A hidroxiapatita (HA) tem sido amplamente utilizada como material de implante por possuir alta similaridade com a composição dos ossos e ter capacidade de formar ligações químicas fortes com o tecido ósseo. Entretanto, a adsorção fácil de moléculas orgânicas (proteínas, aminoácidos e polissacarídeos) pela HA também favorece a adsorção e replicação de bactérias, aumentando os casos de infecções relacionados a esse biomaterial. Visando contribuir para o avanço de novos biomateriais com propriedades antibacterianas, foram produzidas neste trabalho hidroxiapatitas contendo nanopartículas de prata (AgNPs) com diferentes proporções (0,01; 0,05; 0,10 e 0,25% m/m). A primeira etapa do trabalho consistiu na obtenção do pó de HA por precipitação química e na produção de AgNPs em suspensões coloidais por meio de síntese que utiliza a quitosana como agente redutor e estabilizante. Na segunda etapa, as AgNPs foram adsorvidas na HA pelo método de imersão do pó usando um dos coloides sintetizados, obtendo-se quatro hidroxiapatitas contendo AgNPs (HA-AgNPs) nas formas de pó e disco. Na terceira e última etapa, os materiais produzidos foram caracterizados utilizando diversas técnicas e os pós (HA e HA-AgNPs) foram submetidos a avaliações in vitro. O efeito antibacteriano foi avaliado frente a cepas de S. aureus e E. coli utilizando métodos qualitativos e quantitativos. A adesão bacteriana sobre a superfície dos discos foi observada por microscopias eletrônica de varredura (MEV) e confocal de varredura a laser. A citotoxicidade in vitro foi avaliada utilizando cultura de células contendo linhagem de osteoblastos (MG-63). Nesse ensaio, a viabilidade dos osteoblastos foi estudada usando o teste da resazurina; a atividade enzimática foi investigada através da fosfatase alcalina (ALP); e a adesão dos osteoblastos foi observada por MEV. Os resultados mostraram que a HA produzida é nanométrica e que as AgNPs sintetizadas são estáveis e esféricas, com diâmetros variando entre 5-10 nm. Técnicas de MEV, EDS e ICP-AES confirmaram a presença de prata nas HA-AgNPs. As demais caracterizações não mostraram alterações relevantes na estrutura, morfologia e características de superfície (hidrofobicidade e carga líquida). No entanto, a atividade antibacteriana dos materiais mostrou-se eficiente para ambas as cepas e com uma redução de 99,9% das colônias bacterianas em quase todos os materiais já nas primeiras 4 h. Também foi encontrado que a eliminação foi maior tanto para E. coli quanto utilizando materiais em pó. O estudo da adesão bacteriana confirmou os resultados anteriores mostrando efeito superior para quase todas HA-AgNPs produzidas comparado a HA, exceto para o material com menor proporção de AgNPs (0,01% m/m). Por outro lado, os testes de viabilidade, ALP e adesão demonstraram que a HA-AgNPs com maior quantidade de AgNPs (0,25% m/m) tem um efeito negativo sobre os osteoblastos. Considerando ambos os efeitos de citotoxicidade e antibacteriano, aliado a metodologia simples e de baixo custo envolvido na produção desses materiais, sugere-se que a HA contendo entre 0,05 0,10% m/m das AgNPs sintetizada pode ser a mais favorável para o desenvolvimento proposto visando futuras aplicações biomédicas. / Hydroxyapatite (HA) has been widely used as implant material due to its high similarity with the bone composition and its capacity to form strong chemical bonds with the bone tissue. However, the easy adsorption of organic molecules (proteins, amino acids and polysaccharides) by the HA also favors bacteria adsorption and replication, increasing the cases of infection related to this biomaterial. Aiming to contribute to the advancement of new biomaterials with antibacterial properties, were produced in this work hydroxyapatites containing silver nanoparticles (AgNPs) with different ratios (0.01, 0.05, 0.10 and 0.25% m/m). The first step of this work consisted in obtaining the HA powder by chemical precipitation and production of AgNPs colloidal suspensions by synthesis using chitosan as a reducing agent and stabilizer. In the second step, the AgNPs were adsorbed to the HA matrix by the powder immersion method using onde of the synthesized colloids, resulting in four hydroxyapatites containg AgNPs (HA-AgNPs) in disk and powder forms. In the third and final step, the materials produced were characterized using several techniques, with the powders (HA and HA-AgNPs) evaluated in vitro. The antibacterial effect was evaluated against strains of S. aureus and E. coli using qualitative (ágar diffusion test) and quantitative (bacterial colony counts) methods. The bacterial adhesion over the disks surface were observed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and confocal laser scanning microscopy. Cytotoxicity was evaluated in vitro using cell culture containing the osteoblast lineage (MG- 63). In this assay, osteoblasts viability was studied using the resazurin test; the enzyme activity was investigated by alkaline phosphatase (ALP), and osteoblast adhesion was observed by SEM. The results showed that the HA produced is nanometric and the synthesized AgNPs are stable and spherical with diameters ranging from 5-10 nm. SEM, EDS and ICP-AES techniques confirmed the presence of silver in the HA-AgNPs. The others characterizations showed no significant changes in the structure, morphology and surface characteristics (hydrophobicity and net charge). However, the materials antibacterial activity was effective for both strains and with reduction of 99.9% of bacterial colonies in almost all materials within the first 4 h. It was also found that the removal was as great for E. coli as for powder materials. The bacterial adhesion study confirmed previous results showing superior effect for almost all HA-AgNPs produced compared to HA, except for the material with the lowest proportion of AgNPs (0.01% m/m). On the other hand, viability tests, ALP and adhesion demonstrated that HA-AGNPS with higher AGNPS quantities (0.25% m/m) has a negative effect on osteoblasts. Considering both cytotoxicity and antibacterial effects, combined with the simple methodology and low cost involved in the production of these materials, it is suggested that the HA containing synthesized AgNPs ranging from 0.05 to 0.10% m/m can be the most favorable for the development of the proposed material for future biomedical applications.

A pele e as mucosas constituem as primeiras barreiras na defesa contra infecções e os macrófagos são componentes essenciais do sistema imune inato, importante neste aspecto. O envolvimento destas células pode ser verificado em grande percentual das imunodeficiências primárias. Desta forma, a avaliação da função fagocitária é de extrema relevância para o reconhecimento dos distúrbios imunológicos que acometem a pele. O objetivo do presente estudo foi avaliar a metodologia laboratorial para a detecção de defeitos funcionais dos fagócitos. Para isto foram estabelecidos os seguintes testes laboratoriais: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), Dihidrorodamina (DHR), quimiotaxia, fagocitose e a aderência de S. aureus e C. albicans por citometria de fluxo (CF), além de morte intracelular de S. aureus e C. albicans (CF). Para verificar a integridade do sistema complemento realizou-se ensaios hemolíticos para as vias clássica e alternativa (CH50 e AP50). A metodologia proposta foi aplicada em indivíduos normais para a padronização dos testes. O burst oxidativo avaliado pelo teste da dihidrorodamina (DHR) foi aplicado em 101 indivíduos saudáveis e em paralelo, 50 indivíduos sadios para o teste do NBT. Os mesmos testes foram realizados em pacientes com Candidíase mucocutânea crônica (CMC) (n=9 ), Candidíase persistente (n=5), Suspeita de distúrbios de fagócitos (SDF) (n=14), Doença Granulomatosa Crônica (DGC)(n= 7) e portadores de DGC (n=5). A quimiotaxia foi padronizada em 34 controles para neutrófilos estimulados com Lipopolissacarídeo de E.Coli (LPS) e 5 com fungo Candida albicans. A técnica de fagocitose e aderência de patógenos foi padronizada com os mesmos estímulos (n=7 para fungos/n=5 para bactéria). Após a padronização, o ensaio foi aplicado em pacientes com candidíase persistente (n=5 para bactéria e n=5 para fungo) e em pacientes com CMC (n= 3 para bactéria e n=4 para fungo). Os ensaios de fagocitose e morte intracelular (capacidade bactericida e fungicida) foram padronizados em 18 indivíduos sadios para bactérias e os ensaios de morte intracelular para S. aureus foi aplicado em pacientes com CMC (n=5), com CP (n=6), com SDF (n =9) e com DGC (n=2), para os ensaios de fagocitose com morte intracelular para fungos foram utilizados 22 indivíduos saudáveis e após a padronização do ensaio foram aplicados em pacientes com CMC (n=8), pacientes com CP ( n= 7), pacientes com DGC (n=2) e indivíduos com SDF (n= 13) O ensaio de DHR foi padronizado e estabelecido em 80% de intensidade de fluorescência para células estimuladas com PMA e 15% de intensidade de fluorescência para células sem estímulo. Nos resultados do DHR encontrou-se diferença significativa no grupo de DGC (n=7)(P= 0,0001), no grupo de portadores (n=5)(P=0,0005) e no grupo de SDF (n=14)(P= 0,0053). O ensaio do DHR foi repetido após 24 horas da coleta (n=7), não se verificando alteração da resposta. A quimiotaxia mostrou diferença significativa entre C (n=4) vs SDF (n=3)(P=0,0001) e pacientes com CMC apresentaram redução da capacidade quimiotática para bactérias (n=3)e fungos (n= 4) com soro autólogo (P= 0,0246 e P=0,0109, respectivamente). Na fagocitose e aderência de bactérias inativadas ,os grupos de CMC, CP E SDF não mostraram diferenças significativas com bactérias não opsonizadas ou opsonizadas com soro AB e apresentaram menor índice de fagocitose (C x CMC)(P=0,0357) quando foram opsonizadas com soro autólogo. Na fagocitose e aderência de fungos inativados, controles e grupos de pacientes apresentaram resposta semelhante com fagocitose preservada. Os ensaios de morte intracelular para bactérias não opsonizadas houve menor expressão de fagocitose no grupo de C x SDF (P=0,0044). Na capacidade bactericida verificou-se diferença significativa entre os grupos CxCMC (P=0,0403). A opsonização das bactérias com soro AB foi significativamente diferente entre os grupos CxCP (P=0,0129) e CxSDF (P=0,0048) e com capacidade bactericida diferente entre grupos CxCP (P=0,0258) e CxSDF (P=0,0205). Na avaliação da fagocitose de bactérias opsonizadas com soro autólogo foi verificada diferença significativa entre os grupos CxCP (P=0,0013) e CxSDF (P=0,0048). Não houve diferença na capacidade bactericida dos grupos de pacientes com o controle. Os ensaios de fagocitose e morte intracelular para fungos sem opsonização não mostrou diferença estatisticamente significativa. A morte intracelular mostrou-se diferente para o grupo CxCMC (P=0,0155) e quando opsonizado com soro AB houve diferença CxCP (P=0,0369). A fagocitose com opsonização por soro autólogo significativa no grupo CxSDF (P=0,0001) e um paciente de CMC com sua fagocitose comprometida quando comparado com o controle do dia. A morte intracelular foi diferente nos grupos CxCMC (P=0,0018) e CxCP (p=0,0203). Não houve diferença estatisticamente significativa à avaliação do complemento. O ensaio do DHR mostrou ser sensível e preciso para o diagnóstico de DGC e portadores de DGC, porém pode detectar outras alterações de fagócitos. O ensaio de aderência e fagocitose mostraram-se variáveis dificultando a padronização de valores de normalidade e exclusão de defeitos. Ensaios de fagocitose com morte intracelular mostraram-se como a melhor forma de detectar distúrbios de fagócitos além do diagnóstico de DGC. A aplicação de controles do dia mostrou-se necessária e importante para a detecção de defeitos funcionais. O presente trabalho mostrou que a avaliação de distúrbios de fagócitos por morte intracelular por citometria de fluxo pode ser aplicado em outras situações clínicas com comprometimento imunológico / Skin and mucosa are part of the first barriers in the defense against infections, and the macrophages are essential components of the innate immune system, important when related to this aspect. The involvement of these cells can be seen in a large percentage of the primary immunodeficiencies. Therefore, the assessment of the phagocitary function is extremely important for the recognition of immunological disorders which affect the skin. The present study focus on the evaluation of the laboratorial methodology for the detection of functional defects of phagocytes. For this the following laboratorial tests were established: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), chemotaxis, phagocytosis and adherence of S. aureus and C. albicans through flow cytometry (FC), besides the intracellular death of S. aureus and C. albicans (FC). To assess the integrity of the complement system hemolytic assays were performed for the classic and alternative pathways (CH50 and AP50). The proposed methodology was applied to normal individuals for the standardization of the assays. The oxidative burst evaluated through the dihydrorodamine essay (DHR) was applied to 101 healthy individuals and in parallel, 50 healthy individuals for the NBT assay. The same assays were performed on patients with Chronic mucocutaneous candidiasis (CMC)(n=9), persistent candidiasis (n=5), Phagocytes disorders suspicious (PDS) (n=14), Chronicle granulomatous disease (CGD)(n=7) and CGD carriers (n=5). Chemotaxis was standardized using 34 controls for neutrophils stimulated by lipopolisacharydes from e. coli (LPS) and 5 by C. albicans. Phagocytosis and adherence of pathogens were standardized using the same stimuli (n=7 for fungi and n=5 for bacteria). Following the standardization, the assay was applied to patients with persistent candidiasis (n=5 for fungi and n=5 for bacteria) and on patients with CMC (n=4 for fungi and n=3 for bacteria). Phagocytosis and intracellular death assays (bactericidal and fungicidal capacity) were standardized using 18 healthy individuals for bacteria and the intracellular death assays for S. aureus were applied on patients suffering from CMC (n=5), from PC (n=6), from PDS (n=9) and from CGD (n=2), for the phagocytosis with fungi intracellular death assays 22 healthy individuals were used, and following the standardization the assay was applied to patients suffering from CMC (n=8), from PC (n=7), from CGD (n=2) and PDS individuals (n=13). The DHR assay was standardized and established according to fluorescence intensity 80% for cells stimulated by PMA and fluorescence intensity 15% for cells without stimuli. In the DHR results a significant difference in the CGD group (n=7)(P= 0,0001), in the carriers group (n=5)(P=0,0005) and in the PDS group (n=14)(P= 0,0053) was found. The DHR assay was performed once again 24 hours after the sample collection (n=7) and no changes in the response were seen. Chemotaxis showed a significant difference between C (n=4) vs PDS (n=3)(P=0,0001) and patients suffering from CMC showed decreased ability in the chemotaxis of bacteria (n=3) and fungi (n=4) with autologous serum (P= 0,0246 e P=0,0109, respectively). In the phagocytosis and adherence of inactivated bacteria, the CMC, PC and PDS groups showed no significant differences with non-opsonizated bacteria or opsonizated with AB serum and presented a lower phagocytosis level (C x CMC)(P=0,0357) when they were opsonizated by autologous serum. In the phagocytosis and adherence of inactivated fungi, controls and patient groups presented a similar response with preserved phagocytosis. In the intracellular death assays for non-opsonizated bacteria there was a lower phagocytosis expression in the C x SDF group (P=0,0044). In the bactericidal ability a significant difference between the groups C x CMC was seen (P=0,0403). The opsonization of bacteria with AB serum showed a significant difference among the groups C x CP (P=0,0129) and C x SDF (P=0,0048) and with different bactericidal ability among the groups C x CP (P=0,0258) and C x SDF (P=0,0205). In the evaluation of the phagocytosis of bacteria opsonizated by autologous serum a significant difference among the groups C x CP (P=0,0013) and C x SDF (P=0,0048) was seen. There was no difference between the bactericidal ability of the patients group and control group. The phagocytosis and intracellular assays for fungi without opsonization presented no significant statistical difference. Intracellular death was different for the C x CMC group (P=0,0155) and when opsonizated by AB serum difference was shown C x CP (P=0,0369). The phagocytosis with opsonization by autologous serum presented significant difference in the C x SDF group (P=0,0001) and in a CMC patient with compromised phagocytosis when compared with the daily control. Intracellular death was different in the C x CMC (P=0,0018) and C x CP (p=0,0203) groups. There was no significant statistical difference according to the complement evaluation. The DHR assay was seen as very sensitive and precise for the diagnosis of CGD, however it can detect other phagocyte alterations. The phagocytosis and adherence assay varied a lot making the standardization of normal values and defects exclusion very difficult. Phagocytosis with intracellular death assays showed the best performance to detect phagocytes disorders besides CGD diagnosis. The use of daily controls was seen as very necessary and important to detect functional disorders. This study demonstrated that phagocytes disorder evaluation through intracellular death using flow cytometry can be applied to other clinical situations which are immunologically compromised

O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, é uma das doenças mais importantes da citricultura. O estudo do efeito de medidas alternativas de controle para o manejo desta doença assume grande importância tanto para áreas citrícolas onde a erradicação de plantas não é a principal medida de controle do cancro cítrico, como no Estado do Paraná, como para regiões onde a prática da erradicação vem sendo adotada como principal medida de controle da doença, como no Estado de São Paulo. Instalado em pomar citrícola do município de Ourizona, na região Noroeste do Estado do Paraná, este trabalho buscou estudar o progresso dessa importante doença em campo sob condições de proteção química das plantas, utilizando produto cúprico; e cultural, por meio de quebra-vento. Além disso, importantes informações relacionadas ao efeito de cada tratamento sobre a produção das plantas de laranja ‘Pêra’ também foram obtidas. Enquanto a aplicação de cobre apresentou efeito significativo na redução dos níveis de cancro cítrico, o emprego de quebra-vento pouco ou nada contribuiu para o controle da doença. Após 29 avaliações mensais, plantas submetidas à aplicação de bactericida cúprico apresentaram valores médios de AUDPC* de incidência da doença nas folhas de cerca de 20 %, nível 44 % inferior ao observado para as plantas não protegidas quimicamente. O mesmo comportamento foi observado para a severidade da doença. Após 18 avaliações mensais foi possível observar que plantas submetidas à aplicação de produto cúprico apresentaram em média folhas com níveis de AUDPC* de severidade 37 % menores do que plantas não protegidas quimicamente. Em 2004, quando os níveis da doença foram relativamente elevados, plantas submetidas ao controle químico apresentaram produção 54 % superior àquelas não tratadas. Em 2005, quando os níveis de cancro foram menores, não foi observada diferença na produtividade entre os tratamentos. Nas duas safras, plantas tratadas com bactericida apresentaram menor incidência da doença em frutos e maior proporção de frutos colhidos em relação a carga total da planta (colhidos + caídos). Dos modelos testados, o logístico foi o mais adequado para descrever o progresso temporal do cancro cítrico nos dois anos estudados para todos os tratamentos. Nas duas safras estudadas a proporção de frutos colhidos foi a variável que apresentou função de dano com maior coeficiente de determinação (R2) quando relacionada aos níveis de incidência e severidade de cancro cítrico observados. / Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri, is one of the most important diseases to citrus production. The effect of alternative measures of citrus canker control is very important to areas where plant eradication is the most important measure of control, as in Sao Paulo State, as well as to areas where eradication is not a major component of canker control, as in Parana State. This work aimed to study the progress of citrus canker in field conditions under chemical control, by using copper sprays; and cultural control, by using windbreak. Field plots were installed in a citrus orchard of ‘Pêra’ sweet orange located in Ourizona county, northwest of Parana State, Brazil. Information regarding the effect of each treatment alone or in combination was assessed. Whereas copper sprays showed significant effect on reducing citrus canker levels, windbreak did not contribute significantly to disease control. After 29 monthly assessments, plants submitted to copper sprays showed values of AUDPC* of citrus canker incidence near to 20 %. This disease level was 44 % lower than that observed to plants not protected with copper compound. The same pattern was observed to disease severity. After 18 monthly assessments, plants sprayed with copper showed values of AUDPC* of disease severity 37 % lower than that observed to plants of the check plots. In 2004, when the citrus canker level was higher, plants treated with copper yielded 54 % more than that not sprayed. In 2005, when the citrus canker level was lower, no significant difference was observed between treatments. In both seasons, plants sprayed with copper showed lower citrus canker incidence on fruits and higher rate of harvested fruits. Among the temporal models tested, the logistic was the most appropriate to describe citrus canker incidence over time in both years studied to all treatments. In both harvests the rate of harvested fruits was the variable that showed the higher coefficient of determination (R2) when related to citrus canker incidence and severity levels.

HERCULANO. Emanuele Duarte. Óleo essencial de Eucalyptus staigeriana nanoencapsulado para utilização como conservante em alimentos. 2014. 86 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos, Fortaleza-CE, 2014 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-02T15:23:10Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_edherculano.pdf: 2524611 bytes, checksum: a2bde63e81c86e10551edb1c7e551872 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-02T15:24:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_edherculano.pdf: 2524611 bytes, checksum: a2bde63e81c86e10551edb1c7e551872 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T15:24:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_edherculano.pdf: 2524611 bytes, checksum: a2bde63e81c86e10551edb1c7e551872 (MD5) Previous issue date: 2014 / In this study, the Eucalyptus staigeriana essential oil (ESO) was nanoencapsulated and determined the bactericidal effect of its active principle against two strains of pathogenic mircrorganisms, as a preliminary study for use in food preservation. The process occurred by forming a nanoemulsion and spray-drying, using the cashew gum (CG) as encapsulating material. The nanoparticles were characterized by analysis of particle size distribution, zeta potential, absorption spectroscopy in the infrared Fourier transform spectroscopy (FTIR), thermal analysis (TGA/DSC), in vitro release kinetics, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and stability of the encapsulated. Was also determined the Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of nanoparticles, essential oil, and cashew gum to evaluate its antimicrobial activity against Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Gram-positive) and Salmonella Enteritidis IAL 1132 (Gram-negative). The nanoparticles had size ranging from 27.70 ± 3.42 nm to 432.67 ± 41.47 nm in accordance with the formulation, and negatively charged surface. The presence of ESO in the nanoparticles is observed through changes in peak resolutions of the spectra obtained by FT-IR. Thermal analysis showed the main events of mass loss of the samples associated with the degradation of CG. The content of ESO nanoencapsulated varied between 4.76% and 7.12%. The increase in the proportion of CG favored the rapid release of oil in water due to the increased hydrophilic character, and enhance the ability of the nanoparticles to retain the ESO in the polymeric shell during the 365 days. The results for MBC indicated a bactericidal action of the nanoencapsulated oil, and pure oil more efficient in Gram-positive. However, the nanoparticles showed better results against Gram-negative bacteria, due to a possible synergistic effect between the CG and ESO. / Neste trabalho, o óleo essencial de Eucalyptus staigeriana (OES) foi nanoencapsulado e determinado o efeito bactericida de seu princípio ativo contra duas cepas de mircrorganismos patogênicos, como um estudo preliminar para utilização na conservação de alimentos. O processo ocorreu através da formação de uma nanoemulsão e secagem em spray-drying utilizando a goma de cajueiro (GC) como material encapsulante. As nanopartículas foram caracterizadas através das análises de tamanho e distribuição de partícula, potencial zeta, espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), análise térmica (TGA/DSC), cinética de liberação in vitro, cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) e estabilidade do encapsulado. Foi também determinada a Concentração Bactericida Mínima (CBM) das nanopartículas, do óleo essencial e da goma de cajueiro para avaliar sua ação antimicrobiana contra Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Gram-positiva) e Salmonella Enteritidis IAL 1132 (Gram-negativa). As nanopartículas apresentaram tamanho que variaram de 27,70 ± 3,42 nm a 432,67 ± 41,47 nm, de acordo com a formulação, e a superfície carregada negativamente. A presença do OES nas nanopartículas é observada através de modificações nas resoluções de pico dos espectros obtidos por FTIR. A análise térmica evidenciou os principais eventos de perda de massa das amostras associados à degradação de GC. O teor de OES nanoencapsulado variou entre 4,76 % e 7,12 %. O aumento na proporção de GC favoreceu a uma rápida liberação do óleo em água devido ao aumento do caráter hidrofílico, além de aumentar a capacidade das nanopartículas em reter o OES no invólucro polimérico no decorrer dos 365 dias. Os resultados para CBM indicaram uma ação bactericida do óleo nanoencapsulado e do óleo puro mais eficiente na bactéria Gram-positiva. No entanto, as nanopartículas mostraram um resultado melhor contra a bactéria Gram-negativa, devido a um possível efeito sinérgico entre a GC e o OES.

A pele e as mucosas constituem as primeiras barreiras na defesa contra infecções e os macrófagos são componentes essenciais do sistema imune inato, importante neste aspecto. O envolvimento destas células pode ser verificado em grande percentual das imunodeficiências primárias. Desta forma, a avaliação da função fagocitária é de extrema relevância para o reconhecimento dos distúrbios imunológicos que acometem a pele. O objetivo do presente estudo foi avaliar a metodologia laboratorial para a detecção de defeitos funcionais dos fagócitos. Para isto foram estabelecidos os seguintes testes laboratoriais: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), Dihidrorodamina (DHR), quimiotaxia, fagocitose e a aderência de S. aureus e C. albicans por citometria de fluxo (CF), além de morte intracelular de S. aureus e C. albicans (CF). Para verificar a integridade do sistema complemento realizou-se ensaios hemolíticos para as vias clássica e alternativa (CH50 e AP50). A metodologia proposta foi aplicada em indivíduos normais para a padronização dos testes. O burst oxidativo avaliado pelo teste da dihidrorodamina (DHR) foi aplicado em 101 indivíduos saudáveis e em paralelo, 50 indivíduos sadios para o teste do NBT. Os mesmos testes foram realizados em pacientes com Candidíase mucocutânea crônica (CMC) (n=9 ), Candidíase persistente (n=5), Suspeita de distúrbios de fagócitos (SDF) (n=14), Doença Granulomatosa Crônica (DGC)(n= 7) e portadores de DGC (n=5). A quimiotaxia foi padronizada em 34 controles para neutrófilos estimulados com Lipopolissacarídeo de E.Coli (LPS) e 5 com fungo Candida albicans. A técnica de fagocitose e aderência de patógenos foi padronizada com os mesmos estímulos (n=7 para fungos/n=5 para bactéria). Após a padronização, o ensaio foi aplicado em pacientes com candidíase persistente (n=5 para bactéria e n=5 para fungo) e em pacientes com CMC (n= 3 para bactéria e n=4 para fungo). Os ensaios de fagocitose e morte intracelular (capacidade bactericida e fungicida) foram padronizados em 18 indivíduos sadios para bactérias e os ensaios de morte intracelular para S. aureus foi aplicado em pacientes com CMC (n=5), com CP (n=6), com SDF (n =9) e com DGC (n=2), para os ensaios de fagocitose com morte intracelular para fungos foram utilizados 22 indivíduos saudáveis e após a padronização do ensaio foram aplicados em pacientes com CMC (n=8), pacientes com CP ( n= 7), pacientes com DGC (n=2) e indivíduos com SDF (n= 13) O ensaio de DHR foi padronizado e estabelecido em 80% de intensidade de fluorescência para células estimuladas com PMA e 15% de intensidade de fluorescência para células sem estímulo. Nos resultados do DHR encontrou-se diferença significativa no grupo de DGC (n=7)(P= 0,0001), no grupo de portadores (n=5)(P=0,0005) e no grupo de SDF (n=14)(P= 0,0053). O ensaio do DHR foi repetido após 24 horas da coleta (n=7), não se verificando alteração da resposta. A quimiotaxia mostrou diferença significativa entre C (n=4) vs SDF (n=3)(P=0,0001) e pacientes com CMC apresentaram redução da capacidade quimiotática para bactérias (n=3)e fungos (n= 4) com soro autólogo (P= 0,0246 e P=0,0109, respectivamente). Na fagocitose e aderência de bactérias inativadas ,os grupos de CMC, CP E SDF não mostraram diferenças significativas com bactérias não opsonizadas ou opsonizadas com soro AB e apresentaram menor índice de fagocitose (C x CMC)(P=0,0357) quando foram opsonizadas com soro autólogo. Na fagocitose e aderência de fungos inativados, controles e grupos de pacientes apresentaram resposta semelhante com fagocitose preservada. Os ensaios de morte intracelular para bactérias não opsonizadas houve menor expressão de fagocitose no grupo de C x SDF (P=0,0044). Na capacidade bactericida verificou-se diferença significativa entre os grupos CxCMC (P=0,0403). A opsonização das bactérias com soro AB foi significativamente diferente entre os grupos CxCP (P=0,0129) e CxSDF (P=0,0048) e com capacidade bactericida diferente entre grupos CxCP (P=0,0258) e CxSDF (P=0,0205). Na avaliação da fagocitose de bactérias opsonizadas com soro autólogo foi verificada diferença significativa entre os grupos CxCP (P=0,0013) e CxSDF (P=0,0048). Não houve diferença na capacidade bactericida dos grupos de pacientes com o controle. Os ensaios de fagocitose e morte intracelular para fungos sem opsonização não mostrou diferença estatisticamente significativa. A morte intracelular mostrou-se diferente para o grupo CxCMC (P=0,0155) e quando opsonizado com soro AB houve diferença CxCP (P=0,0369). A fagocitose com opsonização por soro autólogo significativa no grupo CxSDF (P=0,0001) e um paciente de CMC com sua fagocitose comprometida quando comparado com o controle do dia. A morte intracelular foi diferente nos grupos CxCMC (P=0,0018) e CxCP (p=0,0203). Não houve diferença estatisticamente significativa à avaliação do complemento. O ensaio do DHR mostrou ser sensível e preciso para o diagnóstico de DGC e portadores de DGC, porém pode detectar outras alterações de fagócitos. O ensaio de aderência e fagocitose mostraram-se variáveis dificultando a padronização de valores de normalidade e exclusão de defeitos. Ensaios de fagocitose com morte intracelular mostraram-se como a melhor forma de detectar distúrbios de fagócitos além do diagnóstico de DGC. A aplicação de controles do dia mostrou-se necessária e importante para a detecção de defeitos funcionais. O presente trabalho mostrou que a avaliação de distúrbios de fagócitos por morte intracelular por citometria de fluxo pode ser aplicado em outras situações clínicas com comprometimento imunológico / Skin and mucosa are part of the first barriers in the defense against infections, and the macrophages are essential components of the innate immune system, important when related to this aspect. The involvement of these cells can be seen in a large percentage of the primary immunodeficiencies. Therefore, the assessment of the phagocitary function is extremely important for the recognition of immunological disorders which affect the skin. The present study focus on the evaluation of the laboratorial methodology for the detection of functional defects of phagocytes. For this the following laboratorial tests were established: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), chemotaxis, phagocytosis and adherence of S. aureus and C. albicans through flow cytometry (FC), besides the intracellular death of S. aureus and C. albicans (FC). To assess the integrity of the complement system hemolytic assays were performed for the classic and alternative pathways (CH50 and AP50). The proposed methodology was applied to normal individuals for the standardization of the assays. The oxidative burst evaluated through the dihydrorodamine essay (DHR) was applied to 101 healthy individuals and in parallel, 50 healthy individuals for the NBT assay. The same assays were performed on patients with Chronic mucocutaneous candidiasis (CMC)(n=9), persistent candidiasis (n=5), Phagocytes disorders suspicious (PDS) (n=14), Chronicle granulomatous disease (CGD)(n=7) and CGD carriers (n=5). Chemotaxis was standardized using 34 controls for neutrophils stimulated by lipopolisacharydes from e. coli (LPS) and 5 by C. albicans. Phagocytosis and adherence of pathogens were standardized using the same stimuli (n=7 for fungi and n=5 for bacteria). Following the standardization, the assay was applied to patients with persistent candidiasis (n=5 for fungi and n=5 for bacteria) and on patients with CMC (n=4 for fungi and n=3 for bacteria). Phagocytosis and intracellular death assays (bactericidal and fungicidal capacity) were standardized using 18 healthy individuals for bacteria and the intracellular death assays for S. aureus were applied on patients suffering from CMC (n=5), from PC (n=6), from PDS (n=9) and from CGD (n=2), for the phagocytosis with fungi intracellular death assays 22 healthy individuals were used, and following the standardization the assay was applied to patients suffering from CMC (n=8), from PC (n=7), from CGD (n=2) and PDS individuals (n=13). The DHR assay was standardized and established according to fluorescence intensity 80% for cells stimulated by PMA and fluorescence intensity 15% for cells without stimuli. In the DHR results a significant difference in the CGD group (n=7)(P= 0,0001), in the carriers group (n=5)(P=0,0005) and in the PDS group (n=14)(P= 0,0053) was found. The DHR assay was performed once again 24 hours after the sample collection (n=7) and no changes in the response were seen. Chemotaxis showed a significant difference between C (n=4) vs PDS (n=3)(P=0,0001) and patients suffering from CMC showed decreased ability in the chemotaxis of bacteria (n=3) and fungi (n=4) with autologous serum (P= 0,0246 e P=0,0109, respectively). In the phagocytosis and adherence of inactivated bacteria, the CMC, PC and PDS groups showed no significant differences with non-opsonizated bacteria or opsonizated with AB serum and presented a lower phagocytosis level (C x CMC)(P=0,0357) when they were opsonizated by autologous serum. In the phagocytosis and adherence of inactivated fungi, controls and patient groups presented a similar response with preserved phagocytosis. In the intracellular death assays for non-opsonizated bacteria there was a lower phagocytosis expression in the C x SDF group (P=0,0044). In the bactericidal ability a significant difference between the groups C x CMC was seen (P=0,0403). The opsonization of bacteria with AB serum showed a significant difference among the groups C x CP (P=0,0129) and C x SDF (P=0,0048) and with different bactericidal ability among the groups C x CP (P=0,0258) and C x SDF (P=0,0205). In the evaluation of the phagocytosis of bacteria opsonizated by autologous serum a significant difference among the groups C x CP (P=0,0013) and C x SDF (P=0,0048) was seen. There was no difference between the bactericidal ability of the patients group and control group. The phagocytosis and intracellular assays for fungi without opsonization presented no significant statistical difference. Intracellular death was different for the C x CMC group (P=0,0155) and when opsonizated by AB serum difference was shown C x CP (P=0,0369). The phagocytosis with opsonization by autologous serum presented significant difference in the C x SDF group (P=0,0001) and in a CMC patient with compromised phagocytosis when compared with the daily control. Intracellular death was different in the C x CMC (P=0,0018) and C x CP (p=0,0203) groups. There was no significant statistical difference according to the complement evaluation. The DHR assay was seen as very sensitive and precise for the diagnosis of CGD, however it can detect other phagocyte alterations. The phagocytosis and adherence assay varied a lot making the standardization of normal values and defects exclusion very difficult. Phagocytosis with intracellular death assays showed the best performance to detect phagocytes disorders besides CGD diagnosis. The use of daily controls was seen as very necessary and important to detect functional disorders. This study demonstrated that phagocytes disorder evaluation through intracellular death using flow cytometry can be applied to other clinical situations which are immunologically compromised

O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, é uma das doenças mais importantes da citricultura. O estudo do efeito de medidas alternativas de controle para o manejo desta doença assume grande importância tanto para áreas citrícolas onde a erradicação de plantas não é a principal medida de controle do cancro cítrico, como no Estado do Paraná, como para regiões onde a prática da erradicação vem sendo adotada como principal medida de controle da doença, como no Estado de São Paulo. Instalado em pomar citrícola do município de Ourizona, na região Noroeste do Estado do Paraná, este trabalho buscou estudar o progresso dessa importante doença em campo sob condições de proteção química das plantas, utilizando produto cúprico; e cultural, por meio de quebra-vento. Além disso, importantes informações relacionadas ao efeito de cada tratamento sobre a produção das plantas de laranja ‘Pêra’ também foram obtidas. Enquanto a aplicação de cobre apresentou efeito significativo na redução dos níveis de cancro cítrico, o emprego de quebra-vento pouco ou nada contribuiu para o controle da doença. Após 29 avaliações mensais, plantas submetidas à aplicação de bactericida cúprico apresentaram valores médios de AUDPC* de incidência da doença nas folhas de cerca de 20 %, nível 44 % inferior ao observado para as plantas não protegidas quimicamente. O mesmo comportamento foi observado para a severidade da doença. Após 18 avaliações mensais foi possível observar que plantas submetidas à aplicação de produto cúprico apresentaram em média folhas com níveis de AUDPC* de severidade 37 % menores do que plantas não protegidas quimicamente. Em 2004, quando os níveis da doença foram relativamente elevados, plantas submetidas ao controle químico apresentaram produção 54 % superior àquelas não tratadas. Em 2005, quando os níveis de cancro foram menores, não foi observada diferença na produtividade entre os tratamentos. Nas duas safras, plantas tratadas com bactericida apresentaram menor incidência da doença em frutos e maior proporção de frutos colhidos em relação a carga total da planta (colhidos + caídos). Dos modelos testados, o logístico foi o mais adequado para descrever o progresso temporal do cancro cítrico nos dois anos estudados para todos os tratamentos. Nas duas safras estudadas a proporção de frutos colhidos foi a variável que apresentou função de dano com maior coeficiente de determinação (R2) quando relacionada aos níveis de incidência e severidade de cancro cítrico observados. / Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri, is one of the most important diseases to citrus production. The effect of alternative measures of citrus canker control is very important to areas where plant eradication is the most important measure of control, as in Sao Paulo State, as well as to areas where eradication is not a major component of canker control, as in Parana State. This work aimed to study the progress of citrus canker in field conditions under chemical control, by using copper sprays; and cultural control, by using windbreak. Field plots were installed in a citrus orchard of ‘Pêra’ sweet orange located in Ourizona county, northwest of Parana State, Brazil. Information regarding the effect of each treatment alone or in combination was assessed. Whereas copper sprays showed significant effect on reducing citrus canker levels, windbreak did not contribute significantly to disease control. After 29 monthly assessments, plants submitted to copper sprays showed values of AUDPC* of citrus canker incidence near to 20 %. This disease level was 44 % lower than that observed to plants not protected with copper compound. The same pattern was observed to disease severity. After 18 monthly assessments, plants sprayed with copper showed values of AUDPC* of disease severity 37 % lower than that observed to plants of the check plots. In 2004, when the citrus canker level was higher, plants treated with copper yielded 54 % more than that not sprayed. In 2005, when the citrus canker level was lower, no significant difference was observed between treatments. In both seasons, plants sprayed with copper showed lower citrus canker incidence on fruits and higher rate of harvested fruits. Among the temporal models tested, the logistic was the most appropriate to describe citrus canker incidence over time in both years studied to all treatments. In both harvests the rate of harvested fruits was the variable that showed the higher coefficient of determination (R2) when related to citrus canker incidence and severity levels.