Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho, foram utilizadas três resinas reticuladas comerciais de troca iônica e caráter ácido à base de estireno e divinilbenzeno: AmberliteGT73 da Rohm and Haas Co. com grupo tiol, Lewatit VPOC1800 da Bayer Co. com grupo sulfônico e Amberlyst 15WET da Rohm and Haas Co. também com grupo sulfônico. As citadas resinas comerciais foram escolhidas por apresentarem grande capacidade de troca iônica, estabilidade e grupos funcionais de interesse para a introdução de íons Ag+. As resinas foram tratadas com ácido clorídrico para garantir as formas ácidas de seus grupos funcionais e em seguida a redução dos íons Ag+, provenientes de solução de nitrato de prata, foi realizada in situ pela hidroxilamina em presença de solução protetora de colóide composta por 2-hidróxi-etil-celulose e gelatina 1:1. Alguns parâmetros foram modificados durante a redução dos íons Ag+ a Ag0, como por exemplo, o tempo de adição da solução redutora de hidroxilamina, a solução utilizada para controle do pH, e condições do repouso após o controle do pH. Após a incorporação das nanopartículas de prata, tanto as resinas comerciais quanto o produto final foram caracterizados por titulometria, fluorescência de raios-x, análise termogravimétrica, análise elementar, grau de inchamento, difração de raios-x, microscopias ótica e eletrônica. A avaliação da atividade biocida foi realizada através do método da contagem em placas utilizando-se uma cepa de Escherichia Coli ATCC25922TM em concentrações de 103 a 107 células/mL. Todos os compósitos obtidos mostraram atividade bactericida significante, sendo que foi possível perceber que a ação bactericida dos compósitos está relacionada com a presença de prata na forma metálica e a características como tamanho, formato e dispersão das partículas na matriz polimérica. Para efeito de comparação, foram realizados ensaios bactericidas com os copolímeros de partida e assim foi comprovado que a ação bactericida pôde ser atribuída somente às nanopartículas de prata / In this study, three commercial cross-linked ion exchange resins with acid character based on styrene divinylbenzene were used: AmberliteGT73 from Rohm and Haas Co. with thiol group, Lewatit VPOC1800 Bayer Co. and Amberlyst 15WET Rohm and Haas Co. both with sulfonic group. These commercial resins were chosen because they have a high ion exchange capacity, stability and good functional groups for the introduction of Ag+ ions. The resins were treated with hydrochloric acid to ensure its acidic functional groups and then to procedure the reduction of Ag+ ions. The silver ions were coming from solution of silver nitrate and the reduction was carried out in situ by hydroxylamine in the presence of protective agent 1:1 solution composed of 2-hydroxyethylcellulose and gelatin. Some parameters were changed during the reduction of Ag+ ions to Ag0, for example, the time of addition of hydroxylamine solution, the solution used for pH control, and conditions that the solution was left at rest after controlling the pH. After the incorporation of silver nanoparticles, both commercial resins and the final product were characterized by titration, fluorescence x-ray, thermal analysis, elemental analysis, swelling degree, X-ray diffraction, optical and electron microscopy. The evaluation of biocidal activity was performed using the viable plate count method and a strain of Escherichia coli ATCC 25922TM at concentrations from 103 to 107 cells/mL. All composites showed significant bactericidal activity, and it is noted that the bactericidal action of the composites is related to the presence of silver in metallic form and characteristics such as size, shape and dispersion of particles in the polymer matrix. Tests were performed also with the commercial resins and it was verified that bacterial action could be attributed only to silver nanoparticles

El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto antibacteriano de la combinación de droga 3Mix y MP y de sus combinaciones alternativas contra Enterococcus faecalis y Fusobacterium nucleatum. Se empleó el método de dilución en caldo para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM) y método de difusión en agar modificado para determinar el efecto antibacteriano de los vehículos. Se emplearon dos cepas ATCC Enterococcus faecalis y Fusobacterium nucleatum, con la combinación de componentes de la droga 3Mix, 3Mix-Cefaclor(reemplazo de minociclina por cefaclor) y 3Mix-Amoxicilina(reemplazo de minociclina por cefaclor) en las siguientes concentraciones: 25µg/ml; 6,25µg/ml; 1,56µg/ml; 0,39µg/ml; 0,195µg/ml; 0,097µg/ml y macrogol(M), propilenglicol(P) y su asociación. La CIM para 3Mix, 3Mix-cefaclor fue 0,39µg/ml y 0,195µg/ml para 3Mix-Amoxicilina mientras que CBM fue >25µg/ml; 25µg/ml; 6,25µg/ml respectivamente sobre Enterococcus faecalis, para Fusobacterium nucleatum la CIM de 3Mix, 3Mix-Cefaclor fue 0,195µg/ml y ≤0,097µg/ml para 3Mix-Amoxicilina, los cuales coincidieron con CBM. Se obtuvo inhibición de crecimiento bacteriano por parte macrogol y propilenglicol+macrogol, sin embargo propilenglicol no formó halo de inhibición sobre Enterococcus faecalis ni Fusobacterium nucleatum. La Combinación de droga 3Mix, 3Mix-Cefaclor y 3Mix-Amoxicilina presentaron efectos antibacterianos contra Enterococcus faecalis y Fusobacterium nucleatum.

Neste trabalho descrevemos o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional de uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, proteína esta denominada BjussuLAAO. O isolamento foi realizado pela combinação de três etapas cromatográficas, utilizando filtração molecular em Sephadex G-75, seguida de cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, seguida pela última etapa cromatográfica, realizada com interação hidrofóbica em Fenil-Sepharose. A BjussuLAAO é uma proteína com massa molecular de 61 kDa e pI 5,8, e apresentou alta similaridade sequencial com as LAAOs já isoladas dos venenos de serpentes. A enzima BjussuLAAO induziu edema apenas na maior dose (100 ?g/animal), não apresentou atividade miotóxica, também não apresentou atividade hemorrágica, mesmo nas doses mais elevadas. A BjussuLAAO, demonstrou ter efeito coagulante e ação fibrinogenolítica e, mesmo utilizando inibidores de metaloproteases e serino proteases, continuou apresentando tal atividade, demonstrando assim não existir contaminantes destas classes de proteínas na amostra. As atividades mais interessantes do ponto de vista farmacológico, onde podemos visualizar a BjussuLAAO como um futuro fármaco, foram as atividades antitumoral, bactericida e antiparasitária. Esta apresentou, em baixas concentrações, citotoxicidade sobre células tumorais, ação leishmanicida e tripanocida, demonstrando assim ser uma substância candidata a fármaco multifuncional. / In this research we described the isolation and biochemical, structural and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu venom, named BjussuLAAO. The purification was carried out through three chromatography steps, using a molecular filtration on Sephadex G-75, followed by an affinity chromatography on Benzamidine-Sepharose, and finally a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. BjussuLAAO is a protein with a molecular mass of 61 kDa and pI 5.8. This protein showed high sequencial similarity with other LAAOs from snake venoms. BjussuLAAO induced edema only in the highest dose (100 ?g/animal), did not show any myotoxic or hemorrhagic activity. BjussuLAAO, showed clotting and fibrinogenolitic activity, even in the presence of metalloproteases and serino-proteases inhibitors. The more interesting pharmacological activities, where from we can look a future application, were the anti-tumoral, bactericide, leishmanicidal and tripanocidal actions. The enzyme displayed a bactericide effect too, showing to be a multifunctional drug.

Neste trabalho de mestrado foram desenvolvidos nanobiocompósitos contendo quitosana (QS) e nanopartículas de prata (AgNPs) para aplicação em matrizes poliméricas com propriedades bactericidas. O trabalho foi conduzido em 4 etapas, sendo: i) a primeira referente ao estudo e escolha do melhor modo de estabilização dos colóides de prata em solução, sendo escolhido o modo de estabilização estérica com a quitosana (QS); ii) a segunda parte está relacionada com um estudo detalhado da interação entre a QS e as nanopartículas de prata (AgNPs) além da otimização da relação QS:AgNPs no nanocompósito para se obter maior ação bactericida; iii) foi também proposta uma rota de síntese na qual não se utiliza-se o Boro Hidreto de Sódio (NaBH4) como redutor, composto altamente reativo, sendo utilizados o citrato de sódio e QS conjuntamente como redutores; iv) inserção do nanocompósito QS:AgNPs em uma matriz de polivinil álcool (PVA). Foram utilizadas as técnicas de espectroscopia UV-vis e FT IR, DLS, Potencial Zeta, MET, DR-X, ensaios microbiológicos de MIC, OD595 e teste de halo de inibição, TGA, DSC e ensaios mecânicos. Concluímos que o uso da QS como agente estabilizante em comparação ao PVA é a mais indicada, devido ao maior número de grupos funcionais interagindo com as nanopartículas de prata. O poder de ação bactericida do nanocompósito QS:AgNPs pode ser aumentado numa certa relação entre ambos, a saber 4:1 em massa. A síntese utilizando citrato de sódio e QS como redutores mostrou a possibilidade da obtenção de nanopartículas de prata pequenas, com tamanho de 2 - 5 nm com estrutura esférica ou maiores. com tamanho de 300 nm, apresentando estruturas dendríticas, dependendo apenas do tempo de reação e concentração de citrato de sódio. A última etapa revelou a possibilidade da inserção do nanocompósito no polímero PVA sem perda significativa das características térmicas e mecânicas do polímero. / The work reported here was aimed at developing chitosan/AgNPs based nanobiocomposits for bactericidal applications. The studies were divided into four main steps, viz.,: i) optimization of the silver colloids stabilition process, in which the use of chitosan resulted in the best stability, ii) a detailed investigation on the interactions between chitosan and AgNPs, as well as the optimization of the chitosan :AgNPs ratio to promote the best bactericidal effect, iii) development of a new synthetic route without using NaBH4, in a search for an environmentally-friendly route, and iv) incorporation of the chitosan:AgNps nanobiocomposites in a PVA matrix for application as smart food packaging. The nanobiocomposites were characterizaed via UV-vis and FT IR spectroscopies, DLS, Zeta potential, TEM and DR-X. Biological essays had also been carried out, as well as tensilestress and thermo analyses (DSC and TGA). The best bactericidal effect was observed for a nanobiocompostie comprising chitosan:AgNPs at a ratio of 4:1 (wt/wt). The synthetic route employing sodium citrate as reducing agent resulted in AgNPs with average diameters of 2 5 nm, as well as bigger nanoparticles with diameters of ca. 300 nm, depending on the reaction time and citrate concentration. The incorporation of the chitosan:AgNPs composites in the PVA matrix resulted in the formation of a bactericidal composite with good mechanical and thermal properties, suitable for applications as smart food packing.

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) catalisam a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios. Membros da sub-família de fosfolipases A2-Lisina49 (PLA2-Lys49), isolados de venenos de serpentes Viperidae mostram uma substituição do resíduo de aspartato na posição 49 por uma lisina, com a eliminação concomitante da atividade hidrolítica contra fosfolipídeos. Apesar da ausência de atividade catalítica, as PLA2-Lys49 apresentam propriedades farmacológicas variadas incluindo miotoxicidade, e danifica membranas artificiais por um mecanismo Ca2+-independente, que não envolve hidrólise de fosfolipídeos. As PLA2-Lys49 formam homodímeros em solução, e estudos cristalográficos e espectroscópicos de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, revelaram que a transição na estrutura quaternária do dímero provoca a mudança de posição da região C-terminal, apoiando a sugestão do envolvimento desta região no modelo proposto de danificação da membrana Ca2+-independente. Um papel para a região Cterminal das PLA2-Lys49 também foi sugerido na atividade bactericida observada para esta proteína, e o presente estudo investiga uma possível correlação entre a atividade de danificação de membranas Ca2+-independente e o efeito bactericida. O efeito bactericida de BthTx-I e mutantes da proteína na região C-terminal foi avaliado contra bactéria Escherichia coli (K12). A BthTx-I nativa e recombinante tiposelvagem apresentaram alta atividade bactericida com uma concentração de 5 mg/mL, porém as mutantes Y117W, Y119W, K122A e F125W reduziram significativamente este efeito, mostrando uma correlação entre os determinantes estruturais das atividades bactericida e de danificação em membranas artificiais. Na tentativa de correlacionar o mecanismo de danificação de membranas artificiais com a atividade bactericida de BthTx-I contra linhagem E.coli (K12), um estudo por partição de sondas fluorescentes em compartimentos celulares específicos foi realizado. A sonda hidrofóbica N-fenil-N-naftilamina (NPN) foi utilizada para avaliar a integridade da membrana externa da bactéria e a sonda Sytox Green (SG) para avaliar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana. A cinética de permeabilização da membrana externa é rápida e não foi influenciada por mutagênese da região C-terminal da proteína. Entretanto, a cinética de permeabilização da membrana plasmática mostrou-se lenta, com um efeito máximo de 2 horas de ação e identificou os mesmos determinantes estruturais como os identificados para a atividade bactericida de BthTx-I. Resultados obtidos pelas técnicas de citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão auxiliaram os dados evidenciando a importância da região C-terminal de BthTx-I na atividade bactericida contra linhagem E.coli. / Phospholipases A2 (PLA2 - EC 3.1.1.4) catalyze the hydrolysis of acid ester bonds at the sn-2 position of glycerophospholipids liberating fatty acids and lysophospholipids as catalysis products. Lysine 49 phospholipase A2 (Lys49-PLA2) are isolated from the venom of viperid snakes, and in these proteins, the aspartic acid at position 49 is replaced by a lysine, resulting in the elimination of hydrolytic activity against phospholipid substrates. Despite the absence of catalytic activity, these Lys49-PLA2s present various pharmacological properties and furthermore damage artificial membranes by a Ca2+-independent mechanism. Lys49- PLA2s form homodimers in solution, and crystallographic and spectroscopic studies of the bothropstoxin-I (BthTx-I), a Lys49-PLA2 isolated from venom of Bothrops jararacussu, reveal that a quaternary structure transition in the homodimer results in a change in the position of the C-terminal loop of the protein, suggesting the involvement of this region in the Ca2+- independent membrane damaging activity. A role for the C-terminal region of Lys49-PLA2 has also been suggested for the bactericidal activity of theses proteins, and using BthTx-I one as a model system, the present study investigates the possible correlation and between the Ca2+-independent membrane damaging and the bactericidal activities. The bactericidal effect of native BthTx-I and site-directed mutants of the C-terminal loop was evaluated using the Gram negative bacteria E. coli strain K12. Both the native and wild type recombinant BthTx-I presented a high bactericidal activity at a concentration of 5 mg/mL, whereas the mutants Y117W, Y119W, K122A and F125W showed significantly reduced the bactericidal effects, showing a correlation between the structural determinants of the bactericidal and membrane damaging activities. The fluorescent probe NPN was used to evaluate the integrity of the external membrane of the bacterial cells after exposure to the BthTx-I and mutants. The permeabilization of the external membrane is complete within 2 minutes, and neither the kinetics nor the extent of membrane damage was influenced by mutagenesis in the C-terminal region. The fluorescent probe Sytox Green (SG) was used to evaluate the integrity of the bacterial plasma membrane, an event which showed a significantly slower kinetic, with a maximum effect observed after two hours exposure to the BthTx-I. Furthermore, the extent of the membrane damage is influenced by mutagenesis in the C-terminal loop, and the structural determinants for the bactericidal activity of BthTx-I are the same as those that determine the permeabilization of the bacterial plasma membrane. Evidence obtained using flow cytometry and transmission electron microscopy support of the suggestion that the C-terminal region of BthTx-I is an important structural determinant of the plasma membrane damaging bactericidal activities.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesta dissertação, foram preparados materiais poliméricos com atividade bactericida a partir de copolímeros de estireno (Sty) e divinilbenzeno (DVB) e de celulose bacteriana. Três copolímeros à base de Sty e DVB foram sintetizados através da técnica de polimerização em suspensão aquosa. Os copolímeros foram preparados com diferentes estruturas porosas, por meio da variação da composição do sistema diluente. Um copolímero comercial macrorreticulado, Amberlite XAD4, de elevada área superficial, também foi usado neste estudo com o objetivo de comparar sua estrutura polimérica e seu desempenho com o dos copolímeros sintetizados. Os copolímeros de Sty-DVB foram caracterizados por meio da densidade aparente, área específica, diâmetro médio de poros, volume de poros, microscopias ótica e eletrônica de varredura, grau de inchamento, espectrometria de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), análise termogravimétrica e análise elementar. Os copolímeros de Sty-DVB foram modificados quimicamente através da reação de nitração, seguida da reação de redução do grupo nitro a amino e posterior reação de diazotação e hidrólise do grupo sal de diazônio. Os copolímeros modificados contendo os grupos NH2 e OH foram utilizados como suporte para a ancoragem das nanopartículas de prata. As partículas de prata foram obtidas pela redução dos íons Ag+ empregando-se cloridrato de hidroxilamina como redutor e PVP como protetor de colóide. O teor de prata impregnada foi determinado pelo método volumétrico. A celulose bacteriana (BC) foi empregada como uma matriz para impregnação de nanopartículas de prata. Membranas de BC foram impregnadas com solução aquosa de AgNO3, a seguir foi realizada a redução dos íons Ag+ com três diferentes agentes redutores (hidrazina, hidroxilamina e ácido ascórbico) empregando ou não protetor de colóide (PVP ou gelatina). As membranas de BC/Ag0 obtidas foram caracterizadas por difração de raios-X, análise termogravimétrica e microscopia eletrônica de varredura. A capacidade bactericida dos copolímeros de Sty-DVB, dos copolímeros funcionalizados e impregnados com prata e das membranas de BC/Ag0 foi avaliada através do método da contagem em placa contra suspensões de Escherichia coli, em diferentes concentrações (103 a 107 células/mL). Foi observado que os copolímeros de origem e os copolímeros modificados contendo os grupos NO2 e NH2 não apresentaram atividade bactericida contra suspensões de E. coli em nenhuma concentração. Por outro lado, os copolímeros modificados contendo o grupo OH apresentaram alguma atividade bactericida, embora abaixo do esperado devido à baixa incorporação de hidroxilas fenólicas. Os copolímeros modificados impregnados com Ag apresentaram maior ação bactericida do que os copolímeros modificados, o que comprova que a ação bactericida é devida às partículas de prata ancoradas nos copolímeros. Os copolímeros modificados contendo o grupo OH impregnados com Ag mesmo possuindo menores teores de prata apresentaram maior ação bactericida do que os copolímeros modificados contendo o grupo NH2 impregnados com Ag. A maior ação bactericida pode ser atribuída à combinação da atividade bactericida das partículas de prata com a atividade dos grupos hidroxilas fenólicas mesmo que estes grupos estejam pouco incorporados nos copolímeros. Os compósitos de BC/Ag0 exibiram atividade bactericida contra E. coli que foi atribuída à ação das nanoparticulas de prata obtidas quando foi empregada a hidroxilamina como agente redutor e a gelatina como protetor de colóide / In this work, styrene and divinylbenzene copolymers and bacterial cellulose were employed as polymeric supports for preparing composite materials with bactericidal activity. Three copolymers based on Sty-DVB were synthesized by suspension polymerization. The copolymers were prepared by varying the solvating power of the employed diluent system aiming to obtain different porosities. The commercial copolymer Amberlite XAD4 was also used aiming to relate its performance with the porous structure of this commercial resin and the synthesized copolymers. These copolymers were characterized by bulk density, specific area, pore average diameter, optical and scanning electronic microscopies, swelling degree, infra-red spectrometry (FTIR), thermogravimetric analysis (TG) and elemental analysis (CHN). The copolymers were modified by the nitration reaction, reduction of the nitro group and subsequent hydrolysis of the diazonium salt group. The chemical modification of copolymers was confirmed by FTIR and by the thermal profiles changes. The modification extension was determined by elemental analysis. The Ag+ ions were reduced by employing hydroxylamine as reductant and PVP as colloid protector aiming to produce silver nanoparticles anchored on the resin surface. The amount of incorporated silver was determinated by tritation. The bacterial cellulose (BC) was also used as a matrix for anchoring nanoparticles of silver. BC membranes were immersed in silver nitrate solution. The Ag+ ions were reduced by employing hydrazine, hydroxylamine or ascorbic acid as reductant in the presence or not of a colloid protector (PVP or gelatin). XRD analysis have confirmed Ag cubic phase on the BC/Ag0 membrane. The particles size distribution of silver nanoparticles and their morphologic features were investigated by scanning eletron microscopy. The antibacterial activity of the original copolymers, the modified copolymers, the copolymers containing anchored silver particles and BC/Ag membranes was determined towards 103 to 107 cells/mL dilutions of Escherichia coli strain. It was noted that the original copolymers and copolymers containing NO2 and NH2 groups did not present bactericidal action. However, the copolymers containing OH groups presented a considerable bactericidal activity but lower than expected due to low amount of OH groups. The copolymers containing anchored silver particles presented higher bactericidal action than the modified copolymers, confirming that the bactericidal activity was attributed to the action of silver nanoparticles. The modified copolymers containing OH groups and anchored silver particles exhibited higher bactericidal action than the modified copolymers containing NH2 groups and anchored silver particles. This highest bactericidal activity was due to the combined action of silver nanoparticles and functional group OH of the copolymers. The composites BC/Ag0 showed antibacterial activity against Escherichia coli that was attributed to the action of silver nanoparticles obtained when a combination of hydroxylamine as reducing agent and gelatine as protective colloid was employed

Objetivo: Evaluar el límite de inhibición bacteriana del Hidróxido de Calcio en polvo sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC® 29212™. Materiales y Métodos: Este estudio experimental in vitro utilizó 40 placas petri con agar BHI solidificado. Se preparó la solución de Hidróxido de Calcio [Ca(OH)2] en polvo de la marca Biodinámica y Maquira a la concentración de 1g/ml. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bacteriostática (CMB) fueron evaluadas mediante diferentes concentraciones de Ca(OH)2 (0.02 g/ml - 1g/ml). La CMI fue evaluada mediante la técnica de Kirby Bauer y la CMB mediante la técnica de Recuento de Unidades Formadoras de Colonia (UFC). Resultados: Al evaluar la actividad antibacteriana de Ca(OH)2 contra la cepa de E. faecalis, se observó las siguientes medias del halo de inhibición: Biodinámica 22.66 ± 0.38 mm; Maquira 23.58 ± 0.47 mm y Clorhexidina al 12% (control positivo) 23.93 ± 0.73 mm. La CMI del Ca(OH)2 en polvo de ambas marcas fue de 0.063 g/ml como límite inferior, confirmando la inhibición del crecimiento de la cepa de Enterococcus faecalis ATCC® 29212™, siendo el límite superior de 1g/ml. Por otro lado, el CMB del Ca(OH)2 en polvo muestra un valor de 0.031 g/ml para la marca Biodinámica y 0.063 g/ml. para la marca Maquira. Conclusión: El límite inferior y superior de inhibición bacteriana del Hidróxido de Calcio, sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC® 29212™ fue de 0.063 g/ml y de 1gr/ml, respectivamente. / Objective: To evaluate the bacterial inhibition limit of Calcium Hydroxide powder on strains of Enterococcus faecalis ATCC® 29212™. Materials and Methods: This in vitro experimental study used 40 petri dishes with solidified BHI agar. The solution of Calcium Hydroxide [Ca(OH)2] powder of the brand Biodinámica and Maquira was prepared at the concentration of 1 g / ml. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Bacteriostatic Concentration (MBC) were evaluated using different concentrations of Ca(OH)2 (0.02 g /ml - 1 g/ml). The CMI was evaluated using the Kirby Bauer technique and the CMB using the Colonies Formation Units (CFU) technique. Results: The antibacterial activity of Ca(OH)2 against the E. faecalis strain, presented the following means of inhibition halo were observed: Biodinámica 22.66 ± 0.38 mm; Maquira 23.58 ± 0.47 mm and 12% Chlorhexidine (positive control) 23.93 ± 0.73 mm. The MIC of the Ca(OH)2 powder of both brands was 0.063 g / ml as the lower limit, confirming the inhibition of the growth of Enterococcus faecalis ATCC ® 29212 ™ strain with the upper limit of 1 g / ml. On the other hand, CMB of the Ca(OH)2 powder shows a value of 0.031 g / ml for Biodinámica and 0.063 g / ml. for Maquira. Conclusion: The lower and upper limit of bacterial inhibition of Calcium Hydroxide, on strains of Enterococcus faecalis ATCC ® 29212™ was 0.063 g / ml and 1 g / ml, respectively. / Tesis

Este trabajo estudia el efecto bactericida del láser de Er, Cr:YSGG cuando se aplica en el interior del conducto radicular que previamente se ha infectado con Enterococcus faecalis. Para ello se han inoculado con Enterococcus faecalis dientes humanos unirradiculares. Para valorar el grado de desinfección de este tipo de láser se ha comparado los resultados obtenidos con la desinfección que se produce con el hipoclorito sódcio al 0.5% y al 5%, ya que estos son los métodos más comunmente utilizados en odontología para la desinfección del conducto radicular. También se ha valorado el incremento de temperatura que se produce en el interior del conducto radicular cuando este es irradiado con el láser de Er,Cr:YSGG. Los resultados de este trabajo muestran que : El láser de Er,Cr:YSGG tiene un importante efecto bactericida sobre Enterococcus faecalis cuando se irradia el interior del conducto radicular. Esta capacidad desinfectante es superior a la del hipoclorito sódico al 0.5% pero inferior a la del hipoclorito sódico al 5%. También se ha podido concluir que utilizando el tip de 200 micras y en las condiciones de este estudio, los mejores resultados, en cuanto a desinfección, se obtienen con los parámetros de 2W (reales 0.6W) durante 60 segundos en 2 sesiones de 30 segundos cada una de ellas y espaciadas entre sí por 15 segundos. Sin embargo, la importante destrucción y desgaste que se produce en la fibra, hace aconsejable utilizar el láser de Er,Cr:YSGG a 1W (real 0.3W) durante una aplicación de 120 segundos, en 4 sesiones de 30 segundos cada una de ellas y espaciadas entre sí por 15 segundos. Además se ha comprobado que, con los parámetros utilizados, con un mayor tiempo de irradiación se produce un efecto bactericida superior. Respecto al incremento de temperatura se concluyó que con los parámetros y condiciones de trabajo del láser de Er,Cr:YSGG empleados en este estudio nunca se ha producido un aumento térmico superior a los 10ºC, incremento éste que se considera como crítico respecto a la inducción de lesiones a los tejidos periapicales

La primera part d'aquest treball s´ha centrat en la caracterització i optimització del procés d'activació de l´onconasa recombinant per tal d'obtenir l´enzim igual a la forma nativa. Per això, les reaccions d'eliminació de la Met-1 i la ciclació de la Glu1, necessàries per generar el piroglutamic han estat seguides per MALDI-TOF MS. La segona part d´aquest treball s´ha centrat en l´estudi de la contribució del pont disulfur 30-75 de l´onconasa a les seves propietats biològiques. Els resultats suggereixen que el potencial redox del citosol cel·lular podria reduir el pont disulfur 30-75 de l´onconasa salvatge afectant la unió onconasa -inhibidor proteic de ribonucleases. La tercera part ha consistit en la construcció de variants de l´HP-RNasa i onconasa amb activitat bactericida. Per això, s´ha introduït el determinant bactericida (YRWR) descrit per la proteïna catiònica d'eosinòfils en els dos enzims. Els resultats obtinguts han evidenciat que les dues ribonucleases amb el determinant bactericida presenten activitat citotòxica contra bacteris gram-negatius preferentment. / The first part of this work has been focused on the characterization and optimization of the activation process of the recombinant onconase to get an enzyme analogous to the native form. For this, Met-1 removal and Glu1 cyclization have been followed by MALDI-TOF MS. The second part of this work is focused on the study of the contribution of the 30-75 disulfide bond of onconase to its biological properties. The results suggest that the redox potential of the cytosol could reduce the disulfide bond 30-75 affecting the binding of onconase-ribonuclease inhibitor. The third part has been focused on the construction of HP-RNase and onconase variants endowed with bactericidal activity. For this, we have introduced a bactericidal (YRWR) determinant described for eosinophil cationic protein onto both enzymes. The resulting variants have bactericidal activity against gram-negative bacteria.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3763.pdf: 14958607 bytes, checksum: 88e7acc77b81aa67c72e939b97e54be3 (MD5) Previous issue date: 2011-04-19 / Financiadora de Estudos e Projetos / The work in this thesis mainly focuses on the preparation and characterization of poly(vinyl alcohol) (PVOH)-based nanocomposites loaded with nanoparticles of titanium dioxide (TiO2 anatase and TiO2 prepared by hydrothermal treatment) and silver (Ag) designed to test the bactericidal activity of such materials. For this purpose, PVOH aqueous solutions at concentrations of 10 wt.% and 18 wt.% were electrospun. Results of the morphological characterization showed that the average diameters of these fibers are in the range of 77 to 155 nm. Subsequently, the poly(vinyl alcohol)(PVOH)/silver (Ag) nanocomposites were prepared by electrospinning process. These nanofibers were characterized by SEM, EDS, XRD, UV-Vis diffuse reflectance spectroscopy and MET. SEM images have shown the average diameter of electrospun fibers of around 90 nm. TEM images have shown the nanoparticles homogeneously dispersed in the fiber, with an average diameter of 5,8 nm. These materials demonstrated significant antibacterial activities against Stapylococcus aureus (87,8%) and Escherichia coli (85,0%). Likewise, this work presents the characterization of PVOH/TiO2 (anatase, commercial) and PVOH/TiO2 (hydrothermal) nanocomposites. These nanofibers were characterized by SEM, XRD, EDS, TEM, UV-VIS diffuse reflectance spectroscopy, TG, and DSC. The TiO2 loading have been shown to be effective in the nanocomposite, changing the UV absorbance. In an attempt to offer an indirect assessment of the antibacterial activities of these nanocomposites, photocatalytics experiments were carried out using a dye, Rhodamine B (RhB), that have been used to probe the activity of TiO2. Although the degradation degree of RhB using nanofibers of PVOH/TiO2 (anatase) and PVOH/TiO2 (hydrothermal) is lower than nanopowders of TiO2 (anatase) and TiO2 (hydrothermal), conversely, the results have shown that nanofibers have photoactivity indicating that some nanoparticles of TiO2 were on the surface, degrading RhB. However, the PVOH photocatalytic degradation experiment showed that only the TiO2 nanoparticles (anatase and spherical in shape) degraded the PVOH. The results showed that the total weight loss percentage of PVOH in the PVOH/TiO2 fiber is 56% after 1 hour irradiation. The PVOH in nanocomposite PVOH/TiO2 (5wt.%) (hydrothermal) was not degraded due to the rodshaped nanoparticles of TiO2 and the predominance of the rutile crystalline phase, which is known to have less and poor photocatalyst activity than TiO2 anatase phase. In this study, PVOH/TiO2 (anatase), PVOH/TiO2 (hydrothermal), and PVOH/Ag nanocomposites are considered to be promising materials for application in the food industry. / Nesta tese foram desenvolvidos e caracterizados nanocompósitos a base de poli(álcool vinílico) (PVOH) carregados com nanopartículas de dióxido de titânio, TiO2 anatase e TiO2 preparado pelo método hidrotérmico, e de prata (Ag), com o objetivo de serem usados como materiais bactericidas. Para isso, primeiro foram eletrofiadas soluções aquosas de PVOH nas concentrações de 10% e 18% em massa do polímero. A caracterização morfológica mostrou que estas nanofibras possuem diâmetros na faixa de 77 a 155 nm. A seguir, foram preparados os nanocompósitos de poli(alcool vinílico) (PVOH)/prata (Ag). Estes foram caracterizados através das técnicas de MEV, EDS, DRX, Espectroscopia de reflectância difusa no UV-Vis e MET. As imagens obtidas por MEV mostraram que os valores dos diâmetros médios das nanofibras são de aproximadamente 90 nm. Através das imagens obtidas por MET, observou-se que as nanopartículas de Ag estão homogeneamente distribuídas nas fibras, cujo valor médio foi de 5,8 nm. Estes materiais apresentaram bons valores de eficácia antibacteriana frente as bactérias Stapylococcus aureus (87,8%) e Escherichia coli (85%). O presente trabalho apresenta também os resultados da caracterização dos nanocompósitos de PVOH/TiO2 (anatase, comercial) e PVOH/TiO2 (hidrotérmico). Estes foram caracterizados por MEV, DRX, EDS, MET, Espectroscopia de reflectância difusa no UV-Vis, TG e DSC. O carregamento com TiO2 demonstrou ser efetivo mudando a absorção da luz na região do UV. Com o objetivo de se avaliar indiretamente a atividade antibacteriana destes nanocompósitos, foram feitos os experimentos fotocatalíticos, utilizando o corante Rodamina B (RhB), como prova da atividade da fibra. Os resultados obtidos mostraram que apesar da degradação da Rodamina B (RhB) ser muito menor com as nanofibras de PVOH/TiO2 (anatase) e PVOH/TiO2 (hidrotérmico) do que com as nanopartículas de TiO2 (anatase) e TiO2 (hidrotérmico), as nanofibras possuem fotoatividade indicando que algumas nanopartículas de TiO2 estão acessíveis na superfície das fibras, degradando a RhB. Entretanto, através dos experimentos de fotodegradação do PVOH, foi verificado que somente as nanopartículas de TiO2 anatase, na forma de esfera, degradaram o PVOH, resultando numa perda de massa de 56% em 1 hora em relação à nanofibra do polímero puro. A não degradação do polímero no nanocompósito de PVOH/TiO2 (5% em massa de TiO2 hidrotérmico) foi atribuída ao formato bastonete das nanopartículas de TiO2 e a predominância da fase cristalina rutilo, a qual é conhecida por ser um pior fotocatalisador do que o TiO2 anatase. Este trabalho demonstrou que os nanocompósitos a base de PVOH carregados com TiO2 (anatase, comercial), TiO2 (hidrotérmico) e Ag podem ser considerados materiais promissores para aplicação na indústria alimentícia.