Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: ß-Galactosidase of Escherichia coli is the equivalent of lactase in humans and has the ability to bind and hydrolyse lactose. Lactase de ciency is a common phenomenon present in almost 70% of the world's population. This has resulted in greater than before demands on the food processing industry to develop a method that will allow for the hydrolysis of the disaccharide lactose in milk but will also allow for the removal of the remaining active enzyme. In this thesis, a new method, that is bio-speci c and well characterized for the removal of lactose from a lactose containing solution, is described. The E537D mutated version of ß-Galactosidase, which has a much lower activity compared to the wildtype and is able to bio-speci cally bind lactose for longer periods, was covalently immobilised to commercially available magnetic nanoparticles (fl uidMAG-Amine) via two coupling strategies. Glutaraldehyde is a cross-linking agent that reacts with amine groups, while N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) is a coupling agent that activates carboxylic groups. These agents are widely used for the coupling of biomolecules to solid supports. The covalently coupled fluidMAG-E537D ß-Galactosidase particles were characterized regarding retained enzymatic activity and ability to bind and physically remove lactose from a lactose containing solution by applying an external magnetic eld, after lactose binding, to the enzyme-particle complex in solution. Each component aimed at yielding this functionally immobilised enzyme complex was studied and optimized to contribute to the development of this novel technique, which is a ordable and simple, for the removal of lactose from solution for the ultimate production of lactose free milk. Results indicated the glutaraldehyde method of ß-Gal cross-linking to fluidMAG-Amine to be the preferred strategy since it allowed an increased carrier capacity of protein to the particles. The glutaraldehyde cross-linked protein also exhibited a two-fold higher activity than the EDC coupled protein. Furthermore, the glutaraldehyde cross-linked fluidMAG-E537D ß-Gal was able to physically remove 34 % of the lactose from a 0.2 nmol/L lactose in solution. This, therefore, con rmed the potential use of this novel technique in the food processing industry. / AFRIKAANSE OPSOMMING: ß-Galaktosidase vanaf Escherichia coli is dieselfde as laktase in mense en beskik oor die vermoë om laktose te bind en te hidroliseer. 'n Gebrek aan laktase kom algemeen voor en ongeveer 70 % van die wêreldbevolking ly hieraan. Laasgenoemde het daartoe gelei dat daar meer druk as vantevore op die voedselproduksie industrie is om 'n metode te ontwikkel waarmee die hidrolise van die disakkaried laktose in melk moontlik sal wees asook die verwydering van die oorblywende aktiewe ensiem. In hierdie tesis word 'n nuwe metode beskryf wat biospesi ek en goed gekarakteriseer is vir die verwydering van laktose vanuit 'n laktose bevattende oplossing. Die E537D gemuteerde weergawe van ß-Galaktosidase, wat beskik oor 'n baie laer aktiwiteit as die wildetipe asook die vermoë om laktose biospesi ek vir langer periodes te bind, is kovalent geïmmobiliseer op kommersieel beskikbare magnetiese nanopartikels (fluidMAG-Amine) via twee koppelingsstrategieë. Glutaraldehied is 'n kruisbindingsagent wat met amino groepe reageer, terwyl EDC 'n koppelingsagent is wat karboksie groepe aktiveer. Hierdie agente word algemeen gebruik vir die binding van biomolekules aan soliede matrikse. Die kovalent gekoppelde fluidMAG-E537D ß-Galaktosidase partikels is gekarakteriseer met betrekking tot behoue ensimatiese aktiwiteit en vermoë om laktose te bind en sies te verwyder vanuit 'n oplossing wat laktose bevat deur 'n eksterne magneetveld op die ensiem-partikel kompleks in oplossing toe te pas, nadat die binding van laktose plaasgevind het. Elke komponent van hierdie funksioneel geïmmobiliseerde ensiemkomplekse is ondersoek en geoptimaliseer met die doel om by te dra tot die ontwikkeling van 'n nuwe tegniek wat bekostigbaar en eenvoudig is vir die verwydering van laktose vanuit 'n oplossing vir die uiteindelike gebruik in die produksie van laktose-vrye melk. Resultate het getoon dat die glutaraldehied metode van ß-Gal kruisbinding op fluidMAG-Amine verkies word aangesien dit 'n verhoogde draerkapasiteit van proteïene op die partikels moontlik maak. Die glutaraldehied gekoppelde proteïene beskik ook oor twee keer meer aktiwiteit as die EDC gekoppelde proteïene. Die glutaraldehied gekoppelde fluidMAG-E537D ß -Gal kon 34 % van die laktose teenwoordig in 'n 0.2 nmol/L laktose oplossing sies verwyder. Hierdie het dus die potensiële gebruik van hierdie nuwe metode in die voedselproduksie industrie bevestig.

Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 2000. / Title from title screen. Paging within document: xii, 211 p. : ill. (some col.). Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (p. 199-211).

Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 2000. / Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (p. 199-211). Also available for download via the World Wide Web; free to University of Oregon users.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-23T11:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 255934.pdf: 897286 bytes, checksum: a9c37d8b67e86e7e36ff1b0b486aaa09 (MD5) / A hidrólise enzimática da lactose presente no soro lácteo é uma das possibilidades mais atrativas para utilização deste composto que é produzido em milhões de toneladas anualmente em todo o mundo. Atualmente, parte deste soro é utilizada para nutrição humana e animal e o restante é descartado no meio ambiente. Além da lactose, o soro apresenta em sua composição proteínas de alto valor biológico que podem ser concentradas por evaporação, precipitação ou ultrafiltração. Uma das possibilidades para valorização do soro lácteo com relação à lactose é sua hidrólise em reatores a membrana que apresenta a vantagem de permear continuamente o hidrolisado, mantendo-se a enzima ativa no retentado. Desta forma, maior quantidade de lactose pode ser hidrolisada por unidade de enzima. Sabe-se que enzimas podem interagir com superfícies hidrofóbicas, que são comuns em muitas membranas poliméricas. Portanto, é importante pesquisar se esta interação pode levar a uma perda de atividade catalítica da enzima adsorvida. Isto pode ocorrer devido à possibilidade da enzima utilizar o seu sítio ativo na adsorção, perdendo parte de sua atividade. Este trabalho teve como objetivo estudar a hidrólise da lactose a partir do permeado resultante da concentração de leite por ultrafiltração, verificando-se a influência das peptonas sobre a ação da enzima ß-galactosidase. Verificou-se, também, a atividade da enzima adsorvida na superfície da membrana e a capacidade de retenção da enzima pelas membranas. A hidrólise da lactose foi estudada em reator a membrana de fluxo perpendicular. Foram utilizadas membranas planas de polifluoreto de vinilideno (PVDF) e de poliétersulfona (PES), ambas com ponto de corte de 10 kDa. Foram utilizadas duas marcas comerciais de ß-galactosidase (Kluyveromyces lactis), Lactozym® 3000 L HP-G e Maxilact® L-5000. A taxa de hidrólise foi determinada através da pesquisa de glicose, um dos produtos da hidrólise, através de kit colorimétrico-enzimático. A maior atividade da enzima Lactozym foi na concentração de 0,4 g.L-1, a 40°C e pH 6,8 e a melhor atividade da enzima Maxilact, na concentração de 0,2 g.L-1, a 35°C e pH 6,8. Os resultados mostraram que a membrana foi capaz de reter totalmente a enzima lactase no reator, conseguindo-se até 95% de hidrólise da lactose após 90 minutos de processo, à temperatura de 35oC e pH 6,8. As peptonas do permeado foram removidas através de aquecimento e centrifugação e seu efeito sobre o fluxo permeado e a taxa de hidrólise foi investigado. A remoção das peptonas do soro fez aumentar o fluxo permeado em até 150% e a taxa de hidrólise em até 20%. Ficou evidenciado que a enzima adsorvida na superfície da membrana apresentou pouca atividade hidrolítica.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-03-31T14:13:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1296266 bytes, checksum: 60f557c8ddb07a76aac9806be65c18aa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-31T14:13:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1296266 bytes, checksum: 60f557c8ddb07a76aac9806be65c18aa (MD5) Previous issue date: 2015-09-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Criogéis são considerados como uma das fases estacionárias mais promissoras para uso comercial, como sendo uma alternativa para colunas de leito empacotado, devido à sua excelente estabilidade física e química e desejáveis características hidrodinâmicas. São de fácil preparação in situ e os monômeros usualmente utilizados são solúveis em água permitindo a biocompatibilidade do leito. Devido à presença de grandes poros, a clarificação de soluções particuladas ou viscosas não é considerada um problema, além de que o processo de transferência de massa é puramente convectivo, eliminando problemas difusionais encontrados em leitos fixos convencionais. Considerando estas importantes características, o objetivo deste trabalho foi produzir um criogel supermacroporoso combinado com a imobilização da enzima β-galactosidase para desenvolver um biorreator para hidrólise de lactose do leite, uma vez que há um grande interesse na produção de produtos delactosados destinados aos consumidores intolerantes à lactose. Os criogéis foram produzidos pela técnica de criopolimerização de acrilamida e bisacrilamida, imobilização seguida da de enzima ativação covalente com β-galactosidase. Por meio glutaraldeído da para caracterização morfológica e hidrodinâmica dos criogéis foi possível observar um gel esponjoso com uma estrutura de poros interconectados, com diâmetros variando entre 10 e 100 μm e com baixa dispersão axial. Foi estudado o efeito do pH de imobilização na capacidade de ligação proteica ao suporte e na sua capacidade de hidrólise. Observou-se que o fator pH de imobilização não influenciou na quantidade da proteína total imobilizada no criogel, mas influenciou diretamente no rendimento da imobilização. Verificou-se um maior rendimento de imobilização em pH 4,0, comparado ao pH 7,0, embora a atividade recuperada não tenha sofrido influência do pH. / Cryogels are one of the most promising stationary phases for commercial use, as an alternative to packed bed columns, due to their excellent physical and chemical stability and desirable hydrodynamic characteristics. These supports exhibit easy in situ preparation and the common use of water soluble monomers provides high levels of biocompatibility. Due to the presence of large pores, clarification of particulate or viscous solutions would not be considered a problem. In addition, the mass transfer process is purely convective eliminating diffusion problems found in conventional fixed beds. Considering these important features, the objective of this work was to synthesize a supermacroporous cryogel combined with the immobilization of β-galactosidase enzyme to develop a bioreactor for milk lactose hydrolysis, since there is great interest in the production of lactose free products for a class of lactose intolerant consumers. The cryogels were produced by the cryopolimerization of acrylamide and bisacrylamide, followed by covalent activation with glutaraldehyde aiming the β-galactosidase immobilization. The morphological and hydrodynamic characterization of cryogels showed a spongy gel structure with interconnected pores of diameters ranging between 10 and 100 μm and low axial dispersion. The effect of the pH of immobilization on protein binding and hydrolysis capacity of the support was studied. It was observed that the pH of immobilization did not influence the amount of total protein immobilized in the cryogel but directly influenced the yield of immobilization. There was a greater yield of immobilization at pH 4, compared to pH 7, although the recovered activity has not been influenced by the pH.

Adviser: Brian W. Matthews. xii, 211 p. ; ill. (some col.) A print copy of this title is available through the UO Libraries under the call number: SCIENCE QP609.G3 J84 2000 / An atomic-level description of the presumed catalytic action of β-galactosidase is described. This large enzyme, from E. coli , carries out two reactions which allow the bacterium to live on the disaccharide lactose. First, it breaks down lactose to the two monosaccharides galactose and glucose. Second, it converts lactose into another disaccharide, allolactose, which is the inducer for the lac operon, and thus is the signal to the bacterium to produce more β-galactosidase. The work is based on high resolution x-ray crystallography and enzyme kinetics. A crystal form of β-galactosidase was isolated that permits data collection up to 1.5 à resolution. Using this crystal form, the structures of several ligands bound to the enzyme were determined. These ligands were chosen to mimic various points in the reaction: binding of substrate, covalent intermediates, transition states, and products. Together these complexes suggest a reaction coordinate for β-galactosidase which clarifies and enhances previous ideas about the reaction mechanism. The reaction includes a conformational change triggered by the progression of the substrate towards the transition state. Additional investigation suggests that this conformational change is involved in determining whether the enzyme carries out its hydrolysis or isomerization reaction. Considerations of the structure in the context of other related enzymes suggest an evolutionary path for β-galactosidase. It is suggested that a progenitor enzyme which catalyzed the hydrolysis of long polysaccharide substrates recruited additional domains which permit β-galactosidase to act on smaller substrates and produce the inducer, allolactose. This dissertation includes both my previously published and co-authored material.

Este trabalho teve por objetivo estudar a produtividade do processo de produção de β-galactosidase de leveduras em biorreator utilizando soro de queijo como meio de cultura. Na primeira parte do estudo determinou-se a influência das velocidades de aeração e de agitação do biorreator na produção de β-galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus. As condições de agitação e aeração testadas foram: 500rpm e 3L/min (condição I); 600rpm e 6L/min (condição II) e 700rpm e 9L/min (condição III). Os resultados mostraram que esta levedura, considerada Crabtree negativa, produz etanol, cuja concentração é maior nas condições de menor aeração. A produção de β-galactosidase mostrou-se dependente das velocidades de aeração, sendo menor na condição de maior aeração, e sendo que a maior produtividade da enzima foi atingida na condição intermediária de oxigenação (condição II). Após, estudou-se diferentes estratégias de alimentação objetivando culturas de alta concentração celular de K. marxianus em cultivos batelada alimentada. Foram testados dois perfis de alimentação (linear e exponencial), três tempos de alimentação (20, 25 e 35 horas) e três diferentes concentrações do meio de alimentação (soro de queijo concentrado duas, três ou quatro vezes). Os resultados mostraram que os cultivos em regime de batelada alimentada não geraram altas concentrações de biomassa. Contudo, a inserção contínua de lactose no meio de cultura induziu uma alta atividade específica de β-galactosidase, aumentando, conseqüentemente, a atividade volumétrica e a produtividade do processo. A melhor estratégia de alimentação, linear crescente durante 25 horas com soro de queijo três vezes concentrado, resultou em uma produtividade β-galactosidase de 291U/(L.h), 50% maior que a produtividade da cultura em batelada. Paralelamente a este estudo, construiu-se uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae produtora de β-galactosidase. A levedura S. cerevisiae W303 foi transformada com os plasmídeos integrativos LAC4 e LAC12, que codificam β-galactosidase e lactose-permease de Kluyveromyces lactis. A cepa transformante BLR030 foi escolhida entre as outras devido ao seu crescimento e produção de β-galactosidase. Um meio de cultura composto por soro de queijo desproteinizado suplementado por extrato de levedura (1%) e peptona (3%) foi escolhido, entre os meios testados, para os experimentos em biorreator. Foram realizados cultivos em regime de batelada e batelada alimentada com alimentação linear crescente durante 25 (FB25), 35 (FB35) e 50 (FB50) horas. Os cultivos FB35 e FB50 apresentaram as maiores atividades específicas da enzima (em torno de 1.800U/g) e também a maior produtividade de β-galactosidase (180U/(L.h)).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2016-04-19T04:21:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015Bitstream added on 2016-05-24T17:28:17Z : No. of bitstreams: 1 337984.pdf: 3082430 bytes, checksum: f6fee464aa1fce0e699df5a94e815c5f (MD5) / As leishmanioses afetam cerca de 12 milhões de pessoas e constituem um problema de saúde mundial. Faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias para o estudo de novas entidades químicas ativas contra a doença e que sejam menos laboriosas, mais rápidas, sensíveis e compatíveis com a automação. No presente trabalho, realizou-se a transfecção de forma integrativa do gene da ß-galactosidase em três espécies de Leishmania (L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis) com o objetivo de padronizar um ensaio colorimétrico rápido e sensível para triagem de compostos contra amastigotas intracelulares de L. (V.) braziliensis. A transfecção dos parasitos não alterou suas características biológicas avaliadas pelo crescimento de promastigotas em cultura, a infectividade para células THP-1 e para camundongos Balb/c em nenhuma das cepas transfectadas. A atividade da enzima medida através de ensaio colorimétrico mostrou correlação direta entre a leitura e o número de parasitos. A expressão da enzima foi estável nas linhagens selecionadas, mesmo na ausência da pressão do antibiótico de seleção, indicando a integração do gene que foi confirmado através de PCR. Ensaios de atividade enzimática utilizando promastigotas mostraram um limite inferior de detecção de 780 parasitos por cavidade, permitindo a determinação da atividade enzimática em amastigotas intracelulares. A transfecção em L. (V.) braziliensis não alterou a susceptibilidade aos fármacos leishmanicicas de uso clínico: anfotericina B e miltefosina. Contudo, o processo de transfecção provocou a resistência dos parasitos aos fármacos paromomicina e glucantime, 3 a 10 vezes acima da IC50 da cepa parental. Os resultados obtidos pela metodologia colorimétrica foram semelhantes aos obtidos pela metodologia clássica de contagem através de microscopia, pasronizando assim o ensaio.<br> / Abstract : Leishmaniasis affects about 12 million people worldwide and represents a global health problem. It is necessary the development of less laborious, faster and more sensitive and compatible with automation methods for the study of new active compounds against the disease. In this present study, we transfeceted in a integrative form the ß-galactosidase in three species of Leishmania (L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis) aiming the standardization of a reproducible, fast and sensitive colorimetric assay for screening of compounds active against intracellular amastigotes using the transfected strain of L. (V.) braziliensis. Transfection did not alter the parasite?s biological characteristics evaluated by promastigote growth in culture, infectivity on THP-1 cells and on Balb/c mice for any of the transfected strain. The enzymatic activity measured by colorimetric assay showed direct correlation between the reading and the number of parasites. Enzymatic expression was stable under the selected strains even in the absence of the selection antibiotic pressure, indicating the integration of the gene, which was confirmed by PCR. Enzymatic activity assay using promastigotes showed a lower limit of 780 parasites per well, allowing the determination of the enzymatic activity in intracelular amastigotes. Transfection in L. (V.) braziliensis did not alter the susceptibility to the drugs: amphotericin B and miltefosine. However the trasnfection process led to resistance to the drugs paromomycin and glucantime, 3 to 10 times higher from the IC50 of the wild type parasite. Results obteinedby the colorimetric assay were similar to the ones obteined by the classical methodology of microscopic counting, validating the assay.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-05Bitstream added on 2014-11-10T11:57:27Z : No. of bitstreams: 1 000790040.pdf: 1326937 bytes, checksum: af8ee251aaaf5a06acd1e6604ded62a3 (MD5) / O presente estudo teve como objetivo principal a síntese e caracterização de derivados hemocompatíveis de quitosana e sua utilização na preparação de nanopartículas para terapia gênica não-viral. O trabalho foi realizado em duas etapas, sendo a primeira a obtenção dos derivados, seguido de estudos da interação com o plasmídeo VR 1412 (pDNA) que expressa a β-galactosidase. A primeira etapa de síntese envolve a modificação de quitosana pela introdução de grupos amino, seguido pela ligação de cadeias de polietilenoglicol (PEG). Os derivados foram caracterizados por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, potenciometria e viscosidade. Os estudos da interação foram realizados utilizando as técnicas de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmica e citotoxicidade. O trabalho foi conduzido de forma comparativa, avaliando as mudanças estruturais e seus efeitos na força de interação e estabilidade das nanopartículas / The current study aimed at the synthesis and characterization of hemocompatible chitosan derivatives and their use in the preparation of nanoparticles for non-viral gene therapy. The project was carried out in two steps, first the synthesis and characterization of the derivatives, followed by studies of the interaction between the chitosan derivatives and the VR1412 plasmid (pDNA), that expresses the β-galactosidase protein. The first step of synthesis was the modification of chitosan by introducing tertiary amino groups, followed by attaching the polyethyleneglycol (PEG) to the chitosan backbone. The study of the interaction between the chitosan derivatives and the pDNA was carried out using the fluorescence, electrophoresis in agarose gel, and light scattering techniques. The study was performed in order to evaluate the effect of structural changes of the chitosan backbone on the strength of interaction and stability of the nanoparticles

Orientador: Marcio José Tiera / Banca: Mário Sergio Galhiane / Banca: Elói da Silva Feitosa / Resumo: O presente estudo teve como objetivo principal a síntese e caracterização de derivados hemocompatíveis de quitosana e sua utilização na preparação de nanopartículas para terapia gênica não-viral. O trabalho foi realizado em duas etapas, sendo a primeira a obtenção dos derivados, seguido de estudos da interação com o plasmídeo VR 1412 (pDNA) que expressa a β-galactosidase. A primeira etapa de síntese envolve a modificação de quitosana pela introdução de grupos amino, seguido pela ligação de cadeias de polietilenoglicol (PEG). Os derivados foram caracterizados por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, potenciometria e viscosidade. Os estudos da interação foram realizados utilizando as técnicas de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmica e citotoxicidade. O trabalho foi conduzido de forma comparativa, avaliando as mudanças estruturais e seus efeitos na força de interação e estabilidade das nanopartículas / Abstract: The current study aimed at the synthesis and characterization of hemocompatible chitosan derivatives and their use in the preparation of nanoparticles for non-viral gene therapy. The project was carried out in two steps, first the synthesis and characterization of the derivatives, followed by studies of the interaction between the chitosan derivatives and the VR1412 plasmid (pDNA), that expresses the β-galactosidase protein. The first step of synthesis was the modification of chitosan by introducing tertiary amino groups, followed by attaching the polyethyleneglycol (PEG) to the chitosan backbone. The study of the interaction between the chitosan derivatives and the pDNA was carried out using the fluorescence, electrophoresis in agarose gel, and light scattering techniques. The study was performed in order to evaluate the effect of structural changes of the chitosan backbone on the strength of interaction and stability of the nanoparticles / Mestre