En la presente tesis doctoral se abordó la regulación de la somatolactina (SL) y del eje somatotrópico (GH-IGF-I) en tres ciclos de engorde con inicio en distinta época del año (primavera, verano y otoño). Se determinaron variaciones estacionales de GH e IGF-I con picos en el periodo estival y los niveles más bajos en otoño e invierno. Los niveles circulantes de GH estuvieron correlacionados positivamente con las tasas de ingesta de alimento, mientras que los niveles de IGF-I lo estuvieron con las tasas de crecimiento. En la SL también se observó variaciones estacionales, pero el pico se estableció en otoño, una vez los animales hubieron alcanzado un determinado estatus energético. Ello mostró una regulación estacional opuesta entre GH y SL. Los valores de SL no coincidieron con los aumentos de cortisol. Como hipótesis de trabajo se estableció que los incrementos de GH actuarían movilizando energía en momentos de déficit energético promoviendo el crecimiento, mientras que los incrementos de SL, una vez el animal hubiera alcanzado cierta disponibilidad energética, servirían para movilizar las reservas energéticas y disparar procesos fisiológicos como el ayuno invernal y la reproducción.Para comprobar esta hipótesis, se llevó a cabo un modelo de alimentación restringida anual. Se utilizó el mismo diseño experimental de tres engordes del capítulo anterior con dos grupos de alimentación, uno ad limitum (saciedad visual) y otro con alimentación restringida. El valor medio de la restricción en todos los engordes fue del 20%. La restricción de la alimentación comportó un aumento de la amplitud del pico de GH, corroborando que esta hormona es utilizada por el animal para movilizar energía en situaciones de déficit energético. En el caso de la SL, la restricción ocasionó un retraso del pico otoñal, corroborando la hipótesis de que se trata de una señal de adiposidad. Estos cambios hormonales se produjeron cuando existieron también cambios en el contenido graso de los animales. Desde un punto de vista práctico, la alimentación restringida comportó una ligera disminución de la biomasa final (<7%), sin embargo, mejoró la tasa de conversión del alimento en todos los grupos (15%) y disminuyó el grado de adiposidad de los animales. Los beneficios de esta alimentación restringida fueron mayores cuanto más alejado estuvo el ciclo de engorde del modelo natural de la dorada en estado salvaje.También se estudió el efecto de esta alimentación restringida sobre el estado inmunopatológico de los animales, ya que experiencias previas pusieron de manifiesto la relación entre la adiposidad y este estado inmunopatológico en otras especies de peces. En este caso, la alimentación restringida comportó una menor tasa de mortalidad, menos alteraciones histopatológicas y una menor prevalencia de infección para la mayoría de los parásitos detectados. Asimismo, esta restricción parece mejorar el estado de inmunocompetencia en algunos aspectos (estallido respiratorio).Otro de los aspectos abordados fue la caracterización del receptor de GH (RGH) en dorada, como pieza clave dentro del eje somatotrópico y para la determinación más precisa del estado nutricional de los animales en cultivo. La secuencia nucleotídica (1726 nt de longitud) codifica para una proteína de 575 aminoácidos de pauta abierta de lectura. El análisis de dicha secuencia se completó por 3' y 5'RACE, encontrándose un péptido señal de 38 aminoácidos, seguido de una región extracelular de 227 aminoácidos, una región transmembrana de 24 aminoácidos y el resto perteneciente a la región intracelular. El alineamiento de las secuencias aminoacídicas del RGH de dorada con el de otros receptores de vertebrados superiores e inferiores mostró la conservación de 7 cisteínas, 5 sitios N-glicosilación (1 de ellos exclusivo de peces) y el motivo FGEFS en la región extracelular. En la región intracelular se encontraron conservados los Dominios 1 y 2 citoplasmáticos y 8 tirosinas (1 de ellas exclusiva de peces).La búsqueda de isoformas del RGH de dorada por Northern blot, 3'RACE y screening mediante RT-PCR del extremo 3' no reflejó la existencia de un procesamiento alternativo del ARN mensajero. El análisis de cross-linking también abogaron por la existencia de una única proteína con distinto grado de glicosilación. El análisis de la estructura genómica del RGH de dorada y rodaballo mostró un alto grado de conservación de la estructura exón-intrón, con la presencia de un intrón exclusivo de peces que, en la chopa, posibilita la existencia de una forma larga con una inserción de 93 pb en la región intracelular. En el caso del rodaballo, la región divergente y el 3'UTR de la forma truncada anclada a membrana están codificados por el extremo 5' del intrón 9/10. Todo ello pone de manifiesto que la presencia de isoformas y los mecanismos de generación de los RGHs de peces y vertebrados superiores son marcadamente específicos. / Aquaculture production of gilthead sea bream has largely increased over the past decade, and research in this sector is being directed towards the improvement of feeding practice. In this scenario, the most suitable approach for culturing fish would be the use of appropriate feeding standards aimed not only to improve economic returns, but also to develop a lasting cohabitation of sustainable aquaculture and a cleaner environment. In this way, available data indicate that the potential benefits of high-energy diets can be compromised in gilthead sea bream by unrestricted feeding. In addition, the growth hormone spurts of summer is concurrent with up-regulation of circulating levels of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor-I (IGF-I). This endocrine arrangement provides an integrated signal for growth and perhaps immune status at times of increasing daylength and temperature. Furthermore, there is a direct evidences for the involvement of somatolactin (SL), a new member of GH and prolactin family. This hormone is up-regulated by the increase of ration size, and their rise and fall is a consistent event after the summer repletion of energy reserves. By other side, restricted feeding regime had lower percent mortality, lower prevalence of infection of the most of the detected parasites, less histopathological alterations than those fed under visual satiety, and seemed to be enhanced respiratory burst activity.Finally, molecular characterization of GH receptor in gilthead sea bream, genomic organization of this receptor in sea bream and turbot and season expression were focused.

Aproximadamente 170 millones de personas en el mundo se encuentran infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC). La gran heterogeneidad del mismo, permite distinguir hasta 6 genotipos y más de 50 subtipos, los cuales presentan diferencias en cuanto a su prevalencia, distribución geográfica y rutas de transmisión. Sin ir más lejos, en la Comunidad Valenciana, el VHC está presente en casi el 3% de la población. Los genotipos mayoritarios presentes, corresponden al 1b y 1a, siendo el 1b mucho más prevalente que el segundo. Así pues se plantea el principal objetivo de esta tesis: ¿Qué hace al genotipo 1b ser más prevalente en la Comunidad Valenciana que el 1a? Dos regiones del genoma del virus han sido utilizadas para llevar a cabo este estudio: la comprendida entre la proteína E1-E2, con una extensión de 472 nucleótidos y que contiene a la región hipervariable HVR1, y otra región de 743 nucleótidos de la proteína NS5A que contiene a la región ISDR, obteniendo un número aproximado de 10.000 clones.Para contestar a la pregunta que se plantea como principal objetivo llevamos a cabo diferentes estudios tales como el cálculo de diferentes medidas de variación genética, la inferencia de la historia demográfica, el desarrollo de distintos tests de neutralidad y la búsqueda de selección positiva en ambas regiones.Con respecto al primero, no encontramos diferencias significativas al llevar a cabo la comparación de las medias de los diferentes parámetros empleados, por lo que no parece, por tanto, que la variación genética esté relacionada con la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro.Uno de los factores que parece influir en la diferente distribución geográfica y prevalencia de los genotipos es la ruta por la cual se transmite la enfermedad. La utilización de métodos basados en la teoría de la coalescencia puede ayudarnos a reconstruir la historia epidémica de diferentes secuencias del VHC, a partir de la diversidad genética viral presente. Uno de estos métodos es el que hemos utilizado aquí para inferir la historia demográfica del VHC para los genotipos 1b y 1a. Este análisis se llevó a cabo a dos escalas: individual y genotípica. El estudio a escala genotípica parece apoyar la hipótesis de que la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro se deba a las diferentes rutas de transmisión. Ya que por un lado, las vías de contagio muestran una clara relación entre la ruta de transmisión y un determinado genotipo, en este caso el 1b con transfusiones y el 1a con ADVP. Por otro lado la fecha en que el genotipo 1b comienza a disminuir su tasa de crecimiento parece coincidir con el aumento en 1a, y a su vez coincide con la primera introducción de métodos de screening de sangre contra no-A no-B en transfusiones. Por tanto, parece que en los últimos años el contagio vía transfusiones de sangre, debido a las fuertes medidas de control sobre los productos sanguíneos, está casi totalmente controlado, por lo que la infección del virus (genotipo 1b) por esta ruta es muy difícil, dejando vía libre al contagio por ADVP (genotipo 1a).Los dos últimos estudios apuntan hacia desviaciones al modelo neutral, las cuales, se deben a la acción de la selección positiva en el caso de la región E1-E2, favoreciendo la resistencia al ataque del sistema inmune y negativa en el caso de la región NS5A, impidiendo la acumulación de mutaciones en la ISDR y favoreciendo la replicación viral. Estos resultados son similares en ambos genotipos, por lo que no serían responsables de la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro.Así pues tras todos los análisis realizados podemos concluir que según nuestros resultados, la diferente ruta de transmisión que parecen seguir los genotipos a y 1b, sería responsable de la mayor prevalencia del genotipo 1b sobre el 1a. / Hepatitis C virus is present in 2% of the human population. It is characterised, phylogenetically, by the presence of a number of major genotypes, with a star-like phylogenetic distribution, and composed by several minor subtypes. The most abundant genotype in Europe is called 1, with two prevailing subtypes, 1a and 1b. In order to explain the higher prevalence of subtype 1b over 1a, we have carried out several large-scale sequence analysis, such as: analysis of polimorphisms, analisys of variance inference of demographic history, neutrality test and search of amonoacidical positions under positive selection. Two regions have been used for this task: one compressing the HVR1 (hypervariable region 1) and other including ISDR (Interferon sensitive determinig region) from 100 viral clones of each one of 25 patients subtype 1a and 25 1b, from the Comunidad Valenciana (Spain).Neither analysis of polimorphisms nor analysis of variance showed differences between subtypes, only the demographic history of the populations reflected some relation with regard to the route of transmission. By other hand we have found several positions in HVR1 under positive selection that coincide in both subtypes, therefore this situation neither explain difference in prevalence. Nevertheless the presence of mutations due to positive selection, could be indicating a mechanism of virus to scape from de attack of immune system. In contrast we observe the absence of positive selection in region ISDR. This absence could be favoring the resistance to interferon and the viral replication. This last situation is similar in both subtypes too.Therefore and in general, our results showed that route of transmission could be the cause of the highest prevalence of subtype 1b over 1a.

Cuatro especies de tortugas marinas anidan en la isla de Bioko (Guinea Ecuatorial): la tortuga verde, Chelonia mydas, la tortuga laúd, Dermochelys coriacea, la tortuga olivácea, Lepidochelys olivacea, y la carey, Eretmochelys imbricata. Estas especies realizan sus puestas de huevos en unos 20 kilómetros de playas en el sur de la isla. Debido a la existencia de amenazas de origen humano, es necesario obtener una evaluación del estado de conservación de esta población de tortugas marinas para aplicar medidas efectivas de conservación. En el presente trabajo estudiamos la biología de puesta de las cuatro especies citadas a partir de un programa de marcaje sobre las hembras nidificantes, de muestreos diarios y de recuento de nidos durante dos temporadas de puesta consecutivas, desde octubre de 1996 hasta 1997 y desde septiembre de 1997 hasta marzo de 1998. El área de estudio está formada por seis playas de arena negra volcánica. Las condiciones ambientales en esta zona son extremas, dándose lluvia intensa y tormentas durante todo el año, excepto en una breve estación seca entre enero y febrero. Los dos objetivos principales del presente estudio fueron la descripción de la población de hembras nidificantes y el estudio de su rendimiento reproductivo a partir del análisis y variación del éxito de eclosión. Las recapturas de tortugas marcadas fuera de Bioko nos permitieron analizar también los movimientos migratorios de las tortugas nidificantes hacia sus áreas de alimentación. Dentro del primer objetivo, estudiamos la duración de la temporada de puesta, la distribución de tallas y la estimación del número de hembras nidificantes. La temporada de puesta transcurre desde noviembre hasta febrero, con un pico en diciembre-enero, tanto para las tortugas verdes como para las tortugas laúd y las oliváceas. Las tortugas carey llegarían al área de estudio en el mes de diciembre. Se han detectado emergencias esporádicas de tortuga verde y tortuga laúd fuera de la temporada de puesta descrita. Encontramos una segregación en la distribución de especies, con las tortugas verdes anidando preferentemente en las playas occidentales, con mayor pendiente, y las tortugas laúd en las orientales. Además, las verdes anidaron preferentemente en la zona de vegetación, cuando ésta era accesible. Las tortugas verdes medidas (LCC media= 98.3 &#61617; 6.1; N= 196) fueron, en conjunto, más pequeñas que las de la mayoría de poblaciones nidificantes de esta especie. Las tortugas laúd medidas en Bioko (LCC media= 157.93 &#61617; 14.96) fueron de tallas similares a las de otras poblaciones. Las tortugas oliváceas (LCC media= 71.65 &#61617; 6.42) parecen ser más grandes que las de otras áreas de puesta. Las tortugas verdes de mayor talla parecen llegar antes a anidar en el sur de Bioko. La estimación de tortugas verdes en el área de estudio se realizó a través de un programa de marcaje y recaptura de hembras nidificantes. Empleamos el número medio de puestas por tortuga (2.99&#61617; 1.82) para obtener una estima de 555 (256-<1681) tortugas verdes en la temporada 1996-97. Debido al reducido marcaje, obtuvimos rangos de las poblaciones de las otras especies de tortugas marinas nidificantes en Bioko empleando valores de número medio de puestas por tortuga y por temporada extraídos de la literatura. El número de tortugas laúd nidificantes en la primera temporada osciló entre 114 y 168. El número de nidos de tortuga verde contabilizados en 1997-98 (1257) comparado con el de la temporada anterior (1671) sugiere que no se produjo un cambio importante en el tamaño poblacional tanto para las tortugas verdes como para las tortugas laúd. Aunque para esta segunda especie, el rango estimado en 1997-98 fue ligeramente superior (156-230 tortugas). Las otras dos especies fueron bastante menos abundantes, entre 19 y 43 tortugas oliváceas y entre 4 y 10 tortugas carey. Un muestreo reciente realizado en el área de estudio por otros investigadores no ha mostrado cambios importantes en el número de nidos de tortugas verdes, oliváceas y carey, aunque sí ha evidenciado un aumento significativo del número de puestas de tortuga laúd. El sur de Bioko parece albergar una de las más importantes áreas de puesta para la tortuga verde en la costa atlántica africana, siendo también un área de puesta importante para la tortuga laúd. Aunque se necesita mayor precisión en las estimas, nuestros resultados parecen suficientes para condicionar la toma de decisiones inmediatas sobre la conservación de estas especies y para realizar comparaciones con estudios futuros en la zona. Abordamos el segundo objetivo a partir de la descripción de los datos relacionados con la producción de neonatos y del análisis de factores bióticos y abióticos que pudieron afectar a estos datos; centrándonos básicamente en la especie de tortuga marina más abundante: la tortuga verde. Para esta especie, el tamaño medio de puesta (número de huevos por nido) fue de 104.3 &#61617; 30.9 (N= 119) en la temporada de 1996-97 y de 112.7 &#61617; 31.5 (N= 83) en la temporada siguiente, sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas entre ambas temporadas. Encontramos cierta relación entre el tamaño de puesta y la talla de las tortugas. Los periodos de incubación medios para los nidos de tortuga verde en cada una de las temporadas de estudio fueron superiores a los registrados en la mayoría de las poblaciones nidificantes de esta especie por todo el mundo, debido probablemente a las especiales condiciones climáticas del sur de Bioko. Los porcentajes de éxito de eclosión obtenidos fueron, para 1996-97: 64.3%&#61617; 25.4, N= 119, y para 1997-98: 75.2%&#61617; 20.7, N= 83. Encontramos una diferencia significativa entre las dos temporadas, probablemente debido a las diferentes condiciones ambientales registradas. Los porcentajes de éxito de eclosión en el área de estudio fueron similares o ligeramente inferiores a los de otras poblaciones en otras áreas. Observamos que las tormentas esporádicas, las cuales producen reducciones bruscas de la temperatura de incubación, pudieron haber tenido un mayor impacto sobre el desarrollo de los huevos que los factores bióticos y abióticos que definen la temperatura de incubación a lo largo de todo el periodo de puesta. Sin embargo, se deben muestrear más temporadas y controlar otros factores para confirmar los resultados obtenidos. En el presente estudio, identificamos una larga lista de depredadores naturales de las tortugas marinas, de los cuales sólo los cangrejos del género Ocypode parecen tener un efecto significativo sobre los huevos y neonatos. Aunque la tortuga verde es una especie protegida, es explotada en Bioko para consumo humano. Una estimación aproximada del número de neonatos producidos que puedan alcanzar la madurez sexual, a partir de los datos tomados en la temporada 1996-97, reflejó una sobre explotación evidente dadas las capturas que se vienen realizando. Respecto al tercer objetivo, encontramos una dispersión en los movimientos migratorios hacia diferentes áreas de alimentación, tras la puesta. La bahía de Corisco para ser un área de alimentación importante para la tortuga verdes del sur de Bioko.Los resultados obtenidos en el presente estudio deben ser interpretados como un punto de partida para futuros estudios que confirmen las conclusiones descritas. / Four sea turtle species nest in 19.4 km of the south coast of Bioko Island (Equatorial Guinea): Chelonia mydas (green turtle), Dermochelys coriacea (leatherbback), Lepidochelys olivacea and Eretmochelys imbricata. The present study summarizes the main aspects of their nesting biology, based on tagging of adult females, nightly surveys and nest census during two nesting seasons. Reproductive success and post-nesting movements are also studied.Main nesting season occurred from October to February, with a peak in December-January. We found some nesting segregation between the two predominant species depending on the characteristics of the beaches. Over 555 (256-<1681) green turtle nesting females were estimated through the mean number of nests (2.99± 1.82) laid by 196 turtles tagged in the 1996-97 season. Nesting leatherbacks ranged from 114 to 230 females. No substantial change in green and leatherback nesting populations were observed in the 1997-98 season. Thus, Bioko Island seems to host one of the most important nesting areas for the green turtle in the atlantic coast of Africa, being also important for leatherbacks. Mean nest size was 107.6&#61617; 31.1 eggs (N= 216). Mean incubation period (66.15&#61617; 11.15 days in 1996-97, and 61.81 &#61617; 6.85 days in 1997-98) was found to be higher than those recorded in other green turtle populations all over the world. Significant difference in the hatching success between seasons (1996-97: 64.27&#61617; 25.35, N= 119; 1997-98: 75.16&#61617; 20.67, N= 83) was found, probably due to the different climatic conditions registered. Sporadic storms might have higher impact on the egg development than biotic and abiotic factors affecting the incubation temperature along the incubation period. Although green turtle is a protected species, nests and adult females are exploited in Bioko, even though our evaluation of the number of hatchlings that could reach to sexual maturity showed an overexploitation of this resource. Recaptures of tagged turtles showed a dispersal to several foraging areas, being Corisco Bay (Equatorial Guinea) an important foraging area for Bioko nesting green turtles. Further studies must be carried out at Bioko sea turtle nesting beaches to confirm the conclusions set forth here.

El uso de los sistemas computarizados de análisis seminal requiere su validación respecto de los métodos de uso generalizado de valoración referidos a los criterios de la OMS (1999). En este trabajo se pretende validar el uso del Sperm Class Analyzer® (V5.1) en el laboratorio clínico humano, así como abordar una análisis integrado de los diversos parámetros cinemáticos y morfométricos de los espermatozoides aportados por el sistema.En primer lugar, se trató de determinar las condiciones más adecuadas de adquisición de imágenes. Para ello, se utilizaron 9 muestras seminales con características heterogéneas. Un alícuota de cada una de las muestras se centrifugó con el fin de obtener plasma seminal con el que realizar diluciones homólogas (50%) y así evitar modificaciones en sus características físico-químicas que pudiesen afectar a los parámetros de movilidad. Los análisis se realizaron con el software del módulo de movilidad del analizador SCA®, a partir de semen fresco y diluido, con contraste de fases positivo y negativo, y con los objetivos de 10x y 20x.Se analizó la posible influencia de las variables metodológicas consideradas en el porcentaje de trayectorias erróneas, así como respecto de los parámetros cinemáticos (VCL, VSL, VAP, LIN, STR, WOB, ALH y BCF) entre sí. Por otra parte, se valoró la correlación entre las determinaciones subjetivas y las objetivas de la concentración y del porcentaje de móviles progresivos (a+b) y totales (a+b+c). El único parámetro que nos aportó la información necesaria para decantarnos por una de las condiciones de análisis fue el de las trayectorias erróneas. Para realizar el estudio cinemático global y de acuerdo con los resultados previos, se eligió como condición de trabajo: contraste de fases negativo, objetivo de 20x y muestra sin diluir. En primer lugar, se realizó un estudio previo de correlación entre la concentración subjetiva determinada con las cámaras Neubauer y Makler, observándose correlación altamente positiva. Seguidamente, se analizó la correlación entre las determinaciones subjetivas y las objetivas de concentración (con la cámara Neubauer), y porcentaje de móviles progresivos y totales (con la cámara Makler).A continuación, se hizo un estudio de correlación entre las diversas variables aportadas por el sistema SCA®. Tras lo cual, se analizó la correlación entre los parámetros cinemáticos, y las determinaciones objetivas de concentración y porcentaje de móviles progresivos y totales.Finalmente, se calcularon y analizaron las componentes principales, a partir de la reducción de las variables cinemáticas a una serie de factores que representaban la mayor parte de la varianza total. Se evaluó la matriz de componentes, calculada a partir de las variables y, después de la extracción inicial de dichas componentes, los factores ortogonales fueron rotados utilizando el criterio Varimax. La interpretación de los resultados se basó en el análisis de los factores dominantes y en el porcentaje de la varianza total explicativa. Las 8 variables cinemáticas quedaron reducidas a tres componentes principales: Índices (explicaba el 42,52 % del total de la varianza), Velocidades (36,74 %) y Frecuencia (12,67 %).Por otra parte, se realizó un estudio morfométrico en paralelo. De cada muestra se realizaron frotis que se tiñeron con el kit Hemacolor, analizándose con el módulo de morfometría del SCA® un mínimo de 100 células por muestra.En primer lugar, se analizó la correlación entre las determinaciones subjetivas y las objetivas (formas normales, defecto de cabeza, defecto de pieza intermedia, y defecto de cabeza + pieza intermedia); y posteriormente, se estudió la correlación entre las diversas variables morfométricas aportadas por el sistema SCA®. A continuación, se hizo un análisis de correlación entre parámetros morfométricos, y determinaciones objetivas de concentración y porcentaje de móviles progresivos y totales.Por último, se procedió a la reducción de los parámetros morfométricos a sus componentes principales. Un total de 13 variables morfométricas (cinco de tamaño de la cabeza: área, perímetro, longitud, anchura y porcentaje de acrosoma; cuatro de forma de la cabeza: elipticidad, rugosidad, elongación y regularidad; dos de tamaño de la pieza intermedia: anchura y área, y dos de inserción: la distancia y ángulo entre los ejes mayores de la cabeza-pieza intermedia), quedaron reducidas a tres componentes que explicaban la mayor parte de la varianza total: Forma de la cabeza (explicaba el 37,91 % de la varianza), Tamaño de la cabeza (26,57 %) y Pieza Intermedia (18,64 %).Finalmente, se integraron los parámetros cinemáticos y morfométricos, se estudió su correlación, y se redujeron a sus componentes principales (CP) mediante el programa SPSS. Estas componentes explicaban el 83, 19% del total de la varianza; CP1, Forma de la cabeza (explicación de la varianza del 29,65%); CP2, Tamaño de la cabeza (20,57%); CP3, Índice de velocidad (13,71%); CP4, Velocidades (12,44%) y CP5, Pieza intermedia (6,78%). Con lo visto hasta ahora, el uso del SCA® se puede considerar validado, en el contexto del laboratorio clínico humano, para el análisis automático de la movilidad y morfología espermática en las condiciones utilizadas; además, se pone de manifiesto la importancia de los parámetros en la definición de la cinemática y morfometría espermática por lo que su inclusión en el análisis resulta imprescindible; y finalmente la reducción del conjunto de parámetros aportados por el SCA® a cinco componentes principales permite sintetizarlos, abriendo las puertas a una comprensión integrada de las características espermáticas, introduciendo criterios mucho más robustos en la valoración seminal que la valoración individualizada de dichos parámetros.Para valorar si los criterios diagnósticos actuales eran deducibles a partir de las nuevas variables obtenidas, las 56 muestras seminales se clasificaron siguiendo los criterios diagnósticos de la OMS (1992, 1999). Como resultado de esta clasificación, se obtuvieron 5 grupos de diagnósticos: normospérmicos, teratospérmicos, oligospérmicos, teratoastenospérmicos y teratoastenooligospérmicos. Se compararon los parámetros cinemáticos y morfométricos, así como las componentes principales entre los grupos, no observándose concordancia entre los criterios diagnósticos actuales y los parámetros cuantitativos.Concluyéndose que los criterios diagnósticos seguidos hasta ahora por la OMS no se ajustan a la valoración cuantitativa de la que ahora se dispone. Por ello, el significado real del presente estudio sólo se tendrá cuando se comience a aplicar el conjunto de conocimientos aquí desarrollados en el campo de la clínica, lo que puede conducir en un futuro, al menos así lo esperamos, a la definición de nuevos parámetros diagnósticos más potentes y precisos. / The aim of this work was validated the use of Sperm Class Analyzer® (SCA) in the human clinic laboratory, so to start on a integrated analysis of the cinematic and morphometric parameteres of spermatozoa. Previously, the suitable conditions of image acquisition were determined. Analysis were made with diluted and no diluted semen, positive and negative contrast, and 10x and 20x objetive (9 samples). The best work condition was no diluted semen, negative contrast and 20x objetive.Firstly, manual sperm counting was compared between Makler chamber and Neubauer hemocytometer (56 samples), showing high correlation. Beside, subjetive and objetive determinations were correlated, so cinematic parameters (VSL, VAP, WOP, LIN, STR, ALH and BCF) among them.Finally, principal components were calculated and analyzed. The understanding of results was based in the dominat factors so in the rate of explicative total variance. Eigth parameters were reduced to three principal components.On another hand, a morphometric study was parallel realized. Equally, subjetive and objetive determinations were correlated, so different morphometric parameters (lenght, width, area, perimeter, acrosome rate, Ellipticity, Rugosity, Elongation and Regularity of head; width and area of middle-piece; and distance between larger axises of head and middle-piece) among them.Lastly, principal components were calculated and analyzed. Thirteen morphometric parameters were reduced to three principal component.To finish, cinematic and morphometric parameters were integrated, studing their correlation and reducing the total of variables to five principal components: shape of head, size of head, index, velocity and middle-piece. In conclusion, the use of SCA is valited to spermatic motility and morphology analysis and the reduction to principal components introduces stearier criterion in seminal assessment.Finally, to assess if actual diagnostic criterions were deducible of new obtained variables, seminal samples were classified according to the WHO guidelines (1992, 1999). Five diagnostic groups were obtained. Cinematics and morphometrics parameters and principal components were compared between the groups, no showing correlation between actual diagnostic criterion and cuantitative parameters. Therefore, the definition of new diagnostic parameters more precise is necessary.

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La tesis se enmarca dentro de la Teoría General de Sistemas, en el área de conocimientos denominada Ecología Sistémica (Systems Ecology) y es por esta razón por lo que está estructurada pasando de lo general (Teoría del Ecosistema) a lo particular (Ecosistema Mediterráneo terrestre). Por el mismo motivo se pasa -en la interpretación semiótica de la Realidad o Modelo- de lo general (El modelo matemático) a lo particular (el modelo matemático ARGILAGA de una especie arbustiva mediterránea, siguiendo la metodología SDWTF). El objetivo es desarrollar un modelo matemático que analiza y evalúa los cambios que puede sufrir la vegetación mediterránea, y las consecuencias que esto puede tener sobre el ciclo hidrológico, la protección del suelo frente a la erosión y la valoración del paisaje vegetal. Para ello ha sido necesario conectar el desarrollo del modelo en una especie o especies que sean a la vez representativas de un ecosistema mediterráneo terrestre y que jueguen un papel importante en la génesis de los incendios y en la evolución post-incendio del ecosistema. Dicho modelo esta concretado en estudiar el comportamiento dinámico de la biomasa y su evolución en el tiempo y en el espacio, de la principal especie arbustiva pirófita, la aliaga (Ulex parviflorus), y su relación con otras especies arbustivas, propias del ecosistema a partir de sus condiciones ecológicas de etapa postincendio y su grado de eficacia como cubierta protectora frente a los procesos erosivos, a corto, medio y largo plazo, tanto en condiciones normales como límites (desertificación). Se establece como meta principal observar dicho comportamiento para poder prever y consecuente intervenir con medidas adecuadas de protección, restauración y gestión. Justificar la supervivencia de la especie por su importancia en retener el suelo y evitar la erosión, originar bancos de semillas, etc. para evitar su posible exterminio con las técnicas de repoblación forestal utilizadas actualmente o conocer en que estadio de su ciclo biológico se puede iniciar y establecer su control. Si se conoce cuales son las estrategias biológicas y se consigue mediante la modelización matemática, estaremos más cerca de poder incidir ordenadamente en la complejidad del ecosistema mediterráneo terrestre. La aplicación de este modelo de carácter predictivo permite relacionar la gestión intervensionista en el ecosistema. En este sentido podemos saber como gestionar las poblaciones de Ulex parviflorus, para minimizar el impacto negativo que ejerce como pirófita en el ecosistema, es decir, podemos saber sí en un momento determinado se deben respetar las poblaciones o controlarlas, todo ello amparado en datos objetivos. Ulex parviflorus es una especie germinadora obligada y que cuenta con bancos de semillas persistentes en el suelo y su germinación resulta estimulada por el fuego. La floración de esta especie es temprana y muy numerosa. El periodo de dispersión primaria va desde finales de marzo a junio, presentando un periodo de máxima dispersión en junio; coincidiendo con un aumento de temperatura y una bajada de humedad relativa. Las semillas son expulsadas de manera violenta de sus frutos (dehiscencia explosiva). Las semillas poseen una protuberancia externa denominada arilo, que constituye una adaptación externa especial para mejorar la dispersión secundaria por las hormigas. Las hormigas granívoras utilizan el arilo para agarrar las semillas y llevarlas al hormiguero, el cual utilizaran de alimento, mientras que el resto de la semilla permanece intacto, generalmente en el hormiguero, sin haber sufrido alteración alguna. La relación que se establece entre las hormigas y las semillas es un tipo de mutualismo denominado, mirmecocoria. Las semillas sufren dos procesos de dispersión, una primaria y otra secundaria, por las hormigas. La posición de los hormigueros y su densidad podría condicionar la aparición de nuevas plantas de Ulex. / The present thesis is framed within the General Theory of Systems, area of knowledge denominated Systemic Ecology and for this reason is structured going through the general (Theory of the Ecosystem) to the particular (Terrestrial Mediterranean Ecosystem). For the same reason, it goes through - in the semiotic interpretation of the Reality or Model - the general (mathematical model) to the particular (mathematical model ARGILAGA of a mediterranean shrub species, following the SDWTF methodology). The objective is to develop a mathematical model analyzing and evaluating changes suffering the mediterranean vegetation, and the consequences that can have on the hydrological cycle, soil protection in front of the erosion and vegetable landscape evaluation. It has been necessary to connect the development of the model in species that are, at the same time, representatives of a terrestrial mediterranean ecosystem playing an important paper in the genesis of fires and ecological post-fire evolution. The model is summed up studying the biomass dynamic behavior of the main pirophyte shrub species Ulex parviflorus, and its relationship with other shrub species, starting from its ecological conditions of post-fire stage and its grade of effectiveness like covered protector in front of the erosive processes, to short, half and long term, so much under normal conditions as limits (desertification). ARGILAGA model has as main goal to observe this behavior being able to foresee and intervene consequently with appropriate measures of protection, restoration and administration. Also, to justify the survival of the species for their importance in soil retention and erosion elimination, to originate banks of seeds, etc. To avoid their possible extermination with the techniques of forest repopulation used in the current moment and knowing in that stage of their biological cycle can begin and establish this control. If mathematically modeling can know biological strategies, we will be able to impact orderly in the complexity of the terrestrial mediterranean ecosystem.

Trabajo Final de InfoCCSS 200901

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-08T12:04:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1951864 bytes, checksum: 47a27808b4e206c27636e5861716f9dc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T12:04:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1951864 bytes, checksum: 47a27808b4e206c27636e5861716f9dc (MD5) Previous issue date: 2000-05-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A análise cladística e os dados de distribuição geográfica deste trabalho foram baseados no exame da informação presente na literatura e nos espécimes adultos da tribo Herdoniini pertencentes a 38 gêneros previamente considerados. A análise cladística dos gêneros foi efetuada com a utilização conjunta dos programas Phylogenetic Analysis Using Parsimony (PAUP) e MacClade. Os resultados desta pesquisa demonstram que Herdoniini forma um grupo polifilético. A reclassificação da tribo foi proposta a partir de sinapomorfias encontradas na análise, assim como a diagnose da tribo e dos gêneros americanos. Os caracteres da genitália dos machos revelaram sinapomorfias que suportam o monofiletismo de 18 gêneros americanos. O cladograma de taxon–área, derivado da análise filogenética, propõe o monofiletismo destes gêneros com origem na América do Sul e demonstra eventos biogeográficos relacionados com padrões de vicariância e dispersão nas américas. Os dados biológicos de literatura continham pouca informação para inferir as características biológicas e associações com espécies de formigas para a explicação do habito mirmecomórfico comum aos gêneros de Herdoniini. / The cladistic analysis and geographic distribution data of this work were based on the examination of information reported on literature and adult specimens of the tribe Herdoniini belonging to 38 genera previously considered. The cladistic analysis of the genera of Herdoniini from the Americas was performed employing the Phylogenetic Analysis Using Parsimony (PAUP) and MacClade programs in conjunction. The results of this research support the polyphyly of Herdoniini. The reclassification of the tribe was proposed using the sinapomorphies showed in this analysis, as well as the diagnoses to the tribe and to the American genera. In the characters of male genitalia were found the sinapomorphies that support the monophyly of the group formed by 18 American genera. The taxon–area cladogram, derived from the phylogenetic analysis, supports the monophyly of these genera with south American origin and shows biogeographic events for the tribe in the Americas related with vicariance pattern and dispersion. The biological data in the literature showed little information to imply their biological features and ant relationships to explain the ant–like habitus of Herdoniini.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-04T17:22:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287490 bytes, checksum: 6275dbc10b29b964ca88a6fa7d78b9a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T17:22:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287490 bytes, checksum: 6275dbc10b29b964ca88a6fa7d78b9a9 (MD5) Previous issue date: 1999-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O cDNA da proteína S-64, homóloga à proteína de ligação à sacarose (SBP), foi previamente isolado de uma biblioteca de expressão de cotilédones de soja. A seqüência de aminoácidos deduzida da proteína S-64 apresenta 85% de identidade com a proteína de ligação à sacarose (SBP), um provável sinal, um sítio consenso de glicosilação e um sítio consenso de ligação à ATP/GTP. Nessa investigação, uma versão truncada da proteína S-64 foi expressa em E. coli e a proteína recombinante purificada, utilizada em ensaios de caracterização bioquímica. Além da alta conservação de seqüência com SBP, o fracionamento subcelular de cotilédones demonstrou que a proteína S-64 está associada a membranas. Consistente com sua localização subcelular, o terminal amino hidrofóbico da proteína parece ter função de Peptídeo sinal, uma vez que a proteína intacta não foi acumulada em E. coli, ao passo que a proteína S-64 isenta do Peptídeo sinal foi eficientemente sintetizada em bactéria. Provavelmente, o sistema de secreção da E. coli reconheceu o terminal hidrofóbico da proteína intacta, e a proteína recombinante foi secretada e degradada. No entanto, tradução in vitro do RNA sintético de S-64 usando reticulócitos de coelho, na presença de membranas microssomais pancreáticas caninas, demonstrou que o Peptídeo sinal de S-64 não é clivado. Tal resultado indicou que a proteína S-64 é uma proteína de membrana do tipo II, e o seu terminal amino apresenta as funções de Peptídeo sinal, endereçando a proteína para o retículo endoplasmático; e domínio transmembrana, fixando a proteína na membrana plasmática. A capacidade de S-64 oligomerizar foi avaliada em géis semidesnaturantes e o seu domínio de oligomerização mapeado, correspondente aos aminoácidos 36 a 343, usando-se versões truncadas da proteína. A possibilidade de a proteína ligar-se à GTP por meio do seu sítio consenso de ligação a nucleotídeos foi determinada por “GTP dot blot”. A proteína S-64 liga-se à GTP, preferencialmente à ATP, uma vez que uma versão de S-64 produzida em E. coli foi marcada radioativamente por [ 32 Pα]-GTP, na presença de ATP não marcado como competidor. O sítio de ligação à GTP foi delimitado pelo teste de perda de função a partir de mutação dirigida in situ. De fato, mutação no putativo sítio de ligação a ATP/GTP bloqueia a referida atividade da proteína. Tais resultados estabelecem que a proteína S-64 é, de fato, uma proteína de ligação à GTP associada à membrana. A atividade de ligação à GTP da proteína pode estar envolvida na regulação da função da proteína como transportadora de sacarose. / A sucrose binding protein (SBP) homologue, named S-64 protein, was previously identified by cloning its cDNA from a soybean cotyledon expression library. The deduced aminoacid sequence for S-64 shares 85% identity with the sucrose-binding protein (SBP), possesses a putative peptide signal, a potential site for N-linked glycosylation and a nucleotide (ATP/GTP)-binding consensus sequence. In this investigation, the S-64 gene and truncated versions of the cDNA were expressed in E. coli and the purified recombinant proteins were used in biochemical characterization assays. In addition to high sequence conservation with SBP, subcellular fractionation of cotyledon cells demonstrated that the S-64 protein is a membrane-associated protein. Consistent with its subcellular localization, the hydrophobic amino terminus of the protein seems to function as a signal peptide because an intact protein failed to accumulate in E. coli, whereas a peptide signal free-protein was efficiently produced in E. coli. Probably the secretion system of E. coli recognized the hydrophobic stretch of aminoacids and the heterologous protein was secreted and degraded. Nevertheless, in vitro translation of synthetic S-64 RNA using a cell-free system in the presence of microsomal membranes demonstrated that the S-64 signal peptide was not cleaved. These results suggest that the S-64 is a type II membrane protein and its peptide signal may serve as dual function. It may address the synthesis of the protein to the endoplasmic reticulum (ER) and may target the protein to membranes. The ability of the protein to undergo oligomerization was analyzed in native gels. The S-64 oligomerization domain was mapped to an internal region of the protein, aminoacids 36 a 343, by assaying the ability of truncated versions of the proteins to oligomerize in native gels. The ability of the protein to associate with nucleotides thought its conserved binding sequence was determined by a GTP-binding blot assay. The S-64 protein binds GTP, rather than ATP, because the E. coli produced S-64 was radiolabeled by [ 32 Pα]- GTP in the presence of large excess of unlabeled ATP competitor. The GTP binding site was delimited by loss of function assays in which the ability of site directed mutants to retain the GTP binding activity was evaluated. In fact, mutation in the putative GTP/ATP binding site blocked GTP binding. These results established that the S-64 protein is, in fact, a GTP-binding membrane-associated protein. The GTP binding activity of S-64 may be involved in the regulation of the protein function. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-10T18:18:02Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 667859 bytes, checksum: c1bce9f72443a6c6fc688a2189f9ab72 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T18:18:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 667859 bytes, checksum: c1bce9f72443a6c6fc688a2189f9ab72 (MD5) Previous issue date: 2004-03-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Este trabalho foi realizado com a linhagem BARC-8 e a variedade comercial IAC-100, com os objetivos de: analisar a expressão do(s) gene(s) que codifica(m) a(s) enzima(s) sintase de isoflavona (IFS) em soja, e avaliar o acúmulo de isoflavonas ao longo do enchimento do grão em plantas cultivadas em duas diferentes temperaturas; mapear e identificar marcadores do tipo microssatélites e RAPD ligados a QTLs associados à determinação do conteúdo de isoflavonas em sementes de soja. Em um primeiro experimento, as plantas da linhagem BARC-8 e da variedade comercial IAC-100 foram cultivadas em dois regimes de temperaturas: 33/22 e 28/13 °C – dia/noite. Foram detectadas seis formas de isoflavonas ao longo do enchimento do grão de soja (daidzina, genistina, glicitina, malonildaidzina, malonilgenistina e malonilglicitina) tanto para IAC-100 como para BARC-8. Os resultados das análises de variância indicaram ter havido variação significativa para teor de isoflavonas em função do genótipo, da temperatura e dos estádios de desenvolvimento, bem como interação entre os três fatores analisados. A análise da cinética de acúmulo do RNA de IFS, pela técnica de RT-PCR, evidenciou que não há uma relação entre o acúmulo de isoflavonas e a quantidade de transcritos para IFS durante o enchimento do grão. Estudos posteriores deverão ser conduzidos, visando fazer uma análise quantitativa, para poder inferir como se comporta a expressão da IFS ao longo do enchimento do grão e se ocorre influência da temperatura sobre o acúmulo do seu transcrito. No segundo experimento, foi utilizada uma população de 93 plantas F 2 , obtidas do cruzamento entre BARC-8 e IAC-100, que são contrastantes para os teores de daidzina, genistina, malonildaidzina, malonilgenistina, isoflavonas totais e proteína. Os teores das isoflavonas foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência e o teor protéico pelo método de Kjeldahl. A população foi analisada, utilizando-se marcadores microssatélites e RAPD. Foram obtidos 22 grupos de ligação pouco saturados, contendo 82 marcadores, além de 25 marcas não ligada. Na análise de marca simples foram identificados 13 marcadores que explicaram a variação dos teores de daidzina. Destes, o marcador Satt318 explicou 17,39%. Na regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt232 e Satt518 explicaram, juntas, cerca de 31,5% desta característica. Seis marcadores explicaram a variação dos teores de genistina. Destes, o Satt318 explicou 16,05% da variação. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt350, Satt127 e OPK20 explicaram, juntas, cerca de 34% da variação. Onze marcadores foram identificados para malonildaidzina. Destes, o Satt318 explicou 16,13%. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt232, Satt417 e Satt197 explicaram, juntas, cerca de 33% da variação. Dezesseis marcadores foram encontrados para malonilgenistina. Destes, o Satt318 explicou 12,05% da variação. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt468, Satt495, Satt350, Satt127 e Satt499 explicaram, juntas, cerca de 45% da variação. Dez marcadores foram identificados para isoflavona total. Destes, o Satt318 explicou 13,59% da variação. Na análise de regressão múltipla, as marcas Satt318, Satt468 e OPAW04 explicaram, juntas, cerca de 26% da variação. Sete marcadores foram identificados para proteína total. Destes, o OPK20 explicou 10,06%. Na análise de regressão múltipla, as marcas OPK20, Satt512, OPU02 e Satt398 explicaram, juntas, cerca de 26% da variação. No mapeamento por intervalo composto, foi identificado um único QTL associado ao teor da isoflavona daidzina no grupo de ligação K, que explicou 28% desta característica. As marcas que mais explicaram as diferentes características avaliadas não foram alocadas no mapa de ligação e, estudos posteriores deverão ser conduzidos, visando aumentar o grau de saturação do mapa. Isto poderá permitir a identificação de QTLs para as diferentes características analisadas. / The soybean line BARC-8 and the commercial cultivar IAC-100 were used in this study in order to analyze the expression of the genes encoding the enzyme isoflavone syntase (IFS) in soybean, and to evaluate the accumulation of isoflavone during the seed filling in soy plants grown under two different temperatures, as well as to map and identify RAPD and microsatellite markers linked to the QTLs associated to the determination of the isoflavone contents in soybean. In the first experiment, the plants were grown under two temperature regimes: 33/22 and 28/13 o C - day/night. Six isoflavone forms were observed along the seed filling (daidzin, genistin, glycitin, malonildaidzin, malonilgenistin and malonilglycitin) in IAC-100 and BARC-8. The results of the variance analyses showed a significant variation in isoflavone content as a function of the genotype, temperature and the stage development, as well as an interaction among those three analyzed factors. A qualitative analysis of the accumulation kinetics of the isoflavone syntase RNA by the RT-PCR technique showed no relationship between isoflavone accumulation and the transcripts for IFS during seed filling. Further quantitative analysis should be conducted to determine the way IFS expression varies along the seed filling, and to verify if there is any influence of the temperature on its transcript accumulation. In the second experiment, a population of 93 F 2 plants were used. These plants were obtained from the crossing between BARC-8 and IAC-100, that are contrasting for the contents of daidzin, genistin, malonildaidzin, malonilgenistin, total isoflavones and protein. The isoflavone contents were determined by high performance liquid chromatography, and the protein content by the Kjeldahl method. The DNA of the plants was extracted and analyzed by RAPD and microsatellite markers. Twenty two linkage groups containing 82 markers in addition to 25 non-linked genetic markers were obtained. In the single marker analysis, thirteen markers explaining the variation in daidzin contents were identified. Among them, marker Satt318 explained 17.39% of the phenotypic variation. In the multiple regression analysis, markers Satt318, Satt232 and Satt518 together explained about 31.5%. Six markers explained the variation in genistin contents. From these, Satt318 explained 16.05% of the variation. In the multiple regression analysis, markers Satt318, Satt350, Satt127 and OPK20 together explained about 34%. A total of eleven markers for malonildaidzin were identified. Among those, Satt318 explained 16.13% of the variation. In the multiple regression analysis, the markers Satt318, Satt232, Satt417 and Satt197 together explained about 33%. Sixteen markers were found for malonilgenistin. From those, Satt318 explained 12.05% of the variation. In the multiple regression analysis, markers Satt318, Satt468, Satt495, Satt350, Satt127 and Satt499 together explained about 45%. Ten markers were identified for total isoflavone. From those, Satt318 explained 13.59% of the variation. In the multiple regression analysis, markers Satt318, Satt468 and OPAW04 together explained about 26%. Seven markers were identified for total protein. Among those, OPK20 explained 10.06%. In the multiple regression analysis, markers OPK20, SATT512, OPU02 and Satt398 together explained about 26% of the variation. In the interval composite mapping, just one QTL associated to daidzin content in linkage group K was identified, which explained 28% of the variation of this trait. The genetic markers which explained a higher amount of the variation of the different traits evaluated were not allocated in the linkage map. Further studies are needed, which should target the increase of the map saturation level. This will probably allow the identification of other QTLs for the different traits analyzed. / Tese importada do Alexandria