La protéine Tau joue un rôle essentiel dans les neurones, notamment par ses interactions avec les éléments du cytosquelette. Des études récentes ont également montré que Tau était impliquée dans la motilité des organelles le long des microtubules axonaux. Dans ce mémoire de Maîtrise, nous avons démontré par recouvrement sur gel une nouvelle interaction in vitro pour Tau avec la petite GTPase Rab5, qui est impliquée dans l’endocytose précoce. De plus, nous avons montré que Tau et Rab5 immuno-précipitaient sur une même population de vésicules in vivo. La sur-expression de Tau dans des neurones primaires de l’hippocampe nous a permis de montrer que Tau et Rab5 avaient une distribution similaire dans l’axone des neurones, suggérant un rôle de Tau dans l’ancrage des endosomes précoces sur les microtubules. Par contre, à la différence de ce qui a pu être observé dans certaines études, la sur-expression de Tau n’a pas inhibé le transport axonal des endosomes précoces. Enfin, nous avons montré que Tau interagissait préférentiellement avec la Rab5 active liée au GTP et des résultats préliminaires nous laissent penser que Tau serait un effecteur ou une GAP pour Rab5. Dans les tauopathies, la Tau devient hyperphosphorylée, décroche des microtubules axonaux et forme des agrégats dans le corps cellulaire du neurone. Ces modifications biochimiques et de localisation de la protéine Tau pourraient être la source d’une perte d’interaction de la Tau avec Rab5 et être responsable de certaines atteintes neurologiques observées dans les tauopathies. / Tau protein plays an essential role in neurons, in particular in its interactions with cytoskeletal elements. Recent studies have shown that Tau was also regulating organelles motility along axonal microtubules. In this work, using far-western blot, we have shown a new in vitro interaction for Tau with the small GTPase Rab5, a protein implicated in early endocytosis. Furthermore, we have shown that Tau and Rab5 were immuno-precipited on a same pool of vesicles in vivo. Over-expression of Tau in primary hippocampal neurons have shown that Tau and Rab5 have a similar distribution in axons, suggesting that Tau plays a role as an anchor protein for early endosomes onto microtubules. In contrast to what has been shown earlier in other studies, Tau did not blocked axonal transport of early endosomes. Finally, we have shown that Tau was interacting preferentially with the active form of Rab5 bound to GTP and preliminary results suggest that Tau would be an effector or a GAP for Rab5. In tauopathies, Tau become hyperphosphorylated, loose its affinity with axonal microtubules and form aggregates in the cell body of the neuron. This biochemicals modifications and relocalisation of Tau protein might be responsible for a loss of interaction between Tau and Rab5 and consequently of some of the neuropathological symptoms observed in tauopathies.

Cette thèse s'intéresse au développement neuronal in vitro dans le but ultime d'enregistrer l'activité de réseaux de neurones à géométrie et connectivité contrôlées. Le développement neuronal est régi par un ensemble de régulations, intrinsèques mais également sous contrôle de facteurs extérieurs, qui permettent à la cellule d'adhérer à un substrat, de croître, et de se polariser. Une partie de ce travail de thèse explore deux types de contraintes physiques de l'environnement que sont la géométrie d'adhésion et la rugosité de surface. La première révèle l'implication des forces dans les stades précoces de développement neuronal régis par un phénomène de compétition neuritique, et permet in fine de contrôler la direction d'émission de l'axone, notamment par une inhibition de sa différenciation sur lignes ondulées. La seconde montre que la distribution des points d'adhésion peut accélérer la croissance jusqu'à favoriser la polarisation axonale. L'autre partie de ce travail s'attache à résoudre le problème technologique majeur qu'est le remplissage des sites d'adhésion par le biais d'une attraction magnétique, et démontre la possibilité de faire croître des réseaux neuronaux modèles sur nanotransistors.

Au cours des dernières années, la synthèse des protéines axonales a été établie comme un mécanisme important pour réguler correctement la réactivité spatiale et temporelle des neurones aux variations de leur microenvironnement, en particulier lors du développement axonal et de la régénération. Pour cela, les transcrits d'ARNm doivent être localisés dans les axones afin d'être traduits. De fait, plusieurs populations d'ARNm ont été identifiées le long des axones de divers types de neurones vertébrés. Le transport approprié des ARNm du corps cellulaire vers le compartiment axonal nécessite des séquences ou des structures spécifiques, généralement trouvées dans le 3'UTR du transcrit. Seules quelques études ont confirmé que le transport et la traduction des ARNm ont lieu dans les axones des vertébrés vivants et que ces mécanismes peuvent être impliqués dans des fonctions neuronales distinctes, comme le maintien de l'homéostasie axonale, le guidage, la croissance et la ramification axonales. Notre laboratoire a précédemment démontré in vivo la présence d'ARNm spécifiques, comme le transcrit de nefma, dans les axones en croissance chez l'embryon de poisson zèbre. En utilisant un système rapporteur développé au sein du laboratoire, il a été démontré que le transport axonal (ou la rétention au corps cellulaire) de plusieurs transcrits dépendait de leur 3'UTR. Se basant sur ces résultats importants, dans une première partie de ce travail, nous avons cherché à étudier la fonction du transcrit nefma transporté dans les axones en développement de l'embryon de poisson zèbre. En effet, Nefma est une protéine cytosquelette propre aux neurones, dont l'expression est déclenchée lors de la différenciation neuronale. Nous avons montré que l’immunoréactivité 3A10 est réduite à mesure que la concentration de MO augmente et que ce marquage est utile pour tester l'efficacité du MO, suggérant que l'anticorps 3A10 pourrait reconnaître nefma. Nous avons également démontré que les neurones de Mauthner se différencient au bon moment et au bon endroit chez les morphants. De plus, nous avons constaté que le « zigzagging » des axones morphants augmente avec la concentration de MO et que la protéine mbp s'accumule inégalement autour des faisceaux axonaux dans les morphants nefma. Cependant, les défauts de perte de fonction de nefma ne sont pas totalement pénétrants et difficiles à quantifier. En outre, dans une deuxième partie de la présente étude, nous avons mis au point une technique de détection de la traduction axonale d'ARNm spécifiques dans le même modèle in vivo. Pour cela, nous avons développé un système inspiré de la technique «TimeSTAMP» développée par l'équipe de Roger Tsien, qui nous permet d'identifier les sites de traduction en étiquetant de manière ingénieuse les protéines nouvellement synthétisées. / In recent years, axonal protein synthesis has been established as an important mechanism to fine regulate spatial and temporal neuronal responsiveness to the varying microenvironment, especially during axonal development and regeneration. For that, mRNA transcripts have to be localized to the axons in order to be translated. In fact, several mRNA populations have been identified along the axons of diverse vertebrate neuronal types. The proper transport from the cell body to the axonal compartment requires specific sequences or mRNA structures, usually found in the 3’UTR of the transcript. Only a few studies have confirmed that mRNA transport and translation take place in axons of living vertebrates, and that these mechanisms can be involved in distinct neuronal functions, as the maintenance of axonal homeostasis, pathfinding, and axonal growth and branching. Our lab previously demonstrated in vivo the presence of specific mRNAs, as nefma transcript, in growing axons of the zebrafish embryo. Thanking advantage of a reporter system developed in the lab, it was shown that axonal transport (or retention at the cell body) of several transcripts depended on their 3’UTR.Building upon these important results, in a first part of this work, we sought to investigate the function of the axonally transported nefma in the developing axons of the zebrafish embryo. Indeed, Nefma is a neuron-specific cytoskeletal protein, which expression is triggered during neuronal differentiation. We showed that the 3A10 signal is reduced as the MO concentration increases and this staining is a useful readout for the efficiency of the MO, suggesting that the 3A10 antibody might recognize nefma. We also demonstrated that the Mauthner neurons differentiate at the right time and place in the morphants. Moreover, we saw that the morphant axons zigzagging increases with increasing MO concentrations and that mbp accumulates in patches around axonal bundles in nefma morphants. However, nefma loss-of-function defects are not totally penetrant and difficult to quantify. Furthermore, in a second part of the present study, we aimed at optimizing a technique facilitating the visualization of axonal translation of specific mRNAs in the same in vivo model. For this, we developed a translation reporter system, inspired on the ‘TimeSTAMP’ technique developed by Roger Tsien’s team, which allows the identification of translation sites along the axons by labeling newly synthesized protein in an ingenious fashion.

La fasciculation des axones joue un rôle essentiel dans le développement des réseaux neuronaux. Cependant, la dynamique de la fasciculation axonale, ainsi que les mécanismes biophysiques à l’œuvre dans ce processus, demeurent encore très mal compris. En vue d'étudier les mécanismes de fasciculation d'axones ex vivo, nous avons développé un système modèle simple, constitué par des explants d'épithélium olfactif de souris embryonnaires en culture, à partir desquels poussent les axones des neurones sensoriels olfactifs. Grâce à une étude en vidéomicroscopie, nous avons observé que ces axones interagissent de façon dynamique par leur fibre, à la manière de fermetures éclair pouvant se fermer ("zippering") ou s'ouvrir ("unzippering"), ce qui conduit respectivement à la fasciculation ou à la défasciculation des axones. Mettant à profit cette nouvelle préparation expérimentale pour l'étude des interactions dynamiques entre axones, nous avons développé une analyse biophysique détaillée des processus de zippering/unzippering.Nous mettons en évidence dans notre travail l'existence d'un mécanisme biophysique cohérent de contrôle des interactions locales entre fibres axonales. Ce mécanisme local est à mettre en relation avec les changements de la structure globale du réseau axonal (degré de fasciculation) qui s'opèrent sur une échelle temporelle plus longue. Enfin, nous discutons la signification fonctionnelle de nos observations et analyses, et proposons un nouveau rôles de la tension mécanique dans le développement du système nerveux : la régulation de la fasciculation des axones et, en conséquence, de la formation des cartes topologiques au sein des réseaux neuronaux. / While axon fasciculation plays a key role in the development of neural networks, very little is known about its dynamics and the underlying biophysical mechanisms. In a model system composed of neurons grown ex vivo from explants of embryonic mouse olfactory epithelia, we observed that axons dynamically interact with each other through their shafts, leading to zippering and unzippering behaviour that regulates their fasciculation. Taking advantage of this new preparation suitable for studying such interactions, we carried out a detailed biophysical analysis of zippering, occurring either spontaneously or induced by micromanipulations and pharmacological treatments.We show that there is a consistent mechanism which governs local interactions between axon shafts, supported by broad experimental evidence. This mechanism can be reconciled with changes in global structure of axonal network developing on slower time scale, analogically to well-studied relation between local relaxations, and topological changes and coarsening in two-dimensional liquid foams. We assess our observations and analysis in light of possible in vivo functional significance and propose a new role of mechanical tension in neural development: the regulation of axon fasciculation and consequently formation of neuronal topographic maps.

Les neurones sont des cellules polarisées qui présentent un seul axone et de nombreuses dendrites courtes. Les réarrangements du cytosquelette, l'augmentation du transport dépendant des microtubules et le couplage mécanique du cytosquelette d'actine à la membrane plasmique sont nécessaires pour établir cette polarité neuronale. Les Myosines 1 qui couplent le cytosquelette d'actine à la membrane plasmique sont des bons candidats pour réguler l'axonogenèse. La Myosine1b étant fortement exprimée dans le cerveau en développement, nous avons donc étudié son rôle dans l'axonogenèse. L'inhibition de l'expression de Myo1b dans les neurones corticaux retarde la différenciation neuronale et empêche l'axonogenèse et l'établissement de la polarité neuronale. La surexpression de Myo1b accélère le développement neuronal et induit la formation d'axones surnuméraires. L'activité motrice et l'interaction de Myo1b avec des phosphoinositides via son domaine PH est nécessaire pour ce processus. Myo1b est associée et contrôle la formation d'ondes d'actine antérogrades qui 'cross-talk" avec les microtubules pour diriger le transport de la kinésine1 sur les microtubules et conduire à la formation de l'axone. L'inhibition de Myo1b empêche la propagation des ondes d'actine et le mouvement de KIF5560 une version constitutivement active du moteur Kinésine 1 associé aux microtubules. L' activité motrice et le domaine PH de Myo1b sont nécessaire à la propagation des ondes d'actine. Nos résultats indiquent que la Myosine 1b contrôle la rupture de la symétrie axonale et la formation de l'axone en contrôllant l'orientation de la polymérisation d'actine à la membrane dans les ondes d'actine antérograde. / Neurons are highly polarized cells, with a long axon and multiple short dendrites. Rearrangements of cytoskeleton, increased microtubule-based transport and coupling mechanically actin cytoskeleton to plasma membrane are required for the establishment of neuronal polarity. Class 1 Myosin, with the unique property to couple mechanically actin cytoskeleton to plasmamembrane are good candidate for regulatin axonogenesis. Myosin1b is highly expressed in developing brain where it was first identified. Thus, we investigated its role in axonogenesis. Depletion of endogenous Myo1b in cultured cortical neurons delays the neuronal differentiation and impairs the axonogenesis and the establishment of the neuronal polarity. The overexpression of Myosin1b rushes the neuronal development and promotes the formation of supernumerary axon-like structures. Myo1b requires its motor activity and its interaction with phosphoinositides via its PH motif to promote the axonogenesis. Myo1b associates and controls the formation of anterograde actin waves that cross-talk with microtubules to direct microtubules-bases transport of kinesin-1, and drive axon formation. Myo1b depletion impairs the propagation of actin waves and the translocation of KIF5560, a constitutively active version of the microtubules motor Kinesin-1. The motor activity and interaction with phosphoinositides of Myo1b are also required for the propagation of actin waves. Together our data indicate that myosin1b controls the neuronal symmetry breaking and the axogenesis by controlling the orientation of the actin polymerization to the membrane in the waves that drive the propagation of anterograde actin waves.

Le potentiel d'action est un des événements de signalisation majeurs du cerveau. Ce travail est dédié à l'étude de la génération du potentiel d'action, et son impact dans le potentiel extracellulaire ainsi que dans le réseau local. Pour ce faire nous avons abordé trois questions principales. Premièrement, nous nous sommes intéressés à comprendre pourquoi les potentiels d'action ont souvent un début brutal dans les enregistrements somatiques des neurones de mammifères. Nous avons montré que l'hypothèse du couplage résistive critique explique comment le potentiel d'action est initié dans le segment initial de l'axone pour fournir le 'kink' dans le soma. Deuxièmement, nous avons évalué l'impact de la position du segment initial sur le potentiel extracellulaire. De façon importante, nous démontrons que l’impact de la position du segment initial axonal dans la forme et l’amplitude du potentiel d’action dépend de la distance entre le site d’enregistrement et l’axone, et de sa position par rapport à l’axe soma-segment initial axonal.Finalement, nous avons exploré l’impact d’un seul potentiel d’action dans l’activité de réseau, car cet effet est souvent questionné. Nos montrons qu’un seul potentiel d’action d’un neurone pyramidal hippocampique peut commencer l’activité «sharp-wave ripple” qui consiste en l’activation de multiple interneurones. L’ensemble de nos résultats montre que les potentiels d’action sont des événements complexes modelés par la biochimie de le membrane neuronale et la morphologie de l’axone. De plus, ces caractéristiques neuronales modulent fortement leur impact dans le champ extracellulaire et l’activité de réseau. / The action potential is considered one of the major signaling events in the brain.Although it has been studied for years, many questions remain unanswered. The present work is dedicated to the study of action potential generation, its impact on extracellular field and local network establishment. We considered three questions: Firstly, (i) we asked why mammalian neurons often have characteristically sharp onset in the somatic recordings of action potentials. We show that the Critical Resistive Coupling Hypothesis is sufficient to explain how the action potential is initiated in the axon initial segment to provide for the ‘kink’ in the soma, while the Back propagation Hypothesis is not sufficient to explain it. Next, (ii)we asked how the placement of the axon initial segment might affect the extracellular field. We show that the impact of the axon initial segment position on the shape and amplitude ofextracellular action potential depends on the distance between the recording site andthe axon and on its position along the soma–axon initial segment axis. Finally, (iii)we inquired if a single action potential might have an effect on the network activity. Weshow that a single action potential from a single pyramidal neuron in the hippocampus can trigger sharp-wave ripple activity consisting of the firing of multiple interneurons.Altogether, our results show that action potentials are complex events shaped by the biochemistry of the neuronal membrane and morphology of the axon. In addition these features strongly modulate the neuron’s impact on the extracellular field and network activity.

La sclérose en plaques est une maladie chronique. Elle se caractérise par une inflammation focale et diffuse, une démyélinisation, une souffrance axonale et une dégénérescence neuronale. L’apparition d’une incapacité progressive et irréversible en est la principale morbidité. Mieux comprendre les liens entre les différents mécanismes impliqués dans la SEP et la part de chacun dans la genèse du handicap est fondamental.L’inflammation dans la SEP est polymorphe. Une famille de produits de contraste, l’USPIO, permet le marquage des macrophages et leur suivi en IRM. Ainsi, 35 patients ont été inclus. Le rehaussement par l’USPIO était spatialement et temporellement différent de celui observé après injection de gadolinium. Les lésions caractérisées par une activité macrophagique induisent localement une déstructuration tissulaire plus importante sur l’IRM initiale et après 1 an.À cette inflammation aiguë s’ajoutent l’inflammation et la démyélinisation chroniques, qui entraînent une accumulation de sodium. La deuxième étude a permis de montrer cette accumulation en IRM chez 20 patients souffrant de la forme progressive, où prédominent l’inflammation et la démyélinisation chroniques.L'importance de l’accumulation corticale de sodium chez ces patients nous a conduit à entreprendre une troisième étude chez des patients souffrant de troubles cognitifs. Ainsi 58 patients rémittents ont été inclus dans cette étude. Une accumulation de sodium a été mise en évidence chez les patients présentant une atteinte cognitive. Cette accumulation touche le néocortex, en particulier préfrontal, cingulaire et le precuneus. De plus, cette accumulation survient avant l’atrophie. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic disease leading to permanent disability. Demyelination, inflammation and diffuse axonal and neuronal loss are histological hallmarks of MS. Better understand the links between these different mechanisms and their role in the genesis of disability is fundamental. Inflammation in MS is polymorphic. A family of recent contrast agents, the USPIO, allows the labelling and monitoring of macrophages. 35 patients were included. Enhancement by USPIO was spatially and temporally different from gadolinium. Lesions characterized by macrophage activity locally induce a more significant tissue destructuration at baseline and at one year.Moreover, chronic inflammation and chronic demyelination lead to intra-neuronal sodium accumulation. Because of the physical properties of 23Na and technical improvements, sodium MRI imaging is to date possible. Thus in the second study, sodium accumulation was demonstrated in 20 patients at a progressive phase, particularly susceptible to chronic inflammation and demyelination. Then, the discovery of the importance of cortical sodium accumulation in this study led us to undertake a third study in patients prone to cognitive disorders, were cortical involvement seems to be more pronounced. 58 remitting patients were enrolled. Sodium accumulation was demonstrated in patients with cognitive impairment. This accumulation affects the neocortex (prefrontal cortices, cingulate and the precuneus). This accumulation occurs before atrophy.

Cette thèse s'intéresse au développement neuronal in vitro dans le but ultime d'enregistrer l'activité de réseaux de neurones à géométrie et connectivité contrôlées. Le développement neuronal est régi par un ensemble de régulations, intrinsèques mais également sous contrôle de facteurs extérieurs, qui permettent à la cellule d'adhérer à un substrat, de croître, et de se polariser. Une partie de ce travail de thèse explore deux types de contraintes physiques de l'environnement que sont la géométrie d'adhésion et la rugosité de surface. La première révèle l'implication des forces dans les stades précoces de développement neuronal régis par un phénomène de compétition neuritique, et permet in fine de contrôler la direction d'émission de l'axone, notamment par une inhibition de sa différenciation sur lignes ondulées. La seconde montre que la distribution des points d'adhésion peut accélérer la croissance jusqu'à favoriser la polarisation axonale. L'autre partie de ce travail s'attache à résoudre le problème technologique majeur qu'est le remplissage des sites d'adhésion par le biais d'une attraction magnétique, et démontre la possibilité de faire croître des réseaux neuronaux modèles sur nanotransistors. / This thesis focuses on in vitro neuronal development, with the long-term goal of building controlled neuron networks that would allow the recording of their electric activity. A collection of intrinsic regulations are involved in neuronal adhesion, growth and polarization, in such a way that the cell can adapt to changes in its environment. Nevertheless, this environment can affect the behavior of the cell through mechanisms that rely on biophysical signals or even physical properties of this environment. The work presented in this thesis is based on the modification of two main aspects of the physical environment: geometry of adhesion and surface roughness. On the one hand, the geometry is controlled by patterns of adhesions, giving the ability to design bipolar motifs that highligt the importance of mechanical forces in neuronal growth, and also more complex motifs that allow the control of neuronal polarization, in particular by an inhibition of axonal differenciation on curved lines. On the other hand, a roughness below the microscale creates a distribution of adhesion points that results in an increase in neuronal growth rate and even influences axonal polarization. The final part of this thesis focuses on the development of an innovative method for placing cells at precise locations on a substrate, by the help of magnetic traps. This method is the final step required for growing model neuron networks on our nanotransistors.

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Les réseaux de neurones in vitro sont des systèmes simples et pertinents pour tenter d'aborder la complexité des traitements de l'information effectués par le cerveau. Ils sont d'autant plus intéressants lorsqu'une architecture évoquant l'organisation de réseaux in vivo peut être imposée. C'est pourquoi les substrats micro-patternés sont maintenant couramment utilisés pour forcer l'adhésion et le développement des cellules conformément à une topologie prédéfinie. Cependant, la création de microcircuits neuronaux requiert un contrôle précis du flux d'information entre les cellules, uniquement réalisable en induisant la polarité neuronale (i.e axonal differenciation) dans une direction spécifique. Bien que des molécules de guidance soient découvertes chaque jour, elles sont difficilement utilisables pour créer des réseaux in vitro de neurones polarisés puisque les technologies de patterning ne sont pas compatibles avec le greffage de protéines. Dans cette thèse, notre but était de réaliser un contrôle total de la polarité neuronale par l'action combinée d'une adhésion non spécifique et de contraintes physiques fournies par des géométries de pattern sophistiquées. Nous reportons ici un succès à près de 90 % du contrôle de la direction de la pousse de l'axone. Ce résultat s'est basé sur d'anciennes observations. D'une part, la localisation du centrosome détermine le point d'émergence de l'axone et d'autre part, l'application d'une tension mécanique extérieure est suffisante pour induire la formation de l'axone. Nous avons exploité ces deux résultats dans un seul motif. Celui-ci contraint la position du centrosome et empêche la pousse de l'axone dans les directions non désirées grâce à des lignes courbées spécifiques limitant la tension interne du neurite. Non seulement ces résultats offrent un outil important pour créer des réseaux de neurones modèles mais aussi ils questionnent la fonction du centrosome et les mécanismes d'adhésion et de transmission de force dans les neurites, trop longtemps négligés à la faveur de l'analyse du cône de croissance.