Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les toxines Cry sont des protéines synthétisées sous forme de cristaux par la bactérie bacille de Thuringe pendant la sporulation. Elles sont largement utilisées comme agents de lutte biologique, car elles sont toxiques envers plusieurs espèces d’invertébrées, y compris les nématodes. Les toxines Cry5B sont actives contre certaines espèces de nématodes parasites, y compris Ankylostoma ceylanicum un parasite qui infeste le système gastro-intestinal des humains. Jusqu’au présent, le mode d’action des toxines Cry nématicides reste grandement inconnu, sauf que leurs récepteurs spécifiques sont des glycolipides et qu’elles causent des dommages importants aux cellules intestinales. Dans cette étude, on démontre pour la première fois que la toxine nématicide Cry5Ba, membre de la famille des toxines à trois domaines et produite par la bactérie bacille de Thuringe, forme des pores dans les bicouches lipidiques planes en absence de récepteurs. Les pores formés par cette toxine sont de sélectivité cationique, à pH acide ou alcalin. Les conductances des pores formés sous conditions symétriques de 150 mM de KCl varient entre 17 et 330 pS, à pH 6.0 et 9.0. Les niveaux des conductances les plus fréquemment observés diffèrent les uns des autres par environ 17 à 18 pS, ce qui est compatible avec l’existence d’arrangement d’un nombre différent de pores élémentaires similaires, activés de façon synchronisée, ou avec la présence d’oligomères de tailles variables et de différents diamètres de pores. / Cry toxins are proteins synthetized as crystal inclusions by the Bacillus thuringiensis bacterium upon sporulation. They are used widely as biological control agents, as they exhibit toxicity to a range of invertebrates, including nematodes. The Cry5B toxins are active against a number of parasitic nematode species, such as Ancylostoma ceylanicum a human gastro-intestinal parasite. So far, the mode of action of nematicidal Cry toxins is largely unknown, except for the facts that their specific receptors are glycolipids and that they cause prominent damage to nematode intestinal cells. In this study, we show for the first time that the nematicidal Cry5Ba toxin, a member of the three domain family of toxins produced by the Bacillus thuringiensis forms pores in receptor-free planar lipid bilayers. The pores formed by the toxin were cation selective, both under acid and alkaline pH conditions. Under symmetrical 150 mM KCl conditions, pore activity was characterized by conductances ranging from 17 to 330 pS, at both pH 6.0 and 9.0. The most frequently observed conductance levels differed from each other by approximately 17 to 18 pS consistent with the existence of clusters of different number of elementary, similar, co-operatively gated pores, or with the presence of variable size oligomers with different pore diameters.

La tuberculose est due à un groupe d’agents infectieux phylogénétiquement proches formant le complexe Mycobacterium tuberculosis, formé de dix espèces. M. tuberculosis est un bacille à croissance lente qui forme des colonies rugueuses. Le complexe M. tuberculosis comporte également des bacilles tuberculeux formant des colonies lisses à croissance rapide, isolées qu’à partir de prélèvements cliniques chez l’homme. Notre revue des articles sur ces souches a montré que les trois premiers isolats ont été obtenus chez des patients en France, à Madagascar et en Polynésie Française par Georges Canetti entre 1968 et 1970. Suite à l'isolement d'une souche lisse à partir d’un ganglion cervical chez un enfant Somali de 2 ans en 1997, ces bacilles tuberculeux ont été nommés "Mycobacterium canettii". Aujourd'hui, moins d'une centaine de ces souches ont été isolées à partir de patients exposés aux pays formant la Corne de l’Afrique, principalement la République de Djibouti, qui présente la plus forte prévalence. Nous avons procédé à l’analyse génotypique de 34 isolats de M. tuberculosis et de 87 isolats de mycobactéries non-tuberculeuses de la Polynésie Française pour voir si des telles souches persistaient.Nous avons pu décrire deux nouvelles lignées de M. tuberculosis et une nouvelle espèce de mycobactérie non-tuberculeuse. Nous avons envisagé une transmission par voie digestive de "M. canettii" et nous avons testé la résistance de "M. canettii" à la chaleur. Nous avons observé la croissance de cette dernière entre 25°C et 45°C. Les données que nous avons obtenues ici pourraient former une base en vue d'élucider les réservoirs et les sources de souches lisses. / Tuberculosis is caused by a group of phylogenetically close infectious agents forming the Mycobacterium tuberculosis complex, consisting of ten species. M. tuberculosis is a slow growing bacterium which form rough colonies. The complex also includes M. tuberculosis tubercle bacilli forming smooth rapidly-growing colonies isolated from clinical specimens in humans. Our review of articles on these strains showed that the first three isolates were obtained from patients in France, Madagascar and French Polynesia by Georges Canetti between 1968 and 1970. Following the isolation of a smooth strain from cervical ganglion of a Somali 2 year-old child in 1997, the tubercle bacilli were named "Mycobacterium canettii". Today, less than a hundred of these strains were isolated from patients exposed to countries forming the Horn of Africa, especially the Republic of Djibouti, which has the highest prevalence. As showed in our revue, one smooth tubercle bacilli was isolated in Frenche Polynesia. To see if such strains persist there, we performed the genotyping of 34 isolates of M. tuberculosis and 87 isolates of non-tuberculous mycobacteria from French Polynesia. We have described two new strains of M. tuberculosis and a new species of mycobacterium tuberculosis not. We considered, on the basis of our data, a transmission through the digestive tract for "M. canettii" and we tested the resistance "Mr. canettii" to heat. We observed the growth of the latter between 25°C and 45°C. The data we got here could form a basis to elucidate the reservoirs and sources of smooth strains.

Les bactéries productrices de β-lactamase à spectre élargi (BLSE) ont été rapportées dans plusieurs pays, mais aucune information nest disponible sur les différents types de BLSE produits par les Entérobactéries au Cameroun. On distingue plus de 290 types de β-lactamases divisés en 4 classes (A, B, C, et D) et jusquaujourdhui il nexiste pas des inhibiteurs capables dinhibés toutes les classes de β-lactamase. Un total de 267 souches dEntérobactéries a été isolé entre 1995-1998 (259 souches) et 2002 (8 souches) des produits pathologiques (urines, pus et sang) des patients hospitalisés dans divers services de lHôpital Central de Yaoundé. Létude de la sensibilité in vitro de ces bactéries à 12 antibiotiques (amoxicilline, amoxicilline/acide clavulanique, pipéracilline, imipénème, céfazoline, céfoxitine, céfotaxime, ceftazidime, aztréonam, gentamicine, ofloxacine et triméthoprime/sulfaméthoxazole) par la méthode des disques a permis de noter un certains nombre de faits : limipénème, lofloxacine et la ceftazidime sont les antibiotiques les plus actifs sur les différentes Entérobactéries avec respectivement 100%, 91% et 88% de bactéries sensibles ; les différentes souches présentent un niveau de résistance élevé à lamoxicilline (90%), à la pipéracilline (79%), à la céfazoline (75%) et au triméthoprime/sulfaméthoxazole (74%). En vue de détecter les espèces bactériennes productrices de BLSE, 69 souches résistantes à au moins une céphalosporine de 3ème génération ou au monobactame ont été soumises au test de double synergie. Trente-huit (31 entre 1995-1998 ; 7 en 2002) souches ont montré un test positif. La prévalence des souches productrices de BLSE est de 12% (31/259). Ces souches présentant un phénotype BLSE sont observées chez toutes les espèces dEntérobactéries étudiées avec une prévalence de 18,8% (Klebsiella spp.), de 17,6% (Citrobacter spp.), de 14,3% (E. coli) et de 1,8% (Proteus spp.). Parmi les 38 souches potentiellement productrices de BLSE, 18 (47,4%) ont transféré le gène de résistance des oxyimino-céphalosporines aux souches E. coli HK 225, K12 et DH5α. Seize de ces gènes ont été transférés par conjugaison et deux par transformation. Le transfert de gène de BLSE a été co-transféré avec le gène de résistance à la gentamicine et/ou au triméthoprime/sulfaméthoxazole. Toutes les souches transconjugantes et transformantes ont présenté un phénotype BLSE et ont été toutes sensibles à la céfoxitine et à limipénème. Les extraits enzymatiques bruts obtenus par sonication des souches transconjugantes, transformantes et cliniques ont été capable de réduire les diamètres dinhibition autour des disques de pénicillines, céphalosporines 1ère à la 3ème génération ou monobactame en utilisant une souche dE. coli complètement sensible aux antibiotiques, mais nont pas eu deffet sur ces zones autour des disques dimipénème, de céfoxitine et damoxicilline/acide clavulanique. La détermination des points isoélectriques (pIs) des différentes souches après transfert du gène de résistance par la technique disoélectrofocalisation a montré que les souches transconjugantes et transformantes produisent des β-lactamases dont les pIs varient de 5,4 à 8,8. En effet, 12 souches produisent les BLSE de pI 8,2 ; deux souches en plus de cette BLSE produisent deux autres enzymes de pIs 5,4 et 8,5. Les souches de phénotypes CTX-M produisent soit une enzyme (pI 8,4 ; une souche) soit deux (pIs 7,3, 8,8 ; 2 souches) ou alors 3 types (pIs 5,4 ; 7,3 et 8,8 ; une souche). Les extraits dADN de 19 souches (16 transconjugantes, 2 transformantes et 1 souche clinique) soumis à la technique de PCR, PCR/NheI, en utilisant les amorces spécifiques des gènes blaSHV, blaCTX-M, blaTEM et blaOXA ont montré que les différents extraits contiennent les gènes des b-lactamases du type SHV (sulfhydryl variable), CTX-M (cefotaximase), TEM (Temoniera) et OXA (aoxacillinase). Lanalyse de la séquence des différents produits de PCR a permis de montrer que : 14 souches produisent la BLSE SHV-12, cinq la BLSE CTX-M (CTX-M-1, une souche ; CTX-M-15, 4 souches) ; quatre souches produisent en association avec les BLSE les β-lactamases TEM-1 (SHV-12, 2 souches ; CTX-M-15, 2 souches) OXA-30 (CTX-M-15, 4 souches). Lanalyse des profils de digestion des plasmides portant les gènes blaCTX-M par les enzymes de restriction, dhybridation et des profils génotypiques des souches cliniques productrice de ces enzymes par ERIC-PCR a montré que la dissémination de la BLSE CTX-M peut se faire soit par transfert de plasmide (on retrouve le même plasmide chez deux souches différentes, E. coli YC-14 et K. pneumoniae YC-17) soit par la même souche dun patient à un autre (E. coli YC-5 = E. coli YC-2). Létude de lenvironnement génétique de ce gène (blaCTX-M-15) par lanalyse des séquences a montré que CTX-M-15 est codée par deux plasmides multirésistants différents, parmi lesquels un (pYC-5b) porte lélément ISEcp1-blaCTX-M-15 flanqué par un site de réplication constituée de 5 paires de bases et inséré dans le transposon Tn2. Une forme tronquée de cet élément a été identifiée chez lautre plasmide (pYC-14). Les BLSE SHV-12, CTX-M-1 et CTX-M-15 sont décrites pour la première fois au Cameroun. Dans le but de rechercher de nouveaux inhibiteurs des β-lactamases plus actifs, nous avons étudié deux plantes médicinales, Garcinia lucida (Clusiaceae) et Bridelia micrantha (Euphorbiceae) en vue dévaluer leur activité anti- β-lactamase. Les concentrations inhibant 50 % de l'activité de l'enzyme (CI50) des extraits de G. lucida et B. micrantha sont respectivement de 0,01 mg/ml (β-lactamase P99) et de 0,019 mg/ml (β-lactamase OXA-10) indiquant ainsi une bonne inhibition des β-lactamases par les extraits de ces plantes. Le produit 4 issu de la purification par chromatographie haute performance de lextrait de G. lucida est très actif sur la β-lactamase P99 (CI50 = 0,038 mg/ml) alors que les produits 2' et 3' provenant de lextrait de B. micrantha sont actifs sur lenzyme OXA-10 (CI50 de 0,09 mg/ml et 0,11 mg/ml respectivement). La détermination de la structure des composés actifs de ces deux plantes pourrait être une voie importante dans le développement des inhibiteurs des β-lactamases. / Bacteria producing extended-spectrum β-lactamase (ESBL) have been reported in many countries, but there is no information on different type of ESBL-producing enterobacteria in Cameroon. More than 290 β-lactamases have been described and divided into four classes (A, B, C and D) and up to now, there is no good inhibitor which can inhibite all classes of β-lactamases. A total of 267 strains of Enterobacteriaceaae were isolated between 1995-1998 (259 isolates) and 2002 (eight isolates) from pathological products (urines, pus and blood) of patients at the Yaounde Central Hospital. The susceptibility of the isolates to 12 antibiotics (amoxicillin, amoxicillin/clavulanate, piperacillin, imipenem, cefazolin, cefoxitin, cefotaxime, ceftazidime, aztreonam, gentamicin, ofloxacin and trimethoprim/sulfamethoxazole) was determined using the agar diffusion disk method. Imipenem, ofloxacin and ceftazidime were the most active antibiotics against overall enterobacteria with susceptibility rates of 100%, 91% and 88% respectively. High resistance rates were observed to amoxicillin (90%), piperacillin (79%), cefazolin (75%) and trimethoprim/sulfamethoxazole (73%). Enterobacteria isolates (69) resistant to oxyimino-cephalosporin or monobactam were screened for ESBL production by the double disk (DD) synergy test. Thirty-eight (31 from 1995-1998; seven in 2002) were proved positive to the DD synergy test, suggesting the presence of ESBL. The prevalence of ESBL was 12% (31/259) and ESBL-producing strains were Klebsiella spp. (18.8%), Citrobacter spp. (17.6%), Escherichia coli (14.3%) and Proteus spp. (1.8%). Of the 38 ESBL-producing strains, 18 (47.4%) were transferred resistance to oxyimino-cephalosporins to E. coli HK 225, K12 and DH5α. Sixteen of these strains were transferred ESBL gene by conjugation and two by transformation. Resistance to gentamicin and/or trimethoprim/sulfamethoxazole was co-transferred. All transconjugant and transformant strains exhibited ESBL phenotype but remained susceptible to cefoxitin and imipenem. Crude extracts of β-lactamase-producing transconjugants, transformants and clinical strains were able to reduce the diameters of inhibition zones around disks containing penicillins, 1st to 3rd generation cephalosporins or monobactam when tested against a fully susceptible E. coli strains, but had no effect on such zones around cefoxitin-, imipenem- and amoxicillin/clavulanate disks. The determination of isoelectric points (pIs) of the various strains after transfer of resistance determinant showed that transconjugants and transformants strains produced β-lactamases with pIs 5.4 to 8.8. In fact, 12 strains produced β-lactamase with pI 8.2, 2 strains in addition to the above enzyme produced two others enzymes with pIs 5.4 and 8.5. Strains with CTX-M- phenotype produced enzyme (pI 8.4, 1 strain), two (pIs 7.3, 8.8; 2 strains) or three types pIs (5.4, 7.3, 8.8; 1 strain). PCR, PCR/NheI was performed using total or plasmid DNA from 19 strains as templates, and the primers specific to blaSHV, blaCTX-M, blaTEM and blaOXA. Direct sequencing of PCR products revealed that: 14 strains produced SHV-12 ESBL, 5 CTX-M- ESBL (CTX-M-1, one strain; CTX-M-15, 4 strains); four other strains shared non-ESBL TEM-1 (2 producing-SHV-12 strains and 2 producing-CTX-M-strains) and OXA-30 (4 producing CTX-M-15 strains). Analysis of restriction patterns of plasmid carrying blaCTX-M gene, hybridization, and genotyping patterns of CTX-M-clinical strains by ERIC-PCR showed that dissemination of blaCTX-M gene could be done by plasmid transfer (same plasmid in different strains, E. coli YC-14 and K. pneumoniae YC-17) or by strains from patient to patient (same strain, E. coli YC-2=E. coli YC-5). Sequence analysis of genetic environment of blaCTX-M-15 revealed that CTXM-15 was encoded by two different multiresistant plasmids, of which one (pYC-5b) carried an ISEcp1-blaCTX-m-15 element flanked by five bp target site duplication and inserted within a Tn2-derived sequence. A truncated form of this element in the second plasmid (pYC-14) was identified. ESBLs SHV-12, CTX-M-1, CTX-M-15 are described for the first time in Cameroon. In our effort to find new active β-lactamase inhibitors, we investigated two medicinal plants, Garcinia lucida (Clusiaceae) and Bridelia micrantha (Euphorbiaceae) for anti- β-lactamase activity. The extracts from G. lucida and B. micrantha exhibited good inhibition of β-lactamase P99 (IC50, 0.01 mg/ml) and OXA-10 (IC50, 0.02 mg/ml) respectively. Purified products from these plants by high performance liquid chromatography showed that, product 4 from G. lucida is very active on β-lactamase P99 (IC50, 0.03 mg/ml) whereas products 2 and 3 from B. micrantha are active on OXA-10 (IC50, 0.09 mg/ml; 0.11 mg/ml respectively). The structural elucidation of the active constituents of these plants will provide useful leads in the development of β-lactamase inhibitors.

Les toxines Cry sont des protéines synthétisées sous forme de cristaux par la bactérie bacille de Thuringe pendant la sporulation. Elles sont largement utilisées comme agents de lutte biologique, car elles sont toxiques envers plusieurs espèces d’invertébrées, y compris les nématodes. Les toxines Cry5B sont actives contre certaines espèces de nématodes parasites, y compris Ankylostoma ceylanicum un parasite qui infeste le système gastro-intestinal des humains. Jusqu’au présent, le mode d’action des toxines Cry nématicides reste grandement inconnu, sauf que leurs récepteurs spécifiques sont des glycolipides et qu’elles causent des dommages importants aux cellules intestinales. Dans cette étude, on démontre pour la première fois que la toxine nématicide Cry5Ba, membre de la famille des toxines à trois domaines et produite par la bactérie bacille de Thuringe, forme des pores dans les bicouches lipidiques planes en absence de récepteurs. Les pores formés par cette toxine sont de sélectivité cationique, à pH acide ou alcalin. Les conductances des pores formés sous conditions symétriques de 150 mM de KCl varient entre 17 et 330 pS, à pH 6.0 et 9.0. Les niveaux des conductances les plus fréquemment observés diffèrent les uns des autres par environ 17 à 18 pS, ce qui est compatible avec l’existence d’arrangement d’un nombre différent de pores élémentaires similaires, activés de façon synchronisée, ou avec la présence d’oligomères de tailles variables et de différents diamètres de pores. / Cry toxins are proteins synthetized as crystal inclusions by the Bacillus thuringiensis bacterium upon sporulation. They are used widely as biological control agents, as they exhibit toxicity to a range of invertebrates, including nematodes. The Cry5B toxins are active against a number of parasitic nematode species, such as Ancylostoma ceylanicum a human gastro-intestinal parasite. So far, the mode of action of nematicidal Cry toxins is largely unknown, except for the facts that their specific receptors are glycolipids and that they cause prominent damage to nematode intestinal cells. In this study, we show for the first time that the nematicidal Cry5Ba toxin, a member of the three domain family of toxins produced by the Bacillus thuringiensis forms pores in receptor-free planar lipid bilayers. The pores formed by the toxin were cation selective, both under acid and alkaline pH conditions. Under symmetrical 150 mM KCl conditions, pore activity was characterized by conductances ranging from 17 to 330 pS, at both pH 6.0 and 9.0. The most frequently observed conductance levels differed from each other by approximately 17 to 18 pS consistent with the existence of clusters of different number of elementary, similar, co-operatively gated pores, or with the presence of variable size oligomers with different pore diameters.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal