resolvemos as estruturas cristalográficas de quatro proteases de HIV-1 complexadas com o inibidor universal C2 simétrico TL-3. As proteases utilizadas foram extraídas de pacientes com AIDS, uma do subtipo B selvagem (Bwt), uma do subtipo F selvagem (Fwt), e um mutante de cada um dos subtipos (Bmut e Fmut), esses dois últimos de pacientes apresentando falha terapêutica. As proteínas foram produzidas por expressão heteróloga em bactérias Escherichia coli, purificadas à partir das proteínas dos corpos de inclusão, e reenoveladas. Os dados coletados foram processados à uma resolução de 2.1 A para o complexo Bwt:TL-3, 1.75 A para Bmut:TL-3, 2.1 A para Fwt:TL-3 e 2.8 A para Fmut:TL-3. Esses dados foram inicialmente processados em P6122 e, posteriormente, reprocessados em P6i. As estruturas foram resolvidas por substituição molecular utilizando a estrutura de uma protease de HIV-1 publicada como modelo. A análise dessas quatro estruturas mostrou que o inibidor TL-3 liga-se de maneira muito próxima em todas elas. Nas proteases Bmut e Fmut a mutação V82A causa um reempacotamento do bolsão SI\', que se reflete num rearranjo da cadeia lateral do inibidor em Pl\'. Nossas análises indicaram, ainda, que algumas substituições polimórficas entre os subtipos B e F podem levar à maior estabilização de regiões naturalmente flexíveis nas proteases do subtipo F, originando uma enzima intrinsicamente menos ativa e resistente à alguns inibidores. Nas proteases Fwt e Fmut, a substituição polimorfica M36I causa um deslocamento do loop entre os resíduos 35-41, que levaria à perda de flexibilidade dos fiaps e do loop 76-83 no sítio ativo. Nossas comparações indicaram também que a substituição L89M nos subtipos não B pode ser equivalente à mutação de resistência L90M em subtipos B. Por fim, esses dados estruturais nos permitiram sugerir modificações na estrutura do inibidor TL-3 que poderiam levar à um aumento da sua potência. Nesta tese também apresentamos os dados de resolução e análise estruturais da L-asparaginase de Escherichia coli, resolvida à uma resolução de 1.95 A no grupo espacial C2. Baseados em dados estruturais e cinéticos propusemos um mecanísmo de reação geral para as amidohidrolases, que incluem as L-asparaginases, através da formação de duas tríades catalíticas Thr-Tyr-Glu e Thr-Lys-Asp, envolvendo as duas treoninas no sítio ativo. Nossas análises do volume da cavidade catalítica de três amidohidrolases também indicam que o aumento da atividade L-glutaminase em algumas enzimas é diretamente proporcional ao aumento do volume dessa cavidade. / One of the major problems faced in antiviral therapy against AIDS is the emergence of viral variants that exhibit drug resistance, as well as viral subtypes naturally more liable to development of therapeutic failure. In this work we solved the crystal structure of four HIV-1 proteases complexed with the universal C2 symmetry-based inhibitor TL-3. These proteases where obtained from patients with AIDS: one of the subtype B wild type (Bwt), one of the subtype F wild type (Fwt), and a mutant of each subtype (Bmut and Fmut), these last two out of patients showing therapeutic failure. The proteins were produced by Escherichia coli bacteria heterologous expression, purified out of the inclusion bodies, and refolded. The collected diffraction data were processed to 2.1 A resolution for the Bwt:TL-3 complex, 1.75 A for Bmut:TL-3, 2.1 A for Fwt:TL-3 and 2.8 A for Fmut:TL-3. These data were initially processed in the P6122 space group and latter reprocessed in P6i. The four structures were solved by molecular replacement using a published HIV-1 protease structure as a model. The structural analysis shown that the TL-3 inhibitor binds in a similar fashion in the active site of all four structures. On the proteases Bmut and Fmut the mutation V82A causes a repacking of the SI\' pocket which rerranges the inhibitor\'s side chain at P1\' subsite. Our analysis further indicate that some polymorphic substitutions between subtypes B and F could lead to a stabilization of naturally flexible regions on subtype F proteases, creating a intrinsically less active resistant enzyme. On the proteases Fwt and Fmut the polymorphic substitution M36I leads to the displacement of the loop between residues 35-41, which would cause a flexibility loss of the flaps and of the loop 76-83 in the active site. Our comparisons further indicate that the polymorphic substitution L89M on non-B subtypes could be equivalent to the L90M resistance mutation on subtype B proteases. Lastly, based on these structural data we were able to suggest a few structural modifications on the TL-3 inhibitor that could furnish a more potent inhibitor. On this thesis we also present the data of structural solution and analysis of the Escherichia coli L-asparaginase solved at 1.95 A resolution in C2 space group. Based on structural and kinetical data we proposed a general reaction mechanism for amidohidrolases, which include L-asparaginases, involving the formation of two catalytic triads Thr-Tyr-Glu and Thr-Lys-Asp, which acounts for the two threonines in the active site. Our cavity volume analysis of three amidohidrolases also indicate that the increasing in the L-glutaminase activity in some enzimes is directly proportional to the increase in the cavity volume.