Las neuronas tanto in vivo como in vitro requieren factores neurotróficos para su supervivencia y diferenciación. En concreto, las motoneuronas(MNs) responden a diferentes factores neurotróficos, entre los que se encuentran la familia de ligandos del GDNF y la familia de las neurotrofinas. Estas células no sólo sobreviven en presencia de estos factores, sino que la propia actividad neuronal y por consiguiente la despolarización de membrana también promueve su supervivencia, incrementando los niveles de calcio intracelular ([Ca2+]i) y activando diferentes vías de señalización.En este trabajo se estudia el papel del calcio y la calmodulina (CaM) en la regulación de la vía de supervivencia PI3K/PKB, en un modelo de MNs deembrión de pollo tratadas con GDNF. Los resultados obtenidos demuestran que GDNF promueve incrementos moderados en la [Ca2+]i que pueden resultar en la activación de la CaM. El tratamiento con antagonistas de la CaM inhibe laactivación de la Pl3K y PKB in vitro, bloqueando la supervivencia inducida por GDNF. El mecanismo por el cual la CaM ejerce este efecto está pococaracterizado. Tanto la PI-3K como la PKB, proteína que actúa por debajo en la vía de señalización de la PI-3K, son importantes mediando la supervivencia por factores neurotróficos. De hecho, se ha demostrado que GDNF promueve lasupervivencia neuronal a través de la activación de esta vía. Experimentos de inmunoprecipitación demuestran una interacción in vitro entre la subunidad reguladora de la PI-3K y CaM. Esta interacción es independiente de factor neurotrófico, pero se bloquea con el tratamiento con quelantes de calcio como EGTA. De estos resultados se concluye que los cambios producidos en [Ca2+]i inducidos por GDNF, promueven la supervivencia neuronal a través de un mecanismo que implica una regulación directa de la PI-3K por la CaM.Como segundo objetivo de este estudio, analizamos el papel de la quinasa regulada por calcio/CaM la CaMKIV en la supervivencia neuronal. Tras el clonaje y la caracterización de la CaMKIV de pollo (gCaMKIV), demostramos que la forma constitutivamente activa de la gCaMKIV es capaz de fosforilar a PKB, lo que se traduce en la supervivencia de las MNs en ausencia de factoresneurotróficos. Por contra, el bloqueo de la expresión endógena de la gCaMKIV,utilizando RNAs de interferencia, reduce el porcentaje de supervivencia mediado por GDNF y por la despolarización de membrana. Experimentos deinmunoprecipitación han demostrado una interacción in vitro entre la subunidad p85 de la PI-3K y la CaMKIV.En conclusión, se describe por primera vez, como GDNF induce incrementos en [Ca2+]i, activando CaM, que se encuentra unida a la PI-3K. Además, CaMKIV se puede unir a CaM y juntas regular la vía PI-3K/PKB promoviendo la supervivencia. Estos resultados aportan parte de las claves moleculares que regulan la supervivencia de estas neuronas, pudiendo así aplicar estos conocimientos para la comprensión y las posibles estrategias terapeúticas relacionadas con las enfermedades donde hay una degeneración de las MNs. / Neurons require neurotrophic factors for their survival and differentiation both in vivo and in vitro. In particular, motoneurons respond to a series of neurotrophic factors such as the family of the neurotrophins and the Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) Family Ligands (GFLs). Moderate increases of intracellular calcium concentration induced by either the activation of tropomyosin receptor kinase (Trk) receptor for neurotrophins or by neuronal activity, regulate neuronal survival.In the present report we wanted to establish the role of calcium and calmodulin in the activation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-K) pathway by GDNF. Our results demonstrate that GDNF treatment promotes moderate increases of intracelullar calcium concentration by mobilizing this cation from internal stores, resulting in the activation of calmodulin.The effects of [Ca2+]i increase after membrane depolarization are mainly mediated by calmodulin (CaM). We show that CaM antagonists inhibit PI 3-kinase and PKB activation as well as motoneuron survival induced by GDNF. It has been reported that (PI 3-K) and its downstream target protein kinase B (PKB) play a central role in cell survival induced by neurotrophic factors; in fact,GDNF promotes neuronal survival through the activation of the PI 3-kinase/PKB pathway. We also demonstrate that endogenous calcium/CaM associates with the 85-kDa regulatory subunit of PI 3-kinase (p85). This interaction is neurotrophic factor-independent, but it can be abolished with calcium chelators like EGTA.The second part of this work is focused on the analysis of proteins activated by calcium. We wanted to analyze the role of calcium and calmodulinrelated kinase, CaMKIV in cultured motoneurons. This work allowed us to cloneand characterize the Gallus gallus CaMKIV (gCaMKIV). We further demonstrate that the active form of gCaMKIV is able to phosphorylate PKB in the absence of neurotrophic factors and this activation can be blocked by PI3-kinase inhibitors.In addition, the active form of gCaMKIV promotes motoneuron survival in the absence of neurotrophic factors. Moreover, reduction of endogenous levels of CaMKIV by RNA interference results in a decrease of motoneuron survivalinduced by GDNF. A physical interaction between CaMKIV and the PI3-kinase regulatory subunit has been demonstrated by pull-down experiments.In conclusion, this study demonstrates that GDNF is able to promote increases in intracellular calcium concentration that leads to the activation of calmodulin thus regulating PI3-kinase pathway through interaction with p85 subunit. Moreover, CaMKIV is able to interact with calmodulin proposing a suitable model of cooperative effects in the regulation of motoneuron survival pathways.Therefore, these results will contribute to the understanding of the molecular basis for the regulation of MNs survival, thus contributing to the knowledge for prevention of MNs associated neuropathologies.

Per al correcte desenvolupament del sistema nerviós cal una precisa coordinació entre la neurogènesi i la morfogènesi neuronal. L'exposició de les cèl·lules neurals progenitores a un seguit de senyals específiques de l´entorn, que regulen la seva proliferació i especificació, donarà lloc a les neurones. Les neurones recent formades comencen a extendre processos neuronals fins a formar una complexa estructura arborescent; durant aquesta etapa es formen les sinapsis entre els axons i les dendrites, i s'estableix una xarxa cerebral funcional. Entre els factors extracel·lulars que controlen aquests processos destaquem per la relació amb aquest treball els membres de la família Wnt, les Neurotrofines (NTs) i el Factor de Creixement Hepàtic (HGF).S'ha demostrat que els factors Wnt regulen la proliferació dels precursors neurals, la neurogènesi, la diferenciació terminal de neurones i la sinaptogènesi. La via de senyalització clàssica per Wnt implica l'estabilització de β-catenina citoplasmàtica i la regulació de la transcripció controlada pels factors de transcripció LEF/TCF. En aquesta tesi demostrem que la senyalització de Wnt-3a i Wnt-3 a través de la via de senyalització canònica regula la diferenciació neuronal (neurogènesi i neuritogènesi) dels precursors neurals de la medul·la espinal.NTs i HGF pertanyen a diferents famílies de factors de creixement, i senyalitzen a través de receptors tirosina quinasa (RTK), regulant supervivència i diferenciació neuronal. En aquest treball hem demostrat que la senyalització de NTs i HGF durant la regulació del creixement i la ramificació axonal en neurones postmitòtiques implica la fosforilació de β-catenina en tirosina. Les vies de senyalització de NTs i HGF fosforilen β-catenina en diferents residus (Y654 i Y142, respectivament). Es interessant la fosforilació de residus diferents, que dirigeixen β-catenina a diferents localitzacions subcel·lulars i activen diferents mecanismes (dependents o independents de TCF) durant la morfogènesi de l'axó.En resum, aquest treball remarca la importància de β-catenina, com a un component de la via de senyalització dependent de Wnt i de la via activada per factors de creixement/RTK, en el control de diferents aspectes de la diferenciació neuronal. / El correcto desarrollo del sistema nervioso requiere de una precisa coordinación de la neurogénesis y morfogénesis neuronal. La señalización por moléculas específicas del entorno regula la proliferación y especificación de precursores neurales, que se diferencian en neuronas. Durante su diferenciación, las neuronas extienden procesos neuríticos que se ramifican dando lugar a complejos arbóreos. Este paso da como resultado la formación de sinapsis entre axones y dendritas y el ensamblamiento de la red funcional cerebral. Entre los factores extracelulares que controlan estos procesos se encuentran los factores Wnts, las neurotrofinas (NTs) y el factor de crecimiento hepático (HGF), que son de especial interés para este trabajo.Está demostrado que los factores Wnt regulan la proliferación de precursores neuronales, la neurogénesis, la diferenciación terminal de la neurona y la sinaptogénesis. La vía de señalización clásica por Wnt implica la estabilización de β-catenina citoplásmica y la regulación de la transcripción por los factores de transcripción LEF/TCF. Aqui demostramos que la señalización por Wnt-3a y Wnt-3 a través de la via canónica/β-catenina regula la diferenciación neuronal (neurogénesis y neuritogénesis) de precursores neurales de la médula espinal.Las NTs y el HGF pertenecen a diferentes familias de factores de crecimiento que señalizan a través de receptores tirosina quinasa (RTK), siendo importantes reguladores de la supervivencia y la diferenciación neuronal. En este trabajo se demuestra la implicación de la fosforilación en tirosina de β-catenina desencadenada por la señalización por NTs y HGF durante la regulación del crecimiento y ramificación del axón en neuronas postmitóticas. La señalización por NTs y HGF induce la fosforilación de β-catenina en diferentes residuos (Y654 y Y142, respectivamente). Es importante esta diferencia en las tirosinas fosforiladas ya que dirige β-catenina a diferentes localizaciones subcelulares y resulta en la activación de diferentes mecanismos (dependientes e independientes de TCF) durante la morfogénesis del axón.En resumen, este trabajo destaca la importancia de β-catenina como un componente de señalización de las vías de Wnt y de los factores de crecimiento/RTK, en el control de distintos aspectos de la diferenciación neuronal. / Proper development of the nervous system requires a precise coordination of neurogenesis and neuronal morphogenesis. Neural progenitors, exposed to specific local environmental signals that regulate their proliferation and specification, give rise to neurons. Newborn neurons start extending neuronal processes that develop into a complex arbour. This step results in the formation of synapses, usually between axons and dendrites, and the assembly of functional brain networks. Among the extracellular factors that control these processes, Wnts, neurotrophins (NTs) and hepatocyte growth factor (HGF) are of special interes for this work.Wnts have been shown to regulate proliferation of neural precursors, neurogenesis, terminal neuronal differentiation and synaptogenesis. Classical Wnt signalling involves stabilization of cytoplasmic β-catenin and regulation of transcription by LEF/TCF transcription factors. Here we demonstrate that Wnt-3a and Wnt-3 signalling through the canonical/β-catenin pathway regulate neuronal differentiation (neurogenesis and neuritogenesis) of spinal cord neural precursors.NTs and HGF belong to different growth factor families signalling through receptor tyrosine kinase (RTK) that are important regulators of neuron survival and differentiation. In this work we show the involvement of β-catenin tyrosine phosphorylation downstream of NTs and HGF signalling during the regulation of axon outgrowth and branching in postmitotic neurons. NTs and HGF signalling phosphorylate β-catenin at different residues (Y654 and Y142, respectively). Interestingly, these differential tyrosine phosphorylations target β-catenin to distinct subcellular locations and activate different downstream mechanisms (TCF-independent and dependent) to regulate axon morphogenesis.Collectively, this work highlights the importance of β-catenin, as a signalling component of Wnt-dependent and growth factor/RTK pathways, in the control of different aspects of the neuronal differentiation.

El ferro és el metall de transició més important per als sistemes biològics. Al llarg de l'evolució, aquest metall s'ha convertit en un element essencial per a la cèl·lula. Això es deu al fet que posseeix una gran versatilitat com a catalitzador biològic, la qual cosa li ha permès formar part de processos biològics indispensables per a la vida. A més, se sap que l'adquisició d'aquest metall és un procés altament controlat. En cèl.lules eucariotes s'ha vist que la desregulació del metabolisme d'aquest metall està associada amb importants defectes que poden conduir, en última instància, a la pèrdua de la viabilitat cel·lular. En humans la sobrecàrrega de ferro s'ha associat a una varietat creixent de patologies, com per exemple, l’Ataxia de Friedreich. Aquesta malaltia és causada pel dèficit d'una proteïna anomenada frataxina. Nombrosos estudis relacionen a aquesta proteïna amb el metabolisme de ferro, ja que en diferents models s'ha vist que el seu dèficit provoca sobrecàrrega d'aquest metall i disminució de l'activitat dels enzims amb centres Fe-S. Aquesta disminució ha establert les bases per a què la majoria dels estudis la considerin essencial per a la biosíntesi d'aquests centres. No obstant això, la funció precisa d'aquesta proteïna es troba en discussió. Saccharomyces cerevisiae ha estat àmpliament utilitzat com a model d'estudi de la funció d'aquesta proteïna ja que posseeix un gen ortòleg anomenat YFH1 (Yeast frataxina homologue). Els resultats obtinguts en aquesta tesi, en què s'han analitzat mutants condicionals de YFH1, emfatitzen la implicació de Yfh1p en el metabolisme del ferro mitocondrial. L'activació del sistema d'alta afinitat d'adquisició de ferro és l'efecte primari de la depleció d'aquesta proteïna. Aquest fet constitueix una prova definitiva de la seva implicació en el metabolisme del ferro. No obstant això, l'anàlisi dels enzims amb centre Fe-S ha permès establir que aquesta activació no depèn del correcte funcionament d’aquest procés biosintètic mitocondrial, ja que la inactivació d'aquests enzims és posterior a l'activació del reguló de ferro. Per tant, la pèrdua d'activitat dels enzims Fe-S seria una conseqüència secundària d'un conjunt d'esdeveniments promoguts per la sobrecàrrega de ferro. Entre aquests esdeveniments destaca un increment del dany oxidatiu induït a les proteïnes (formació de carbonils), el qual seria el reflex d'un augment de l'estrès oxidatiu en l'interior de la mitocòndria. Aquest increment és el resultat de dos importants esdeveniments: i) l'augment del nivell de ferro a l’orgànul i ii) la pèrdua d'activitat de l'enzim antioxidant Mn-SOD. Es va trobar que aquesta pèrdua d'activitat era el resultat d'una baixa biodisponibilitat de manganès. A més es va observar que aquest baix contingut cel·lular de manganès era el resultat de la disminució de l’activitat del transportador Smf2p. Utilitzant el doble mutant yfh1aft1 es va aconseguir prevenir la disminució de l’activitat de l’esmentat transportador, la qual cosa va constituir la prova definitiva del rol de la sobrecàrrega de ferro en aquesta disminució. Es va trobar que la pèrdua de funció dels enzims dependents de centres Fe-S provoca una fallada en la capacitat respiratòria de la cèl·lula, la qual cosa condueix a una disminució del creixement. Una anàlisi de l'expressió gènica global (microarrays) va servir per a comprovar, una vegada més, l'activació de Aft1 i va demostrar que hi ha una resposta transcripcional del mutant davant la pèrdua de capacitat respiratòria. A més es va trobar que el factor de transcripció ADR1 podria tenir un paper clau en aquesta resposta. En resum, els resultats obtinguts permeten establir un jerarquia temporal entre els diferents esdeveniments que segueixen a la manca de YFH1. / El hierro es el metal de transición más importante para los sistemas biológicos. A lo largo de la evolución, este metal se ha convertido en un elemento esencial para la célula. Esto se debe a que posee una gran versatilidad como catalizador biológico, lo cual le ha permitido formar parte de procesos biológicos indispensables para la vida. Además, se sabe que la adquisición de este metal es un proceso altamente controlado. En células eucariotas se ha visto que la desregulación del metabolismo de este metal está asociada con importantes defectos que pueden conducir, en última instancia, a la pérdida de la viabilidad celular. En humanos la sobrecarga de hierro se ha asociado a una variedad cada vez mayor de patologías, como por ejemplo, la Ataxia de Friedreich. Dicha enfermedad es causada por el déficit de una proteína denominada frataxina. Numerosos estudios relacionan a esta proteína con el metabolismo de hierro, ya que en diferentes modelos se ha visto que su déficit provoca sobrecarga de este metal y disminución de la actividad de las enzimas con centros Fe-S. Esta disminución ha sentado las bases para que la mayoría de los estudios la consideren esencial para la biosíntesis de dichos centros. Sin embargo, la función precisa de esta proteína se encuentra en discusión. Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizado como modelo de estudio de la función de esta proteína ya que posee un gen ortólogo denominado YFH1 (Yeast frataxin homologue). Los resultados obtenidos en esta tesis, en la que se han empleado mutantes condicionales de YFH1, enfatizan la implicación de Yfh1p en el metabolismo del hierro mitocondrial. La activación del sistema de alta afinidad de adquisición de hierro es el efecto primario de la depleción de esta proteína. Este hecho, constituye una prueba definitiva de su implicación en el metabolismo del hierro. Sin embargo, el análisis de las enzimas con centro Fe-S ha permitido establecer que dicha activación no depende del correcto funcionamiento de este proceso biosintético mitocondrial, ya que la inactivación de estas enzimas ocurre posteriormente a la activación del regulón de hierro. Por ende, la pérdida de actividad de las enzimas Fe-S sería una consecuencia secundaria de un conjunto de eventos promovidos por la sobrecarga de hierro. Entre estos eventos destaca un incremento del daño oxidativo inducido a las proteínas (formación de carbonilos), el cual sería el reflejo de un aumento del estrés oxidativo en el interior de la mitocondria. Este incremento es el resultado de dos importantes eventos: i) el aumento del nivel de hierro en el organelo y ii) la pérdida de actividad de la enzima antioxidante Mn-SOD. Se encontró que esta pérdida de actividad era el resultado de una baja biodisponibilidad de manganeso. Además se observó que este bajo contenido celular de manganeso era el resultado de la down-regulación del transportador Smf2p. Utilizando el doble mutante yfh1aft1 se consiguió prevenir dicha down-regulación, lo cual constituyó la prueba definitiva del papel de la sobrecarga de hierro en dicha disminución. Se encontró que la pérdida de función de las enzimas Fe-S provocaba un fallo en la capacidad respiratoria de la célula, lo cual conduce a una disminución del crecimiento. Un análisis de la expresión génica global (microarrays) sirvió para comprobar, una vez más, la activación de AFT1 y demostró que existe una respuesta transcripcional del mutante frente a la pérdida de capacidad respiratoria. Además se encontró que el factor de transcripción ADR1 podría tener un papel clave en esta respuesta. En resumen, los resultados obtenidos permiten establecer un jerarquia temporal entre los distintos eventos que siguen a la falta de YFH1. / Iron is the most important transition metal for biological systems. This metal became an essential element for cell throughout the evolution. This fact is due to its versatility as a biological catalyst, which allowed it take part in essential biological processes. The uptake of this metal is a highly controlled process. In eukaryotic cells deregulation of the iron metabolism is associated with significant defects that can lead ultimately to the loss of cell viability. In humans iron overload has been associated with an increasing variety of diseases such as Friedreich's ataxia. This disease is caused by a deficiency in frataxin. Several studies link this protein to iron metabolism because its deficiency leads to iron overload. It has also described in different models that its deficit causes a decrease in the activity of Fe-S enzymes. Based on this observation, several authors consider frataxin essential for the biosynthesis of Fe-S centers. Nevertheless, the precise function of this protein remains unclear. Saccharomyces cerevisiae has been widely used as a model for studying the function of this protein. YFH1 (Yeast frataxin homologue) is the orthologue of this gene in yeast. The results obtained in this thesis using conditional YFH1 mutants emphasize the involvement of Yfh1p in mitochondrial iron metabolism. Activation of high affinity iron uptake system is a primary effect of Yfh1p depletion and constitutes a definitive probe of its implication in mitochondrial iron metabolism. Interestingly, the analysis of Fe-S enzymes established that the activation of the regulon it does not depend on the status of this mitochondrial biosynthetic pathway, since inactivation of this enzyme occurs long after the activation of the iron regulon. In fact, loss of Fe-S enzymes activity is a secondary consequence of a series of events promoted by iron overload. These events include an increase of oxidative damage to proteins (carbonylation), which would reflect an increase in oxidative stress conditions inside of mitochondria. This increase is the result of two major events: i) an increase in the level of iron in the organelle ii) the loss of the antioxidant enzyme Mn-SOD. It was found that this loss of activity was the result of low bioavailability of manganese. It was also observed that this low manganese content was due to the down-regulation of the Smf2p transporter. This down-regulation was prevented in yfh1aft1 double mutant. This was the definitive evidence that emphasized a key role for iron overload in this decrease. It was also found that decrease of Fe-S enzymes caused a failure in the respiratory capacity of the cell that lead to slow growth. A global gene expression analysis by microarrays further confirmed AFT1 activation and demonstrated that there is a yeast transcriptional response related to the loss of respiratory capacity. It was also found that the transcription factor ADR1 could play a central role in this response. In summary, the results obtained show a temporal order between the different events which follow the YFH1 deficiency. In summary, we have characterized in detail the biochemical events that are triggered by YHF1 depletion in order to identify the early events affected by the loss of this protein.

S. cerevisiae és un organisme unicel·lular on s'hi han descrit dos tipus d'envelliment, el cronològic i el replicatiu. L'envelliment cronològic es defineix com la capacitat d'un cultiu de mantenir la seva viabilitat al llarg del temps i s'utilitza com a model senzill d'estudi d'envelliment en teixits post-mitítics. L'envelliment replicatiu es defineix com el nombre de cèl·lules filles que una cèl·lula mare verge pot generar al llarg de la seva vida i es utilitzat com a model d'estudi de l'envelliment en teixits mitíticament actius.La teoria de l'estrés oxidatiu aplicada a l'envelliment proposa que les espèciesreactives de l'oxigen (ROS) provoquen un dany progressiu que afecta a DNA, lípids iproteïnes i que té com a resultat el deteriorament cel·lular que caracteritza l'envelliment. Entre les modificacions oxidatives que tenen lloc en proteïnes, la formació de grups carbonil és una de les més estudiades. Es tracta d'una alteració del'estructura química de tipus irreversible i s'ha descrit que la seva presència augmentaamb l'edat en diversos tipus cel·lulars. En aquest treball s'ha utilitzat una aproximacióproteímica per estudiar l'oxidació de les proteïnes del llevat durant l'envelliment. Coma marcador de dany oxidatiu s'ha utilitzat la formació de grups carbonil. Els resultatsindiquen un increment progressiu de dany oxidatiu durant l'envelliment cronològic i replicatiu. En ambdós casos, aquest dany és previngut per la restricció calòrica, l'única intervenció coneguda capaç d'augmentar la longevitat en tots els organismes estudiats. A més, s'han identificat les principals dianes d'oxidació proteica en ambdóstipus d'envelliment que corresponen a proteïnes de resistència a estrés i proteïnes delmetabolisme energètic. Per estudiar amb profunditat l'efecte del dany oxidatiu enl'envelliment s'han construït soques amb una còpia addicional de gens d'aquestes proteïnes, la qual cosa ha portat a identificar la soca 2xADH1 com més longeva.Adh1 és una alcohol deshidrogenasa que catalitza l'últim pas de la fermentació de la glucosa en llevat. En aquesta reacció la reducció de l'acetaldehid a etanol va ssociada a l'oxidació del NADH regenerant el coenzim NAD+. Sir2 és una histona desacetilasa dependent de NAD+ que juga un paper clau en la regulació de l'envelliment replicatiu del S. cerevisiae. Els resultats assenyalen que un augment de l'activitat Adh1 augmenta el rítio NAD+/NADH i l'activitat de Sir2 promovent l'increment de la longevitat replicativa. D'altra banda, l'augment d'expressió d'Adh1 genera un augment en la taxa de respiració mitocondrial i un augment de les ROS intracel·lulars que porta a la inducció de les defenses antioxidants. Aquest fet permetque la soca 2xADH1 sigui més resistent a un tractament amb H2O2 i presenti unamajor longevitat cronològica. Tant els fenòmens que incrementen la longevitat replicativa com la cronològica semblen estar connectats ja que s'ha vist que un tractament amb H2O2 indueix l'expressió de Sir2. A més, la deleció de SIR2 suprimeix les diferències de resistència a estrés. Aquestes dades fan pensar en una possible viad'inducció dels sistemes antioxidants on la proteïna nuclear Sir2 tingui un paper clau id'altra banda posa en evidència el fet que el manteniment de l'activitat d'enzims queparticipen en l'equilibri NAD+/NADH afectarà l'envelliment replicatiu i el cronològic. / S. cerevisiae es un organismo unicelular en el que se han descrito dos tipos de envejecimiento, el cronológico y el replicativo. El envejecimiento cronológico se define como la capacidad de un cultivo de mantener su viabilidad a lo largo del tiempo. Por sus características es utilizado como modelo de estudio sencillo del envejecimiento entejidos post-mitíticos. El envejecimiento replicativo se define como el número decélulas hijas que una célula madre virgen puede generar durante toda su vida. Por suscaracterísticas se utiliza como modelo de estudio del envejecimiento en tejidos mitíticamente activos.La teoría del estréss oxidativo aplicada al envejecimiento propone que las especiesreactivas del oxígeno (ROS) provocan un daño progresivo que afecta a DNA, lípidos yproteínas y que da como resultado el deterioro celular que caracteriza el envejecimiento. Entre las modificaciones oxidativas que tienen lugar en proteínas, la formación de grupo carbonilos es una de las más estudiadas. Se trata de una alteración de la estructura química de carácter irreversible y se ha descrito que su presencia aumenta con la edad en diferentes tipos celulares. En este trabajo se ha utilizado una aproximación proteímica para estudiar la oxidación de las proteínas en levadura durante el envejecimiento. Como marcador de daño oxidativo se ha utilizadola formación de grupos carbonilo. Los resultados indican un incremento progresivo del daño oxidativo durante el envejecimiento cronológico y replicativo. En los dos casos, este daño es evitado por la restricción calórica, la única intervención conocida capaz de aumentar la longevidad en todos los organismos estudiados. Además, en este estudio, se han identificado las principales dianas de oxidación proteica en los dos tipos de envejecimiento que se corresponden con proteínas de resistencia a estrés yproteínas del metabolismo energético. Para estudiar con profundidad el efecto deldaño oxidativo en el envejecimiento se han construido cepas con una copia adicionalde genes de estas proteínas. Esto ha permitido identificar a la cepa 2xADH1 como máslongeva.Adh1 es una alcohol deshidrogenasa que cataliza el último paso de la fermentación de la glucosa en levadura. En esta reacción la reducción del acetaldehído a etanol va asociada a la oxidación del NADH regenerando el coenzima NAD+. Sir2 es una histona deacetilasa dependiente de NAD+ que desempeña un papel importante en la regulación del envejecimiento replicativo de S. cerevisiae. Los resultados muestran que un aumento de la actividad Adh1 promueve un aumento del ratio NAD+/NADH yde la actividad de Sir2. Esto de traduce en una mayor longevidad replicativa en la cepa 2xADH1. Por otro lado, aumento de expresión de Adh1 genera un incremento de la tasa de respiración mitocondrial y una mayor producción de ROS que induce las defensas antioxidantes. Este hecho permite que la cepa 2xADH1 sea más resistente atratamiento con H2O2 y presente una mayor longevidad cronológica. Estos fenómenos que aumentan la longevidad replicativa y cronológica parecen estar conectados ya se ha visto que un tratamiento con H2O2 induce la expresión Sir2. Además, la deleción de SIR2 suprime las diferencias observadas en resistencia a estrés. Estos resultados hacen posible pensar en una posible vía de inducción de los sistemas antioxidantes donde la proteïna nuclear Sir2 juegue un papel clave. Además, en este trabajotambién se pone en evidencia el hecho que el mantenimiento de la actividad de enzimas que participen en el equilibrio NAD+/NADH afectará al envejecimiento replicativo y cronológico. / In the yeast S. cerevisiae two aging processes has been described, chronological and replicative lifespan. Chronological lifespan refers to the ability of stationary cultures to maintain viability over time and has been used as a valuable model to study aging in post-mitotic tissues. Replicative lifespan is described as the number of daughter cells produced by each dividing mother cell and has been used as a usefulmodel to study aging in mitotic tissues.The oxidative stress theory of aging states that reactive oxygen species (ROS) causes a progressive damage, afecting DNA, lipids and proteins, resulting in the functional decline that defines aging. Among the oxidative mofications afectingproteins, carbonylation is one of the most studied. This reaction has an irreversiblenature and a large number of studies have shown that protein carbonylation increaseswith age. In this study, a proteomic approach has been used to study protein oxidation in yeast aging and carbonyl formation was selected as a marker of oxidative stress. In both, replicative and chronological lifespan, an increase in protein oxidative damage has been observed when compared old with young cells. In addition, calorierestriction, the only know intervention in grade to increase longevity in all the organisms studied, resulted in a decreased oxidative damage during yeast aging.Furthermore, the main protein targets of oxidative stress have been identified and common targets between the two aging models include stress resistance proteins and enzymes involved in glucose metabolism. To analyse the effect of oxidative damage to proteins in the aging process, several strains carrying an additional copy of the gene from these proteins were constructed. This fact leads to identification of 2xADH1 as along-lived strain when compared to wild type.Adh1 is an alcohol dehydrogenase that catalyzes the conversion of acetaldehyde to ethanol in the last step of glycolisis. In this reaction, NADH is oxidazed to regenerate NAD+. In S. cerevisiae, Sir2 is a NAD+-dependent histone deacetylase that plays a key function in replicative lifespan. In the 2xADH1 strain an increase both in NAD+/NADHratio and Sir2 activity were observed when compared to wild type. This agrees withthe increased replicative lifespan observed. Moreover, Adh1 overexpression increasesmitochondrial respiration rate and ROS production. This leads to an induction of several antioxidant genes promoting higher oxidative stress resistance and an increase in chronological lifespan in 2xADH1 cells. Interestingly, this two facts leading to an increased replicative and chronological aging seem to be connected because a H2O2 treatment induces Sir2 expression. In addition, SIR2 deletion abrogates the observeddifferences between wild type and 2xADH1 cells in stress resistance. All these data suggest a possible stress resistance pathway where Sir2 participates actively. In summary, it may be suggested that maintaining the activity of enzymes participating in NAD+/NADH balancing will affect chronological and replicative lifespan.

El ferro juga un paper essencial en el metabolisme a causa de la seva gran versatilitat com a catalitzador biològic. La seva acumulació, però ha estat associada amb diverses condicions patològiques com per exemple l'Ataxia de Friedreich. Aquesta malaltia humana està causada per la disminució de l'expressió d'una proteïna mitocondrial anomenada frataxina. Un gran nombre d'estudis utilitzant diferents models, relacionen frataxina amb el metabolisme de ferro, ja que la seva deficiència provoca la sobrecàrrega d'aquest metall. La funció precisa de la proteïna és motiu de controvèrsia. La majoria d'investigadors la consideren necessària per a la biosíntesi dels centres Fe-S ja que en la seva absència les activitats d'enzims amb aquest tipus de centres es troben disminuïdes. Molts dels estudis realitzats a fi de conèixer la funció de frataxina han estat duts a terme en el llevat Saccharomyces cerevisiae, ja que frataxina i el seu homòleg en llevat, YFH1, són ortólegs.Com a punt de partida d'aquesta tesi, ens plantejàrem l'estudi del proteoma del mutant Δyfh1en llevat com a model de l'Ataxia de Friedreich. L'estratègia utilitzada es va basar en l'ús d'electroforesi bidimensional i posterior identificació de proteïnes diferencialment expressades en mutants Δyfh1 mitjançant empremta de masses peptídiques. Aquest anàlisi proteòmic, ens va revelar que les esmentades cèl·lules presenten un increment en la quantitat de proteïnes involucrades en la resposta a estrès oxidatiu. Entre els enzims induïts trobem a les superòxiddismutases 1 i 2, que, tanmateix, van mostrar menor activitat que la trobada a les cèl·lules control. En el cas de la superòxid dismutasa dependent de manganès (Mn-SOD), aquest fet paradoxal era degut a una deficiència en aquest metall, ja que al suplementar el medi de cultiu amb manganès, van ser restaurats tant el seu contingut cel·lular com l'activitat Mn-SOD. Les activitats enzimàtiques de quatre proteïnes que contenen centres Fe-S van ser analitzades, abans i després de la suplementació del medi de cultiu amb manganès. Les activitats de tres d'elles van ser restaurades, el que indica que frataxina no és essencial per a la biosíntesi de centres Fe-S. La quarta proteïna analitzada, aconitasa, no recuperava la seva activitat.El segon objectiu va ser realitzar l'anàlisi del dany oxidatiu a proteïnes -també referit com a oxiproteoma- de les cèl·lules deficients en YFH1. La toxicitat del ferro està relacionada amb la seva capacitat per generar espècies reactives de l'oxigen (ROS), les quals tenen el potencial de danyar els components cel·lulars. Mitjançant immunodetecció de grups carbonil identificàrem 14 proteïnes selectivament oxidades, la majoria de les quals presentaven unió a magnesi, ja sigui directament unit per elles, o per mitjà de nucleòtids units a les esmentades proteïnes. Estudis in vitro van mostrar que l'oxidació d'aquestes proteïnes pot ser previnguda per magnesi i incrementada per ATP. A més, el ferro quelable va mostrar ser set vegades superior a les cèl·lules de la soca Δyfh1 i la seva disminució mitjançant un agent quelant, va aconseguir prevenir la inactivació dels enzims magnesi- dependents. Una de les proteïnes oxidades era la superòxid dismutasa 1 dependent de CuZn (CuZn-SOD), la qual mostrava nivells elevats de proteïna però es trobava parcialment inactivada. La relació entre la baixa activitat SOD, l'elevat contingut en ferro quelable i l'oxidació de proteïnes va ser estudiat amb més detall. Mitjançant l'addició de coure i manganès al medi de cultiu, es va aconseguir prevenir el dany oxidatiu específic a les proteïnes així com la seva inactivació. Així mateix, el mutant deficient en SOD1 va presentar elevats nivells de ferro quelable i inactivació d'enzims d'unió a magnesi. Aquests fets en el seu conjunt indiquen que la falta d'activitat SOD seria la responsable que els alts nivells de ferro puguin produir dany oxidatiu a les proteïnes en les cèl·lules Δyfh1.Finalment, hem desenvolupat un model cel·lular humà d'Ataxia de Friedreich utilitzant la línia SH-SY5Y diferenciada a fenotip neuronal. Després de la depleció de frataxina en l'esmentat model mitjançant RNA d'interferència, trobem la inducció d'ambdues superòxid dismutasas i la disminució en l'activitat CuZn-SOD. Aquestes dades reforcen la hipòtesi de que les alteracions en l'activitat de les superòxid dismutases poden jugar un paper rellevant en el desenvolupament de l'Ataxia de Friedreich. / El hierro juega un papel esencial en el metabolismo debido a su gran versatilidad como catalizador biológico, sin embargo, su acumulación ha sido asociada con diversas condiciones patológicas como por ejemplo la Ataxia de Friedreich. Esta enfermedad humana está causada por la disminución de la expresión de una proteína mitocondrial denominada frataxina. Un gran número de estudios utilizando diferentes modelos, relacionan a frataxina con el metabolismo de hierro ya que su deficiencia provoca la sobrecarga de este metal. La función precisa de la proteína es motivo de controversia. La mayoría de investigadores la consideran necesaria para la biosíntesis de los centros Fe-S ya que en su ausencia las actividades de enzimas con centros Fe-S se encuentran disminuidas. Muchos de los estudios realizados con el fin de conocer la función de frataxina han sido llevados a cabo en la levadura Saccharomyces cerevisiae, ya que frataxina y su homólogo en levadura YFH1 son ortólogos.Como punto de partida de esta tesis, nos planteamos el estudio del proteoma del mutante Δyfh1 en levadura como modelo de la Ataxia de Friedreich. La estrategia utilizada se basó en el uso de electroforesis bidimensional y posterior identificación de proteínas diferencialmente expresadas en mutantes Δyfh1 mediante huella de masas peptídicas. Este análisis proteómico, nos reveló que dichas células presentan un incremento en la cantidad de proteínas involucradas en la respuesta a estrés oxidativo. Entre las enzimas inducidas encontramos a las superóxido dismutasas 1 y 2, las cuales, sin embargo, mostraron menor actividad que la encontrada en las células control. Para el caso de la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (Mn-SOD), este hecho paradójico era debido a una deficiencia en este metal, ya que al suplementar el medio de cultivo con manganeso, fueron restaurados tanto su contenido celular como la actividad Mn-SOD. Las actividades enzimáticas de cuatro proteínas que contienen centros Fe-S fueron analizadas, antes y después de la suplementación del medio de cultivo con manganeso. Las actividades de tres de ellas fueron restauradas, lo que indica que frataxina no és esencial para la biosíntesis de centros FeS. La cuarta proteína analizada, aconitasa, no recuperaba su actividad.El segundo objetivo fue realizar el análisis del daño oxidativo a proteínas -también referido como oxiproteoma- de las células deficientes en YFH1. La toxicidad del hierro está relacionada con su capacidad para generar especies reactivas del oxígeno (ROS), las cuales tienen el potencial para dañar los componentes celulares. Mediante inmunodetección de grupos carbonilo identificamos 14 proteínas selectivamente oxidadas, la mayoría de las cuales presentaban unión a magnesio, ya sea directamente unido por ellas, o por medio de nucleótidos unidos a dichas proteínas. Estudios in vitro mostraron que la oxidación de estas proteínas puede ser prevenida por magnesio e incrementada por ATP. Además, el hierro quelable mostró ser siete veces mayor en las células de la cepa Δyfh1 y su disminución mediante un agente quelante, logró prevenir la inactivación de las enzimas magnesio- dependientes. Una de las proteínas oxidadas fue la superóxido dismutasa 1 dependiente de CuZn (CuZn-SOD), la cual mostraba niveles elevados de proteína pero se encontraba parcialmente inactivada. La relación entre la baja actividad SOD, el elevado contenido en hierro quelable y la oxidación de proteínas fue estudiado con más detalle. Mediante la adición de cobre y manganeso al medio de cultivo, se logró prevenir el daño oxidativo específico a las proteínas así como su inactivación. Asimismo, el mutante deficiente en SOD1 presentó elevados niveles de hierro quelable e inactivación de enzimas de unión a magnesio. Estos hechos en su conjunto indican que la falta de actividad SOD sería la responsable de que los altos niveles de hierro puedan producir el daño oxidativo a las proteínas en las células Δyfh1.Por último, desarrollamos un modelo celular humano de ataxia de Friedreich utilizando la línea SH-SY5Y diferenciada a fenotipo neuronal. Tras la depleción de frataxina en dicho modelo mediante RNA de interferencia, encontramos la inducción de ambas superóxido dismutasas y la disminución en la actividad CuZn-SOD. Estos datos refuerzan la hipótesis de que las alteraciones en la actividad de las superóxido dismutasas pueden jugar un papel relevante en el desarrollo de la ataxia de Friedreich. / Iron plays an essential role in cellular metabolism due to its great versatility as a biologic catalyst. However, high tissue iron concentrations have been associated with several pathological conditions such as Friedreich Ataxia (FRDA). FRDA is caused by decreased expression of the mitochondrial protein frataxin. Many studies link frataxin to iron metabolism because its deficiency generates iron overload in different models. However, the precise function of this protein remains a matter of debate. Most researchers consider that Frataxin plays a role in iron-sulfur cluster biosynthesis because decreased activities of iron-sulfur containing proteins have been reported. Many studies in frataxin function arise from experiments performed with Saccharomyces cerevisiae, as frataxin and the yeast homologue Yfh1 are orthologues.In this work we analyzed the proteome of the yeast model of Friedreich Ataxia. The strategy used was based on the use of two-dimensional electrophoresis and subsequent identification of proteins differentially expressed in Δyfh1 cells by peptide mass fingerprinting. We found that these cells show an increased amount of proteins involved in the oxidative stress response, among them, Superoxide dismutase 1 and 2. However, these two enzymes showed decreased activity in Δyfh1 cells. In the case of superoxide dismutase manganese-dependent (Mn-SOD), this paradox was due to a deficiency in the cellular amount of manganese, because in cells grown in manganese-supplemented media, both Mn-SOD activity was restored. The activities of four Fe-S enzymes were analyzed for the effects of manganese supplementation.Enzyme activities were recovered by manganese treatment, except for aconitase, suggesting that frataxin is not essential for Fe-S clusters biosynthesis.We also analyzed oxidative damage to proteins in cells deficient in YFH1. Iron toxicity is related to its ability to trigger the generation of reactive oxygen species (ROS). These species are highly reactive and have the potential to damage cellular components. By carbonyl group inmunodetection we identified 14 proteins selectively oxidized, most of which showed binding sites to magnesium or nucleotides. In vitro studies showed that oxidation of these proteins can be prevented with magnesium, and increased by ATP. In addition, cheatable iron was found seven times increased in Δyfh1 cells. The use of a chelating agent, was able to prevent inactivation of magnesium dependent enzymes. Superoxide dismutase 1 (CuZn-SOD) was one of the oxidized proteins. This protein was partiality inactive. The relationship between low SOD activity, the high cheatable iron content and protein oxidation was studied in more detail. The addition of copper and manganese to the culture medium prevented both oxidative damage and inactivation of specific proteins. The mutant deficient in SOD1 showed high levels of chelatable iron and inactivation of magnesium-binding enzymes. These facts indicate that the absence of CuZn-SOD activity is the responsible for the high levels of chelatable iron that can cause oxidative damage to proteins in Δyfh1 cells.Finally, we developed a human cell model of Friedreich ataxia using the SH-SY5Y cell line differentiated to neuronal phenotype. Upon frataxin depletion in this model using interference RNA, we found induction of both superoxide dismutases and decreased CuZn-SOD activity.These data indicate that alterations in the activity of superoxide dismutases may play an important role in the development of Friedreich Ataxia.

El component principal del meu programa de investigació ha estat un anàlisi detallat, a nivell molecular i bioquímic de plantes de blat de moro que provenien de creuaments amb parentals de fons genètics diferents. Els parentals van ser millorats genèticament amb transgens que codificaven per a las rutes metabòliques dels carotenoids, cetocarotenoids i vitamina E. Vaig iniciar la meva recerca introduint una mini-ruta metabòlica carotenogènica en línies pures de blat de moro de color groc que contenien perfiles variats de carotenoids. El resultat va ser l’obtenció d’una col•lecció de blats de moro híbrids amb unes concentracions de carotenoids més elevades que els parentals originaris. Les anàlisis transcriptòmiques i metabòliques dels nous híbrids van mostrar limitacions en passos específics de les ramificacions ε i β de la ruta dels carotenoids. La conclusió més important va esser que aquestes plantes podrien contribuir cap una ràpida i efectiva producció d’híbrids amb un contingut divers i elevat de carotenoids. En un altre assaig de transformació vaig co-introduir els gens PDS1, HPT1, VTE3 i VTE4 d’Arabidopsis thaliana amb la intenció de recrear la ruta metabòlica de la vitamina E. Per a aprofundir en l’impacte específic de l’acumulació i interacció de la vitamina E amb la ruta metabòlica dels carotenoids, vaig introduir la mini-ruta metabòlica de la vitamina E en una línia de blat de moro transgènica que ja expressava Zmpsy1 i PacrtI. També vaig generar una nova línia de blat de moro (línia ZWB) co-expressant dos β-carotè cetolases (sBcrtW i sCbkt) i una β-carotè hidroxilasa (sBcrtZ). Aquesta línia només va acumular astaxantina, demostrant una conversió total dels carotenoids de la línia salvatge (utilitzada per a la transformació en aquest experiment) a cetocarotenoids. La introgressió de la ruta metabòlica dels cetocarotenoids de ZWB a una línia salvatge amb elevat contingut de β-carotè, va produir híbrids que, a més d’acumular astaxantina, també acumulessin altres carotenoids i cetocarotenoids intermediaris. Amb aquest treballs he demostrat que l’elecció d’un fons genètic que contingui una ruta metabòlica parcial influencia significativament la conversió dels carotenoids a molècules de passos posteriors en la ruta metabòlica, incloent l’astaxantina. Finalment vaig regenerar i analitzar línies de blat de moro que acumulaven pABA i pterina, precursors involucrats en la biosíntesis de folat. Els nivells d’aquest precursors en les línies obtingudes no van ser suficients per incrementar el contingut de folat en blat de moro. Vaig concloure que calia un pas addicional o alternatiu en la ruta metabòlica i/o en el metabolisme per assolir una acumulació significativa de folat en blat de moro. / El componente principal de mi programa de investigación ha sido un análisis detallado, a nivel molécular y bioquímico de plantas de maíz provenientes de cruces con parentales con fondos genéticos diferentes. Los parentales estaban mejorados genéticamente con transgenes que codificaban para las rutas metabólicas de los carotenoides, cetocarotenoides y vitamina E. Inicié mi investigación introduciendo una mini-ruta metabólica carotenogénica en diferentes líneas puras de maíz amarillo que contenían diferentes perfiles de carotenoides. El resultado de este experimento fue la obtención de una colección de maíces híbridos con elevadas cantidades de carotenoides, al compararlos con sus parentales correspondientes. Los análisis transcriptómicos y metabólicos de los nuevos maíces híbridos nos mostraron limitaciones en pasos específicos de las ramificaciones ε y β de la ruta de los carotenoides. La conclusión más importante fue que las plantas que generadas pueden contribuir hacia una rápida y efectiva producción de híbridos con elevado y diverso contenido de carotenoides. Hice un segundo experimento de transformación de maíz donde co-introduje los genes PDS1, HPT1, VTE3 y VTE4 provenientes de Arabidopsis thaliana con la intención de recrear la ruta metabólica de la vitamina E. Para profundizar en el impacto específico de la acumulación e interacción de vitamina E con la ruta metabólica de los carotenoides, introduje la mini-ruta metabólica de la vitamina E en una línea de maíz transgénica que ya expresaba Zmpsy1 y PacrtI. También generé una nueva línea de maíz (línea ZWB) co-expresando dos β-caroteno cetolasas (sBcrtW and sCbkt) y una β-caroteno hidroxilasa (sBcrtZ). Esta línea acumuló astaxantina como único carotenoide, demostrando una total conversión de los carotenoides de la línea salvaje utilizada para la transformación en este experimento a este cetocarotenoide. La introgresión a una línea salvaje con alto contenidos de β-caroteno de la ruta metabólica de los cetocarotenoides proveniente de ZWB, resultó en híbridos que además de acumular astaxantina, también acumulaban otros carotenoides y cetocarotenoides intermediarios. Mi trabajo demuestra que la elección de un fondo genético que contenga una ruta metabólica parcial influye significativamente en la conversión de los carotenoides a moléculas de pasos posteriores en la ruta metabolica, incluyendo astaxantina, en los híbridos. Finalmente regenere y analice líneas de maíz que acumulaban pABA y pterina, precursores involucrados en la biosíntesis de folato. Los niveles de estos precursores en las líneas transgénicas que regeneré no fueron suficientes para el incremento de folato en maíz. Mi conclusión fue que se requiere de un paso adicional o alternativo en la ruta metabólica y/o en el metabolismo para alcanzar una acumulación significativa de folato en maíz. / The major component of my research program focused on an in depth molecular and biochemical analysis of maize plants from different genetic backgrounds containing metabolic pathways introgressed from parents engineered with different transgenes representing the carotenoid, ketocarotenoid and vitamin E pathways. In the first instance I introgressed a carotenogenic mini-pathway into different yellow maize inbred lines having diverse carotenoid profiles. These experiments resulted in hybrids with higher amounts of carotenoids compared to their corresponding parents. Targeted transcriptomic and metabolite analysis revealed bottlenecks in sequential steps in the ε- and β-branches of the carotenoid pathway in the newly created hybrids. I discuss my results in terms of how plants I have generated might contribute towards a rapid and effective production of maize hybrids with high and diverse carotenoid content. I generated transgenic maize plants co-expressing Arabidopsis thaliana PDS1, HPT1, VTE3 and VTE4 genes in order to recreate the vitamin E biosynthetic pathway in maize. I then used a stacking strategy to introgress the vitamin E mini-pathway into a second transgenic maize line expressing Zmpsy1 and PacrtI in an attempt to determine the specific impact on metabolite accumulation and interaction of the vitamin E and the carotenoid biosynthetic pathways. I also generated a novel maize line (ZWB line) co-expressing two β-carotene ketolases (sBcrtW and sCbkt) and a β-carotene hydroxylase (sBcrtZ). This line accumulated astaxanthin as the only carotenoid, demonstrating total conversion of the carotenoid precursor pool in the wild type line used for the transformation experiment to this ketocarotenoid. Introgression of the ketocarotenoid biosynthetic pathway from ZWB into transgenic maize lines engineered previously with different carotenogenic genes and a wild type line accumulating high levels of β-carotene, resulted in hybrids which not only accumulated astaxanthin, but also other intermediate carotenoids and ketocarotenoids. My work demonstrates that choice of an appropriate genetic background containing a partial carotenoid pathway influences significantly carotenoid conversion to downstream molecules, including astaxanthin, in hybrids. I have also recovered and analyzed maize lines accumulating pABA and pterin, precursors involved in folate biosynthesis. The levels of these precursors in the transgenic lines I generated were not sufficient to enhance folate content in maize. I concluded that additional or alternative steps in the pathway and/or metabolism need to be engineered to achieve substantial folate accumulation in maize.

The establishment of functional neuronal connectivity starts during development and depends on neuronal migration and the correct positioning of newborn neurons which integrate into specific layers of the cortex. The fibronectin and leucine-rich family of transmembrane proteins (FLRT) have evolved as new regulators of several aspects during nervous system development, including neuronal migration. This work is focused on the study of in vivo FLRTs involvement in the tangential migration of interneurons. For this, we have analyzed nervous system specific knockout animals for FLRT2 and FLRT3, single mutants as well as the double mutants The simultaneous suppression of FLRT2 and FLRT3, resulted in the appearance of several defects related to interneuron migration. Finally, was addressed the intracellular mechanisms involved in FLRT function and was assessed the relationship between FLRT3 and the Rho GTPase Rnd3. The results suggest a possible functional interaction between FLRTs and Rnds in the central nervous system. / L’establiment de les connectivitats neuronals a l’escorça en desenvolupament depèn de la migració i del correcte posicionament de les noves neurones que integren específicament les diferents capes corticals. Les proteïnes transmembrana riques en fibronectina i leucina (FLRT) han estat identificades com a nous reguladors de diversos aspectes en el desenvolupament del sistema nerviós, incloent la migració neuronal. El present treball de tesi està centrat en l’estudi in vivo de la implicació dels FLRTs en la migració tangencial de les interneurones. Amb aquest propòsit, hem analitzat animals knockout de FLRT2 i FLRT3, específics de sistema nerviós, com a mutants simples i també, com a dobles mutants. La supressió simultània de FLRT2 i FLRT3, produeix diversos defectes relacionats amb la migració de les interneurones. Finalment, es van abordar els mecanismes intracel•lulars implicats en la funció de FLRT, descrivint la relació entre FLRT3 i RhoGTPase Rnd3. Això suggereix una interacció funcional entre els FLRTs i els Rnds en el sistema nerviós. / El establecimiento de las conectividad neuronal comienza durante el desarrollo y depende de la migración neuronal y del correcto posicionamiento de las nuevas neuronas, las cuales se integran dentro de capas específicas de la corteza. Las proteínas transmembrana ricas en fibronectina y leucina (FLRT) han evolucionado como nuevos reguladores de varios aspectos durante el desarrollo del sistema nervioso, incluyendo la migración neuronal. Este trabajo se centra en el estudio de la implicación in vivo de FLRTs en la migración tangencial de las interneuronas. Para ello, hemos analizado animales knockout (KO) específicos del sistema nervioso para FLRT2 y FLRT3, simples mutantes y dobles KOs (DKO). La supresión simultánea de FLRT2 y FLRT3, resultó en la aparición de varios defectos relacionados con la migración de las interneuronas. Por último, se abordaron los mecanismos intracelulares implicados en la función de FLRT y se evaluó la relación entre FLRT3 y Rho GTPase Rnd3. Los resultados sugieren una posible interacción funcional entre FLRTs y Rnds en este sistema.

Uno de los aspectos más sorprendentes del proceso de división celular es la capacidad de duplicar y transmitir los cromosomas a las células hijas con enorme precisión. Las proteínas SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) forman una familia de ATPasas esenciales durante los procesos de replicación, reparación y segregación de los cromosomas. En las células eucariotas hay tres complejos proteicos de tipo SMC: cohesina, condensina y Smc5/6. Este último es necesario para que los cromosomas estén bien resueltos en el momento de su segregación y, a diferencia de los otros dos complejos SMC, tiene una subunidad con actividad SUMO-ligasa, conocida como Mms21 o Nse2. La presencia de una SUMO-ligasa en el complejo sugiere que éste pueda tener funciones de señalización además de estructurales. Mms21 se une a los dominios coiled-coil de la proteína Smc5 y sumoila varias subunidades del complejo además del mismo Smc5. Curiosamente, Mms21 también participa en la sumoilación de varias subunidades en los complejos cohesina y condensina. Aunque la función SUMO-ligasa de Mms21 no es esencial para la viabilidad celular, sí lo es para el mantenimiento de la integridad genómica. Es por ello que conocer su mecanismo de activación es de gran importancia. En este trabajo proponemos que la actividad ATPasa del complejo Smc5/6 está mecanísticamente acoplada a la activación de la SUMO-ligasa Mms21. Por un lado mostramos que la ligasa Mms21 necesita unirse al complejo Smc5/6 para acceder a sus dianas. A través del estudio de distintos mutantes ATPasa, mostramos que la activación de la SUMO-ligasa requiere como mínimo la unión a ATP e interacción entre los dominios ATPasa de Smc5 y Smc6, pero no la hidrólisis de ATP. A pesar de que los dominios SUMO-ligasa y ATPasa se encuentran en zonas distantes en la molécula, las dos actividades se comunican a través de los dominios coiled-coil de Smc5. Además, la activación de Mms21 requiere la presencia de disrupciones evolutivamente conservadas en los dominios coiled-coil. Proponemos que estas disrupciones funcionarían a modo de articulaciones que permitirían los cambios conformacionales necesarios para activar la ligasa Mms21. La coordinación de estas dos funciones en un mismo complejo proteico es extremadamente útil para la célula y la estabilidad de su genoma, ya que permite integrar un papel estructural en la cromatina, dependiente de la actividad ATPasa, con una función de señalización a través de SUMO, promoviendo así la correcta reparación y segregación de los cromosomas. Finalmente, en este estudio hemos diseccionado la región del coiled-coil donde recae la sumoilación de Smc5, con el fin de generar mutantes no sumoilables y analizar su función. Nuestros resultados indican que la sumoilación de Smc5 es prescindible para la reparación de daño en DNA durante la replicación del genoma; sin embargo, sí parece ser necesaria en condiciones de acumulación de intermediarios de recombinación, lo cual sugiere la participación de la sumoilación de Smc5 en el metabolismo de este tipo de estructuras. / Un dels aspectes més sorprenents del procés de divisió cel·lular és la capacitat de duplicar i transmetre els cromosomes a les cèl·lules filles amb una precisió enorme. Les proteïnes SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) formen una família d’ATPases essencials durant els processos de replicació, reparació i segregació dels cromosomes. En les cèl·lules eucariotes hi ha tres complexos proteics de tipus SMC: cohesina, condensina i Smc5/6. Aquest últim és necessari per a què els cromosomes estiguin ben resolts en el moment de la seva segregació i, a diferència dels altres dos complexos SMC té una subunitat amb activitat sumo-lligasa, coneguda com Mms21 o Nse2. La presència d'una sumo-lligasa en el complex suggereix que aquest pugui tenir funcions de senyalització a més d'estructurals. Mms21 s'uneix als dominis coiled-coil de la proteïna Smc5 i sumoila diverses subunitats del complex a més del mateix Smc5. Curiosament, Mms21 també participa en la sumoilació de diverses subunitats en els complexos cohesina i condensina. Tot i que la funció sumo-lligasa de Mms21 no és essencial per a la viabilitat cel·lular, sí que ho és per al manteniment de la integritat genòmica. És per això que conèixer el seu mecanisme d'activació és de gran importància. En aquest treball proposem que l'activitat ATPasa del complex Smc5/6 està mecanísticament acoblat a l'activació de la sumo-lligasa Mms21. D'una banda mostrem que la lligasa Mms21 necessita unir-se al complex Smc5/6 per accedir a les seves dianes. A través de l'estudi de diferents mutants ATPasa, mostrem que l'activació de la sumo-lligasa requereix com a mínim la unió a ATP i interacció entre els dominis ATPasa de Smc5 i Smc6, però no la hidròlisi d'ATP. Tot i que els dominis sumo-lligasa i ATPasa es troben en zones distants en la molècula, les dues activitats es comuniquen a través dels dominis coiled-coil de Smc5. A més, l'activació de Mms21 requereix la presència de disrupcions evolutivament conservades en els dominis coiled-coil. Proposem que aquestes disrupcions funcionarien a mode d'articulacions que permetrien els canvis conformacionals necessaris per activar la lligasa Mms21. La coordinació d'aquestes dues funcions en un mateix complex proteic és extremadament útil per a la cèl·lula i l'estabilitat del seu genoma, ja que permet integrar un paper estructural en la cromatina, dependent de l'activitat ATPasa, amb una funció senyalitzadora a través de SUMO, promovent així la correcta reparació i segregació dels cromosomes. Finalment, en aquest estudi hem disseccionat la regió del coiled-coil on recau la sumoilació de Smc5, per tal de generar mutants no sumoilables i analitzar la seva funció. Els nostres resultats indiquen que la sumoilació de Smc5 no és essencial per a la reparació de dany a DNA durant la replicació del genoma; no obstant això, sí que sembla ser necessària en condicions d'acumulació d'intermediaris de recombinació, la qual cosa suggereix la participació de la sumoilació de Smc5 en el metabolisme d'aquest tipus d'estructures. / One of the most surprising aspects of cell division is the ability to duplicate and transmit chromosomes to daughter cells with great precision. SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) proteins are a family of essential ATPases required for the replication, repair and segregation of chromosomes. In eukaryotic cells there are three different SMC complexes: cohesin, condensin and Smc5/6. The latter is necessary for proper resolution of chromosomes at the time of segregation, and unlike the other two SMC complexes, has a subunit with SUMO ligase activity, known as Mms21 or Nse2. The presence of a SUMO ligase in the complex suggests that it may have signaling roles besides its structural functions. Mms21 binds to the coiled-coil domain of the Smc5 protein and sumoylates Smc5 and other subunits in Smc5/6. Interestingly, Mms21 also participates in sumoylation of several subunits in the cohesin and condensin complexes. Although the SUMO ligase function in Mms21 is not essential for cell viability, it is required for the maintenance of genomic integrity. Therefore, understanding how the mechanisms that trigger its activation are of great importance. In this work we propose that the ATPase activity of the Smc5/6 complex is mechanistically coupled to the activation of the Mms21 SUMO ligase. On the one hand we show that the Mms21 ligase needs to bind to the Smc5/6 complex to access its targets. Through the study of various ATPase mutants, we further show that activation of the SUMO ligase requires ATP binding to Smc5 and engagement of Smc5 and Smc6 ATPase heads, but not ATP hydrolysis. Although the SUMO ligase and ATPase domains are located in different regions of the Smc5/6 molecule, the two activities are communicated through the coiled-coil domains of Smc5. Furthermore, activation of the SUMO ligase requires the presence of evolutionarily conserved disruptions in the coiled-coil domains. We propose that these disruptions operate as joints that allow the conformational changes necessary to activate the Mms21 ligase. The coordination of these two functions in the same protein complex is extremely useful for the genome stability as it allows integrating a structural role on chromatin, dependent on the ATPase activity, with a signaling function through SUMO, thus enhancing the correct disjunction and segregation of chromosome. Finally, in this study we have dissected the coiled-coil region in the Smc5 molecule that is targeted by SUMO, and we have generated unsumoylatable mutants to study the role of Smc5 sumoylation. Our results indicate that sumoylation of Smc5 is not required for the repair of damage during DNA replication; however, Smc5 sumoylation becomes critical under conditions that trigger accumulation of unresolved recombination intermediates, suggesting the participation of Smc5 modification in the metabolism of these type of structures.

Orientador: Renato Eugênio da Silva Diniz / Banca: Ana Maria de Andrade Caldeira / Banca: Denise de Freitas / Resumo: A presente dissertação teve como propósito investigar como os professores de Biologia compreendem, organizam e ensinam a Sistemática e a Taxonomia Biológica na disciplina de Biologia da rede estadual no município de São Carlos - SP. Para tanto, partimos da hipótese que os conteúdos de Biologia são trabalhados de modo memorístico e fragmentado e que o ensino dos conteúdos trazidos pela Sistemática e Taxonomia durante os anos do Ensino Médio podem ser norteadores e necessários para que haja a contextualização e compreensão das demais áreas que a Biologia contempla, entre elas a Zoologia, a Botânica, Evolução e de todo o conhecimento biológico. Desse modo, o objetivo geral desta pesquisa é verificar como se dá a organização, o entendimento e o trabalho em sala de aula, referentes ao ensino de Sistemática e de Taxonomia, a partir da perspectiva de professores efetivos da rede estadual de ensino do município de São Carlos, interior do estado de São Paulo. No que se diz respeito aos capítulos teóricos deste estudo, buscou-se tecer algumas considerações acerca do histórico da Sistemática e Taxonomia Biológica como áreas que trazem conteúdos e temas que são considerados como saberes clássicos. Além disso, uma discussão sobre alguns aspectos relevantes do ensino de Biologia e do ensino de Sistemática e Taxonomia durante os anos que compreendem o Ensino Médio também foram executadas, bem como um breve levantamento sobre as pesquisas que estão ocorrendo em relação ao ensino das áreas es... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This thesis aims to investigate how the biology teachers understand, organize and teach Systematic and Biological taxonomy in biology courses of the state in São Carlos - SP. The starting point was the hypothesis that the Biology contents are worked memoristic and piecemeal and that the teaching of content brought by Systematics and Taxonomy during the years of high school can be guiding and necessary for there to contextualization and understanding of other areas that includes biology, including Zoology, Botany, Evolution and all the biological knowledge. Thus, the objective of this research is to see how is the organization, understanding and work in the classroom for the teaching of Systematics and Taxonomy, from the perspective of effective teachers teaching of the state of the city of San Carlos, upstate São Paulo. As regards the theoretical chapters of this study, we attempted to make a few remarks about the history of Systematic and Biological Taxonomy as areas that bring content and themes that are regarded as classics knowledge. In addition, a discussion of some relevant aspects of teaching Biology and Systematics of education and Taxonomy for years to understand the high school were also performed, as well as a brief survey of the research taking place in relation to the teaching of the areas studied this dissertation. To this end, this qualitative research, with the participation of fifteen effective teachers of Biology, who first answered a questionnaire that incl... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A ativação dos fagócitos é crítica para a defesa contra vários patógenos, por isso a importância de estudos que desenvolvam alternativas para a ativação dessas células. Nosso estudo visou investigar os efeitos do BAY 41-2272 na ativação de fagócitos. Para este propósito avaliamos a fagocitose, liberação de superóxido e atividade microbicida. Foram usados PBMC, neutrófilos e a linhagem celular THP-1, cultivadas na presença ou ausência de BAY 41-2272 (1mM ou 3mM) por 1h ou 48h a 37°C. A liberação de superóxido foi avaliada pelo ensaio da redução do citocromo c inibido especificamente pela superóxido dismutase; a fagocitose foi analisada através da co-cultura com partículas de Zymosan e contagem das células com partículas englobadas; e a atividade microbicida foi mensurada por meio da co-cultura com E. coli enteropatogênica seguida pela contagem das CFU formadas pelas bactérias recuperadas dos fagócitos. Além disso, fizemos a dosagem de IL-12, IFN-g e TNF-a e a análise da expressão gênica do gene CYBB. Todos os tipos celulares responderam aos tratamentos. Os PBMC, neutrófilos e THP-1 tratados com BAY 41-2272 produziram significativamente mais superóxido (cerca de 50% mais), e apresentaram significativamente maior atividade fagocítica (cerca de 54% mais), microbicida (cerca do dobro) comparados ao grupo controle não tratado, além de produzir TNFa. Ainda, o tratamento com o fármaco aumentou a expressão do gene da gp91phox nas THP-1 e PBMC. BAY 41-2272, especialmente na dose de 3mM, mostrou um grande potencial na ativação dos fagócitos em vários aspectos. Este potencial pode ser explorado na busca por novas terapias destinadas ao controle de infecções, principalmente no caso das imunodeficiências. / Phagocyte activation is critical role for host defense against several pathogens, so that studies developing alternatives for activating these cell are very important. We investigated the effects of BAY 41-2272 on phagocytes activation. For this purpose we evaluated several aspects indicating cellular activation, as phagocytosis, superoxide release and microbicidal activity. We used PBMC, neutrophils and THP-1 cell lineage cultured or not with BAY 41-2272 (1mM and 3mM) for 1h or 48h at 37°C. Superoxide release was tested by superoxide dismutase-inhibitable cytochrome c reduction assay; phagocytosis was evaluated through co-culture with zymosan particles and counting of ingested particles; and microbicidal activity was measured through co-incubation with enteropathogenic E. coli followed by counting of CFU from recovered bacteria from phagocytes. We analyzed the IL-12, IFN-g and TNF-a cytokine production and gp91phox gene expression. All cell types showed a response to treatments. PBMC, PMN and THP-1 treated with BAY 41-2272 produced significantly more superoxide (about 50% more), and presented significantly more phagocytic (about 54% more), microbicidal (about twice) activity than control group and production more TNF-a than control group. The expression of CYBB gene was more expressed on treated cells than control. BAY 41-2272, especially at 3mM, showed a great potential in activation of phagocytes in several aspects. This potential should be investigated at the light of new therapies seeking infection control, mainly in immunodeficiency.