Made available in DSpace on 2016-01-26T18:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Renato.pdf: 278461 bytes, checksum: cfd21e9648f079dd782efb08a25ac054 (MD5) Previous issue date: 2008-10-14 / The objectives of this study was to select bacterial isolates of the genus Bacillus in samples of soil form the west region of Sao Paulo state, Brazil, and assess their effect when inoculated in two corns grown in the soil conditions (natural and sterilized soil), utilizing nutritional parameters and of growth of plan in 14 isolates. The bacterial isolates were characterized at Bacillus genus and then selected as fungus antagonists and as producers of plant hormone (auxin) in the laboratory. Besides they were also characterized as the potential for insoluble phosphate solubilization. The maize plants were grown in pots of 5 Kg of soil in a greenhouse environment for 50 days. The assessments made during the conduct of the trial were: height of plants to 29 and 50 days after planting; number of leaves and dry biomass produced deployed to 50 days after planting. None of the isolated not showed phosphate solubilization in vitro. The cultivation of maize in sterile soil provided the greatest number of plant leaves deployed in the 50 days of age. Most of the evaluated isolated bacteria provided some benefit for the growth of maize, since the isolated NGR-1 showed the best performance for the three variables during the maize growth. Six single bacterial (BRG-2, CAS-2, NGR-1, PNP-2, PRP-2, and TAC-2) highlighted themselves as promoters of growth of maize evaluated by the production of biomass for the plant to the 50 days of age in natural soil. The promotion of the maze growth offered by the bacteria may be due to several factors, however the parameters of selection used for the individual can be considered satisfactory.The production of AIA by the bacteria wasn t a parameter for the best performance of bacterial isolates for inoculation of maize.Inoculated plants had a greater increase in the accumulation of nutrients in the aerial part. / Rizobactérias; Auxinas; Fenologia; Nutrição vegetal O objetivo do trabalho foi selecionar isolados bacterianos do gênero Bacillus em amostras de solo da região oeste paulista e avaliar sua inoculação em milho cultivado em duas condições de solo (natural e esterilizado), utilizando-se parâmetros nutricionais e de crescimento da planta em 14 isolados. Os isolados bacterianos, caracterizados como pertencentes ao gênero Bacillus, foram selecionados previamente quanto ao antagonismo a fungos fitopatogênicos e produção de hormônio vegetal (auxinas) em laboratório. Além disto, foram também caracterizados quanto ao potencial de solubilização de fosfatos insolúveis em meio de cultivo. As plantas de milho foram cultivadas em vasos com 5kg de solo em ambiente de casa de vegetação durante 50 dias. As avaliações efetuadas durante a condução do experimento foram: altura de plantas aos 29 e 50 dias após o plantio; número de folhas desdobradas e biomassa seca produzida aos 50 dias após o plantio. Nenhum dos isolados de Bacillus spp. avaliados conseguiu solubilizar fosfatos insolúveis em condições de laboratório.O cultivo do milho em solo estéril proporcionou maior número de folhas desdobradas na planta aos 50 dias de idade. A maioria dos isolados bacterianos avaliados proporcionou benefícios ao crescimento do milho, sendo que o isolado NGR-1 teve o melhor desempenho na maioria das variáveis avaliadas durante o crescimento do milho. Seis isolados de Bacillus spp. (BRG-2, CAS-2, NGR-1, PNP-2, PRP-2 e TAC-2) destacaram-se como promotores de crescimento do milho na avaliação de produção de biomassa, pela planta, aos 50 dias de idade em solo natural. A promoção de crescimento do milho proporcionada pelas bactérias pode ser devido a vários fatores, contudo os parâmetros de seleção utilizados para os isolados podem ser considerados satisfatórios. A maior produção de auxinas pelas bactérias, detectadas em laboratório, não foi um parâmetro fundamental para influenciar o desempenho dos melhores isolados bacterianos avaliados no crescimento do milho em casa de vegetação. O milho, quando inoculado, com a maioria dos isolados bacterianos, apresentou maior acúmulo de nutrientes na parte aérea.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Renato.pdf: 278461 bytes, checksum: cfd21e9648f079dd782efb08a25ac054 (MD5) Previous issue date: 2008-10-14 / The objectives of this study was to select bacterial isolates of the genus Bacillus in samples of soil form the west region of Sao Paulo state, Brazil, and assess their effect when inoculated in two corns grown in the soil conditions (natural and sterilized soil), utilizing nutritional parameters and of growth of plan in 14 isolates. The bacterial isolates were characterized at Bacillus genus and then selected as fungus antagonists and as producers of plant hormone (auxin) in the laboratory. Besides they were also characterized as the potential for insoluble phosphate solubilization. The maize plants were grown in pots of 5 Kg of soil in a greenhouse environment for 50 days. The assessments made during the conduct of the trial were: height of plants to 29 and 50 days after planting; number of leaves and dry biomass produced deployed to 50 days after planting. None of the isolated not showed phosphate solubilization in vitro. The cultivation of maize in sterile soil provided the greatest number of plant leaves deployed in the 50 days of age. Most of the evaluated isolated bacteria provided some benefit for the growth of maize, since the isolated NGR-1 showed the best performance for the three variables during the maize growth. Six single bacterial (BRG-2, CAS-2, NGR-1, PNP-2, PRP-2, and TAC-2) highlighted themselves as promoters of growth of maize evaluated by the production of biomass for the plant to the 50 days of age in natural soil. The promotion of the maze growth offered by the bacteria may be due to several factors, however the parameters of selection used for the individual can be considered satisfactory.The production of AIA by the bacteria wasn t a parameter for the best performance of bacterial isolates for inoculation of maize.Inoculated plants had a greater increase in the accumulation of nutrients in the aerial part. / Rizobactérias; Auxinas; Fenologia; Nutrição vegetal O objetivo do trabalho foi selecionar isolados bacterianos do gênero Bacillus em amostras de solo da região oeste paulista e avaliar sua inoculação em milho cultivado em duas condições de solo (natural e esterilizado), utilizando-se parâmetros nutricionais e de crescimento da planta em 14 isolados. Os isolados bacterianos, caracterizados como pertencentes ao gênero Bacillus, foram selecionados previamente quanto ao antagonismo a fungos fitopatogênicos e produção de hormônio vegetal (auxinas) em laboratório. Além disto, foram também caracterizados quanto ao potencial de solubilização de fosfatos insolúveis em meio de cultivo. As plantas de milho foram cultivadas em vasos com 5kg de solo em ambiente de casa de vegetação durante 50 dias. As avaliações efetuadas durante a condução do experimento foram: altura de plantas aos 29 e 50 dias após o plantio; número de folhas desdobradas e biomassa seca produzida aos 50 dias após o plantio. Nenhum dos isolados de Bacillus spp. avaliados conseguiu solubilizar fosfatos insolúveis em condições de laboratório.O cultivo do milho em solo estéril proporcionou maior número de folhas desdobradas na planta aos 50 dias de idade. A maioria dos isolados bacterianos avaliados proporcionou benefícios ao crescimento do milho, sendo que o isolado NGR-1 teve o melhor desempenho na maioria das variáveis avaliadas durante o crescimento do milho. Seis isolados de Bacillus spp. (BRG-2, CAS-2, NGR-1, PNP-2, PRP-2 e TAC-2) destacaram-se como promotores de crescimento do milho na avaliação de produção de biomassa, pela planta, aos 50 dias de idade em solo natural. A promoção de crescimento do milho proporcionada pelas bactérias pode ser devido a vários fatores, contudo os parâmetros de seleção utilizados para os isolados podem ser considerados satisfatórios. A maior produção de auxinas pelas bactérias, detectadas em laboratório, não foi um parâmetro fundamental para influenciar o desempenho dos melhores isolados bacterianos avaliados no crescimento do milho em casa de vegetação. O milho, quando inoculado, com a maioria dos isolados bacterianos, apresentou maior acúmulo de nutrientes na parte aérea.

La tasa de cuajado es un factor determinante en la producción de un cultivar. Este proceso, regulado en gran medida por señales hormonales, representa la primera etapa del desarrollo de un fruto y depende del éxito de la polinización y de la fecundación. A pesar de su importancia agronómica, los mecanismos moleculares que regulan el proceso del cuajado del fruto son aún desconocidos. La identificación y caracterización de mutantes afectados en la tasa de cuajado es una de las mejores estrategias para lograr este propósito. En este trabajo de investigación hemos abordado la caracterización de tres mutantes insercionales de tomate afectados en la tasa de cuajado de fruto. Dos de estos mutantes, Lower fruit setting 2084 y 2448 (Lfs2084 y Lfs2448), identificados en el contexto de esta Tesis Doctoral, exhiben menor tasa de cuajado de fruto y presentan un patrón de herencia autosómica dominante. La caracterización de ambas mutaciones ha permitido descubrir que están asociadas a un fenómeno de letalidad del gameto masculino. La mutación Lfs2084 promueve la degeneración de los granos de polen que portan el inserto, pero también afecta al desarrollo reproductivo del ovario, lo que reduce de forma dramática la tasa de cuajado de fruto. El análisis del contenido endógeno de hormonas de este mutante parece indicar una alteración de la ruta del 2C-metil-Deritrol 4-fosfato (MEP), responsable de la síntesis de fitohormonas, pigmentos fotosintéticos y moléculas de defensa. Los menores contenidos de GA1 en Lfs2084, la giberelina activa más importante en el inicio del desarrollo del fruto de tomate, podrían estar asociados con una mayor actividad del enzima catabólico SlGA2ox2. Estos resultados, junto con los cambios en los perfiles de expresión de SlARF7 y TAG1, son coherentes con el fenotipo de menor tasa de cuajado observado en el mutante. La mutación Lfs2448 también promueve la degeneración de los granos de polen portadores del inserto, reduciendo en gran medida la cantidad de tubos polínicos que progresan a lo largo del estilo durante el proceso de polinización. Su caracterización molecular ha indicado que el fenotipo de Lfs2448 podría estar ocasionado por la alteración de la función de uno o dos genes que codifican proteínas CYP450 y que se expresan mayoritariamente en botones florales y frutos de 1 cm. Los resultados sugieren que la mutación desempeña un relevante papel en el desarrollo reproductivo de tomate, afectando al proceso de polinización y al cuajado de fruto. Además, la caracterización del mutante Arlequín (Alq) ha revelado alteraciones en su programa de desarrollo vegetativo y reproductivo. Respecto al desarrollo vegetativo, Alq promueve un patrón de crecimiento más vigoroso que el que exhiben las líneas hermanas que carecen de la mutación, así como cambios en la configuración espacial del desarrollo radicular. Con relación al desarrollo reproductivo, Alq conduce a un mayor cuajado de fruto como consecuencia de eventos de división celular en el pericarpio del ovario previos al proceso de polinización. Un aspecto esencial desde un punto de vista agronómico es que la mayor tasa de cuajado permite que Alq mantenga la producción de fruto en condiciones de moderada salinidad. / Fruit setting rate is one of the most determining factors in the yield of a cultivar. This process, largely regulated by hormonal signals, is the first stage of fruit development and depends on the successful completion of pollination and fertilization. Despite their agronomic importance, the molecular mechanisms regulating the fruit setting process are still unknown. The identification and characterization of mutations affecting fruit set rate is one of the best strategies to achieve this purpose. In this research work the characterization of three tomato insertional mutants altered in the fruit set rate has been addressed. Two of these mutants, Lower fruit setting 2084 y 2448 (Lfs2084 and Lfs2448), identified in the context of this Doctoral Thesis, exhibit decreased fruit set rate and present an autosomal dominant inheritance pattern. The characterization of both mutations allowed us to discover that they are associated with a phenomenon of lethality of the male gametes carrying the T-DNA insert. The Lfs2084 mutation not only promotes degeneration of pollen grains bearing the T-DNA, but also affects the reproductive development of the ovary, dramatically reducing the fruit set rate. Analysis of the endogenous hormone content of this mutant suggests an alteration of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway, responsible for the synthesis of phytohormones, photosynthetic pigments and plant defence molecules. The lower GA1 content in Lfs2084 mutant, the main active form to induce fruit development, may be associated with increased activity of the SlGA2ox2 catabolic enzyme. These results, together with the changes in the expression profiles of both SlARF7 and TAG1 genes, are consistent with the phenotype of lower fruit set rate. The Lfs2448 mutation also promotes degeneration of the pollen grains carrying the T-DNA, largely reducing the number of pollen tubes that progress along the style during the pollination process. Its molecular characterization indicated that the Lfs2448 mutant phenotype could be caused by the functional alteration of one or two genes that encode CYP450 proteins mostly expressed in floral buds and young fruits. Results suggest that the tagged gene plays an important role in tomato reproductive development, affecting both normal pollination and fruit set process. Furthermore, the characterization of the Arlequín (Alq) mutant revealed alterations in its vegetative and reproductive developmental program. As regards vegetative development, Alq mutation promotes a more vigorous growth pattern, as well as changes in the spatial configuration of root system. Regarding reproductive development, Alq mutation leads to increased fruit set as a consequence of cell division events in the ovary pericarp prior to the pollination process. Finally, it should be noted that, thanks to its higher fruit set rate, the Arlequin mutant is capable of maintaining fruit production in moderate salinity conditions, which is of great importance from an agronomic point of view. / La taxa de quallat és un factor determinant en la producció d`un cultivar. Aquest procés, regulat en gran mesura per senyals hormonals, representa la primera etapa del desenvolupament d¿un fruit i depén de l¿èxit de la pol·linització i de la fecundació. A pesar de la seua importància agronòmica, els mecanismes moleculars que regulen el procés de quallat són encara desconeguts. La identificació i caracterització de mutants afectats en la taxa de quallat és una de les millors estratègies per aconseguir aquest propòsit. En aquest treball d¿investigació hem abordat la caracterització de tres mutants insercionals de tomaca afectats en la taxa de quallat de fruit. Dos d¿aquests mutants, Lower fruit setting 2084 i 2448 (Lfs2084 i Lfs2448), identificats en el context d¿aquesta Tesi Doctoral, exhibixen una menor taxa de quallat de fruit i presenten un patró d¿herència autosòmica dominant. La caracterització d¿ambdós mutacions ha permés descobrir que es troben associades a un fenomen de letalitat del gàmeta masculí. La mutació Lfs2084 promou la degeneració dels grans de pol·len que porten l¿insert, però també afecta el desenvolupament reproductiu de l¿ovari, la qual cosa reduïx de forma dramàtica la taxa de quallat de fruit. L¿anàl·lisi del contingut endogen d¿hormones d¿aquest mutant pareix indicar una alteració de la ruta 2C-metil-Deritrol 4-fosfato (MEP), responsable de la síntesi de fitohormones, pigments fotosintètics i molècules de defensa. Els menors continguts de GA1 en Lfs2084, la gibberel·lina activa més important a l'inici del desenvolupament del fruit de tomaca, podrien estar associats amb una major activitat de l¿enzim catabòlic SlGA2ox2. Aquests resultats, juntament amb els canvis en els perfils d¿expressió de SlARF7 i TAG1, són coherents amb el fenotip de menor taxa de quallat observat en el mutant. La mutació Lfs2448 també promou la degeneració dels grans de pol·len portadors de l¿insert, reduint en gran mesura la quantitat de tubs pol·línics que progressen al llarg de l¿estil durant el procés de pol·linització. La seua caracterització molecular ha indicat que el fenotip de Lfs2448 podria estar ocasionat per una alteració de la funció d¿un o dos gens que codifiquen proteïnes CYP450 i que s'expressen majoritàriament en botons florals i fruits d¿un centímetre. Els resultats suggerixen que la mutació té una funció important en el desenvolupament reproductiu de la tomaca, afectant el procés normal de pol·linització i el quallat de fruit. A més, la caracterització del mutant Arlequín (Alq) ha revelat alteracions en el seu programa de desenvolupament vegetatiu i reproductiu. Pel que fa al desenvolupament vegetatiu, Alq promou un patró d¿expressió més vigorós que el que exhibixen les línies germanes que no porten la mutació, així com canvis en la configuració espacial del desenvolupament radicular. Quant al desenvolupament reproductiu, Alq conduïx a un major quallat de fruit com a conseqüència d¿events de divisió cel·lulars en el pericarp de l¿ovari previs al procés de pol·linització. Un aspecte essencial des d¿un punt de vista agronòmic és que la major taxa de quallat pemet que Alq mantinga la producció de fruit en condicions de moderada salinitat. / Ribelles Alfonso, C. (2018). IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MUTANTES DE TOMATE RELACIONADOS CON EL CUAJADO DEPENDIENTE E INDEPENDIENTE DE POLINIZACIÓN [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111833

[EN] Abstract Fruit set is the transition from a quiescent ovary of the flower to a developing fruit after pollination. This process is associated with the content of gibberellin (GAs) and auxins in the ovary. Therefore the development of parthenocarpic fruit (seedless fruit) can be induced by applying both kinds of hormones. In tomato it has been described that auxin action during fruit set is mediated by GAs, by inducing different biosynthesis pathway genes, among them SlGA20ox, which codify important enzymes for GAs biosynthesis regulation. The SlGA20ox gene family is composed of 4 genes, and SlGA20ox1 seems to play a key role in fruit set. In order to deepen the understanding of this process, it has been investigated in the ovary of tomato: a) the site of expression of SlGA20ox1 and its regulation; b) the localization of IAA (auxin). For this, we have obtained transgenic lines of the tomato Micro-Tom (MT) cultivar and various hormonal mutants (procera, 35S::CsGA20ox1 Dwarf, entire and dgt) with the transgene pSlGA20ox1::GUS. Transgenic lines do not differ phenotypically from the original lines and they have been used to analyze the expression of SlGA20ox1, using the GUS gene as reporter. Localization of SlGA20ox1 transcripts was also investigated in situ. SlGA20ox1 expression in ovary after pollination was located mainly in the funiculus, placenta and embryo. Auxin and brassinosteroids (BR) increased the expression of SlGA20ox1. On the other hand, auxin location in the ovary was investigated using the transgenic line DR5::GUS (expressing the auxin-response gene DR5), and analyzing directly the IAA content by immunolocalization. In pollinated ovaries, GAs and auxin co-localize in the egg (embryo and embryo-sac) and placenta, supporting the hypothesis that both hormones interact during fruit set. Phenotypic analysis of the mutants used in this work showed that GAs inhibit the development of axillary buds, through the DELLA protein. This inhibitory effect is reversed, at least partially, by BR. Furthermore, the introduction of wild gen Dwarf in MT (normalizing its content of BR) increases plant height, but does not extend its vegetative cycle, nor increases parthenocarpy in MT. / [ES] Resumen La fructificación, paso del ovario en reposo a fruto en crecimiento tras la polinización, asociada al aumento de contenido de giberelinas (GAs) y auxinas en el ovario, es un proceso clave para la producción. Por ello se puede inducir también el desarrollo de frutos partenocárpicos (sin semillas) aplicando ambos tipos de hormonas. En tomate se ha descrito que parte de la acción de las auxinas en la fructificación está mediada por GAs, induciendo distintos genes de la ruta biosintética, entre ellos los que codifican SlGA20ox, enzimas importantes para la regulación de la síntesis de GAs. De los 4 genes que forman la familia, SlGA20ox1 parece ser clave en la fructificación. Con objeto de profundizar en el conocimiento de este proceso, se ha investigado en el ovario de tomate: a) la localización de la expresión de SlGA20ox1 y su regulación; b) la localización de IAA (auxina). Para ello, se han obtenido líneas trangénicas del cultivar Micro-Tom (MT) de tomate y diversos mutantes hormonales (procera, 35S::CsGA20ox1 Dwarf, dgt y entire) con el transgén pSlGA20ox1::GUS. Las líneas transgénicas no difieren fenotípicamente de las líneas originales y se utilizaron para analizar la expresión de SlGA20ox1 con el gen delator GUS. Se investigó además la localización de los transcritos de SlGA20ox1 in situ. La expresión de SlGA20ox1 en el ovario tras la polinización se localizó, principalmente, en el funículo, la placenta y el embrión. Tanto las auxinas como los brasinosteroides (BR) aumentaron la expresión de SlGA20ox1. Por otro lado se investigó la localización de auxinas en el ovario usando una línea transgénica DR5::GUS (que expresa el gen de respuesta a auxinas DR5), y analizando también directamente el contenido de IAA mediante inmunolocalización. En ovarios polinizados, la localización de las GAs y auxinas coincidió en el óvulo (embrión y saco embrionario) y la placenta, apoyando la hipótesis de que ambas hormonas interaccionan durante la fructificación. El análisis fenotípico de los mutantes utilizados mostró que las GAs inhiben el desarrollo de los brotes axilares por GAs, a través de la proteína DELLA. El efecto inhibidor es revertido, al menos parcialmente, por BR. Por otro lado, la introducción del gen silvestre Dwarf en MT (normalizando así su contenido en BR) aumenta la altura de la planta, pero no prolonga su ciclo vegetativo, ni aumenta la capacidad partenocárpica de MT. / [CA] Resum La fructificació, pas de l'ovari en repòs a fruit en creixement després de la pol·linització, associada a l'augment de contingut de giberelines (GAs) i auxines en l'ovari, és un procés clau per a la producció. Per això es pot induir també el desenvolupament de fruits partenocàrpics (sense llavors) aplicant tots dos tipus d'hormones. En el tomàquet s'ha descrit que part de l'acció de les auxines en la fructificació està intervinguda per GAs, induint diferents gens de la ruta biosintètica, entre ells els que codifiquen SlGA20ox, enzims importants per a la regulació de la síntesi de GAs. Dels 4 gens que formen la família, SlGA20ox1 sembla ser clau en la fructificació. A fi d'aprofundir en el coneixement d'aquest procés, s'ha investigat en l'ovari del tomàquet: a) la localització de l'expressió de SlGA20ox1 i la seva regulació; b) la localització de l'IAA (auxina). Per a això, s'han obtingut línies transgèniques de conrear Micro-Tom (MT) de tomàquet i diversos mutants hormonals (procera, 35S::CsGA20ox1 Dwarf, dgt i entire) amb el transgèn pSlGA20ox1::GUS. Les línies transgèniques no difereixen fenotípicamente de les línies originals i es van utilitzar per analitzar l'expressió de SlGA20ox1 amb el gen delator GUS. Es va investigar, a més, la localització dels transcrits de SlGA20ox1 in situ. L'expressió de SlGA20ox1 en l'ovari després de la pol·linització es va localitzar, principalment, en el funicle, la placenta i l'embrió. Tant les auxines com els brasinosteroides (BR) van augmentar l'expressió de SlGA20ox1. D'altra banda es va investigar la localització d'auxines en l'ovari usant una línia transgènica DR5::GUS (que expressa el gen de resposta a auxines DR5) i analitzant també directament el contingut de IAA mitjançant immunolocalització. En ovaris polinitzats, la localització de les GAs i auxines va coincidir en l'òvul (embrió i sac embrionari) i la placenta, refermant la hipòtesi que ambdues hormones interaccionen durant la fructificació. L'anàlisi fenotípic dels mutants utilitzats va mostrar que les GAs inhibeixen el desenvolupament dels brots axil·lars per GAs, a través de la proteïna DELLA. L'efecte inhibidor és revertit, almenys parcialment, per BR. D'altra banda, la introducció del gen silvestre Dwarf en MT (normalitzant així el seu contingut de BR) augmenta l'alçada de la planta, però no perllonga el seu cicle vegetatiu, ni augmenta la capacitat partenocàrpica d'MT. / Gallego García, M. (2016). Papel de la GA 20-oxidasa en la fructificación del tomate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61958

O relógio biológico de plantas é uma rede regulatória de grande relevância para a adaptação dos organismos ao ambiente. Essa rede é composta por diversas vias de controle transcricional e pós-transcricional que se retroalimentam e geram ritmos biológicos. O controle exercido pelo relógio pode ser observado nos mais diversos aspectos da fisiologia e desenvolvimento de plantas. No presente projeto de pesquisa foi investigada a relação entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas, uma classe de fitohormônios, em cana-de-açúcar. Foram utilizadas técnicas de expressão gênica, como RT-qPCR, para definição de um protocolo robusto de avaliação de respostas transcricionais a auxinas em plântulas de cana-de-açúcar geradas por organogênese direta. Após 1h da aplicação de 80 µM auxina sintética ácido 1-naftalenoacético, foi possível observar controle transcricional evidente exercido pela aplicação de auxina sobre alguns genes. Também foi observado variação na resposta obtida, dependendo do horário do ciclo circadiano em que o estímulo era oferecido. Esse fenômeno de controle temporal sobre a resposta a um estímulo é chamado gating, sendo de grande relevância para a atuação do relógio biológico de plantas. A partir dessas observações foram realizadas análises de expressão gênica em larga escala, usando oligoarranjos, para compreensão mais aprofundada da conexão entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas em cana-de-açúcar. Entre os genes diferencialmente expressos após estímulo com auxina, foi verificado grande presença de genes relacionados a respostas contraestresse biótico. Além disso, as respostas observadas devem estar sobre o controle do relógio biológico de cana-de-açúcar. Diversos genes relacionados a combate a infecções, como quitinases e taumatinas, tiveram sua expressão alterada após aplicação de auxinas, sendo possível observar diferenças no padrão de expressão dos genes dependendo do horário em que auxina era aplicada. Dessa forma, o relógio biológico de cana-de-açúcar, a partir da sinalização por auxinas, deve exercer controle sobre as respostas a estresses bióticos nesse organismo. Os dados obtidos são inéditos e podem contribuir para o aumento da produtividade de cana-de-açúcar assim como para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas focadas nesse cultivar, o qual apresenta grande relevância econômica / The circadian clock is a regulatory network with great relevance to fitness of plants. This network creates biological rhythms, influencing plants metabolism and their interaction with the environment. The clock is composed of interlocking feedback transcriptional and post-transcriptional pathways. In the presente study, we investigated the interconnection between circadian clock and signaling through auxins, a group of phytohormones with great impact to plant biology. Using RT-qPCR, it was established a protocol to measure transcriptional responses after synthetic auxin 1-naphtalenacetic acid (NAA) treatment. The biological material used was leaves of sugarcane plantlets generated by direct organogenesis. After 1h treatment with 80 µM NAA, we observed obvious transcriptional responses in sugarcane plantlets. It was also possible to detect alterations of transcriptional responses according to the moment when the stimulus was offered. This temporal control is called gating and is of great relevance to plant circadian clocks. We then performed transcriptomic analysis, using oligoarrays, to get a deeper understanding of the results obtained. Indeed, it was verified that auxin stimulus is connected to biotic stress transcriptional responses and that these responses are clock-controlled. Transcripts coding for proteins like chitinases and thaumatins, which are related to biotic stress responses, were differentially expressed after auxin treatment. Also, the response of most genes was daytime-dependent. We conclude that sugarcane circadian clock, through auxin signaling, might exert control under biotic stressresponses in sugarcane. The data obtained are novelty and may contribute to increase sugarcane productivity and/or to development of new biotechnological tools dedicated to this cultivar.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert is a native forest species with many possible uses, with great potential for commercial plantations. However, there is little information on the production of seedlings of this species, which, together with the inherent limitations of tree species, impedes the setting of breeding programs and, therefore, the establishment of stands of appropriate genetic quality. Studies related to the Peltophorum dubium propagation by tissue culture techniques can help in this regard. Therefore, this study aimed to evaluate methodologies for in vitro culture of Peltophorum dubium, with the specific purpose of increasing rates of multiplication of the species and reduce leaf senescence. Furthermore, we tried to establish an efficient methodology for the indirect organogenesis, which can be an alternative way to induce organs. On in vitro multiplication and leaf senescence were investigated different sources and concentrations of cytokinins 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin (KIN), isopentenyladenine (2iP), and thidiazuron (TDZ), combined one with each other, or isolated, and its association with α-naphthaleneacetic acid (NAA) and in the case of kinetin, 2iP and TDZ, also with BAP. In indirect organogenesis, we evaluated the effect of different concentrations of 2.4-D and various explants cultured in the presence or absence of light. It can be concluded that the use of cytokinin 2iP, in the evaluated concentrations in the presence of NAA or in association with NAA and BAP, has no effect on in vitro multiplication of the epicotyls containing cotyledonary node of Peltophorum dubium. Further, after 21 days of in vitro culture, under conditions of high temperature, occurs expressive leaf senescence. Cytokinins BAP, KIN, 2iP and TDZ, in evaluated concentrations, do not influence the in vitro multiplication of Peltophorum dubium. To maintain controlled leaf senescence when TDZ is used is dispensable using NAA, however, when the cytokinin 2iP is employed, the presence of NAA contributes to a reduction in the number of senescent leaves. Generally, from 21 days of in vitro culture the auxin and cytokinins used (NAA, 2iP and TDZ) start to have a significant effect on the occurrence of leaf senescence, which will depend on the combination of growth regulators. Can be also checked that the presence of TDZ, 2iP and NAA at the concentrations tested have no influence on survival, establishment and number of leaves formed in Peltophorum dubium during the initial in vitro culture of epicotyls containing cotyledonary node, have been observed high averages for these variables. Furthermore, the combination of NAA and TDZ has significant deleterious effect on in vitro survival of Peltophorum dubium explants during the first 30 days of subculture. This association also has significant deleterious effect on in vitro establishment and number of new shoots in shoot apical segments during first 30 days of subculture of Peltophorum dubium. The presence of 2iP and NAA at the concentrations tested doesn't have influence on survival, establishment, number of shoots and number of leaves formed in Peltophorum dubium during the first subculture of 30 days. The callogenesis is maximized in the presence of 20 μM of 2.4-D in cotyledon and hypocotyl segments. In the absence of 2.4-D hypocotyl are more efficient in callus formation. There is a high phenolic oxidation, but that, in general, does not impair the formation of callus, mainly in hypocotyls and cotyledon segments. There are 100% of root formation in cotyledon segments in the presence of light and nutritive medium supplemented with 40 μM of 2.4-D; in the absence of light and in the presence of 20 μM auxin rooting is also satisfactory. / Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert é uma espécie florestal nativa com muitas possibilidades de uso e com grande potencial para plantios comerciais. No entanto, há poucas informações sobre a produção de mudas desta espécie, o que, aliado às limitações inerentes às espécies arbóreas, dificulta a implantação de programas de melhoramento genético e, consequentemente, o estabelecimento de povoamentos de adequada qualidade genética. Estudos relacionados à propagação de Peltophorum dubium por técnicas da cultura de tecidos in vitro podem auxiliar nesse sentido. Considerado o exposto, o presente estudo objetivou avaliar o efeito de fontes, concentrações e combinações de fitorreguladores na multiplicação e senescência foliar in vitro de Peltophorum dubium. Adicionalmente, procurou-se estudar a resposta de diferentes explantes em relação à organogênese indireta, que pode ser uma maneira alternativa para a indução de órgãos. Na multiplicação in vitro e na senescência foliar in vitro foram avaliadas diferentes fontes e concentrações das citocininas 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (CIN), isopenteniladenina (2iP) e thidiazuron (TDZ), combinadas entre si, ou isoladas, bem como sua associação com ácido α-naftalenoacético (ANA) e, no caso de CIN, 2iP e TDZ, com BAP. Na organogênese indireta, avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de 2,4-D e diferentes explantes cultivados na presença ou ausência de luz. Pode-se concluir que o emprego da citocinina 2iP, nas concentrações testadas, na presença de ANA ou em conjunto com ANA e BAP, não exerce influência na multiplicação in vitro de epicótilos contendo o nó cotilenodar de Peltophorum dubium. Ainda, aos 21 dias de cultivo in vitro, em condições de temperatura elevada, ocorre expressiva senescência foliar. As citocininas BAP, CIN, TDZ e 2iP, nas concentrações testadas, não influenciam na multiplicação in vitro de Peltophorum dubium. Verificou-se que, quando se utiliza TDZ, é dispensável a utilização de ANA para que se mantenha controlada a senescência foliar, no entanto, quando é 2iP, a presença de ANA contribui para a redução no número de folhas senescentes. De maneira geral, a partir dos 21 dias de cultivo in vitro, a auxina e as citocininas utilizadas (ANA, 2iP e TDZ) passam a exercer efeito significativo na ocorrência de senescência foliar, a qual vai depender da combinação dos fitorreguladores. Pode-se verificar, também, que a presença de TDZ, ANA e 2iP, nas concentrações testadas, não exerce influência na sobrevivência, estabelecimento e número de folhas formadas em Peltophorum dubium durante o cultivo in vitro inicial de epicótilos contendo o nó cotiledonar, observando-se elevadas médias para estas variáveis. Ainda, a associação entre ANA e TDZ tem efeito prejudicial significativo na sobrevivência in vitro de explantes de Peltophorum dubium durante o primeiro subcultivo de 30 dias. Esta associação também tem efeito prejudicial significativo no estabelecimento in vitro e número de brotos formados em segmentos apicais caulinares de Peltophorum dubium durante o primeiro subcultivo de 30 dias. A presença de 2iP e ANA, nas concentrações testadas, não exerce influência na sobrevivência, estabelecimento, número de brotos e número de folhas formados em Peltophorum dubium durante o primeiro subcultivo de 30 dias. A calogênese é maximizada na presença de 20 μM de 2,4-D em segmentos cotiledonares e hipocótilos. Na ausência de 2,4-D os hipocótilos são mais eficientes na calogênese. Observam-se altas porcentagens de oxidação fenólica, mas de maneira geral, as oxidações não inviabilizam a formação de calos, principalmente em segmentos cotiledonares e hipocótilos. Ocorrem 100% de formação de raízes em segmentos cotiledonares, na presença de luz e em meio nutritivo suplementado com 40 μM de 2,4-D; na ausência de luz e presença de 20 μM da auxina, a rizogênese é também satisfatória.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1982474 bytes, checksum: 1612e19e8ad39e9083e77817292c4d1a (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / The auxins IAA (indole-3-acetic, natural), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) and 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid, the latter two synthetic) were sprayed on corn (Zea mays, monocot) and beans (Phaseolus vulgaris, dicot), in order to investigate some differential responses of the two plant groups as associated to ethylene metabolism. Corn plants treated with the auxins did not produce ethylene, not exhibiting also any senescence symptom. Beans plants, on the other hand, produced large amounts of ethylene following treatment with auxins. Aminoethoxyvinylglycine (AVG) plus Co2+ (ethylene biosynthesis inhibitors) were not able to relieve the epinasty, drying and leaf wrinkling effects in bean plants, but leaf yellowing was considerebly reduced, suggesting this was an ethylene effect. Following spraying with auxins, corn plants showed no production of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC), a response shown by beans plants. Therefore in the monocot, auxins seemed not to induce the expression of ACC synthase (ACS) or its activity. When treated with ACC, corn plants failed to produce any trace of ethylene, unlikely bean plants. This suggested that in monocot, auxins seemed also not to induce the expression or activity of ACC oxidase (ACO) or the enzyme is not activated. Potassium ferrocyanide, employed as a source of cyanide ions, was much more toxic to bean plants than to corn and so the monocot seemed to be more resistant than bean plants. Maximum quantum yield of photosystem II (Fv/Fm) and photosynthetic pigments contents kept unchanged in corn plants treated with the auxins. Bean plants showed significant decreases in both variables following spraying with 2,4-D and 2,4,5-T. Decreases in chlorophyll contents in bean plants treated with 2,4-D and 2,4,5-T correlated well with leaf chlorosis what was shown to be due to a more pronounced fall of chlorophyll contents rather than to an increase in carotenoid contents. The xanthophylls (neoxanthin, violaxanthin and anteraxantina) also showed a higher degradation than the alpha and beta carotenes in bean plants treated with 2,4-D and 2,4,5-T. When AVG and Co2+ were supplied together with auxin, no appreciable decrease in either the Fv/Fm ratio or pigment contents was observed, with the exception of alpha carotene. Also the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b was also larger in bean plants treated with 2,4-D and 2,4,5-T than in the plants treated with 2,4-D and 2,4,5-T plus AVG and Co2+. The ratio of chlorophyll a to chlorophyll b did not show any significance in bean plants upon treatment with IAA. / As auxinas AIA (ácido indol-3-acético, natural), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e 2,4,5-T (ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético, as duas últimas sintéticas) foram aplicadas em plantas de milho (Zea mays, monocotiledônea) e feijão (Phaseolus vulgaris, dicotiledônea), visando investigarem-se algumas respostas diferenciais dos dois grupos em relação ao metabolismo do etileno. Plantas de milho tratadas com as auxinas não produziram etileno e não exibiram quaisquer sintomas de senescência e epinastia. O feijão produziu bastante etileno após tratamento. Quando se utilizou aminoetoxivinilglicina (AVG) mais Co2+ (inibidores da biossíntese de etileno), a epinastia das plantas de feijão foi mantida mas o amarelecimento das plantas mostrou-se reduzido, deduzindo-se ser o amarelecimento um sintoma da ação do etileno. Após pulverização com as auxinas, o milho não exibiu produção do ácido 1-carboxílico-1- amino-ciclopropano (ACC), fato observado no feijão. Assim, na monocotiledônea, as auxinas parecem não induzir a expressão da sintase do ACC (ACS) ou, pelo menos, sua atividade. Quando tratadas com o ACC, as plantas de milho não produziram qualquer traço de etileno, ao contrário as plantas de feijão. Daí deduzir-se que na monocotiledônea, as auxinas parecem também não induzir a expressão ou atividade da oxidase do ACC (ACO) ou a enzima não é ativada. Empregando-se K4Fe(CN)6 como fonte de íons cianeto, as plantas de milho pareceram se mostrar mais resistentes à intoxicação do que as plantas de feijão. O rendimento quântico máximo de fotossistema II (razão Fv/Fm) e os níveis dos pigmentos fotossintéticos não sofreram alterações em plantas de milho tratadas com as auxinas. As plantas de feijão mostraram quedas significativas em ambas variáveis após pulverização com 2,4-D e 2,4,5-T, mas não com o AIA. A redução nos níveis das clorofilas em plantas de feijão tratadas com 2,4-D e 2,4,5-T relacionou-se com a clorose observada, desde que ocorreu uma degradação mais acentuada das clorofilas do que dos carotenoides. As xantofilas (neoxantina, anteraxantina e violaxantina) também sofreram uma degradação mais acentuada do que o alfa e beta caroteno em plantas de feijão tratadas com 2,4-D e 2,4,5-T. Quando AVG e Co2+ foram fornecidos conjuntamente com as auxinas, não ocorreu queda na razão Fv/Fm e nem no nível dos pigmentos, com exceção do alfa caroteno. A razão entre clorofila a e clorofila b também mostrou-se maior nas plantas de feijão tratadas com 2,4-D e 2,4,5-T do que nas plantas tratadas com 2,4-D e 2,4,5-T mais AVG e Co2+. Nas plantas tratadas com AIA o aumento na razão entre clorofila a e clorofila b não foi significativo.

O relógio biológico de plantas é uma rede regulatória de grande relevância para a adaptação dos organismos ao ambiente. Essa rede é composta por diversas vias de controle transcricional e pós-transcricional que se retroalimentam e geram ritmos biológicos. O controle exercido pelo relógio pode ser observado nos mais diversos aspectos da fisiologia e desenvolvimento de plantas. No presente projeto de pesquisa foi investigada a relação entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas, uma classe de fitohormônios, em cana-de-açúcar. Foram utilizadas técnicas de expressão gênica, como RT-qPCR, para definição de um protocolo robusto de avaliação de respostas transcricionais a auxinas em plântulas de cana-de-açúcar geradas por organogênese direta. Após 1h da aplicação de 80 µM auxina sintética ácido 1-naftalenoacético, foi possível observar controle transcricional evidente exercido pela aplicação de auxina sobre alguns genes. Também foi observado variação na resposta obtida, dependendo do horário do ciclo circadiano em que o estímulo era oferecido. Esse fenômeno de controle temporal sobre a resposta a um estímulo é chamado gating, sendo de grande relevância para a atuação do relógio biológico de plantas. A partir dessas observações foram realizadas análises de expressão gênica em larga escala, usando oligoarranjos, para compreensão mais aprofundada da conexão entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas em cana-de-açúcar. Entre os genes diferencialmente expressos após estímulo com auxina, foi verificado grande presença de genes relacionados a respostas contraestresse biótico. Além disso, as respostas observadas devem estar sobre o controle do relógio biológico de cana-de-açúcar. Diversos genes relacionados a combate a infecções, como quitinases e taumatinas, tiveram sua expressão alterada após aplicação de auxinas, sendo possível observar diferenças no padrão de expressão dos genes dependendo do horário em que auxina era aplicada. Dessa forma, o relógio biológico de cana-de-açúcar, a partir da sinalização por auxinas, deve exercer controle sobre as respostas a estresses bióticos nesse organismo. Os dados obtidos são inéditos e podem contribuir para o aumento da produtividade de cana-de-açúcar assim como para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas focadas nesse cultivar, o qual apresenta grande relevância econômica / The circadian clock is a regulatory network with great relevance to fitness of plants. This network creates biological rhythms, influencing plants metabolism and their interaction with the environment. The clock is composed of interlocking feedback transcriptional and post-transcriptional pathways. In the presente study, we investigated the interconnection between circadian clock and signaling through auxins, a group of phytohormones with great impact to plant biology. Using RT-qPCR, it was established a protocol to measure transcriptional responses after synthetic auxin 1-naphtalenacetic acid (NAA) treatment. The biological material used was leaves of sugarcane plantlets generated by direct organogenesis. After 1h treatment with 80 µM NAA, we observed obvious transcriptional responses in sugarcane plantlets. It was also possible to detect alterations of transcriptional responses according to the moment when the stimulus was offered. This temporal control is called gating and is of great relevance to plant circadian clocks. We then performed transcriptomic analysis, using oligoarrays, to get a deeper understanding of the results obtained. Indeed, it was verified that auxin stimulus is connected to biotic stress transcriptional responses and that these responses are clock-controlled. Transcripts coding for proteins like chitinases and thaumatins, which are related to biotic stress responses, were differentially expressed after auxin treatment. Also, the response of most genes was daytime-dependent. We conclude that sugarcane circadian clock, through auxin signaling, might exert control under biotic stressresponses in sugarcane. The data obtained are novelty and may contribute to increase sugarcane productivity and/or to development of new biotechnological tools dedicated to this cultivar.

[EN] Cold is one of the most important abiotic stresses, severely affects the growth and development of plants, and limits their geographical distribution. Given that cold, salinity and drought stresses overlap some of their molecular mechanisms of response, a cDNA library of sugar beet (Beta vulgaris), generated from leaves of plants subjected to saline stress, was used to try to identify genes for tolerance to cold stress by its overexpression in yeast. In this way it was identified, among others, the CRIO4 gene whose characterization has been the work of this thesis. CRIO4 encodes a SEC14-like protein, and it is ortholog to PATL family of Arabidopsis thaliana and it shares a conserved domain with SEC14 and SFH family of yeast. CRIO4 overexpression confers to the yeast cells the ability to grow at low temperatures and tolerance to tunicamycin (an inhibitor of protein glycosylation). The in silico analysis of the CRIO4 sequence confirms several motifs and domains conserved in the protein that seem to direct its function toward the vesicular trafficking, and it reveals multiple potential phosphorylation sites in CRIO4 suggesting a possible role in signaling. Sec14 domain is a phospholipid binding and transfer domain, and the obtained results indicate that CRIO4 binds to phosphatidylinositol and phosphatidylethanolamine. CRIO4 does not complement the function of Sec14p of yeast, and this could be due to the lack of phosphatidylcholine affinity by CRIO4. Tryptophan transport is the greatest limiting factor for growth at low temperatures in yeast. The results of the yeast coexpression assay of CRIO4 and TAT2 (a high-affinity tryptophan permease) displayed in this thesis, seem to indicate stimulation of Tat2p transport to the plasma membrane by CRIO4, which could develop into an enhanced tryptophan absorption, thereby explaining the greater cold tolerance conferred by overexpression of CRIO4 in yeast. The subcellular localization study has shown that CRIO4 is associated with the plasma membrane and intracellular membranes, being part of vesicles, which seems to confirm the role of CRIO4 in intracellular trafficking, function that it would share with its orthologous genes. The expression pattern of CRIO4 in sugar beet has shown that CRIO4 is expressed in all analyzed tissues, focusing its highest expression in leaf and root. It has also been shown that CRIO4 expression increases after shorter exposure to cold stress and heat stress. Phenotypic studies of several mutant lines of PATLs genes from Arabidopsis thaliana have been carried out and high variability in results was obtained, this could be due to functional redundancy among the members of this multigenic family. Phenotypic studies of transgenic lines of Arabidopsis thaliana overexpressing the CRIO4 gene have also been performed. These lines show an improvement in their growth and development at low temperatures, thereby increasing their tolerance to cold stress. Furthermore, expression of CRIO4, in A. thaliana transgenic lines, increases considerably after cold stress and heat shock. Moreover, accumulation points of CRIO4 were observed along the whole cell, after heat shock. Intracellular recycling of PIN2, a gravitropic response indicator, is affected by decreasing temperature. The results obtained in this thesis suggest that overexpression of CRIO4 reactivates intracellular transport of PIN2 under cold stress, which would imply that its phenotype is related to auxin traffic. / [ES] El frío es uno de los estreses abióticos más importantes, afecta severamente al crecimiento y desarrollo de las plantas, y limita su distribución geográfica. Puesto que el estrés por frío, por salinidad y por sequía solapan algunos de sus mecanismos moleculares de respuesta, se usó una biblioteca de ADNc de remolacha (Beta vulgaris) generada con hojas de plantas sometidas a estrés salino, para tratar de identificar genes de tolerancia a estrés por frío mediante su sobreexpresión en levadura. De este modo se identificó, entre otros, el gen CRIO4 cuya caracterización ha sido el trabajo de esta tesis. CRIO4 codifica una proteína tipo Sec14, y es ortólogo a la familia PATL de Arabidopsis thaliana y tiene un dominio conservado con SEC14 y la familia SFH de levadura. La sobreexpresión de CRIO4 confiere a las células de levadura la capacidad de crecer a temperaturas bajas y tolerancia a tunicamicina (inhibidor de la glicosilación de proteínas). El análisis in silico de la secuencia de CRIO4 confirma diversos motivos y dominios conservados en la proteína que parecen dirigir su función hacia el tráfico vesicular, y revela múltiples potenciales sitios de fosforilación en CRIO4 sugiriendo una posible función en señalización. El dominio Sec14 es un dominio de unión y transferencia de fosfolípidos, y los resultados obtenidos indican que CRIO4 establece unión con fosfatidiolinositol y fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la función de Sec14p de levadura, y esto podría ser debido a la falta de afinidad de CRIO4 por fosfatidilcolina. En levadura, el transporte de triptófano es el mayor factor limitante para el crecimiento a temperaturas bajas. Los resultados del ensayo de coexpresión de CRIO4 con TAT2 (una permeasa de alta afinidad para triptófano) en levadura mostrados en esta tesis, parecen indicar una estimulación del transporte de Tat2p hacia la membrana plasmática por parte de CRIO4, que podría devenir en una absorción de triptófano mejorada, explicando así la mayor tolerancia a frío conferida por la sobreexpresión de CRIO4 en levadura. El estudio de localización subcelular ha mostrado que CRIO4 está asociada a la membrana plasmática y en membranas intracelulares, formando parte de vesículas, lo que parece confirmar el papel de CRIO4 en el tráfico intracelular, función que compartiría con sus ortólogos. El patrón de expresión de CRIO4 en remolacha ha mostrado que CRIO4 se expresa en todos los tejidos analizados, concentrándose su mayor expresión en hoja y raíz. También se ha mostrado que la expresión de CRIO4 aumenta tras tiempos cortos de exposición a estrés por frío y estrés por calor. Se han realizado estudios fenotípicos de diferentes líneas mutantes en genes PATLs de Arabidopsis thaliana, obteniéndose una gran variabilidad en los resultados que podría ser debida a la redundancia funcional entre los miembros de esta familia multigénica. También se han realizado estudios fenotípicos de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen CRIO4. Estas líneas muestran una mejoría en su crecimiento y desarrollo a temperaturas bajas, aumentando por tanto su tolerancia al estrés por frío. Además, la expresión de CRIO4, en las líneas transgénicas de A. thaliana, aumenta considerablemente tras el estrés por frío y tras un choque térmico, observándose en este último caso, acúmulos de CRIO4 a lo largo de toda la célula. El reciclaje intracelular de PIN2, indicador de la respuesta gravitrópica, se ve afectado por la disminución de la temperatura. Los resultados obtenidos en esta tesis parecen indicar que la sobreexpresión de CRIO4 reactiva el transporte intracelular de PIN2 bajo estrés por frío, lo que implicaría que su fenotipo está relacionado con el tráfico de auxinas. / [CA] El fred és un dels estressos abiòtics més importants, afecta severament al creixement i desenvolupament de les plantes, i limita la seua distribució geogràfica. Ja que l'estrès per fred, per salinitat i per sequera solapen alguns dels seus mecanismes moleculars de resposta, es va usar una biblioteca d'ADNc de remolatxa (Beta vulgaris) generada amb fulles de plantes sotmeses a estrès salí, per tractar d'identificar gens de tolerància a estrès per fred mitjançant la seua sobreexpressió en llevat. D'aquesta manera es va identificar, entre d'altres, el gen CRIO4 la caracterització del qual ha estat el treball d'aquesta tesi. CRIO4 codifica una proteïna tipus Sec14, i és ortòleg a la família PATL d'Arabidopsis thaliana i té un domini conservat amb SEC14 i la família SFH de llevat. La sobreexpressió de CRIO4 confereix a les cèl·lules de llevat la capacitat de créixer a temperatures baixes i tolerància a tunicamicina (inhibidor de la glicosilació de proteïnes). L'anàlisi in silico de la seqüència de CRIO4 confirma diversos motius i dominis conservats en la proteïna que semblen dirigir la seua funció cap al tràfic vesicular, i revelen múltiples potencials llocs de fosforilació en CRIO4 suggerint una possible funció en senyalització. El domini Sec14 és un domini d'unió i transferència de fosfolípids i els resultats obtinguts indiquen que CRIO4 estableix unió amb fosfatidiolinositol i fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la funció de Sec14p de llevat, i això podria ser a causa de la falta d'afinitat de CRIO4 per fosfatidilcolina. En llevat, el transport de triptòfan és el major factor limitant per al creixement a temperatures baixes. Els resultats de l'assaig de coexpressió de CRIO4 amb TAT2 (una permeasa d'alta afinitat per triptòfan) en llevat mostrats en aquesta tesi, semblen indicar una estimulació del transport de Tat2p cap a la membrana plasmàtica per part de CRIO4, que podria esdevindre en una absorció de triptòfan millorada, explicant així la major tolerància a fred conferida per la sobreexpressió de CRIO4 en llevat. L'estudi de localització subcel·lular ha mostrat que CRIO4 està associada a la membrana plasmàtica i en membranes intracel·lulars, formant part de vesícules, la qual cosa sembla confirmar el paper de CRIO4 en el tràfic intracel·lular, funció que compartiria amb els seus homòlegs. El patró d'expressió de CRIO4 en remolatxa ha mostrat que CRIO4 s'expressa en tots els teixits analitzats, concentrant-se la seua major expressió en fulla i arrel. També s'ha mostrat que l'expressió de CRIO4 augmenta després de temps curts d'exposició a estrès per fred i estrès per calor. S'han realitzat estudis fenotípics de diferents línies mutants en gens PATLs d'Arabidopsis thaliana, obtenint-se una gran variabilitat en els resultats que podria ser deguda a la redundància funcional entre els membres d'aquesta família multigènica. També s'han realitzat estudis fenotípics de línies transgèniques d'Arabidopsis thaliana que sobreexpressen el gen CRIO4. Aquestes línies mostren una millora en el seu creixement i desenvolupament a temperatures baixes, augmentant per tant la seua tolerància a l'estrès per fred. A més, l'expressió de CRIO4, en les línies transgèniques d'A. thaliana, augmenta considerablement després de l'estrès per fred i després d'un xoc tèrmic, observant-se en aquest últim cas, cúmuls de CRIO4 al llarg de tota la cèl·lula. El reciclatge intracel·lular de PIN2, indicador de la resposta gravitrópica, es veu afectat per la disminució de la temperatura. Els resultats obtinguts en aquesta tesi semblen indicar que la sobreexpressió de CRIO4 reactiva el transport intracel·lular de PIN2 sota estrès per fred, la qual cosa implicaria que el seu fenotip està relacionat amb el tràfic d'auxines. / Izquierdo García, AC. (2016). Caracterización del gen CRIO4 y su implicación en tolerancia a estrés por frío [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62826

Uma das abordagens mais utilizadas atualmente para se estudar o metabolismo e a transdução de sinais hormonais é o uso de mutantes com alterações nos genes que codificam os principais componentes desses processos. A cultivar miniatura de tomateiro (Lycopersicon esculentum) denominada Micro-Tom (MT) possui porte reduzido (8 cm) e ciclo de apenas 75 dias, constituindo-se em um excelente modelo para uma abordagem genética de estudos fisiológicos. Mutantes com alterações no balanço auxina/citocinina, ou na capacidade de resposta a esse balanço, podem ser utilizados para desvendar o papel da interação entre esses hormônios no controle do desenvolvimento, inclusive no que se refere à capacidade de regeneração in vitro. O presente trabalho teve como objetivo criar um modelo para se estudar o papel do balanço auxina/citocinina endógeno na competência para regeneração in vitro, através da incorporação das mutações dgt, brt, gf, lutescent, ls e bu, as quais sugerem alterações no metabolismo e/ou sensibilidade hormonal, na cultivar MT. Essas mutações foram caracterizadas quanto à sensibilidade à auxina e citocinina através da obtenção de curvas de dose-resposta, utilizando-se diferentes concentrações de AIA (0; 0.1; 1; 10 e 100 µM) e TDZ (0; 0.01; 0.1; 1; 10 e 100 µM), em segmentos de pecíolo e plântulas germinadas em gerbox, respectivamente. As mutações caracterizadas para auxina e citocinina, bem como o controle MT, foram testadas in vitro, quanto à sua capacidade de regeneração, em meio de cultura MS, suplementado com 5µM de BAP (explantes cotiledonares e segmentos de hipocótilo) e 4,5 µM de Zeatina (segmentos de raiz). Os mutantes lutescent, gf e bu, apesar de possuírem fenótipo bastante interessante, não parecem ser relacionados à sensibilidade à auxina e citocinina, bem como ao etileno. Já os mutantes dgt e brt apresentaram respostas típicas de mutantes com pouca sensibilidade à auxina e citocinina, respectivamente. Dessa forma, a resposta ao balanço AIA/Cks é alterado nesses mutantes, afetando o processo de regeneração. Nos segmentos de hipocótilo, houve formação de calos em todos os explantes, entretanto, poucos explantes formaram gemas adventícias, sendo que o mutante dgt foi o que apresentou menor taxa de regeneração. Nos explantes cotiledonares, a taxa de regeneração foi menor ainda no MT e no mutante dgt, e ausente no mutante brt. Não houve regeneração em nenhum dos genótipos em segmentos de raiz. Esses resultados sugerem que, embora a competência para regeneração in vitro possa ser dependente do balanço AIA/Cks, ou da resposta a esse balanço, existem interações mais complexas entre esses hormônios e seus efeitos na regeneração. A exemplo disso, era de se esperar uma maior formação de gemas caulinares em dgt, já que sua capacidade de resposta ao balanço está voltada para Cks. Um estudo mais aprofundado para a correta interpretação dessa interação deve levar em conta que a sensibilidade à auxina é necessária também no processo de desdiferenciação. Além disso, auxinas e citocininas não só atuam na diferenciação, mas também podem interferir na regeneração, independente do balanço AIA/Cks, já que são necessárias para a expansão e divisão celular. / To date, one of approaches more used to study the metabolism and transduction of hormone signals are the mutants with alterations in genes which encode the principal components of this process. The miniature cultivar of tomato (Lycopersicon esculentum) named Micro-Tom (MT) possesses reduced size (8 cm) and a life cycle of just 75 days, constituting an excellent model for a genetic approach of physiology studies. Mutants with altered auxin/cytokinin ratio, or in the response capacity to this ratio, can be used to clear up the role of interactions between these hormones in the control of development, including those concerning the in vitro regeneration capacity. The current work aimed to produce a model to study the role of endogenous auxin/cytokinins ratio in the competence for in vitro regeneration, through incorporation of the dgt, brt, gf, lutescent, ls and bu mutations, which concern altered hormone metabolism and/or sensibility, in the MT cultivar. These mutations were tested for the hypothesis of being related to auxin and cytokinin sensibility by means of dose-response curves, using different concentrations of IAA (0; 0.1; 1; 10 e 100 µM) and TDZ (0; 0.01; 0.1; 1; 10 e 100 µM), in petiole segments and gerbox-germinated seedlings, respectively. The mutations confirmed to be auxin and cytokinin related, as well the MT control, were tested in vitro for regeneration capacity, in MS culture media, with either 5µM de BAP (cotyledon explants and hypocotyl segments) or 4,5 µM Zeatin (root segments). The luescent, gf and bu mutants, despite showing an interesting phenotype, do not seem to be related to auxin and cytokinin sensibility, as well as to ethylene. However, the dgt and brt mutants showed typical responses of reduced auxin and cytokinin sensibility, respectively. Thus, the response to auxin/cytokinin is altered in these mutants, affecting the regeneration process. Calli were observed in all hypocotyl segments, however few explants formed adventitious buds, with the dgt mutant presenting the least regeneration ratio. In the cotyledon explants, the regeneration ratio was even less than in MT and in dgt, and absent in the brt mutant. There was no regeneration whatsoever from root segments in any genotype. These results suggest that, although the competence for in vitro regeneration might be dependent on the IAA/Cks ratio, or the response to this ratio, interactions far more complex exist between these hormones and their effects on regeneration. For instance, a greater adventitious buds formation was expected in dgt, because its response ability is biased toward Cks. A deeper study for the correct interpretation of these data should consider that the sensibility to auxin is also necessary in the process of undifferentiation. Besides, both auxins and cytokinins have roles not only in differentiation, but also can interfere with regeneration independent of the IAA/Cks ratio, as they are required for cell division and expansion.