Ulm, Univ., Diss., 2001.

A flexibilidade da execução do orçamento exige que diversos instrumentos sejam utilizados, os quais não são homogêneos no que se refere à participação do Poder Legislativo. Em algumas situações, este necessita se manifestar prévia e especificamente, aprovando créditos suplementares que estão fora das margens de remanejamento, créditos especiais e transferências. Em outros casos, a decisão do parlamento é enfraquecida, como nos créditos suplementares abertos nos limites das margens de remanejamento ou nos créditos extraordinários. Nos primeiros, a autorização parlamentar é concedida anteriormente à necessidade de suplementação, de forma genérica. Nos segundos, a abertura dá-se por medida provisória, nem sempre se cumprindo o requisito da imprevisibilidade. É, porém, nos casos em que o Poder Executivo promove o contingenciamento de recursos que o controle exercido pelo Legislativo se mostra mais tênue. Justificam-no algumas concepções predominantes sobre o orçamento. De um lado, a divisão do ciclo orçamentário em fases distribuídas com exclusividade entre Executivo e Legislativo, em que o governo elabora e executa o orçamento, ao passo que o parlamento o aprova e controla sua execução, pode dar a entender que as decisões que necessitam ser tomadas na fase de execução orçamentária competem exclusivamente ao Poder Executivo. De outro lado, é dominante a ideia de que a natureza jurídica do orçamento é a de uma lei meramente formal da qual não se podem extrair obrigações positivas ao governo para determinar o gasto até o teto das dotações. Estas noções têm suas origens em momentos históricos e situações constitucionais distintos e não mais prevalecem diante das funções orçamentárias do parlamento, a quem compete aprovar a lei e decidir a propósito de políticas, que subordinam a atividade administrativa de execução. Diante disso, o orçamento impositivo se mostra uma forma possível de melhorar o cumprimento da vontade parlamentar e aprimorar o planejamento, embora encontre dificuldades de implementação. / Die Flexibilität des Haushaltsvollzuges setzt die Anwendung vielfältiger Instrumente voraus, die nicht homogen hinsichtlich der Mitwirkung der gesetzgebenden Gewalt sind. In gewissen Fällen muss die Legislative sich vorher und spezifisch manifestieren, indem sie über- oder auerplanmäige Ausgaben bewilligt. In anderen Fällen ist die parlamentarische Entscheidung weicher, einige auerplanmäige Krediten können nämlich entweder vorher pauschal oder durch ein Dekret in auergewöhlichen Situationen ermächtigt werden. Im letzten Fall ist die Voraussetzung der Unvorhersehbarkeit nicht immer beobachtet. Die legislative Kontrolle zeigt sich aber enorm abgeschwächt, wenn die Regierung entscheidet, Ausgaben zu sperren. Man findet in der beherrschenden Meinung des Haushaltsrechts eine Begründung dafür. Der Budgetkreislauf ist in verschiedenen Phasen geteilt, in denen die Regierung das Budget vorbereit und ausführt, während das Parlament für die Feststellung und Kontrolle des Vollzuges zuständig ist. Diese Aussage kann hindeuten, dass der Etat zum Eigenbereich der Exekutive gehört. Auf der anderen Seite geht die bislang vorherrschende Rechtsansicht davon aus, dass das Budget mangels eines materiellen Rechtssatzcharakters eine bindende Verpflichtung der Regierung zu seinem Vollzug nicht enthalten könne. Diese Rechtsansichten werden auf unterschiedlichen historischen Zeitpunkten und verfassungsrechtlichen Kontexten zurückbezogen. Die veränderte Verfassungslage unter der Bundesverfassung hat eine umfassende Prärogative des Parlaments eingeführt, die die parlamentarische Entscheidung des Haushaltsgesetz zulät. Angesichts der politischen Bedeutung des staatlichen Haushalts muss die Verwaltungstätigkeit, die im Haushaltsvollzug stattfindet, der Politik und dem Gesetz unterordnen. In dieser Hinsicht zeigt sich ein bindendes Haushaltsgesetz als eine Möglichkeit, die Planung und die parlamentarische Bewilligung zu stärken, wenn es auch Ausführungsschwierigkeiten gibt.

In this work, dRNA-seq (differential RNA sequencing) and RNAtag-seq were applied to first define the global transcriptome architecture of C. difficile, followed by Hfq RIP-seq (RNA immunoprecipitation followed by RNA-seq) and RIL-seq (RNA interaction by ligation and sequencing) to characterize the Hfq-mediated sRNA interactome on a transcriptome-wide scale. These approaches resulted in the annotation of > 60 novel sRNAs. Notably, it not only revealed 50 Hfq-bound sRNAs, but also > 1000 mRNA-sRNA interactions, confirming Hfq as a global RNA matchmaker in C. difficile. Similar to its function in Gram-negative species, deletion of Hfq resulted in decreased sRNA half-lives, providing evidence that Hfq affects sRNA stability in C. difficile. Finally, several sRNAs and their function in various infection relevant conditions were characterized. The sRNA nc085 directly interacts with the two-component response regulator eutV, resulting in regulation of ethanolamine utilization, an abundant intestinal carbon and nitrogen source known to impact C. difficile pathogenicity. Meanwhile, SpoY and SpoX regulate translation of the master regulator of sporulation spo0A in vivo, thereby affecting sporulation initiation. Furthermore, SpoY and SpoX deletion significantly impacts C. difficile gut colonization and spore burden in a mouse model of C. difficile infection. / Der anaerobe Gram-positive humanpathogene Erreger Clostridioides difficile (C. difficile) gilt als Hauptursache für nosokomiale Antibiotika-assoziierte Diarrhöe. Verschiedene Virulenzfaktoren und -eigenschaften beeinflussen das Fortschreiten und den Schweregrad der Krankheit, darunter Toxinexpression und Sporenbildung. Kleine regulatorische RNAs (sRNAs) sind bekannte post- transkriptionelle Regulatoren von Virulenz- und Stress-assoziierten Stoffwechselwegen in vielen pathogenen Bakterien. In Gram-negativen Arten wird sRNA-abhängige post-transkriptionelle Regulierung häufig durch das RNA-Chaperon Hfq vermittelt, welches die sRNA-mRNA- Basenpaarung erleichtert. Trotz ihrer Bedeutung in Gram-negativen Bakterien ist vergleichsweise wenig über die verschiedenen Aspekte der post-transkriptionellen Regulation in Gram-positiven Arten bekannt. Erste Daten deuten auf eine wichtige Funktion von Hfq bei der Regulierung verschiedener infektionsassoziierter Signalwege in C. difficile hin, sowie auf die Existenz eines umfangreichen post-transkriptionellen Netzwerks. Eine globale Identifizierung von Hfq- assoziierten RNAs und deren Einfluss auf die Virulenz von und Kolonisierung durch C. difficile ist jedoch bisher noch nicht erfolgt. In dieser Arbeit wurde dRNA-seq (differentielle RNA-Sequenzierung) und RNAtag-seq angewandt, um zunächst die globale Transkriptom-Architektur von C. difficile zu definieren. Anschließend wurde Hfq RIP-seq (RNA-Immunpräzipitation gefolgt von RNA-seq) und RIL-seq (RNA-Interaktion durch Ligation und Sequenzierung) durchgeführt, um das Hfq-vermittelte sRNA-Interaktom auf globaler Ebene zu charakterisieren. Diese Ansätze führten zur Annotation von > 60 neuen sRNAs. Darüber hinaus wurden 50 Hfq-gebundene sRNAs, sowie > 1000 mRNA- sRNA-Interaktionen identifiziert, wodurch Hfq als globaler RNA-Matchmaker in C. difficile bestätigt wurde. Analog zu seiner Funktion in Gram-negativen Arten, führte die Deletion von Hfq zu verringerten sRNA-Halbwertszeiten, was darauf hindeutet, dass Hfq die sRNA-Stabilität in C. difficile beeinflusst. Schließlich wurden mehrere sRNAs und ihre Funktion unter verschiedenen infektionsrelevanten Bedingungen charakterisiert. Die sRNA nc085 interagiert direkt mit dem Zweikomponenten-Regulator eutV, was zu einer Regulierung der Ethanolaminverwertung führt. Als häufig vorkommenden Kohlenstoff- und Stickstoffquelle im Darm, kann Ethanolamin die Pathogenität von C. difficile beeinflussen. SpoY und SpoX regulieren dagegen die Translation des Hauptregulators der Sporulation spo0A in vivo und damit die Sporulationsinitiation. Darüber hinaus hat die Deletion von SpoY und SpoX signifikante Auswirkungen auf die Besiedlung des Darms mit C. difficile sowie die Sporenbelastung in einem Mausmodell der C. difficile-Infektion. Insgesamt liefert diese Arbeit Beweise für eine umfassende Hfq-abhängige post-transkriptionelle Regulierung, die die Physiologie und Virulenz eines Gram-positiven Erregers beeinflusst. Auch wenn mit dieser Arbeit die Charakterisierung der sRNA-vermittelten Regulation in C. difficile gerade erst begonnen hat, können die RIL-seq-Daten als Grundlage für zukünftige mechanistische Studien der RNA-basierten Genregulation in C. difficile herangezogen werden.

Eine Defizienz des LTBP4-Gens ruft schwerwiegende Erkrankungen wie das human autosomal-rezessive Cutis laxa Syndrom Typ 1C (ARCL1C) hervor. Die Interaktion zwischen LTBP4 und TGF-β ist hierbei von pathogenetisch relevanter Bedeutung. Durch fehlende Synthese bzw. Sekretion des TGF β (bedingt durch die LTBP4-Defizienz) kann es zu einer verminderten TGF-β-Aktivität im Lungenparenchym kommen, woraus insgesamt eine fehlerhafte Produktion elastischer Fasern resultiert. Phänotypisch zeigen Patienten Multimorbidität und besonders schwere Defekte in der Lungenentwicklung. Emphyseme infolge fehlerhafter Alveolarisierung und Septierung führen zu früher Mortalität der Patienten innerhalb der ersten Wochen bis Monate. Als Tiermodell wurde die Ltbp4-/- Mauslinie generiert, die nahezu den gleichen Phänotyp aufweist, den auch Patienten mit ARCL1C zeigen. Ziel der Untersuchungen war es, den Einfluss der Pneumozyten Typ I und II auf die gestörte Alveolarisierung, Septierung sowie Angiogenese der Lunge von Ltbp4-/- Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen zu überprüfen. Zusätzlich sollte erforscht werden, ob das Sekretom von murinen Ltbp4-/- Lungenfibroblasten (MLF) in vitro die Homöostase der Pneumozyten im Vergleich zu WT MLF hemmt bzw. deren Expression und Sekretion pro- und anti-angiogenetischer Faktoren beeinflusst. In dieser Studie konnte nachgewiesen werden, dass die Defizienz des Ltbp4-Gens postnatal zu schwerwiegenden Lungenmissbildungen und gestörter Alveologenese der Maus führt, wobei sowohl die Pneumozyten Typ I als auch die Pneumozyten Typ II nachweislich in reduzierter Anzahl in Ltbp4-/- Mäusen vorhanden waren. Weiter wurde bestätigt, dass die Pneumozyten Typ II verantwortlich für eine erhöhte Tgf-β-Aktivität sind und somit präfibrotische Prozesse im Lungenparenchym von Ltbp4-/- Mäusen begünstigt werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Defizienz des Ltbp4 Gens erheblichen Einfluss auf das Sekretom der MLF hat. Da das humane ARCL1C Syndrom ebenfalls ein dysfunktionales LTBP4-Gen aufweist, konnten durch dieses Projekt weitere Erkenntnisse der Pathogenese einer fehlerhaften Alveolarisierung in der Lungenentwicklung gewonnen werden. Von großer Bedeutung ist auch, dass dieses Mausmodell den Phänotyp pädiatrischer Lungenerkrankungen aufweist, sodass diese Erkenntnisse zum Verständnis der Pathogenese der prä- und neonatalen Entwicklung pädiatrischer Lungenerkankungen beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 3 2.1 Die Lunge 3 2.2 Morphologie der Lunge 4 2.3 Alveolarepithel 4 2.4 Die Blut-Gas-Schranke 6 2.5 Embryologie der Lunge 6 2.6 Anatomie der Lunge von Maus und Mensch im Vergleich 9 2.7 LTBP – latent TGF-β bindende Proteine 10 2.8 Isoformen des LTBPs 13 2.9 Ltbp4 in der Lunge 15 2.10 Angiogenese 15 2.11 Autosomal-rezessives Cutis laxa Syndrom Typ 1C 17 3. Tiere, Material und Methoden 19 3.1 Tiere 19 3.2 Material 20 3.2.1 Geräte 20 3.2.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 22 3.2.3 Kits und Assays 25 3.2.4 Puffer und Lösungen 26 3.2.5 Gele 28 3.2.6 Antikörper 28 3.2.7 Primer 29 3.3 Zelllinien 30 3.4 Methoden 31 3.5 Organentnahme der Versuchstiere 31 3.6 Histologie 33 3.7 Zellkultur 34 3.7.1 Isolierung primärer muriner Lungenfibroblasten 35 3.7.2 MLE 12-Zellkultivierung 36 3.7.3 Tube Formation Assay 36 3.7.4 TGF-β Minc Lung Assay 37 3.7.5 Proliferations Assay 39 3.7.6 Viabilitäts Assay 40 3.7.7 Caspase-3 Assay 40 3.7.8 Fluoreszenz Activating Cell Sorting (FACS) 41 3.8 Molekularbiologische Methoden 44 3.8.1 Genotypisierung 44 3.8.2 Polymerase-Ketten-Reaktion 45 3.8.3 Western Blot 47 3.8.4 RNA-Isolierung mit konditioniertem Medium MLF stimulierter MLE 12-Zellen 50 3.8.5 cDNA-Synthese und Aktin-Kontroll-PCR 51 3.8.6 Real time quantitative PCR 53 3.9 Statistische Auswertung 55 4. Ergebnisse 56 4.1 Lungen von Ltbp4-/- Mäusen weisen eine reduzierte Anzahl von Pneumozyten Typ II auf 56 4.2 Lungen von Ltbp4-/- Mäusen weisen eine reduzierte Anzahl von Pneumozyten Typ I auf 59 4.3 Aktivierung von Tgf-β nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF in MLE 12-Zellen 61 4.4 Konditioniertes Medium von Ltbp4-/- MLF vermindert die Proliferation von MLE 12-Zellen und erhöht die Viabilität 63 4.5 Die Apoptoserate (Casp3/7) der MLE 12-Zellen nach Stimulation mit konditio-niertem Medium von Ltbp4-/- MLF wird nicht beeinflusst 64 4.6 mRNA Expression von Sp-C und Sp-B in MLE 12-Zellen nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF 64 4.7 MLE 12-Zellen weisen eine erhöhte mRNA Expression von Ltbp1 und eine unveränderte mRNA Expression von Ltbp4 nach Stimulation mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF auf 65 4.8 Die angiogene Stimulation von Endothelzellen und die mRNA Expression angiogener Faktoren von MLE 12-Zellen, die mit konditioniertem Medium von Ltbp4-/- MLF vergleichend zum WT MLF stimuliert wurden, wird stark beeinflusst 66 5. Diskussion 69 6. Zusammenfassung 80 7. Summary 82 8. Literaturverzeichnis 84 9. Anhang 91

LPS wird von Gram-negativen Bakterien freigesetzt und führt mit Hilfe von LBP zur Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine aus Monozyten und Makrophagen. Diese von LPS ausgelöste Kaskade, ist entscheidend an der Entstehung der Sepsis beteiligt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die LPS-induzierte Stimulation von Makrophagen durch murines Serum gehemmt werden kann. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit im Mausmodell verdeutlicht werden, welche Rolle Lipoproteine und LBP bei dem protektiven Serumeffekt spielen. Von den in Mausseren verschiedener Mausstämme bestimmten Parametern korrelierte der Phospholipidgehalt relativ gut mit dem inhibitorischen Serumeffekt. Eine Depletion von Lipoproteinen aus den Seren führte zu einer starken Reduktion des inhibitorischen Serumpotentials, während die Verwendung von LBP-defizienten Seren keinen Einfluß auf den Serumhemmeffekt hatte. Lipoproteine sehr geringer, geringer und hoher Dichte verursachten in Gegenwart von LBP eine deutliche Reduktion der LPS-Effekte, die gut mit ihrem Phospholipidgehalt korrelierte. In Abwesenheit von Serum und LBP konnten Lipoproteine LPS-Effekte auch bei hohen Phospholipidkonzentrationen kaum noch inhibieren. In nativen murinen Lipoproteinen hoher Dichte und lipoproteindefizientem Serum ließ sich LBP nachweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß native Lipoproteine sehr geringer, geringer und hoher Dichten als Akzeptoren für LPS dienen können. Ihr inhibitorisches Potential korreliert am besten mit ihrem Phospholipidgehalt. Der Transport von LPS in diese Lipoproteine wird durch LBP katalysiert, was den protektiven Effekt hoher LBP-Konzentrationen erklärt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß LBP nicht der einzige Bestandteil von murinem Serum ist, der LPS in Lipoproteine transferiert. Vermutlich ist bei den, in dieser Arbeit verwendeten Serumkonzentrationen der PLTP-Gehalt ausreichend, diesen LPS-Transfer in Abwesenheit von LBP zu vollziehen. Bei der Interaktion zwischen Lipoproteinen und LPS handelt es sich um einen physiologischen Weg des Organismus, um auf bakterielle Endotoxine zu reagieren und so der Sepsis entgegenzuwirken. Mit genaueren Kenntnissen über diese Interaktion, bei der Lipidtransferproteine wie LBP und PLTP eine entscheidende Rolle spielen, können eventuell in Zukunft Methoden gefunden werden, diese physiologischen Vorgänge des Körpers zu unterstützen, um so eine Sepsis zu therapieren. / LPS released by gram-negative bacteria is bound by LBP and initiates the release of proinflammatory cytokines in makrophages and monocytes. These cytokines are thought to play a central role in the pathophysiology of sepsis. In these studies I was able to show an inhibitory effect of murine serum on the LPS-induced stimulation of macrophages. Furthermore the role of lipoproteins and LBP in this protective effect of serum was investigated. The inhibitory effect of serum from different mouse strains was best correlated to its phospholipid content. Depletion of serum from lipoproteins strongly reduced its LPS-inhibitory potential while depletion of serum from LBP had no effect. Murine VLDL, LDL and HDL were found to be potent inhibitors of LPS-effects in presence of LBP. In abscence of LBP the inhibitory effect was much weaker. LBP could be detected in murine HDL and murine lipoproteindeficient serum. My data shows that HDL, LDL and VLDL can act as acceptors of LPS. Their inhibitory potential is best correlated to their phospholipid content. LBP catalyses transport of LPS into lipoproteins. This could be an explanation for its protective effect in high doses. Furthermore it could be shown that LBP is not the only serum component that transfers LPS into Lipoproteins. Possibly the used serum contained enough PLTP to perform this transfer in absence of LBP. The interaction between Lipoproteins and LPS is a physiological way of the organism to react on endotoxines and inhibit the development of sepsis. PLTP and LBP play major roles in this interaction. Understanding the pathways of LPS-detoxification may help to support the organism s physiological answer and establish new methods to treat sepsis.

Cancer metastasis accounts for approximately 90% of all cancer-related deaths; however, the underlying mechanisms remain largely unknown. It has been known proteins that control F-actin dynamics are crucial for cancer metastasis. In this study, we revealed how an F-actin binding protein, Switch-associated protein 70 (SWAP-70), contributes to breast cancer metastasis. Moreover, immunotherapy is a promising approach to treat metastatic cancer cells by enhancing the function of the host immune system against cancer. Our lab has conducted extensive studies on how SWAP-70 regulates the function of several immune cell types, including dendritic cells (DCs), B cells, and mast cells. These cells have been reported to contribute to tumor immunity. Thus, we hypothesized that SWAP-70 plays a role in tumor immunity. To characterize the function of SWAP-70 in metastasis, we generated 4T1, mouse breast cancer, SWAP-70 knockout (KO) cells using Crispr/Cas9 technology. A syngeneic orthotopic model was used to recapitulate clinical disease progression, and the results showed that SWAP-70 led to significant metastasis to the lungs and bones in immunocompetent mice. Several functional assays have revealed that SWAP-70 promotes anchorage-independent growth, cell migration, invasion, and adhesion in 4T1 cells. Biophysical measurements showed that SWAP-70 contributes to cellular mechanics. To investigate how SWAP-70 in host cells affects tumor immunity, SWAP-70 deficient mice were injected with E0771 mouse breast cancer cells to study tumorigenicity. SWAP-70 deficient mice showed delayed primary tumor growth and less distant metastasis. Isolated SWAP-70−/− DCs were impaired in generating CD8 T cell responses pulsed with soluble OVA protein, but not with OVA peptide, suggesting that the antigen uptake, processing, and presentation process in SWAP-70−/− DCs may be diminished. Taken together, our findings describe the potential mechanisms by which the loss of SWAP-70 hinders cancer metastasis and provide several insights into how targeting SWAP-70 could be a potential therapeutic approach to target cancer.

Der Sekretionsweg ist essenziell für die Funktion von Zellen und beginnt, wenn mRNAs, die für Membran- und Sekretionsproteine codieren, an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebracht werden. Allerdings ist wenig darüber bekannt, inwiefern RNA-bindende Proteine zur Erkennung und Translation von ER lokalisierten mRNAs beitragen. In dieser Arbeit haben wir das humane RNA-bindende Protein HDLBP charakterisiert. Wir haben durch PAR-CLIP-, Zellfraktionierungs- und RNA-Seqeuenzierexperimente festgestellt, dass HDLBP an mehr als 80% aller ER lokalisierten mRNAs bindet. Analysen zu HDLBPs Bindungsmotiv haben gezeigt, dass HDLBP vorwiegend an ein CU-haltiges Motiv in der codierenden Sequenz (CDS) hauptsächlich von ER lokalisierten mRNAs bindet. Im Gegensatz dazu enthalten zytosolische HDLBP gebundene mRNAs weniger Bindungsstellen und diese treten sowohl in der CDS als auch in 3‘ untranslatierten Regionen auf. Dies zeigt, dass sich ER lokalisierte mRNAs von Zytosol lokalisierten mRNAs in ihrer Sequenzzusammensetzung hinsichtlich der HDLBP Bindungsstellen unterscheiden. Weitere Analysen des PAR-CLIP-Experiments ergaben, dass HDLBP mit RNA-Komponenten des Signalerkennungspartikels (SRP) und der 40S ribosomalen Untereinheit interagiert. Durch BioID-Experimente haben wir Proteine in unmittelbarer Nähe zu HDLBP bestimmt und konnten damit die Assoziation von HDLBP mit Komponenten des Translationsapparates und des SRPs bestätigen. Funktionelle Studien, bei denen wir CRISPR-Cas9 erzeugte HDLBP Knockout (KO) Zelllinien in Kombination mit Ribosomen-Profiling verwendet haben, haben gezeigt, dass HDLBP die Translation von mRNAs fördert, die an HDLBP gebunden und am ER lokalisiert sind. Letztlich haben in vivo Experimente mit Nacktmäusen ergeben, dass HDLBP KO eine Abnahme der Lungentumorbildung verursacht, was die Relevanz von HDLBP für die Tumorprogression hervorhebt. Insgesamt zeigt unsere Arbeit eine generelle Funktion von HDLBP bei der Translation von ER lokalisierten mRNAs. / The secretory pathway is essential for proper cell functioning and starts when mRNAs encoding membrane and secretory proteins are targeted to the endoplasmic reticulum (ER). However, little is known about the contribution of RNA-binding proteins to the recognition, localization and translation of ER-localized mRNAs. In this work, we characterized the human RNA-binding protein HDLBP. We identified that HDLBP binds to more than 80% of all ER-localized mRNAs by PAR-CLIP, cell fractionation and RNA-sequencing experiments. Analysis of the HDLBP binding motif showed that it predominantly binds to a CU-containing motif and forms high affinity multivalent interactions primarily in the coding sequence (CDS) of ER-localized mRNAs. In contrast, we identified that cytosolic HDLBP mRNA targets show less HDLBP binding sites randomly distributed between the CDS or 3’ untranslated regions. This indicates that ER-localized mRNAs per se differ from cytosol-localized mRNAs in their sequence composition with regard to HDLBP binding sites. Further PAR-CLIP analysis revealed that HDLBP interacts with RNA components of the signal recognition particle (SRP) and the 40S ribosomal subunit. We identified by BioID experiments proteins in close proximity to HDLBP and confirmed the association of HDLBP with components of the translational apparatus and the SRP. Functional studies using CRISPR-Cas9 HDLBP knockout (KO) cell lines in combination with ribosome profiling demonstrated that HDLBP promotes the translation of its ER-localized target mRNAs. We validated this finding by pSILAC experiments and detected the corresponding decrease in protein synthesis of proteins encoded by mRNAs that are bound by HDLBP and ER-localized. Lastly, in vivo experiments with nude mice showed that HDLBP KO resulted in a decrease of lung tumor formation highlighting the relevance of HDLBP for tumor progression. Overall, these results demonstrate a general function for HDLBP in the translation of ER-localized mRNAs.

LBP vermittelt im Wirtsorganismus die direkte Immunantwort auf bakterielle Liganden wie das Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen oder Lipopeptide von Gram-positiven Bakterien. In dieser Arbeit wurde die Funktionsweise von LBP weiter aufgeklärt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine natürlich vorkommende Mutation des LBP (c998t), die an Position 333 zu einem Austausch der Aminosäure Prolin zu Leucin führt, hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Struktur und Funktionalität des Proteins untersucht. Westernblot-Analysen des rekombinant hergestellten Proteins und humaner Seren von Mutationsträgern weisen auf einen Zerfall des mutierten Proteins hin. Es kommt zu einer Beeinträchtigung der Bindung bakterieller Liganden und einer deutlichen Reduktion der LBP-vermittelten Zytokinausschüttung von Immunzellen. Der hier untersuchte Polymorphismus hat eine Allelfrequenz von 0,072 in einer gesunden europäischen Population. Genotypanalysen von Patientengruppen zeigten, dass es durch die Mutation zu einer deutlich erhöhten Mortalität bei Patienten mit septischen Komplikationen und einer durch Gram-negative Erreger verursachten Pneumonie kommt. Unsere Ergebnisse zur eingeschränkten Funktion des LBP-c998t bieten eine erste Erklärung dafür, wie diese Mutation vermutlich die Fähigkeit, Krankheiten zu bewältigen, beeinträchtigt. Innerhalb dieser Arbeit ging es um die Analyse der Bindung von bakteriellen Liganden an LBP. Dabei wurde eine potentiell gemeinsame Bindungsstelle für Liganden untersucht, die von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien stammen und später von den Toll-like Rezeptoren (TLRs) 2 und -4 erkannt werden. Dazu wurden Bindungsversuche zwischen Lipopeptiden und LPS mit einer zweiten LBP-Variante (LBP-E94/95) durchgeführt. Beim LPS führt dies zu einem Bindungsverlust. Auch für die Lipopeptide war durch die Mutationen die Interaktion mit LBP beeinträchtigt, was die These einer gemeinsamen Bindungsstelle von TLR2- und TLR4-Liganden an das Protein weiter unterstützt. / LBP enhances the innate immune reaction against bacterial ligands like LPS from gram negative or lipopeptides from gram positive bacteria in the host. Here we investigated the function of LBP using two recombinant mutants of the protein. The first part of this work examines a natural occurring mutation of LBP (c998t) leading to an amino acid exchange of proline to leucine at position 333 with regard to the impact on structure and function of the protein. Western blot analyses of the recombinant protein and sera obtained from individuals differing in the LBP genotype indicate the disaggregation of the mutated protein. Thereby binding of bacterial ligands to LBP is diminished and the LBP mediated cytokine secretion of immune cells is reduced. The gene polymorphism leading to the occurrence of the mutation is present with an allelic frequence of 0.072. A recent study has shown that this LBP-SNP led to a higher mortality in patients with septic complications and gram negative pneumonia. The results presented here, showing the negative impact on the function of LBP due to the mutation, may therefore be a first explanation on how this mutation affects the ability of people to deal with disease. Within this work binding of ligands to LBP was also explored. It was investigated whether ligands which are later recognized by Toll-like receptors (TLRs) 2 and – 4 share a common binding site on LBP. Assays with immobilized lipopeptides and LPS were performed with a second mutated LBP (LBP-E94/95). LPS binding to LBP is diminished completely. Here we showed that binding of lipopeptide to LBP is affected likewise, furthermore supporting the hypothesis of a common binding site for TLR2- and TLR4- ligands.

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Phosphorylierung modulieren. Obwohl heute bereits Tausende von Phosphorylierungsstellen annotiert sind, sind entsprechende funktionelle Informationen begrenzt. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es keine Hochdurchsatzmethoden zur Erforschung der Funktion einer Phosphorylierungsstelle gibt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, habe ich eine auf Shotgun-Proteomik basierende Strategie zur Messung der RNA-Bindungsaktivität von RBPs und ihren phosphorylierten Proteoformen entwickelt, die 'quantitative RNA-Interactome Capture (qRIC)' genannt wird. QRIC quantifiziert die Pull-Down-Effizienz von RBPs, die mit Oligo(dT)-Magnetbeads isoliert werden. Diese Effizienz korreliert mit der Anzahl der RNA-Bindungsstellen und der Spezifität der Motivbindung, und spiegelt so die RNA-Bindung in vivo wieder. In einer Gegenüberstellung der Pull-Down-Effizienz verschiedener Proteoformen in unbehandelten Zellen, habe ich qRIC als unvoreingenommenes Screening von regulatorischen Phosphorylierungsstellen in RBPs eingesetzt. Für jede einzelne Phosphorylierungsstelle wurde ein Delta-Effizienzwert berechnet, der den Einfluss auf die RNA-Bindung in vivo reflektiert. Die Effizienzunterschiede spiegelten das erwartete Verhalten von RBPs während der Phasentrennung von membranlosen Organellen und die Ladungsabstoßung zwischen Phosphorylierungsstellen und Nukleotiden bei physiologischem pH-Wert wider. Mithilfe des Delta-Effizienzwertes identifizierte ich mehrere bereits bekannte regulatorische Phosphorylierungsstellen in SF3B1, UPF1 und ELAVL1, sowie neue, bisher unbekannte und möglicherweise regulatorische Phosphorylierungsstellen in SERBP1, LARP1 und RBM20. Phosphomimetische Mutationsvarianten dieser Phosphorylierungsstellen wurden analysiert, um den molekularen Einfluss auf die Regulation der RBP-Funktion zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung bestimmter Stellen im Spleißregulator RBM20 dessen nukleo-zytoplasmatische Lokalisierung, die Assoziation mit zytosolischen RNA-Granula und die Spleißfunktion beeinflusst. Diese Erkenntnisse könnten sich beispielsweise auf die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Patienten mit dysfunktionalen RBM20-Mutationen auswirken, die zu dilatativer Kardiomyopathie führen. QRIC kann als Hochdurchsatzverfahren dazu beitragen, unser Wissen über die Regulierung von Protein-RNA-Interaktionen durch Phosphorylierung zu erweitern. / Post-transcriptional regulation of gene expression is fundamental in health and disease. RNA-binding proteins (RBPs) directly bind and govern the fate of RNAs in cells. At the same time, cell signaling cascades control RBP functions by modulating their physicochemical properties through post-translational modifications, like phosphorylation. Although thousands of phosphorylation sites have been annotated, functional information is limited. This, in part, is due to the lack of high-throughput methods that measure function. To tackle this challenge I developed a shotgun proteomics-based strategy for measuring the RNA-binding activity of RBPs and their phosphorylated proteoforms, named quantitative RNA-interactome capture (qRIC). In qRIC, pull-down efficiency of RBPs isolation with oligo(dT) magnetic beads is quantified in cells at steady state and correlates with the number of RNA-binding sites and motif binding specificity, reflecting a link to RNA-binding in vivo. By contrasting pull-down efficiency of different proteoforms in the cells, I applied qRIC as an unbiased screening of regulatory phosphorylation sites in RBPs affecting pull-down efficiency. A delta efficiency score was calculated for each individual phosphorylation site to denote its influence on RNA-binding in vivo. Efficiency differences globally reflected the expected behavior of RBPs during phase separation of membraneless organelles and charge repulsion between phosphorylation sites and nucleotides in physiological pH. Using the delta efficiency score, I identified several previously known regulatory phosphorylation sites in SF3B1, UPF1 and ELAVL1, plus novel candidate regulatory sites in SERBP1, LARP1 and RBM20. Phosphomimetic mutant variants of these sites were analysed to investigate the molecular mechanism of regulation. Importantly, I show that phosphorylation of candidate sites in the splicing regulator RBM20 affects its nucleo-cytoplasmic localization, association with cytosolic RNA granules, and splicing function. These findings could have implications for the development of novel treatments based on kinase activity for patients with dysfunctional RBM20 mutations leading to congenital dilated cardiomyopathy. I anticipate that qRIC, as a high throughput approach, will help to expand our knowledge about the regulation of protein-RNA interactions and their regulation by phosphorylation.