Plusieurs études ont permis la caractérisation de la structure et de la fonction du ribosome. En ce qui attrait à la biogénèse du ribosome, nombreux aspects restent à être découverts et compris de façon plus dynamique. En effet, cette biogénèse englobe une variété de voies de modifications et d’assemblages requises pour la maturation des ARNr et pour leurs liaisons avec les protéines ribosomales. De ce fait, les protéines Noc ont été caractérisées comme des facteurs d’assemblages et ont permis la découverte d’une des premières indications sur l’ordre spatio-temporel de la maturation du ribosome. Ainsi, en utilisant la levure comme modèle, notre objectif est d’étudier d’avantage l’échange des complexes composés des protéines Noc ainsi que leur localisation intranucléaire. Ainsi, la nature des interactions de Noc2p avec Noc1p et Noc3p et l’influence de l’arrêt du transport intranucléaire ont été étudiés en utilisant des promoteurs inductibles, la microscopie à fluorescence, des immunobuvardages, qRT-PCR et des purifications par affinité. / Several studies have been performed to characterize the ribosome as far as to understand its structure and its function. However, major aspects of ribosome biogenesis remain elusive or gave only a static picture of the process. In fact, ribosome biogenesis involves dynamic processing and assembly pathways that are required for rRNA modification and folding, in addition to rRNA binding with some ribosomal proteins. One set of assembly factors, the Noc proteins, allowed one of the first indications about the spatio-temporal ordering of ribosome maturation. By using yeast as model, our objective is to provide a dynamic picture of the Noc proteins complexes exchange and nuclear localization by determining the nature of Noc2p interactions with Noc1p and Noc3p and by studying the influence of reversibly arrested intranuclear transport on these proteins and on Rix7p, an AAA-ATPase. In order to achieve these aims, inducible promoter, fluorescent microscopy, western blot, qRT-PCR and affinity purification analyses were used.

Les cassures double-brins d’ADN (CDBs) constituent une menace pour la viabilité cellulaire et l’intégrité du génome puisque l’absence de la réparation d’une CDB pourrait conduire à la mort cellulaire. En plus de la réparation par jonction d’extrémités nonhomologues (NHEJ) en phase G1 et de la recombinaison homologue (RH) en phase S et G2, les CDBs peuvent être réparées par l’ajout de télomères par l’action de la télomérase; un phénomène qui s’appelle l’ajout de télomères de novo. Ce phénomène pourrait mettre en danger la stabilité génomique parce qu’il engendre, dans la plupart des cas, une perte du bras chromosomique du fragment non-centromérique. En conséquence, ceci engendre soit une perte de l’hétérozygotie (LOH) dans les cellules diploïdes ou la mort cellulaire dans les cellules haploïdes. Dans le but d’empêcher la formation de télomères de novo, la cellule possède des mécanismes et des voies qui préviennent l’action inappropriée de la télomérase à des CDBs. Une des principales questions dans le domaine est de comprendre comment la cellule inhibe l’ajout de télomères de novo par la télomérase en favorisant la réparation des CDBs par les autres voies (NHEJ et la RH).Dans ce projet, nous utilisons la technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur le facteur limitant de la télomérase, l’ARN TLC1 de la levure S. cerevisiae. Nous avons pu montrer que l’ARN TLC1 fait un trafic intranucléaire durant le cycle cellulaire des cellules sauvages. En phase G1/S, l’ARN TLC1 adopte une localisation nucléoplasmique avec les télomères, alors qu’il s’accumule au nucléole en phase G2/M. Nous avons fait l’hypothèse que l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléole en G2/M pourrait réduire la compétition entre la RH, qui est exclusivement nucléoplasmique, et la télomérase pour la réparation des CDBs. Pour tester cette hypothèse, nous avons employé la bléomycine (blm), un composé chimique générant des CDBs, pour traiter des cellules sauvages ou déficientes de la RH par la délétion du gène RAD52. Nous avons observé que l’ARN TLC1 conserve une localisation nucléolaire dans les cellules sauvages traitées par la blm en phase G2/M, alors que dans lescellules délétées de RAD52 exposées à la blm, l’ARN TLC1 se localise maintenant au nucléoplasme et s’associe partiellement aux sites de cassures. De plus, nous avons trouvé que l’accumulation nucléoplasmique de l’ARN TLC1 dans les cellules délétéées de RAD52 traitées à la blm, dépend de la voie de dommage à l’ADN (MRX, ATM/Tel1 et ATR/Mec1) et de la sumoylation par la SUMO E3ligase, Siz1. Plus particulièrement, l’association de la télomérase à des CDBs dépend de son interaction avec Cdc13, une protéine qui recrute la télomérase aux télomères. D’une manière surprenante, nous avons observé une accumulation rapide de Cdc13 à des CDBs en absence de Rad52, bien que nos résultats suggèrent que Rad52 empêche l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléoplasme par l’inhibition de l’accumulation de Cdc13 aux sites de cassures. L’ensemble de nos résultats ont mis en évidence que la télomérase est normalement exclue des sites de la réparation d’ADN. Cependant, en absence d’une voie fonctionnelle de la RH, la télomérase se localise du nucléole au nucléoplasme et s’accumule partiellement à des CDBs d’une manière dépendante de Cdc13 et Siz1. / DNA double-strand breaks (DSB) constitute a threat to genome integrity and cell survival if they are not repaired. In addition to canonical DNA repair systems such as nonhomologous end joining (NHEJ) in G1 and homologous recombination (HR) in S and G2 phases, DSBs can also be repaired by addition of new telomeres by telomerase. This phenomenon is referred to as telomere healing or de novo telomere addition. This process threatens genome stability since it results in chromosome arm loss, which could be lethal in haploid cells and lead to loss of heterozygosity (LOH) in diploid cells. Therefore, cells possess mechanisms that prevent the untimely action of telomerase on DSBs. One of the questions driving this field is to understand how telomere addition by telomerase is inhibited and DSBs repair can be efficiently performed by canonical DSB repair (NHEJ and HR). In this project, we used fluorescent in situ hybridization (FISH) to detect the endogenous TLC1 RNA, which is the limiting component of telomerase of the budding yeast. Using this technique, we found that TLC1 RNA traffics inside the nucleus during the cell cycle of wild-type cells. In G1 and S phases, TLC1 RNA adopts a nucleoplasmic localization, which is related to its function in telomere elongation, while it accumulates in the nucleolus in G2/M. We hypothesize that the nucleolar accumulation of TLC1 RNA in G2/M may reduce the possibility that telomerase interferes with HR to repair DNA DSB, since HR is excluded from the nucleolus and occurs only in the nucleoplasm. To test this hypothesis, we treated wild-type and rad52 (HR deficient cells) with bleomycin, a radiomimetic agent that generates preferentially DSBs. Our results show that after induction of DSB with bleomycin, TLC1 RNA remains nucleolar in wild-type cells in G2/M, but accumulates in the nucleoplasm and colocalizes partially with DSBs sites in rad52 cells, suggesting that RAD52 inhibits the nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA in the presence of DSBs. Nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA after DSB induction requires the DNA damage pathway (MRX, ATM/Tel1 and ATR/Mec1), and the SUMO ligase E3 Siz1. Interestingly, association of TLC1 RNA with DSBs depends on the single-strand telomeric binding protein Cdc13, which rapidly accumulates at sites of DNA damage, while Rad52 suppresses this process by inhibiting Cdc13 accumulation at DSBs. These results suggest that telomerase is normally excluded from sites of DNA repair. In the absence of functional homologous recombination, telomerase leaves the nucleolus and accumulates partially at DSB in the nucleoplasm in a Cdc13- and Siz1-dependent manner.

Les ribosomes sont responsables de la traduction des ARNm en protéines. Des modifications de la composition des ribosomes altèrent son activité de traduction et favorisent la tumorigenèse. L’identification des altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein pourrait être un nouveau mécanisme de tumorigenèse mammaire et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En effet, les cancers du sein restent la première cause de mortalité liés aux cancers chez la femme et leur hétérogénéité induit un problème thérapeutique important. Dans ce contexte, les altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein ont été abordées dans des cohortes humaines et dans des modèles cellulaires de l’EMT (Transition Epithélio-Mésenchymateuse), un processus impliqué dans la tumorigenèse mammaire. Ces travaux ont permis d’identifier : i) deux facteurs impliqués dans la biogenèse des ribosomes, FBL (fibrillarine) et NCL (nucléoline) dont les variations d’expression sont associées à un mauvais pronostic chez les patientes ; et ii) des variations de composition du ribosome et de son activité traductionnelle dans l’EMT. L’ensemble de ces résultats soutient l’existence d’altérations de composition des ribosomes dans les cancers du sein / Ribosomes are responsible of translating mRNAs to proteins. Alterations of ribosome composition modify its translation activity and favour tumourigenesis. Identification of ribosomes composition alterations in breast cancers might correspond to a new mechanism responsible of mammary tumourigenesis and might open up novel therapeutic approaches. Indeed breast cancers represent the first cause of women mortality due to cancers and their heterogeneity induces an important therapeutic problem.In this context, alterations of ribosomes composition were determined in human cohorts and in EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) cellular models, the EMT being a process involved in mammary tumourigenesis. This studies identify : (i) two factors involved in ribosome biogenesis, FBL (fibrillarin) and NCL (nucleolin) whose expression variations are associated with poor prognosis in patients and (ii) variations of ribosome composition and its translational activity in EMT. Altogether, this data support the presence of ribosomes composition alterations in breast cancers

L’ADOA-1 (Autosomal dominant optic atrophy) est une maladie neurologique pouvant être causée par la mutation de la protéine mitochondriale OPA1 (Optic atrophy type 1) et pouvant conduire à une cécité. Certains patients peuvent présenter un dysfonctionnement mitochondrial plus généralisé, et développer d'autres complications neuromusculaires (ADOA-1+). La protéine OPA1 est une dynamine GTPasique impliquée dans la dynamique mitochondriale en modulant la fusion des membranes internes, et plus largement dans le maintien des fonctions mitochondriales. Le rôle de cette protéine a été étudié dans beaucoup de types cellulaires, mais peu d’études se sont intéressées à la cellule cardiaque qui pourtant possède de nombreuses mitochondries.La 1ère question soulevée par cette thèse était de déterminer l’implication de la protéine OPA1 dans l’organisation du réseau mitochondrial et dans le fonctionnement de la cellule cardiaque en condition physiologique ou pathologique. Pour répondre à cela, nous avons utilisé un modèle murin hétérozygote pour Opa1 (Opa1+/-). Nous avons montré que dans le cardiomyocyte adulte, la diminution d’expression d’OPA1 induisait un déséquilibre de la balance fusion/fission, qui se traduisait par une désorganisation du réseau mitochondrial, ainsi qu’une altération de la morphologie des mitochondries. Cependant, ces modifications n’engendraient pas d’altération des capacités oxydatives des mitochondries, mais conduisaient à une perturbation des propriétés d’ouverture du PTP. En outre, la déficience en OPA1 n’influençait pas la fonction cardiaque en condition physiologique, mais était associée à son altération plus sévère en condition pathologique. La 2nde question de cette thèse était de savoir l’implication d’OPA1 dans la réponse à un stress physiologique des cellules musculaires squelettiques, et ainsi étudier le lien éventuel entre OPA1 et la mise en place de la biogénèse mitochondriale. Nous avons donc soumis nos souris Opa1+/- à un exercice d’endurance. Nos résultats ont révélé que nos deux groupes d’animaux disposaient des mêmes capacités physiques à l’entraînement. L’adaptation des souris Opa1+/- à l’entrainement s’effectuait par un remodelage métabolique, vraisemblablement pour contrer un défaut d’adaptation de la biogénèse mitochondriale. En conclusion, nos résultats ont permis de mieux définir le rôle de la protéine OPA1 dans les muscles striés et son implication dans l’adaptation à un stress. Ce travail nous ouvre des perspectives sur le rôle de la dynamique mitochondriale dans l’adaptation à un stress. / ADOA-1 (Autosomal dominant optic atrophy) is a neurological disease that can be caused by mutations in mitochondrial protein OPA1 (Optic atrophy type 1) and can lead to blindness. Some patients with OPA1 mutations may have a generalized mitochondrial dysfunction, and may develop additional neuromuscular complications (ADOA-1+). OPA1 protein is a GTPase dynamin involved in mitochondrial dynamics by controlling the fusion of inner membranes, and also in the maintenance of mitochondrial functions. The role of this protein has been studied in many cell types, but only few studies have been done on cardiac cell, which nevertheless has many mitochondria.The first question raised by this thesis was to determine the involvement of OPA1 protein in mitochondrial network organization and the functioning of the cardiac cell in physiological or pathological condition. To answer this, we used a mouse model heterozygous for Opa1 (Opa1+/-). We have shown that in adult cardiomyocytes, a decrease expression of OPA1 induces an imbalance fusion/fission, which results in a disruption of mitochondrial network, as well as alteration of the morphology of mitochondria. However, these changes did not alter oxidative capacities, but leads to a disturbance of PTP opening. Additionally, OPA1 deficiency did not affect cardiac function under physiological conditions, but it is associated with a stronger impairment of cardiac function in pathological condition.The 2nd part of this thesis was to determine the involvement of OPA1 in response to physiological stress in cells of skeletal muscle, and thus to study the possible link between OPA1 and mitochondrial biogenesis activation. For this, we submitted our Opa1+/- mice to an exercise training. Our results showed that both groups of animals were able to perform the same physical activity. The adaptation of Opa1+/- mice to training did not involve mitochondrial biogenesis and led to a specific response involving a metabolic remodelling towards higher fatty acids utilization.In conclusion, our results allowed us a better understanding of OPA1 role in striated muscle and its involvement for adaptation to a stress. This work opens new perspectives on the role of mitochondrial dynamics in cardiac and muscle cells and during adaptation to a stress

La mitochondrie est de plus en plus reconnue pour sa contribution à la dégénerescence musculaire. Les dysfonctions mitochondriales, en plus de causer une défaillance énergétique, contribuent à la signalisation apoptotique, stimule la production de ROS et peuvent induire une surcharge calcique. Ces caractéristiques sont tous reliées à certains types de myopathies. Cette thèse met en lumières comment certaines dysfonctions mitochondriales peuvent intervenir dans la pathogenèse de diverses myopathies. Nous démontrons que les dysfonctions mitochondriales sont impliqués dans l’atrophie dû à la perte d’innervation. Par contre, la désensabilisation de l’ouverture du pore mitochondrial de transition de perméabilité, via ablation génétique de cyclophiline-D, ne prévient ni la signalisation apoptotique mitochondrial ni l’atrophie. Nous avons aussi observé des dysfonctions mitochondriales dans le muscle atteint de dystrophie musculaire de Duchenne qui furent améliorés suite à une transfection de PGC1-α, laquelle résulta aussi en une amélioration de la pathologie. Finalement, nous démontrons que le recyclage de mitochondrie par les voies de mitophagies et de contrôles de la qualité impliquant Parkin et possiblement d’autres voies de signalisation inconnues sont cruciales au recouvrement cardiaqe lors d’un choc septique. / Mitochondria are increasingly being recognized for their role in contributing in cellular damage. Mitochondrial dysfunctions, in addition to causing energy failure, contribute to apoptotic signaling, stimulate ROS production and calcium overload. These are all features of various types of myopathies. This thesis sheds light on how mitochondrial dyfunctions may contribute to the pathogenesis in certain myopathies that have been found to show mitochondrial abnormalities. Specifically, we found that although mitochondrial dysfunctions are involved in denervation-associated atrophy, desensitizing mitochondrial permeability transition pore opening through genetic ablation of CyclophilinD does not prevent mitochondrial apoptotic signaling nor atrophy in this model of chronic inactivity. We also observed mitochondrial dysfunctions in the Duchenne dystrophic muscle that were improved after PGC1-α transfection, which also resulted in an amelioration of the disease presentation. Finally, we found that mitochondrial recycling, led by Parkin and alternate mitophagy pathways a crucial component of cardiac recovery in sepsis.

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La protéine BamB est une lipoprotéine de membrane externe appartenant au complexe BAM (β-Barrel Assembly Machinery) et impliquée dans l’assemblage des protéines de membrane externe (PME), la sensibilité aux antibiotiques, le contrôle de l’expression des trois systèmes de sécrétion de type III (T3SS) et la virulence de Salmonella. Chez E. coli, au sein du complexe BAM, elle interagit directement avec la protéine BamA. De plus, chez cette bactérie, BamB présente une activité sérine-thréonine kinase. Afin de mieux caractériser le rôle de BamB, nos objectifs ont été d’étudier (1) l’impact de l’altération de l’interaction de BamB avec le complexe BAM ou de sa séquestration dans le cytoplasme sur l’ensemble des rôles décrits de BamB et (2) l’activité kinase putative de BamB chez Salmonella. Nos résultats montrent que certains rôles de BamB sont dissociables entre eux et que l’interaction BamA/BamB n’est pas requise pour le rôle de BamB dans le contrôle de l’expression des T3SS, la virulence de Salmonella et l’assemblage des PME à la membrane externe. Aucune activité kinase ni aucune activité cytoplasmique de la protéine n’a pu être formellement démontrée. / BamB is an outer-membrane lipoprotein belonging to the BAM complex (β-Barrel Assembly Machinery). In Salmonella, it is involved in the assembly of outer membrane proteins (OMP), in antibiotic susceptibility, in the transcriptional control of the three Type-Three-Secretion-Systems (T3SS) related genes and also in virulence. In E. coli, BamB interacts directly with the BamA protein. Moreover, BamB has been shown to have a serine-threonin kinase activity in this bacterium. In order to better characterize the roles of the BamB protein, our purposes were to study (1) the impact of the alteration of the interaction of BamB with the BAM complex or of its cytoplasmic sequestration and (2) its putative kinase activity in Salmonella. Our results show that some of the BamB roles are dissociable and that the BamA/BamB interaction is not required for T3SS expression, Salmonella virulence or OMP assembly in the outer membrane. Currently, neither a kinase activity nor a cytoplasmic activity has been clearly demonstrated for this protein.

Les exosomes sont des vésicules membranaires de 30 à 100 nm de diamètre, formées dans les endosomes multivésiculaires et sécrétées par la plupart des cellules. Les propriétés biophysiques et biochimiques des exosomes ainsi que les mécanismes permettant leur biogénèse et sécrétion ont fait l’objet de nombreuses études. Cependant, ces derniers sont encore méconnus, limitant l'analyse des fonctions des exosomes in vivo. Au moins deux mécanismes ont été proposés pour la biogénèse des exosomes : un mécanisme nécessiterait l’action de protéines impliquées dans le tri endosomal, les ESCRT (« endosomalsorting complex required for transport »). Un autre mécanisme serait indépendant de leur fonction. La sécrétion des exosomes, une fois générés dans les endosomes, requiert la petite GTPase, Rab27a, comme montré dans un modèle cellulaire humain. Mes travaux de thèse ont porté sur l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la biogénèse et la sécrétion des exosomes. Une première étude visant à analyser la fonction de Rab27a dans des cellules murines, m’a permis de mettre en évidence l’existence de différentes populations d’exosomes, dont la sécrétion dépend ou non de Rab27a. Une deuxième étude a eu pour objectif d’analyser l’implication des ESCRT dans la biogénèse des exosomes dans des cellules HeLa CIITA. Le criblage d’une librairie d’ARN d’interférence dirigés contre les différentes protéines ESCRT, a permis l’identification de 7 molécules potentiellement impliquées dans cette voie : HRS, STAM1, TSG101, leur inactivation induisant la diminution de la sécrétion des exosomes. L’inactivation de CHMP4C, VPS4B,VTA1 et ALIX, au contraire, l’augmente. L’inhibition de l’expression de ces candidats suivie de l’analyse des exosomes sécrétés a démontré l’hétérogénéité des vésicules sécrétées, et une modification de leur taille et de leur composition protéique par rapport aux cellules contrôle. Plus particulièrement, l’inactivation d’ALIX induit une augmentation de lasécrétion d‘exosomes de plus grande taille, et l’enrichissement sélectif en molécules de CMH de classe II. En accord, j’ai montré que les cellules inactivées pour ALIX, aussi bien des cellules HeLa que des cellules dendritiques humaines ont une plus forte expression de CMH de classe II à la surface et dans des compartiments intracellulaires. Ces résultats suggèrent l’implication de certains membres de la famille ESCRT dans la voie de biogenèse et sécrétion des exosomes, ainsi qu’un rôle potentiel d’Alix dans le trafic des molécules CMH de classe II, et dans la modulation de la composition protéique des exosomes. / Exosomes are small membrane vesicles with sizes ranging from 30 to 100 nm in diameter, which are formed in multivesicular endosomes and secreted by most cell types. Numerous studies have focused on the biophysical and biochemical properties of exosomes, as well as the mechanisms of biogenesis and secretion of these vesicles. However, these aspects are not fully understood, which limits the analysis of the functions of exosomes in vivo. At least two mechanisms have been proposed for the biogenesis of exosomes : one would rely on the function of proteins involved in endosomal sorting, the ESCRT family (for “endosomal sorting complex required for transport”). Another mechanism would be independent of their activity. Once exosomes are formed in endosomes, their secretion requires the small GTPase RAB27A, as shown in a human cell line. The objective of my PhD project was to gain insights into the molecular mechanisms that drive exosome biogenesis and secretion. A first study performed to analyze the function of Rab27a in murine cells allowed me to show the existence of different populations of exosomes, dependent or not on Rab27a for their secretion. A second study was aimed at analyzing the involvement of ESCRT proteins in exosome biogenesis in HeLa-CIITA cells. Seven molecules potentially involved in this process were identified on the basis of the screening of an RNA interference library directed against the different ESCRT proteins: the inactivation of HRS, STAM1 and TSG101 induced a decrease in exosome secretion, whereas the down regulation of CHMP4C, VPS4B, VTA1 and ALIX increased it. Gene expression of the different candidate proteins was inhibited and exosomes secreted by these cells were analyzed: we showed the heterogeneity of the secreted vesicles, as well as an alteration of their size and protein composition, as compared to control cells. In particular, the inactivation of ALIX induced an increase in the secretion of larger vesicles, and the selective enrichment of these vesicles in MHC class II molecules. Accordingly, I showed that both HeLa-CIITA and human primary dendritic cells inactivated for ALIX possess a higher expression of MHC class II molecules at the cell surface and in intracellular compartments. These results suggest that some members of the ESCRT family are involved in the exosome biogenesis and secretion pathway, and propose a potential role of ALIX in the trafficking of MHC class II molecules and in the modulation of the protein composition of exosomes.

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