O presente estudo teve como objetivo avaliar a conversão dos açúcares do bagaço de cana em etanol, com foco na integração entre o pré-tratamento com H2SO4 diluído, sacarificação com celulases comerciais e fermentação com Scheffersomyces stipitis DSM- 3651, buscando-se uma configuração simplificada. Previamente aos ensaios de integração, o bagaço foi moído para a redução de sua heterogeneidade granulométrica. Após a moagem, o bagaço foi submetido a fracionamento, por fluxo de ar, separando frações de fibras e finos. Estas frações foram submetidas a analise composicional e observou-se que a fração de finos possui elevados teores de cinzas e extrativos, além de baixo teor de lignina em relação à fração de fibras, entretanto a estratégia de fracionamento do bagaço não foi seletiva. Os experimentos de definição da condição de pré-tratamento mais adequada para a avaliação entre integração entre sacarificação e fermentação foram conduzidos em reator Parr (2 gal) com 2Kg de mistura reacional, incluindo bagaço (10%), água e ácido. Três condições operacionais de pré-tratamento foram avaliadas: 140°C/1%H2SO4/20 min, 150°C/2% H2SO4/30 min e 160°C/3% H2SO4/40 min. Após o pré-tratamento, o slurry foi separado em sólido pré-tratado e hidrolisado hemicelulósico, por filtração. Em seguida o bagaço pré-tratado foi lavado exaustivamente com água destilada e submetido à hidrólise enzimática com celulases (10 FPU/g bagaço) por 72h. Paralelamente, o hidrolisado foi submetido à fermentação com S. stipitis (3 g/L) por 120h. As composições das frações geradas após o pré-tratamento (bagaço pré-tratado, hidrolisado e água de lavagem), quanto aos teores de açúcares e sólidos (solúveis e insolúveis) foram determinadas. As três condições de pré-tratamento levaram a remoção completa de hemicelulose do bagaço, e o aumento da severidade do pré-tratamento acarretou em aumento da eficiência de sacarificação dos sólidos pré-tratados, porém em menor recuperação de glicose após hidrólise enzimática. Por outro lado, o aumento da severidade do pré-tratamento prejudicou a recuperação de açúcares no hidrolisado hemicelulósico, elevando concentrações de ácido acético, furfural e HMF, resultando em inibição completa de fermentação daqueles obtidos nas condições de 150°C e 160°C. A conversão do sólido prétratado (lavado ou não-lavado) + hidrolisado (destoxificado ou não), e do slurry completo (destoxificado ou não) ambos obtidos após pré-tratamento à 140°C, foi avaliada em duas configurações, respectivamente: \"Fermentação do hidrolisado hemicelulósico (FHH), em separado da sacarificação do sólido pré-tratado e da fermentação do hidrolisado celulósico, separadas (SHF)\" e \"Sacarificação do sólido pré-tratado, em separado da co-fermentação dos hidrolisados celulósico e hemicelulósico, integradas (ISHCF)\". Na primeira, observouse que a destoxificação do hidrolisado com lacase (1U/mL) aumentou a produção de etanol, e possibilitou a redução do tempo de conversão em 48h. A sacarificação de sólidos não-lavados foi prejudicada pela presença de compostos solúveis e o condicionamento com lacase não influenciou a eficiência de sacarificação. A eficiência máxima de conversão em configuração de SHF+FHH foi de 28,4%, devido a não lavagem do sólido pré-tratado (13,7%) e destoxificação do HH (14,7%). Em ISHCF, observou-se que a eficiência de conversão de slurry integral destoxificado com lacase é mais alta (38,9%) do que em SHF+FHH, devido a não separação sólido-líquido e maior disponibilidade de açúcares. / This study aimed to evaluate the conversion of sugarcane bagasse into ethanol, focusing on integration between pretreatment with dilute H2SO4, saccharification with commercial cellulases and fermentation with Scheffersomyces stipitis DSM-3651, in a simplified design process. Prior to integration assays, the bagasse was milled to reduce its granulometric heterogeneity. After milling, the fractions of bagasse (fiber and pith) were separated by air flow. These fractions had their chemical composition determined and it was observed that pith fraction has higher content of ash, soluble extractives and low lignin content than fiber fraction; however the separation method was not selective. The experiments to define the most suitable pretreatment condition for evaluating the integration between saccharification and fermentation were conducted in a Parr reactor (2 gal) with 2 kg of reaction mixture, including bagasse (10%), water and acid. Three operational conditions of pretreatment were evaluated: 140°C/1% H2SO4/20min, 150°C/ 2% H2SO4/30 min and 160°C/3% H2SO4/40min. After pretreatment, the slurry was separated in pretreated solid and hemicellulosic hydrolyzate, by filtration. The pretreated solid was thoroughly washed with distilled water and submitted to enzymatic hydrolysis with cellulases (10 FPU / g residue) for 72h. In parallel, the hemicelullosic hydrolyzate was submitted to fermentation with S. stipitis (3 g / L) for 120h. The compositions of the fractions generated after pretreatment (pretreated bagasse, hemicellulosic hydrolyzate and washing water), regarding sugars and solids (soluble and insoluble) contents were determined. All pretreatment conditions led to complete removal of hemicellulose from the bagasse, and the increase of pretreatment severity improved the saccharification yield of pretreated solid, but, leaded to low recovery of glucose after enzymatic hydrolysis. On the other hand, the increase of pretreatement severity impaired the recovery of sugars in hemicellulosic hydrolysate besides increasing the concentrations of acetic acid, furfural and HMF, resulting in complete inhibition of fermentation of those obtained under the pretreatement conditions of 150°C and 160°C. The conversion of pretreated solid (washed and non-washed) + hemicellulosic hydrolyzate (with or without detoxification) and of the whole slurry, both obtained at 140°C was evaluated in two process designs, respectively: \"Fermentation of hemicellulosic hydrolyzate (FHH), separated from hydrolysis of pretreated solid and fermentation of cellulosic hydrolyzate, separately (SHF)\" and \"Integrated hydrolysis of pretreated solid separated from co-fermentation of cellulosic and hemicellulosic hydrolysates (ISHCF)\". In the first, it was observed that the detoxification of the hydrolyzate with laccase (1U / ml) improved the ethanol production, particularly for conversion time. The saccharification of non-washed solid was hampered by the presence of soluble compounds and its conditioning treatment with laccase did not influence the saccharification yield. The maximum conversion efficiency in SHF + FHH configuration was 28.4% due to not washing the pretreated solid (13.7%) and detoxification of hemicellulosic hydrolysate (14.7%). In the second process design, it was observed that the conversion efficiency of whole slurry, with laccase detoxification, was higher (38.9%) than in the separate configuration, with a lower conversion time.

Este trabalho teve como objetivo geral estudar a viabilidade técnica de utilizar bagaço de cana como meio reativo de barreiras reativas permeáveis (BRP) para remoção de sulfato e metais de águas subterrâneas contaminadas. O estudo baseou-se em investigação experimental, por meio de ensaios laboratoriais de coluna, e em modelagem matemática, para a qual utilizaram-se também alguns dados obtidos em um estudo de caso de uma unidade industrial contaminada com sulfato e metais. Neste local contaminado, as características hidrogeológicas e topográficas propiciam a utilização de uma barreira reativa permeável como técnica de remediação. Barreiras reativas permeáveis são uma alternativa para remediação de águas subterrâneas que vem progredindo rapidamente na última década, a partir de ensaios de bancada e coluna em laboratório para implementação em escala real em campo. Três colunas bióticas foram montadas utilizando bagaço de cana como meio reativo e um material de base poroso constituído de areia e cascalho para fornecer adequada condutividade hidráulica, com a proporção de 1:28 em massa seca. Também foi adicionado ao meio reativo um inóculo bacteriano composto por esterco bovino dissolvido. Uma quarta coluna, sem inóculo e contendo um agente biocida, compôs o experimento branco (abiótico). Uma solução sintética foi introduzida nas colunas simulando condições da água subterrânea do estudo de caso, com velocidade de Darcy em torno de 2,0x10-7 m/s composta por sulfato e metais (zinco e níquel) com concentrações de 6.000 mg/L e 15 mg/L, respectivamente. Os resultados das análises da fase líquida das colunas bióticas apresentaram: (i) média da taxa de remoção de sulfato durante todo o tempo do experimento de 49 mg/L/dia; (ii) as concentrações de Zn e Ni diminuíram de 15 mg/L para valores não detectáveis pela técnica analítica utilizada (< 0,01 mg/L); (iii) aumento do pH de 5.5-5.8 para valores entre 6,8-8,0; (iv) redução do valor do potencial de óxido redução (Eh) para valores de até -200mV. Não foram observadas reduções das concentrações de metais e sulfato na fase líquida da coluna abiótica e os valores de pH e Eh permaneceram dentro das faixas iniciais. Análises nas fases sólidas das colunas bióticas por MEV e EDS após o término do experimento identificaram a presença de Ni, Zn, S e Mn, indicando a precipitação desses metais em forma de sulfetos. Estes elementos não foram detectados na fase sólida da coluna abiótica. Assim, pôde-se inferir que toda a remoção de sulfato verificada nas colunas bióticas pode ser atribuída a redução bacteriana de sulfato. A partir das condições experimentais dos ensaios, foi realizada a modelagem e o dimensionamento da BRP. Para a estimativa da cinética de redução de sulfato, aplicou-se a solução analítica de Van Genuchten para transporte de contaminantes com degradação, obtendo-se uma taxa de decaimento de primeira ordem de 0,01 dia-1. A determinação da espessura e tempo de residência da barreira foi realizada considerando que a concentração de sulfato na saída da barreira fosse menor ou igual a 250 mg/L. O resultado do dimensionamento de uma BRP preenchida com bagaço de cana e areia nas proporções de 1:28 em massa seca resultaria em uma BRP de 7,1 m de espessura, com tempo de residência de 950 dias, no local de estudo de caso. Caso fosse utilizado o dobro da proporção de bagaço de cana e areia em massa seca (1:14), a implantação da BRP apresentar-se-ia viável, com espessura aproximada de 4 m. Através destes resultados, pôde ser comprovada a hipótese de que bagaço de cana como substrato e esterco bovino como inóculo compõem um meio reativo viável para a redução de sulfato e precipitação de metais em uma BRP. / This research had as general objective to study the technical feasibility of use sugarcane bagasse as reactive medium of permeable reactive barriers (PRB) for removal of sulfate and metals from contaminated groundwater. The study was based on experimental investigation, through laboratory column tests and by mathematical modeling, for which data of a case study of an industrial unit contaminated with sulfate and metals was used. At this contaminated unit, the hydrogeological and topographical features propitiate the utilization of a permeable reactive barrier as remediation technique. Reactive permeable barriers are an alternative to groundwater remediation that comes progressing quickly in the last decade, from bench and column tests in the laboratory to full-scale implementation in the field. Three biotic columns were assembled using bagasse as a reactive medium and a porous base material consisting of sand and gravel to provide adequate hydraulic conductivity, with the proportion of 1:28 by dry mass. It was also added to the reactive medium a bacterial inoculum consisting of dissolved cow manure. A fourth column, without inoculum, and containing a biocidal agent composed the blank experiment (abiotic). A synthetic solution was introduced in columns simulating groundwater conditions of the case study, with Darcy velocity around 2, 0x10-7 m/s, composed by sulfate and metals (zinc and nickel) with concentrations of 6,000 mg/L and 15 mg/L, respectively. The results of the analyses of the liquid phase of the biotic columns showed: (i) the average of sulfate removal rate during all the time of the experiment of 49 mg/L/day; (ii) the concentrations of Zn and Ni decreased from 15 mg/L to non-detectable values by the used analytical technique (0.01 mg/L); (iii) increase in the pH of 5.5-5.8 for values between 6.8-8.0; (iv) reduction in the value of the oxidation-reduction potential (Eh) for values up to -200mV. The reductions were not observed in concentrations of metals and sulfate in liquid phase of abiotic column and the values of pH and Eh remained within the initial tracks. Analyses on solid phases of biotic columns by SEM and EDS after experiment finalization have identified the presence of Ni, Zn, S and Mn, indicating the precipitation of these metals in the form of sulfides. These elements were not detected in the solid phase of the abiotic column. So, it might be inferred that any reduction in sulfate removal biotic columns can be attributed to bacterial sulfate reduction. Base on the experimental conditions of the tests, it was conducted the modeling and PRB dimensioning. For the sulfate reduction kinetics estimation, the analytical solution of Van Genuchten was applied for contamination degradation and transport, obtaining a first-order decay rate of 0.01 day-1. The determination of the thickness and residence time of the barrier was performed considering the concentration of sulfate in the output of the barrier being less than or equal to 250 mg/L. The result of the dimensioning of the PRB filled with bagasse and sand in 1:28 dry mass ratios would result in a PRB of 7.1 m thick, with 950 days residence time on the site of case study. If the proportion of bagasse and sand were 1:14 by dry mass (twice), the deployment of the PRB would be feasible, with approximate thickness of 4 m. Through these results, it might be concluded that the hypothesis that sugarcane bagasse as a substrate and cow manure as inoculum make up a reactive medium viable for the reduction of sulfate and precipitation of metals in a PRB.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é um dos principais fungos utilizados para a produção em larga escala de enzimas devido a sua grande capacidade de produção e secreção de holocelulases para aplicação em processos de sacarificação da biomassa vegetal lignocelulósica. Embora o T. reesei seja utilizado como um dos principais produtores de celulases a nível industrial, diversos processos e estudos são realizados com o objetivo de aprimorar o entendimento de todo o mecanismo de degradação de biomassa vegetal além de prover o aumento da eficiência tanto da produção quanto da atividade das celulases. No presente trabalho foi realizado a construção de uma linhagem mutante para o gene cel74a (codificando para uma xiloglucanase) e a caracterização funcional de CEL74A na regulação gênica de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. Os nossos resultados mostraram que deleção de cel74a possivelmente pode estar envolvida no sinergismo da regulação da expressão de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. A partir da análise do perfil de expressão gênica, foi possível observar a redução na expressão de todos os genes de celulases testados (cel7a, cel7b e cel6a) embora não tenha afetado a atividade enzimática, ao passo que as hemicelulases (xyn1 e xyn2) apresentaram aumento tanto na expressão quanto na atividade enzimática. Na linhagem ?cel74a, foi observado redução na liberação de glicose, xilose e galactose após a hidrólise de xiloglucano. Além disso, a atividade de CEL74A foi modulada na presença de cálcio e pode ser necessária para a atuação mais eficiente de outras enzimas envolvidas na degradação de xiloglucano. Desta forma, em T. reesei, CEL74A apresenta um papel importante tanto na regulação de genes holocelulolíticos quanto para a degradação eficiente de bagaço de cana-de-açúcar, contribuindo para a elucidação de mecanismos pelos quais este fungo utiliza para a utilização do bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono / The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the main fungi used for the large-scale production of enzymes due to their great capacity of production and secretion of holocellulases for application in saccharification processes of lignocellulosic plant biomass. Although T. reesei is used as one of the main producers of cellulases at industrial level, several processes and studies are carried out with the aim of improving the understanding of the whole plant biomass degradation mechanism, as well as increasing the efficiency of both the production and cellulase activity. In the present work the construction of a mutant lineage for the cel74a gene (coding for a xyloglucanase) and the functional characterization of CEL74A in the gene regulation of holocellulases during the cultivation of sugarcane bagasse were carried out. Our results showed that deletion of cel74a may be involved in the regulation of holocellulase expression during sugarcane bagasse cultivation. From the analysis of the gene expression profile, it was possible to observe the reduction in the expression of all tested cellulase genes (cel7a, cel7b and cel6a), although it did not affect the enzymatic activity, whereas the hemicellulases (xyn1 and xyn2) presented increase in both expression and enzymatic activity. In the ?cel74a strain, a reduction in glucose, xylose and galactose release was observed after xyloglucan hydrolysis. In addition, the activity of CEL74A was modulated in the presence of calcium and may be required for the more efficient performance of other enzymes involved in the degradation of xyloglucan. Thus, in T. reesei, CEL74A plays an important role both in the regulation of holocellulolytic genes and in the efficient degradation of sugarcane bagasse, contributing to the elucidation of mechanisms by which this fungus uses for the use of sugarcane bagasse as source of carbon

Importantes produtos úteis à sociedade podem ser obtidos a partir do bagaço de cana-deaçúcar, como por exemplo, o etanol de segunda geração. Para a produção deste álcool, reforçam-se estudos visando alternativas de processos diferenciados, como por exemplo, utilizando células imobilizadas em biorreatores. O presente trabalho teve como objetivos o estudo de condições de imobilização da levedura Scheffersomyces shehatae UFMG-HM 52.2, encapsulada em gel de alginato de cálcio, e a avaliação de condições de produção de etanol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, com as células imobilizadas em processos operados em reator de leito fluidizado. Inicialmente, o bagaço de cana-de-açúcar foi submetido à hidrólise ácida seguida de concentração e destoxificação do hidrolisado hemicelulósico. Em ensaios fermentativos em frascos Erlenmeyer, com a nova e promissora levedura fermentadora de pentoses, Scheffersomyces shehatae UFMGHM 52.2 na forma livre, testou-se diferentes meios nutricionais para a seleção dos nutrientes importantes na suplementação do hidrolisado hemicelulósico. Após análise, escolheu-se o meio composto por 5 g/l de sulfato de amônio, 3 g/l de extrato de levedura e 3 g/l de extrato de malte para as fermentações subsequentes. Utilizando-se este meio, observou-se valores de fator de rendimento (YP/S) e produtividade volumétrica em etanol (QP) de 0,38 g/g e 0,19 g/l.h, respectivamente. Em uma primeira etapa, determinou-se as condições de imobilização celular da levedura por encapsulamento em gel de alginato de cálcio, utilizando um planejamento experimental 23 completo com três pontos centrais. Avaliou-se a influência da concentração de alginato de sódio, de cloreto de cálcio e tempo de cura, tendo como variáveis resposta YP/S e QP. Pela análise estatística e fermentativa, definiu-se o uso da concentração de 1% de alginato de sódio, 0,2 M de cloreto de cálcio e 12 h de tempo de cura para o processo de imobilização celular. Nesta condição, observou-se valores de YP/S e QP de 0,32 g/g e 0,14 g/l.h, respectivamente. Posteriormente, conduziuse fermentações utilizando células imobilizadas em modo de bateladas repetidas em frascos Erlenmeyer, verificando-se a estabilidade na produção de etanol em cinco ciclos fermentativos consecutivos. Em uma segunda etapa, avaliou-se as condições de produção de etanol utilizando células imobilizadas em reator de leito fluidizado, por meio de planejamento experimental 22 completo com três pontos centrais. Avaliou-se a influência da vazão de aeração e massa de suporte com células imobilizadas, tendo como variáveis resposta YP/S e QP. A partir da análise estatística e fermentativa, verificou-se como melhores condições para o processo, o uso de 200 g de suporte e 200 ml/min de vazão de aeração. Nestas condições, observou-se valores de YP/S e QP de 0,26 g/g e 0,17 g/l.h, respectivamente. Sob estas condições de processo, realizou-se também fermentações em modo de bateladas repetidas, verificando-se a estabilidade do sistema operacional de produção de etanol em sete ciclos fermentativos consecutivos. Por estes resultados, concluiu-se que esse processo fermentativo com células imobilizadas em reator de leito fluidizado apresenta destacada potencialidade, podendo servir como conhecimentos para estudos futuros visando a sua implementação em maiores escalas. / Important useful products to society can be obtained from sugarcane bagasse, e.g. secondgeneration ethanol. For the production of this alcohol, studies are focused on alternatives for different processes, e.g., using immobilized cells in bioreactors. This work had as objectives the study of immobilization conditions on the yeast Scheffersomyces shehatae UFMG-HM 52.2, encapsulated in gel of calcium alginate, and evaluating the conditions of ethanol production from sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate, with the immobilized cells in the process carried out in a fluidized bed reactor. Initially, the sugarcane bagasse was subject to acid hydrolysis followed by concentration and detoxification of hemicellulosic hydrolysate. In fermentation tests in Erlenmeyer flasks, with the novel and promising pentose fermenting yeast, Scheffersomyces shehatae UFMGHM 52.2 in free form, different nutritional media were tested for the selection of important nutrients in the supplementation of hemicellulosic hydrolysate. After the analysis, the medium composed of 5 g/l of ammonium sulfate, 3 g/l of yeast extract and 3 g/l of malt extract was chosen for subsequent fermentations. By using this medium, it was observed values of etanol yield (YP/S) and volumetric productivity (QP) of 0.38 g/g and 0.19 g/l.h, respectively. In a first step, it was determined the yeast cells immobilization conditions by encapsulation in calcium alginate gel using a 23 full factorial design with three central points. The influence of the concentration of sodium alginate, calcium chloride and conditioning time was evaluated, with the response variables YP/S and QP. By statistical and fermentative analysis, it was chosen the concentrations of 1% for sodium alginate, 0.2 M for calcium chloride and 12 h for conditioning time in the immobilization process. In this condition, it was observed values of YP/S and QP of 0.32 g/g and 0.14 g/l.h, respectively. Thus, fermentations were performed applying immobilized cells in Erlenmeyer flasks in repeated batch, where the stability of ethanol production in five consecutive cycles was verified. In a second step, the conditions of ethanol production using immobilized cells in fluidized bed reactor were evaluated, by using a 22 full factorial design with three central points. In this investigation, the influence of aeration rate and mass of suport with immobilized cells was tested, and the response variable were YP/S and QP. By statistical and fermentative analysis, it was found that the best conditions for the process included the use of 200 g of support with immobilized cells and 200 ml/min for aeration rate. Under these conditions, it was observed values of YP/S and QP of 0.26 g/g and 0.17 g/l.h, respectively. Also, under the same conditions, repeated batch fermentations were carried out, where it was verified that ethanol production system stability in seven consecutive fermentation cycles. For these results, it was concluded that this fermentation with immobilized cells in fluidized bed reactor offers outstanding potential and could be used as basis for future studies aiming its implementation in large scales.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é um dos principais fungos utilizados para a produção em larga escala de enzimas devido a sua grande capacidade de produção e secreção de holocelulases para aplicação em processos de sacarificação da biomassa vegetal lignocelulósica. Embora o T. reesei seja utilizado como um dos principais produtores de celulases a nível industrial, diversos processos e estudos são realizados com o objetivo de aprimorar o entendimento de todo o mecanismo de degradação de biomassa vegetal além de prover o aumento da eficiência tanto da produção quanto da atividade das celulases. No presente trabalho foi realizado a construção de uma linhagem mutante para o gene cel74a (codificando para uma xiloglucanase) e a caracterização funcional de CEL74A na regulação gênica de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. Os nossos resultados mostraram que deleção de cel74a possivelmente pode estar envolvida no sinergismo da regulação da expressão de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. A partir da análise do perfil de expressão gênica, foi possível observar a redução na expressão de todos os genes de celulases testados (cel7a, cel7b e cel6a) embora não tenha afetado a atividade enzimática, ao passo que as hemicelulases (xyn1 e xyn2) apresentaram aumento tanto na expressão quanto na atividade enzimática. Na linhagem ?cel74a, foi observado redução na liberação de glicose, xilose e galactose após a hidrólise de xiloglucano. Além disso, a atividade de CEL74A foi modulada na presença de cálcio e pode ser necessária para a atuação mais eficiente de outras enzimas envolvidas na degradação de xiloglucano. Desta forma, em T. reesei, CEL74A apresenta um papel importante tanto na regulação de genes holocelulolíticos quanto para a degradação eficiente de bagaço de cana-de-açúcar, contribuindo para a elucidação de mecanismos pelos quais este fungo utiliza para a utilização do bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono / The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the main fungi used for the large-scale production of enzymes due to their great capacity of production and secretion of holocellulases for application in saccharification processes of lignocellulosic plant biomass. Although T. reesei is used as one of the main producers of cellulases at industrial level, several processes and studies are carried out with the aim of improving the understanding of the whole plant biomass degradation mechanism, as well as increasing the efficiency of both the production and cellulase activity. In the present work the construction of a mutant lineage for the cel74a gene (coding for a xyloglucanase) and the functional characterization of CEL74A in the gene regulation of holocellulases during the cultivation of sugarcane bagasse were carried out. Our results showed that deletion of cel74a may be involved in the regulation of holocellulase expression during sugarcane bagasse cultivation. From the analysis of the gene expression profile, it was possible to observe the reduction in the expression of all tested cellulase genes (cel7a, cel7b and cel6a), although it did not affect the enzymatic activity, whereas the hemicellulases (xyn1 and xyn2) presented increase in both expression and enzymatic activity. In the ?cel74a strain, a reduction in glucose, xylose and galactose release was observed after xyloglucan hydrolysis. In addition, the activity of CEL74A was modulated in the presence of calcium and may be required for the more efficient performance of other enzymes involved in the degradation of xyloglucan. Thus, in T. reesei, CEL74A plays an important role both in the regulation of holocellulolytic genes and in the efficient degradation of sugarcane bagasse, contributing to the elucidation of mechanisms by which this fungus uses for the use of sugarcane bagasse as source of carbon

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a fermentabilidade do hidrolisado enzimático do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino, visando a produção de etanol por leveduras. Inicialmente, o bagaço de cana foi pré-tratado com sulfito alcalino para remover parcialmente a lignina e alterar a estrutura da celulose e hemicelulose. Os efeitos deste pré-tratamento foram avaliados em termos da composição química dos materiais obtidos: um material lavado (BPL) e outro não lavado (BPNL) após tratamento. A digestibilidade enzimática dos materiais obtidos foi testada empregando dois extratos enzimáticos comercias e 3 cargas de enzimas, de acordo com um planejamento experimental 22. A partir destes resultados foi selecionado o extrato Cellubrix suplementado com ?-glicosidase na carga de 18 FPU/g de biomassa, e nesta condição os rendimentos de conversão de celulose e xilana foram cerca de 70% e 65%, respectivamente. Os hidrolisados enzimáticos do BPL e BPNL porém suplementados com nutrientes (2,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,0 g/L de KH2PO4, 0,3 g/L de MgSO4.7H2O, 5,0 g/L de extrato de levedura), e avaliados quanto a produção de etanol por K. marxianus Y-6860 a 40°C. Os resultados mostraram que a levedura produziu etanol apenas a partir de glicose, e os parâmetros fermentativos obtidos com o hidrolisado BPNL QP = 3,7 g/L.h e YP/S = 0,40 g/g foram 20 e 5%, respectivamente superior ao BPL. O hidrolisado enzimático do BPNL foi então selecionado, para avaliar o efeito da suplementação nutricional nos parâmetros fermentativos da levedura K. marxianus Y-6860, em três temperaturas diferentes (30, 35 e 40°C) de acordo com um planejamento experimental 22. Para efeito de comparação, foi também avaliada a fermentabilidade do hidrolisado BPNL pelas leveduras S. cerevisiae PE-2 e S. stipitis Y-7124. Os resultados mostraram que para as três leveduras estudadas, os valores dos parâmetros fermentativos, foram favorecidos a 30 °C na presença nutrientes. Nesta condição, as leveduras apresentaram valores de YP/S similares (~ 0,48 g/g), em quanto que o QP foi de 3,25; 2,17 e 0,95 g/L.h para K. marxianus, S. cerevisiae e S. stipitis, respectivamente. Ressalta-se ainda que nesta condição, a S. stipitis Y-7124 foi a única levedura, capaz de consumir completamente ambos os açúcares (glicose + xilose) e produzir uma concentração de etanol 46% maior comparado as outras leveduras. Foi avaliado também a fermentabilidade das três leveduras no hidrolisado enzimático BPNL com alta concentração de glicose (100 g/L), nas condições anteriormente selecionadas. Os resultados mostraram que, as três leveduras apresentaram potencial para produção de etanol a partir da glicose, com uma eficiência de conversão de etanol superior a 70%, no entanto deveriam se implementar estratégias para estimular o consumo de xilose. Com os resultados do presente trabalho se pode concluir que o hidrolisado enzimático do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino suplementado com nutrientes, é um meio com grande potencial para a produção de etanol com características favoráveis para ser eficientemente fermentado por diferentes espécies de leveduras. / The present work had the objective to evaluate the fermentability of the enzymatic hydrolyzate of sugar cane bagasse pre-treated with alkali sulfite process, aiming the ethanol production by yeasts. Initially, sugarcane bagasse was pretreated with alkaline sulfite process to remove lignin partially. The effects of this pre-treatment, were evaluated in the chemical composition of the materials: one material washed after treatment (WB) and another unwashed material (UWB). The enzymatic digestibility of the obtained materials was tested using two commercial enzymatic extracts and three enzyme loads according to an experimental design 22. From these results, the Cellubrix extract supplemented with ?-glucosidase, was selected in the load of 18 FPU/g of biomass, in this condition the cellulose and xylan conversion yields were about 70% and 65%, respectively. The enzymatic hydrolysates of WB and UWB supplemented with nutrients (2,0 g/L (NH4)2 SO4, 1,0 g/L KH2 PO4, 0,3 g/L MgSO4 .7H2O, 5,0 g/L yeast extract), were evaluated for ethanol production by K. marxianus Y-6860 at 40°C. The results showed that the yeast produced ethanol only from glucose, and the fermentative parameters obtained with the UWB hydrolyzate QP= 3,7 g/L.h and YP/S= 0,40 g/g, were 20 and 5% respectively higher to WB. The UWB hydrolyzate, was selected to evaluate the effect of nutritional supplementation, in the fermentative parameters of K. marxianus, at three different temperatures (30, 35 and 40°C) according to an experimental design 22. For comparison, were also evaluated fermentability of S. cerevisiae PE-2 and S. stipitis Y-7124 in the hydrolyzate. In the three yeasts, the results showed that the values of the fermentative parameters, are favored when the hydrolyzate is supplemented with nutrients to 30°C. In this condition , yeasts showed similar YP/S value (~0,48 g/g), whereas the QP was of 3,25; 2,17 and 0,95 g/L.h for K. marxianus, S. cerevisiae and S. stipitis, respectively. It is also worth noting that in this condition S. stipitis was the only yeast able to completely consume both sugars (glucose+xylose) and produce a concentration of ethanol of 46% higher than other yeasts. In the previously selected condition, the fermentability of the hydrolyzate with high glucose concentration (100 g/L) was also evaluated. The results showed that the three yeasts presented potential for the production of ethanol from glucose, with an ethanol efficiency of over 70%, however strategies should be implemented to stimulate the consumption of xylose. With the results of the present work it can be concluded that the enzymatic hydrolyzate of sugar cane bagasse pretreated with alkaline sulfite process supplemented with nutrients is a medium with great potential for the production of ethanol with characteristics favorable to be efficiently fermented by different species of yeasts.

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Os processos de separação por membrana (PSM) vêm ganhando destaque em aplicações industriais por conta de suas vantagens, principalmente o baixo custo de implementação e o baixo consumo de energia para sua operação. A utilização de subprodutos agrícolas na obtenção de materiais é uma tendência crescente, sendo os seus maiores atrativos a grande disponibilidade desses subprodutos e por serem uma matéria-prima barata. O presente trabalho teve como principais objetivos a produção de membranas sua utilização na detoxificação do hidrolisado hemicelulósico originado do tratamento ácido do bagaço de cana-de-açúcar. Para tanto foram produzidos dois tipos de membranas a partir de três polímeros diferentes, o acetato de celulose obtido a partir do bagaço de cana, o acetato de celulose comercial e a poliamida 66. Na produção de acetato a partir do bagaço foi realizado um estudo exploratório para extrair a celulose, matéria-prima do acetato, de uma maneira que se obtivesse um material com alto grau de pureza e que as perdas de celulose durante o processo fossem minimizadas. Para a produção das membranas foi utilizada a técnica de inversão de fases. No caso das membranas de acetato de celulose, foi realizada uma variação dos parâmetros utilizados no processo de confecção das membranas (tempo de evaporação do solvente, temperatura do banho de coagulação e tratamento térmico), com o intuito de se estabelecer as melhores variáveis do processo, enquanto que para a poliamida 66, foram utilizadas condições previamente determinadas por outros estudos. Depois de prontas, as membranas foram caracterizadas fisicamente e pelas suas propriedades de fluxo de água pura, fluxo de vapor de água, rejeição de sais, rejeição de açúcares e rejeição de compostos tóxicos. Finalmente, as membranas foram aplicadas no processo de detoxificação do hidrolisado hemicelulósico para testar sua capacidade de remoção de furfural, hidroximetilfurfural (HMF), ácido acético e compostos fenólicos. No estudo de extração da celulose do bagaço, as melhores condições produziram uma celulose com pureza de 84,01%. O acetato produzido apresentou um grau de substituição de 2,52, podendo ser classificado como um triacetato de celulose. Em comparação, o acetato comercial apresentou um grau de substituição de 2,85. Fisicamente, todas as membranas apresentaram uma morfologia que intercalava a presença de poros com regiões nodulares. As membranas de bagaço de cana apresentaram uma considerável fragilidade, por isso nos testes de permeação sob pressão, elas foram suportadas por uma membrana de polissulfona comercial. Todas as membranas de acetato de bagaço e membrana de poliamida apresentaram fluxo de água pura, enquanto que apenas algumas membranas de acetato comercial conseguiram permear água pura. As membranas apresentaram diferentes resultados nos experimentos de rejeição de compostos, resultado das diferenças estruturais entre elas. No ensaio de detoxificação, a membrana que alcançou o melhor desempenho foi a membrana obtida a partir do acetato comercial. Essa membrana conseguiu remover 89,92% de HMF, 91,99% de furfural, 51,52% de ácido acético e 8,35% de compostos fenólicos. As membranas produzidas a partir do bagaço de cana alcançaram uma remoção de 71,66 de HMF, 60,87% de furfural, 91,79% de ácido acético e 10,86% de fenólicos. / Membrane separation processes (MSP) have been highlighted at industrial processes because of their advantages, mainly the low cost of implementation and the low energy consumption during their operation. The utilization of agriculture co-products for the obtainment of material is a increasing trend, wherein the main attractive are the high availability and the low cost of these co-products. The aims of this work were to produce membranes and to investigate their utilization in the detoxification of the hemicellulosic hydrolisate originated from the acid treatment of sugarcane bagasse. For that, two types of membranes were produced from three different types of polymers, cellulose acetate obtained from sugarcane bagasse, commercial cellulose acetate and polyamide 66. For the production of the sugarcane bagasse cellulose acetate it was conducted an exploratory study in order to extract cellulose, raw-material of the acetate, in a manner that the final material possessed high purity degree and the losses of cellulose during the process were minimized. The technique of phase inversion was utilized to produce the membranes. In the case of cellulose acetate membranes, the variation of the membrane production parameters (time of solvent evaporation, temperature of coagulation bath and thermical treatment) was performed for the purpose of establishing the best process parameters, whereas it was utilized previously established conditions found in the literature for the polyamide membrane production. The membranes were characterized physically and for their properties of pure water flux, vapor water flux, salt rejection, sugar rejection and toxic compound rejection. Finally, the membranes were applied in the process of hemicellulosic hydrolysate detoxification for testing their capacity of furfural, hydroxymethylfurfural (HMF), acetic acid and phenolic compound removal. The best conditions of cellulose extraction from sugarcane bagasse were able to produce cellulose with 84.01% of purity. The sugarcane cellulose acetate presented a substitution degree of 2.52, being classified as cellulose triacetate. In comparison, commercial cellulose acetate presented a substitution degree of 2,85. Physically, all membranes possessed a morphology that interspersed the presence of porous and nodular regions. Due to their fragility, sugarcane bagasse membranes were supported by a polysulfone commercial membrane in the tests of permeation under pressure. All sugarcane bagasse membranes and polyamide membrane achieved pure water flux. Nevertheless, just some commercial cellulose acetate membranes could permeate pure water. In the assays of compound rejection, the membranes reached different results, on behalf of their structural differences. The membrane that obtained the best performance in the detoxification process was the membrane produced form commercial cellulose acetate. This membrane was able to remove 89.92% of HMF, 91.99% of furfural, 51.52% of acetic acid and 8.35% of phenolic compounds. The membranes produced from sugarcane bagasse reached a removal of 71.66 of HMF, 60.87% of furfural, 91.79% of acetic acid and 10,86% of phenolics.

Uma tecnologia para o fracionamento de materiais lignocelulósicos, baseada no uso de solventes apropriados, foi proposta para separar os principais componentes (celulose, hemicelulose e lignina). De acordo com a técnica, é adicionado ao material um solvente para celulose (ácido fosfórico concentrado); então, acetona é adicionada para promover a precipitação da celulose na forma amorfa. As etapas subsequentes são as seguintes: uma primeira extração com acetona para remover a lignina; e uma segunda extração com água, para remover a hemicelulose. Estudos aplicando o fracionamento, denominado \"COSLIF\" (\"cellulose solvent and organic solvent based lignocellulose fractionation\"), em diferentes materiais demonstraram altas taxas e rendimentos de hidrólise da celulose em presença de baixas cargas enzimáticas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi definir condições apropriadas para fracionar o bagaço de cana-de-açúcar usando o fracionamento COSLIF, com vistas à produção de etanol de 2ª geração. Para otimização das condições de fracionamento, foi realizado um planejamento fatorial 25, com as seguintes variáveis: concentração de ácido fosfórico (81-85 %), temperatura (40-60 ºC), tempo (30-120 min), volume de acetona (80-120 mL) e volume de água (120-160 mL), determinando, a partir da composição das frações geradas, parâmetros relacionados à recuperação e seletividade do fracionamento. Apesar de grande variabilidade experimental, conseguiu-se definir a condição ótima por meio de análise estatística, para o fracionamento de 1 g de bagaço (massa seca): ácido fosfórico (83,8 %), temperatura (45,8 ºC), tempo (56,1 min), volume de acetona (91,6 mL) e volume de água (131,6 mL). Esta condição, reproduzida em escala ampliada, foi eficaz na amorfização da celulose e na separação da hemicelulose no extrato aquoso. O rendimento global (RG + X (S + L)) obtido foi de 87,1%; o rendimento de recuperação de glucana na fração sólida (RG(S)) foi de 84,6%; e o rendimento de recuperação de xilana na fração líquida (RX(L)) foi de 61,0%. Em relação à seletividade de recuperação de glucana na fração sólida (SG(S)) foi obtido 95,3%; e à seletividade de recuperação de xilana na fração líquida (SX(L)), foi obtido 72,7%. A análise estrutural da fração sólida, por meio de difração de raios-X e termoporometria, demonstrou que a tecnologia consegue romper a estrutura do material, diminuindo a cristalinidade e aumentando a porosidade. O índice de cristalinidade, que no bagaço \"in natura\" era de 44%, foi reduzido para 0; a área superficial cumulativa para moléculas com diâmetros de até 10 nm, que no bagaço \"in natura\", era de 43 m2/g, foi aumentada para 166 m2/g. Aliada à remoção de hemicelulose, tais alterações proporcionaram elevada eficiência de sacarificação da glucana em glicose; 93%, em 24 horas de hidrólise. O hidrolisado enzimático foi fermentado por Scheffersomyces stipitis, com produção de 10,5 g/L de etanol em 48 horas de fermentação; o rendimento de conversão de glicose em etanol (YP/S) foi de 0,36 g/g, com produtividade volumétrica (QP) de 0,22 g/Lh. / A technology for fractionating lignocellulosic materials, based on the use of suitable solvents, was proposed to separate the main components (cellulose, hemicellulose and lignin). According to the technique, a solvent for cellulose (concentrated phosphoric acid) is added to the material, then, acetone is added to promote precipitation of the cellulose in an amorphous form. The subsequent steps are as follows: a first extraction with acetone, to remove lignin, and a second extraction with water, to remove hemicellulose. Studies applying the fractionation, called \"COSLIF\" (\"cellulose solvent and organic solvent based lignocellulose fractionation\"), to different materials demonstrated the high rates and yields of cellulose hydrolysis in the presence of low enzymes loadings. In this context, the objective of the present study was to define appropriate conditions to fractionate the sugarcane bagasse of using the COSLIF procedure, aiming the production of 2nd generation ethanol. To optimize the conditions of fractionation, we performed a 25 factorial design, with the following variables: concentration of phosphoric acid (81-85%), temperature (40-60° C), time (30-120 min), volume of acetone (80-120 mL) and volume of water (120-160 mL), determining, from the composition of the generated fractions, the parameters of recovery and selectivity. Despite of high experimental variability, it was possible to define optimum condition, by means of statistical analysis, for the fractionation of 1 g of bagasse (dry weight): phosphoric acid (83,8%), temperature (45,8° C), time (56,1 min), volume of acetone (91,6 mL) and volume of water (131,6 mL). This condition, reproduced at a larger scale, was effective in the amorphization of cellulose and in the separation of hemicellulose in the aqueous extract. The overall yield (RG + X (S + L)) was 87,1%. The recovery yield of glucan in the solid fraction (GR (S)) was 84,6%, and the recovery yield of xylan in the liquid fraction (RX (L)) was 61,0%. The selectivity of glucan recovery in the solid fraction (SG (S)) was 95,3%, the selectivity of xylan recovery in the liquid fraction (SX (G)) was 72,7%. The structural analysis of the solid fraction, by means of X-ray diffraction and thermoporometry, demonstrated that the technology can disrupt the structure of the material, decreasing the crystallinity and increasing the porosity. The index of crystallinity, which in the \"in natura\" bagasse was 44%, was reduced to 0, the surface area cumulative to molecules with diameters up to 10 nm, which in the \"in natura\" bagasse was 43 m2/g, was increased to 166 m2/g. Coupled with the removal of hemicellulose, such changes provided high efficiency of saccharification of glucan into glucose, 93% in 24 hours of hydrolysis. The enzymatic hydrolyzate was fermented by Scheffersomyces stipitis, producing 10,5 g/L ethanol in 48 hours of fermentation, the conversion efficiency of glucose into ethanol (YP/S) was 0,36 g/g, and the volumetric productivity (QP) was 0,22 g/Lhr.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a conversão dos açúcares do bagaço de cana em etanol, com foco na integração entre o pré-tratamento com H2SO4 diluído, sacarificação com celulases comerciais e fermentação com Scheffersomyces stipitis DSM- 3651, buscando-se uma configuração simplificada. Previamente aos ensaios de integração, o bagaço foi moído para a redução de sua heterogeneidade granulométrica. Após a moagem, o bagaço foi submetido a fracionamento, por fluxo de ar, separando frações de fibras e finos. Estas frações foram submetidas a analise composicional e observou-se que a fração de finos possui elevados teores de cinzas e extrativos, além de baixo teor de lignina em relação à fração de fibras, entretanto a estratégia de fracionamento do bagaço não foi seletiva. Os experimentos de definição da condição de pré-tratamento mais adequada para a avaliação entre integração entre sacarificação e fermentação foram conduzidos em reator Parr (2 gal) com 2Kg de mistura reacional, incluindo bagaço (10%), água e ácido. Três condições operacionais de pré-tratamento foram avaliadas: 140°C/1%H2SO4/20 min, 150°C/2% H2SO4/30 min e 160°C/3% H2SO4/40 min. Após o pré-tratamento, o slurry foi separado em sólido pré-tratado e hidrolisado hemicelulósico, por filtração. Em seguida o bagaço pré-tratado foi lavado exaustivamente com água destilada e submetido à hidrólise enzimática com celulases (10 FPU/g bagaço) por 72h. Paralelamente, o hidrolisado foi submetido à fermentação com S. stipitis (3 g/L) por 120h. As composições das frações geradas após o pré-tratamento (bagaço pré-tratado, hidrolisado e água de lavagem), quanto aos teores de açúcares e sólidos (solúveis e insolúveis) foram determinadas. As três condições de pré-tratamento levaram a remoção completa de hemicelulose do bagaço, e o aumento da severidade do pré-tratamento acarretou em aumento da eficiência de sacarificação dos sólidos pré-tratados, porém em menor recuperação de glicose após hidrólise enzimática. Por outro lado, o aumento da severidade do pré-tratamento prejudicou a recuperação de açúcares no hidrolisado hemicelulósico, elevando concentrações de ácido acético, furfural e HMF, resultando em inibição completa de fermentação daqueles obtidos nas condições de 150°C e 160°C. A conversão do sólido prétratado (lavado ou não-lavado) + hidrolisado (destoxificado ou não), e do slurry completo (destoxificado ou não) ambos obtidos após pré-tratamento à 140°C, foi avaliada em duas configurações, respectivamente: \"Fermentação do hidrolisado hemicelulósico (FHH), em separado da sacarificação do sólido pré-tratado e da fermentação do hidrolisado celulósico, separadas (SHF)\" e \"Sacarificação do sólido pré-tratado, em separado da co-fermentação dos hidrolisados celulósico e hemicelulósico, integradas (ISHCF)\". Na primeira, observouse que a destoxificação do hidrolisado com lacase (1U/mL) aumentou a produção de etanol, e possibilitou a redução do tempo de conversão em 48h. A sacarificação de sólidos não-lavados foi prejudicada pela presença de compostos solúveis e o condicionamento com lacase não influenciou a eficiência de sacarificação. A eficiência máxima de conversão em configuração de SHF+FHH foi de 28,4%, devido a não lavagem do sólido pré-tratado (13,7%) e destoxificação do HH (14,7%). Em ISHCF, observou-se que a eficiência de conversão de slurry integral destoxificado com lacase é mais alta (38,9%) do que em SHF+FHH, devido a não separação sólido-líquido e maior disponibilidade de açúcares. / This study aimed to evaluate the conversion of sugarcane bagasse into ethanol, focusing on integration between pretreatment with dilute H2SO4, saccharification with commercial cellulases and fermentation with Scheffersomyces stipitis DSM-3651, in a simplified design process. Prior to integration assays, the bagasse was milled to reduce its granulometric heterogeneity. After milling, the fractions of bagasse (fiber and pith) were separated by air flow. These fractions had their chemical composition determined and it was observed that pith fraction has higher content of ash, soluble extractives and low lignin content than fiber fraction; however the separation method was not selective. The experiments to define the most suitable pretreatment condition for evaluating the integration between saccharification and fermentation were conducted in a Parr reactor (2 gal) with 2 kg of reaction mixture, including bagasse (10%), water and acid. Three operational conditions of pretreatment were evaluated: 140°C/1% H2SO4/20min, 150°C/ 2% H2SO4/30 min and 160°C/3% H2SO4/40min. After pretreatment, the slurry was separated in pretreated solid and hemicellulosic hydrolyzate, by filtration. The pretreated solid was thoroughly washed with distilled water and submitted to enzymatic hydrolysis with cellulases (10 FPU / g residue) for 72h. In parallel, the hemicelullosic hydrolyzate was submitted to fermentation with S. stipitis (3 g / L) for 120h. The compositions of the fractions generated after pretreatment (pretreated bagasse, hemicellulosic hydrolyzate and washing water), regarding sugars and solids (soluble and insoluble) contents were determined. All pretreatment conditions led to complete removal of hemicellulose from the bagasse, and the increase of pretreatment severity improved the saccharification yield of pretreated solid, but, leaded to low recovery of glucose after enzymatic hydrolysis. On the other hand, the increase of pretreatement severity impaired the recovery of sugars in hemicellulosic hydrolysate besides increasing the concentrations of acetic acid, furfural and HMF, resulting in complete inhibition of fermentation of those obtained under the pretreatement conditions of 150°C and 160°C. The conversion of pretreated solid (washed and non-washed) + hemicellulosic hydrolyzate (with or without detoxification) and of the whole slurry, both obtained at 140°C was evaluated in two process designs, respectively: \"Fermentation of hemicellulosic hydrolyzate (FHH), separated from hydrolysis of pretreated solid and fermentation of cellulosic hydrolyzate, separately (SHF)\" and \"Integrated hydrolysis of pretreated solid separated from co-fermentation of cellulosic and hemicellulosic hydrolysates (ISHCF)\". In the first, it was observed that the detoxification of the hydrolyzate with laccase (1U / ml) improved the ethanol production, particularly for conversion time. The saccharification of non-washed solid was hampered by the presence of soluble compounds and its conditioning treatment with laccase did not influence the saccharification yield. The maximum conversion efficiency in SHF + FHH configuration was 28.4% due to not washing the pretreated solid (13.7%) and detoxification of hemicellulosic hydrolysate (14.7%). In the second process design, it was observed that the conversion efficiency of whole slurry, with laccase detoxification, was higher (38.9%) than in the separate configuration, with a lower conversion time.