Estudou-se, em casa-de-vegetação, o efeito da desinfestação do solo com brometo de metila e da presença de camadas subsuperficiais compactadas no desenvolvimento das raízes e no estabelecimento da simbiose da soja com as estirpes nativas do solo, SEMIA 5079 e SEMIA 5080 inoculadas individualmente. Utilizou-se para tal, amostra de Latossolo Vermelho-Escuro álico, textura média, do município de Uberlândia, MG, previamente calcareado e adubado. Os vasos utilizados, foram formados pela sobreposição de três anéis de PVC, com 1,5 dm de diâmetro e altura de 0,5 dm para o anel central e inferior e 1,25 dm para o anel superior, unidos por fita adesiva. O solo do anel central foi submetido a diferentes níveis de compactação para obter as densidades de 1,15; 1,30; 1,45; 1,60 kg dm-3. Metade do solo utilizado foi previamente desinfestado, com 0,25 dm3 m-3 de brometo de metila. Formada a coluna, pela união dos três anéis com fita adesiva foi plantada soja IAC-8, com sementes previamente desinfestadas e inoculadas com as estirpes de rizóbios SEMIA 5079 e SEMIA 5080. As estirpes nativas encontravam-se no solo utilizado. Quarenta e sete dias após a emergência, as plantas de soja foram cortadas rente ao solo, secadas em estufa de ventilação forçada, pesada e submetidas à digestão para determinação do nitrogênio. As colunas de PVC foram desmontadas para coleta e quantificação de raízes e nódulos de rizóbios. Análise e interpretação dos dados possibilitaram constatar que a produção de matéria seca da parte aérea da soja foi crescente com a desinfestação do solo e inoculação com a estirpe de rizóbio SEMIA 5080, dentro das densidades de até 1,30 kg dm-3. Para valores maiores do que este, as estirpes estudadas não diferiram entre si. A compactação, por outro lado, promoveu reduções lineares na produção da matéria seca da parte aérea no solo desinfestado, e, parabólica, com maior produção na densidade de 1,35 kg dm-3 no solo não desinfestado. A concentração de nitrogênio na parte aérea da soja foi significativamente menor com a inoculação menor com a inoculação da estirpe SEMIA 5079 no solo desinfestado, enquanto que, no não desinfestado as estirpes estudadas não diferiram entre si. A compactação aplicada reduziu linearmente a concentração de nitrogênio. Com a desinfestação do solo a maior produção ocorreu com a presença da estirpe nativa. Por outro lado, a compactação produziu efeito parabólico na produção de raízes tanto no solo desinfestado como no solo não desinfestado, com pontos de máxima produção nas densidades 1,47 kg dm-3 e 1,61 kg dm-3, respectivamente. A desinfestação do solo aumentou significativamente a massa dos nódulos em todos os níveis de compactação, enquanto que não houve efeito da estirpe inoculada. Por outro lado, a compactação promoveu aumentos da massa dos nódulos até a densidade do solo de 1,33 kg dm-3 em todas as estirpes inoculadas. Enquanto a desinfestação do solo possibilitou aumentos no número de nódulos, a inoculação não foi significativa. A compactação promoveu redução linear no número de nódulos no solo desinfestado e aumento linear no solo não desinfestado em todas as estirpes estudadas / not available

O raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar (RS) é uma das doenças mais importantes desta cultura, ocorrendo, se não em todas, na maioria das áreas de produção comercial do mundo. A falta de sintomas característicos tem dificultado uma avaliação rápida da intensidade do RS em campos comerciais e durante o melhoramento genético das variedades. Muitos métodos de diagnóstico são citados na literatura, porém não foram devidamente estudados quanto a sua eficiência e praticidade. Sendo assim, este trabalho se propôs a elucidar alguns pontos a fim de determinar um método que possua características desejáveis como praticidade na execução, economia de tempo, baixo custo e precisão. Concomitante a esta comparação de métodos, avaliou-se a resistência ao RS de algumas variedades comerciais de cana-de-açúcar para verificar a validade dos métodos na seleção de variedades resistentes. Três métodos foram avaliados: coloração do xilema através do fluxo transpiratório (CL) , observação da bactéria do RS em suco extraído do xilema (CT) e autofluorescência do metaxilema (FL). Verificou-se que os métodos (CL e CT) são equivalentes no diagnóstico do RS quando aplicados em plantas cujo processo de transporte de seiva bruta já sofreu interferência da bactéria. Nas condições testadas esta interferência ocorreu em torno de dez meses após a brotação. O método CT mostrou maior sensibilidade por detectar o patógeno em colmos na fase inicial do processo patológico. A simplicidade de execução e o baixo custo do método CL permitem a sua utilização para avaliação de campos comerciais, viveiros de mudas e seleção de variedades resistentes nos programas de melhoramento genético. / The ratoon stunting disease of sugarcane (RSD ) is one of the most important diseases of this crop, occurring, if not in alI, in most of the commercial production areas of the world. The lack of characteristic symptoms has made more difficult a quick evaluation of the intensity of RSD in commercial fields and during the breeding of the varieties. Many diagnostic methods are mentioned in the literature. However, they were not properly studied regarding their efficiency and practicability. Therefore, this work was proposed to illustrate some points, in order to determine a method that has desirable characteristics such as, practicability in execution, economy of time, low cost and accuracy. Simultaneously with this comparison of methods, the resistance to RSD was evaluated in some commercial varieties of sugarcane in order to verify the validity of the screening method of resistant varieties. Three methods were evaluated: staining of the xylem by means of the transpiratory flow (CL), observation of the RSD bacterium in juice extracted from the xylem (CT) and alkaline-induced metaxylem autofluorescence (FL). It was verified that the methods (CL and CT) are equivalent in diagnosis of RSD when applied in plants where the bacterium had already interferred in the transport of xylem sap. Under the conditions tested, this interference occurred in approximately ten months after sprouting. The CT method showed greater sensivity for detecting the disease in stalks in the initial phase of the pathological process. The simplicity of execution and the low cost of the CL method permit its utilization for evaluation of commercial fields and nurseries and screening of resistant varieties in the breeding programs

Variedades transgênicas de cana-de-açúcar (Saccharum ssp.), resistentes a Diatraea saccharalis (broca da cana-de-açúcar), foram obtidas por bombardeamento de calos embriogênicos com partículas de tungstênio cobertas com os plasmídeos pCIB4421 (construção contendo o gene que codifica a toxina CryIA(b) de Bacillus thuringiensis (Bt) e o promotor da fosfoenolpiruvato carboxilase de milho), pCIB4426 (construção contendo o gene que codifica a toxina CryIA(b) de Bt e o promotor de um gene expresso especificamente em vasos condutores de milho) e pHA9 (construção do gene neo, que confere resistência a antibióticos). Estes plasmídeos foram usados em experimentos de co-transformação, e a seleção in vitro foi feita com o antibiótico geneticina. A eficiência de co-transformação foi alta, sendo que foram obtidas plantas transgênicas de duas variedades comerciais brasileiras. A primeira etapa envolveu a produção in vitro de calo, a partir de folhas jovens em meio CI-3clav (MS modificado, suplementado com 2,4-ácido diclorofenoxiacético e Clavulin®). Calos embriogênicos foram repicados e selecionados no mesmo meio, sendo subseqüentemente bombardeados com os plasmídeos citados acima. Calos e plantas foram selecionados para resistência a antibiótico em meio CI-3 contendo geneticina (CI-3Gen35). As plantas regeneradas foram enraizadas em meio CIGen35 (sem 2,4-D) e transferidas para a casa-de-vegetação, onde foram testadas para resistência ao antibiótico canamicina. As plantas transformadas foram analisadas através de bioensaios, Southern Blot, PCR, ELISA e experimentos de campo. Plantas transgênicas das variedades comerciais SP80-1842 e SP80-3280 foram multiplicadas, estabelecidas no campo e avaliadas quanto à similaridade fenotípica com as variedades originais, intensidade de infestação de brocas e características tecnológicas. Este estudo mostra a eficiência do gene que codifica a proteína CryIA(b) de Bacillus thuringiensis quando introduzido no genoma da cana-de-açúcar, expressando resistência a Diatraea saccharalis / not available

Neste trabalho, foram realizados estudos envolvendo a relação tritrófica onde as plantas de cana-de-açúcar transgênica fazem parte do primeiro nível trófico, que alimenta o segundo nível, formado pelos insetos-alvo (neste caso, a broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis), os quais possuem inimigos naturais (o parasitóide Trichospilus diatraeae), caracterizando o terceiro nível trófico, sendo analisada a longevidade, a fertilidade, a porcentagem de parasitismo e a atratividade da planta transgênica ao parasitóide. Outro teste envolveu o pulgão da cana-de-açúcar Melanaphis sacchari (segundo nível trófico), e o predador Chrysoperla externa (terceiro nível trófico) sendo que os parâmetros avaliados foram a longevidade, a fertilidade, o período de desenvolvimento e a viabilidade. As pesquisas foram desenvolvidas no Departamento de Entomologia da Cooperativa de Produtores de Cana, Açúcar e Álcool do Estado de São Paulo Ltda (COPERSUCAR), de Piracicaba-SP, que possui o Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB) - nº 0006-96. Os resultados demonstraram que a longevidade da progênie de T. diatraeae foi maior quando comparada com a longevidade das fêmeas de T. diatraeae utilizadas para o parasitismo de pupas da broca da cana-de-açúcar. O número de descendentes de T. diatraeae foi semelhante quando comparado com as plantas transgênicas e a testemunha. Nos testes realizados em telado envolvendo a mesma praga e o parasitóide T. diatraeae não ocorreram diferenças significativas nos diferentes tratamentos. Experimentos com o predador C. externa demonstraram algumas diferenças significativas, na longevidade das larvas de 2º instar e na fase pupal, enquanto que na primeira geração a diferença significativa foi maior apenas na fase pupal. O número de ovos foi semelhante em todos os tratamentos, e a razão sexual de C. externa foi de uma fêmea para um macho. / not available

Xylella fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica transmitida por insetos vetores conhecidos como cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae, Subfamília Cicadellinae). Uma estirpe desta bactéria causa o Mal de Pierce em videira nos EUA e México. No Brasil, esta bactéria ainda não foi detectada colonizando videira, embora esta cultura tenha importância em algumas regiões Nesta pesquisa foi feito um levantamento faunístico de cigarrinhas da família Cicadellinae por meio de armadilhas adesivas amarelas em vinhedos dos Estados do Rio Grande do Sul e Pernambuco, com o objetivo de identificar potenciais vetoras de X. fastidiosa e sua flutuação populacional. Para a obtenção das cigarrinhas foram realizadas coletas com cartões adesivos amarelos em quatro parreirais comerciais de Vitis vinifera para cada Estado. Em cada parreiral foram instalados 20 cartões, distribuídos em 10 pontos espaçados de 40 x 40 m, com duas alturas de amostragem (45 cm do solo e 45 cm acima da lâmina foliar de videira). Os cartões adesivos foram trocados quinzenalmente no período de setembro/2004-setembro/2006 e junho/2005-junho/2007 no Rio Grande do Sul e Pernambuco, respectivamente. Baseando-se em análise faunística, determinaram-se as espécies de cigarrinhas mais abundantes, constantes, freqüentes e dominantes, as quais foram avaliadas quanto à flutuação populacional. No Rio Grande do Sul, 34 espécies de cicadelíneos e 6 de cercopídeos foram encontradas. Porém, a maioria (98,4%) dos 3,893 espécimes coletados foram cicadelídeos, distribuídos nas subfamílias Cicadellinae (n = 2.344; 23 espécies), Gyponinae (n = 1.327; 9 espécies), Deltocephalinae (n = 147; 1 espécie) e Coelidinae (n = 13; 1 espécie). Os insetos da subfamília Cicadellinae foram divididos nas tribos Cicadellini (n = 1.606; 12 espécies) e Proconiini (n = 738; 11 espécies). Dentre os cicadelíneos, 5 espécies de Cicadellini (Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus dispar, Macugonalia cavifrons e a morfo-espécie Cicadellini sp. 1) e 5 de Proconiini (Molomea consolida, Oncometopia facialis, Oncometopia fusca e Tapajosa rubromarginata) prevalecem nos vinhedos do Rio Grande do Sul, de acordo com as análises faunísticas. Nos vinhedos de Pernambuco, verificou-se uma menor diversidade de espécies de cigarrinhas em relação aos do Rio Grande do Sul. Um total de 4.106 cicadelídeos foram coletados, pertencentes a duas subfamílias: Cicadellinae (n = 4.094; 4 espécies) e Gyponinae (n = 12; 2 espécies). A espécie mais abundante foi a H. spottii com 3.965 indivíduos encontrados. Esta espécie utiliza a videira como hospedeiro de oviposição e desenvolvimento. Os períodos de maior ocorrência de cigarrinhas nos vinhedos são de outubro a agosto na Serra Gaúcha, e de janeiro a junho em Pernambuco. Neste estudo também foi testada a possibilidade de transmissão por cigarrinhas de uma estirpe de X. fastidiosa de citros, causadora da Clorose variegada dos citros (CVC), para videira e ameixeira. Não houve transmissão para videira, indicando que a estirpe de X. fastidiosa de citros pode não ser capaz de estabelecer infecção sistêmica em videira, após a inoculação por inseto vetor. No entanto, a diversidade e abundância de cigarrinhas potenciais vetoras nos Estados de Pernambuco e Rio Grande do Sul indicam um grande risco para disseminação do Mal de Pierce em videira caso uma estirpe de X. fastidiosa patogênica a esta cultura seja introduzida ou evolua a partir de estirpes existentes no Brasil. / Xylella fastidiosa is plant-pathogenic bacterium transmitted by leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the subfamily Cicadellinae, commonly known as sharpshooters. In the United States and Mexico, a particular strain of this bacterium causes Pierce\'s disease (PD) in grapevines. PD has not been reported in Brazil, although grape is a major crop in some regions of this country. In this study, a 2-year survey of Cicadellidae leafhoppers was carried out by yellow sticky traps in vineyards of the States of Rio Grande do Sul and Pernambuco, in order to identify potential vectors of X. fastidiosa as well as their seasonal patterns of occurrence in the crop. The survey was conducted in four commercial plantings of Vitis vinifera L. per State, by using 20 traps distributed in 10 sampling points and 2 heights (45 cm above soil and 45 cm above the crop canopy) per vineyard. The cards were changed fortnightly during the periods of September/2004-September/2006 and June/2005-June/2007 in the States of Rio Grande do Sul and Pernambuco, respectively. Faunistic analyses of the trapping data from each vineyard were run to determine the most abundant, constant, frequent and dominant sharpshooter species, for which the population fluctuation was studied. In Rio Grande do Sul, 34 leafhopper and 6 spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae) species were trapped, but most (98.4%) of the 3,893 specimens collected were leafhoppers, which were distributed in the subfamilies Cicadellinae (n = 2,344; 23 species), Gyponinae (n = 1,327; 9 species), Deltocephalinae (n = 147; 1 species) and Coelidinae (n = 13; 1 species). The sharpshooter (Cicadellinae) specimens were divided in the tribes Cicadellini (n = 1,606; 12 species) and Proconiini (n = 738; 11 species). Among the sharpshooters, 5 species of Cicadellini (Bucephalogonia xanthophis, Dilobopterus dispar, Macugonalia cavifrons and the morpho-species Cicadellini sp. 1) and 5 of Proconiini (Molomea consolida, Oncometopia facialis, Oncometopia fusca and Tapajosa rubromarginata) are prevalent in vineyards of Rio Grande do Sul based on the faunistic indices. In the vineyards of Pernambuco State, a different species composition and a lower diversity of sharpshooters were found. A total of 4,106 leafhopper specimens were trapped, distributed in two subfamilies: Cicadellinae (n = 4,106; 4 species) and Gyponinae (n = 12; 2 species). H. spottii was the most abundant sharpshooter, with 3,965 specimens. The periods of higher sharpshooter populations in the vineyards are from October to August in Rio Grande do Sul, and from January to June in Pernambuco. The possibility of transmission of a Citrus variegated chlorosis (CVC) strain of X. fastidiosa from citrus to grape was tested by using the sharpshooter B. xanthophis as a vector. No transmission to the test plants was recorded, suggesting that the CVC strain may not establish systemic infections in grape after vector inoculation. However, the diversity and abundance of native sharpshooters found in Rio Grande do Sul and Pernambuco indicate a high risk of PD spread in vineyards if a pathogenic strain of X. fastidiosa to grapes evolves or is introduced in Brazil.

Phrynops geoffroanus é uma espécie de quelônio com ampla distribuição na América do Sul, ocupando diversos tipos de habitat, inclusive rios urbanos poluídos. Com o objetivo de se conhecer aspectos ecológicos da espécie em ambientes antropizados, durante os anos de 2006 e 2007 foi realizado um estudo na bacia do rio Piracicaba, tendo como sítios amostrais o rio Piracicaba e seu afluente o ribeirão Piracicamirim. Um dos temas deste estudo foi à avaliação de aspectos sanitários da espécie. Foi investigado o perfil hematológico dos cágados no rio Piracicaba e ribeirão Piracicamirim, e avaliado um índice de estresse (razão heterófilo/linfócito), que além dos dois corpos d\'água foi adicionado um grupo de animais provenientes de cativeiro, da Fundação Parque Zoológico de São Paulo. A diferença entre um rio de maior volume, Piracicaba, e seu afluente Piracicamirim, ambos poluídos e com diferentes históricos de ocupação do solo, pouco influenciaram nas variações dos dados hematológicos dos cágados e os animais não apresentaram nenhum sinal de enfermidade através dos resultados obtidos no hemograma. Estas análises foram o tema do primeiro capítulo desta dissertação. Outro aspecto sanitário avaliado foi a microbiota bacteriana oral dos cágados em ambos os corpos d\'água, abordado no segundo capítulo. As amostras foram incubadas a 25 e 37ºC. Avaliou-se a patogenicidade das bactérias tanto para os cágados quanto para seres humanos. Houve crescimento de bactérias patogênicas para o homem e para os animais e a bactéria mais prevalente a 37ºC foi a Escherichia coli. Apesar disso, os cágados não apresentaram sinal aparente de infecção. Estudos de longo prazo são recomendados para animais residentes em ambientes antropizados, monitorando-se o estado sanitário e aspectos ecológicos e demográficos. / Phrynops geoffroanus is a freshwater turtle species, with a wide distribution in South America, living in many types of habitats, including polluted urban rivers. During 2006 and 2007, aiming to study ecological aspects of the species in anthropogenic environments, it was conducted an investigation at Piracicaba River Basin, in two sample sites, the Piracicaba river and its tributary, Piracicamirim stream. One of the topics studied was a health assessment of the turtles. It was examined the blood profile in Piracicaba and Piracicamirim turtles and evaluated a measure of stress (heterophil/lymphocyte ratio), that had another study group besides the animals from the rivers, turtles in captivity from Sao Paulo Zoo Park Foundation. The difference between a large river, Piracicaba and its tributary Piracicamirim, both polluted and with different soil use and occupation had a little influence on turtles\' hematological variation, and the animals did not show any sign of disease through the blood profile examination. These evaluations were the subject of the thesis\' first chapter. Another part of the health assessment study, subject of the second chapter, was the oral microbiota investigation, performed in Piracicaba and Piracicamirim turtles. The samples were incubated at 25 and 37º Celsius, aiming to check the bacterium\'s pathogenicity for the animals and for humans. The results showed growth of pathogenic bacterium for both and the most prevalent bacteria at 37ºC was Escherichia coli. Although, the turtles did not show any sign of infection. Long-term studies are suggested for turtles living in anthropogenic environments to monitor their health status, demography and ecological issues.

Muitos fatores, como variações sazonais, tipos de tecido vegetal, cultivares e espécies de hospedeiro, tipo de solo, interação com microrganismos benéficos ou patógenos entre outros, afetam a estrutura e a composição da comunidade bacteriana das plantas. A introdução de plantas geneticamente modificadas (PGM) foi somada ao conjunto desses fatores, podendo acarretar efeitos diretos e indiretos sobre a comunidade bacteriana. Cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância no Brasil; a área de cultivo está em expansão devido aos incentivos para a produção de álcool. Uma bactéria potencialmente importante para a cultura de cana-de-açúcar é a Methylobacterium, um importante endófito de diversas culturas de interesse econômico e que, em cana-de-açúcar, pode melhorar a germinação de sementes, promover um aumento do peso da planta e da área foliar, além do número de internódios. Dessa forma, o trabalho teve como objetivos: i) avaliar os efeitos da canade- açúcar transgênica resistente a insetos e a herbicida sobre a comunidade bacteriana associada; ii) avaliar se o suposto efeito causado pela cana-de-açúcar transgênica resistente a herbicida deriva diretamente do transgene ou dos tratos culturais diferenciados aos quais a planta transgênica é submetida; iii) avaliar a interação entre Methylobacterium spp. e cana-de-açúcar. Analisando a densidade bacteriana das plantas de cana-de-açúcar convencionais e transgênicas não foi possível constatar diferenças relacionadas à introdução dessas plantas. Analisando somente quanto ao manejo de ambos os experimentos, foi possível observar que diferenças em trato cultural ou manejo de plantas, decorrentes ou não da transgenia, podem influenciar a comunidade bacteriana. Por meio de ARDRA, foi possível observar distribuição diferenciada dos ribotipos com a introdução das PGMs. No experimento realizado somente com plantas transgênicas para resistência a Imazapyr, foi possível notar que, em 17 meses, a presença da planta transgênica e a aplicação do herbicida Imazapyr podem ter resultado na redução da densidade bacteriana associada à rizosfera de cana-de-açúcar. Por meio de DGGE, foi visto que o estado fisiológico da planta foi a maior fonte de variação. Novamente por meio de ARDRA, foram observados ribotipos cuja presença foi afetada pelo cultivo da planta transgênica. Esses ribotipos diferentemente distribuídos poderiam resultar em alterações na atividade bacteriana dessas plantas, uma vez que esses ribotipos podem representar grupos funcionais importantes. A colonização de Methylobacterium spp. em cana-de-açúcar foi analisada por meio de microscopia eletrônica de varredura, reisolamento e microscopia óptica de fluorescência. Foi visto que as linhagens utilizadas colonizam cana-de-açúcar, sendo que os pontos de maior colonização são os flanges cuticulares e as regiões pilosas da raiz. Outros estudos são necessários para o melhor aproveitamento dessa bactéria na cultura de cana-de-açúcar. / Many factors, such as seasonal variations, kinds of vegetal tissue, cultivares and host species, kind of soil, interaction with beneficial or pathogen microorganisms, among others, affect the structure and composition of plants bacterial community. The introduction of genetically modified plants (GMP) was added to the set of these factors, making it possible to cause direct and indirect effects on the bacterial community. Sugarcane is a very important crop in Brazil; the cultivation area is expanding due to incentives to alcohol production. A potentially important bacterium for sugar cane cultivation is the Methylobacterium, which is an important endophyte for several cultures of economic interest and which can improve seed germination in sugar cane, promote an increase of plant weight and foliar area, and also the internodes. Thus, the work had as objectives: i) to assess the effects of transgenic sugarcane resistant to insects and herbicide on the associated bacterial community; ii) to assess if the presumed effect caused by transgenic sugarcane resistant to herbicides derives directly from the transgene or differentiated cultural handlings to which the genetically modified plant is undertaken; iii) to assess the interaction between Methylobacterium ssp. and sugarcane. Analyzing the bacterial density of conventional and transgenic sugarcane plants it was not possible to see differences related to the introduction of these plants. Analyzing only in relation to the handling of both experiments, it was possible to see that differences in cultural wielding or handling of plants derived or not from transgenia can influence the bacterial community. By means of ARDRA, it was possible to see a differentiated distribution of ribotypes with the introduction of GMPs. In the experiment made only with transgenic plants for Imazapyr resistance, it was possible to see that in 17 months, the presence of the transgenic plant and the application of Imazapyr herbicide can bring result regarding the bacterial density reduction associated to sugarcane rizosphere. By means of DGGE, it was seen that the physiological status of the plant was the greatest variation source. Again, by means of ARDRA, ribotypes whose presence was affected by transgenic plant cultivation were observed. If distributed differently, these ribotypes can represent important functional groups. The Methylobacterium ssp. Colonization in sugarcane was analyzed and by means of scanning electronic microscopy, re-isolation, and fluorescence optical microscopy. It was observed that the utilized lineages colonize sugarcane being cuticle flange and perilous regions of root the highest colonization points. Other studies are needed to a better good use of this bacterium in sugarcane culture.

Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.

A utilização de vacinas destaca-se como medida preventiva contra a leptospirose. Sete potenciais antígenos vacinais de L. interrogans sorovar Copenhageni foram estudados: LipL32, LipL23 e LipL22 (lipoproteínas), SphH e Sph4 (hemolisinas), AnkB (domínio anquirina) e OmpA76 (domínio OmpA). Os genes foram amplificados, clonados e as proteínas expressas em E.coli e Salmonella enterica para ensaios de imunização e desafio. As sete proteínas foram purificadas. No primeiro desafio, hamsters foram imunizados com a salmonela recombinante para expressar a OmpA76 e desafiados com sorovar Pomona. Sobreviveu 30% do grupo salmonela recombinante, 100% da vacina comercial e 10% dos controles. No segundo desafio, hamsters foram imunizados com pool das sete proteínas e desafiados com sorovar Copenhageni. Sobreviveram 30% do grupo pool de proteínas, 90% da vacina comercial, 100% da bacterina e 0% do grupo PBS. A LipL32, OmpA76, LipL23 e LipL22 reagiram com soros de hamsters infectados. Extratos de leptospiras foram reconhecidos pelos soros específicos contra LipL32, OmpA76 e LipL23. / Preventive measures as vaccines are the best strategies to combat leptospirosis. Seven potential vaccine candidates from L. iInterrogans serovar Copenhageni were studied: LipL32, LipL23 and LipL22 (lipoproteins), SphH e Sph4 (hemolysins), AnkB (ankyrin domain) and OmpA76 (OmpA domain). The genes were amplified, cloned and the proteins expressed in E. Coli e Salmonella enteric for challenge assays. In the first assay, hamsters were immunized with the recombinant salmonella to express OmpA76 in vivo, and challenged with serovar Pomona. The survival was 30% of the recombinant salmonella group, 100% of the commercial vaccine and 10% of the control groups. In the second assay, hamsters were immunized with a pool of the purified proteins and challenged with serovar Copenhageni. The survival was 30% of the group pool of proteins, 90% of the commercial vaccine, 100% of the bacterin and 0% of the PBS group. LipL32, OmpA76, LipL23 and LipL22 reacted with hamsters infected sera. Leptospiral extracts were recognized by specific sera against LipL32, OmpA76 and LipL23.

Os micro-organismos desempenham importante papel na reciclagem dos elementos em ecossistemas de manguezais, uma vez que como produtores primários podem controlar reações químicas. O grupo particular das cianobactérias atua promovendo a entrada de carbono e nitrogênio por meio da sua capacidade de realizar fotossíntese oxigênica e fixação de nitrogênio atmosférico. No Brasil, as florestas de manguezais ocupam uma área de aproximadamente 25.000 km2 e no Estado de São Paulo, 240 km2 da área total está coberta por este ecossistema. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de cianobactérias que colonizam as folhas de Avicennia schaueriana, Rhizophora mangle e Laguncularia racemosa do manguezal da Ilha do Cardoso, um ambiente pristino, bem como acessar e comparar a população de cianobactérias dos solos dos manguezais da Ilha do Cardoso e de Bertioga, este último contaminado com óleo bruto. Para este propósito, as técnicas de DGGE e biblioteca de clone do gene RNAr 16S, ARISA e TRFLP do gene nifH foram utilizadas. Os resultados da filosfera evidenciaram uma sutil influência do gênero de árvore na colonização das cianobactérias, entretanto, um forte efeito da localização destas dentro do manguezal foi observado. As folhas das árvores do meio da área de manguezal apresentaram uma maior diversidade de gêneros de cianobactérias. No geral, foram identificados 19 gêneros e várias sequências de cianobactérias não cultiváveis. Uma predominância de sequências com alta similaridade com representantes das ordens Nostocales e Oscillatoriales foi observada. Sequências com identidade com o gênero Symphyonemopsis (ordem Stigonematales) foram recuperadas em maiores quantidade. Com relação à diversidade no solo, os resultados de DGGE e ARISA demonstraram que a população de cianobactérias é distinta entre os manguezais estudados, porém os perfis eletroforéticos das amostras coletadas próximo ao mar se agruparam, sugerindo que a colonização é influenciada pelas condições de inundação. O perfil mais diferente foi obtido no ponto próximo à floresta no manguezal de Bertioga, local mais afetado pela contaminação de óleo. As bibliotecas de clones claramente indicaram diferenças das sequências do gene RNAr 16S entre os pontos amostrados. Um total de 99 UTOs foi obtido, com 61 "singletons". Na localidade próxima ao mar os gêneros Procholorococcus e Synechococcus foram dominantes em ambos os manguezais. A maioria das sequências de RNAr 16S encontradas nos outros pontos foram relacionadas com cianobactérias não cultiváveis. A diversidade alfa sugeriu que o local com menor diversidade foi o meio do manguezal de Bertioga, e o maior foi em Bertioga próximo à floresta, os demais pontos tiveram valores similares. Os maiores índices de riqueza foram encontrados nos pontos próximos à floresta, enquanto menores valores foram observados nos pontos próximos ao mar. A maioria das sequências de RNAr 16S obtidas em Bertioga no meio do manguezal e próximo à floresta tiveram identidades menores do que 90% com as disponíveis no GenBank. Estas sequências podem representar novos táxons ou cianobactérias conhecidas, porém ainda não sequenciadas. O TRFLP do gene nifH indicou que os locais próximos ao mar e meio do manguezal na Ilha do Cardoso abrigaram populações de diazotróficos semelhantes, enquanto que em Bertioga estes pontos apresentaram diferenças nos perfis de TRFLP. As maiores diferenças estavam nos locais próximos à floresta em ambos os manguezais. / Microorganisms play important role in the recycling of elements in mangrove ecosystems, since as primary producers they can control chemical reactions. The particular cyanobacteria group act promoting the input of carbon and nitrogen through their ability to realize oxygenic photosynthesis and fixing atmospheric nitrogen. In Brazil, the mangrove forests occupy an area of approximately 25.000 km2, and in the total area of São Paulo State, 240 km2 are covered by this ecosystem. The aim of this work was to evaluate the cyanobacterial diversity that colonize Avicennia schaueriana, Rhizophora mangle and Laguncularia racemosa leaves from Cardoso Island mangrove, a pristine site, as well as to assess and compare the soil cyanobacterial population from both Cardoso Island and Bertioga mangroves, this last one contaminated with crude oil. For this purpose, the techniques of DGGE and clone library of 16S rRNA gene, ARISA, and TRFLP of nifH gene were used. The phyllosphere results evidenced a subtle difference of the genus of tree on the colonization of cyanobacteria, however a strong effect from tree’s location within the mangrove was observed. The tree leaves from the middle of mangrove area showed a greater diversity of cyanobacterial genera. In geral, 19 genera and several uncultivated cyanobacteria were identified. A predominance of sequences with high similarities to representatives of the order Nostocales and Oscillatoriales were observed. Sequences with similarities to the genus Symphyonemopsis (order Stigonematales) were recovered in higher quantity. Regarding to the soil diversity, DGGE and ARISA results showed that the cyanobacterial population is distinct among both mangroves studied, however the electrophoretic profiles from samples collected near to the sea grouped together, suggesting that colonization is influenced by flood conditions. The most different profile was obtained in the site near to the forest in Bertioga mangrove, location more affected by the oil contamination. Clone libraries clearly showed 16S rRNA sequences differences among sites sampled. A total of 99 OTUs were obtained, with 61 singletons. In the site near to the sea the Procholorococcus and Synechococcus genera were dominant in both mangroves. The majority of 16S rRNA sequences found in the other sites were related to uncultured cyanobacteria. Alpha diversity suggested that the site with lowest diversity was middle of the Bertioga mangrove, and the highest was Bertioga near to the forest, the remainder sites had similar values. The highest richness indices were found in the sites near to the forest, while lower values were observed in the sites near to the sea. The majority of the 16S rRNA sequences obtained from the middle of the mangrove and near to the forest in Bertioga showed identities lower than 90% with that available in the GenBank. These sequences may represent novel cyanobacterial taxa or known cyanobacteria not yet sequenced. The TRFLP of nifH gene indicated that the sites near to the sea and middle of the Cardoso Island mangrove harbored similar diazotrophic populations, while in Bertioga these sites presented differences in TRFLP profiles. The greatest differences were in the sites near to the forest in both mangroves.