La MTHFR y la MTRR,enzimas dependientes de la riboflavina,participan en el metabolismo de la homocisteína. Sus substratos, elfolato y la cobalamina respectivamente, se asocian inversamente con la homocisteínemia (tHcy).El estado en riboflavina también podría afectar tHcy. Investigamos cómo losestados en riboflavina,folato y cobalamina afectan a la asociación entre los polimorfismosMTHFR 677 C>T,MTRR 66 A>G y MTRR 524 C>T y tHcyen una población adulta y en gestantes. El estado en riboflavina se asocia inversamente con tHcyen homocigotos mutantes paraMTHFR 677 TT, independientemente del estado en folato. Un estado alto en riboflavina se asocia positivamente con tHcyen los portadores del alelo mutante del polimorfismo MTRR 66 A>G peroinversamenteen losMTRR 524 C>T, cuando el estado en cobalamina es bajo. En gestantes, un estado alto en riboflavina y bajo en cobalamina se asocia positivamente con tHcy en ambos polimorfismos de MTRR. / MTHFR and MTRR, riboflavin dependent enzymes, participate in homocysteine metabolism. Their substrates,folate and cobalamin, respectively, are inversely associated with fasting plasma homocysteine (tHcy). Riboflavin status may also affect tHcy. We investigated whether riboflavin, folate and cobalamin status affect the association between the MTHFR 677 C>T, MTRR 66 A>G orMTRR 524 C>T polymorphisms and tHcy in an adult population and in pregnant women. Riboflavin status was inversely associated with tHcy in the presence of the MTHFR 677 TT genotype, independently of folate status. High riboflavin status was positively associated with tHcy in carriers of the MTRR 66 A>Gmutant allele but inversely associated with tHcy in MTRR 524 C>T mutant allele carriers when cobalamin status was low. High riboflavin combined with low cobalamin status was positively associated with tHcy in pregnant carriers of mutant alleles for either of the latter polymorphisms.

L’atàxia de Friedreich és una malaltia rara neurodegenerativa causada pel dèficit d’una proteïna mitocondrial anomenada frataxina. La miocardiopatia és freqüent en els pacients i sol ser la principal causa de mort. Actualment no existeix cap model cel•lular cardíac per estudiar la patofisiologia en aquestes cèl•lules. És per això que hem desenvolupat un model utilitzant miòcits ventriculars de rates neonatals i RNA d’interferència. Utilitzant aquest model hem observat que el dèficit de frataxina en aquestes cèl•lules causa una alteració de la xarxa mitocondrial i estrès oxidatiu. A més, els miòcits cardíacs pateixen un canvi en el perfil metabòlic i acumulen una gran quantitat d’àcids grassos en gotes lipídiques. Aquest model ens permetrà en un futur estudiar els mecanismes de la malaltia cardíaca a l’atàxia de Friedreich, descobrir nous biomarcadors i provar possibles tractaments. / La ataxia de Friedreich es una enfermedad rara neurodegenerativa causada por el déficit de una proteína mitocondrial denominada frataxina. La miocardiopatía es frecuente en los pacientes y suele ser la principal causa de muerte. Actualmente no existe ningún modelo celular cardíaco para estudiar la patofisiología en estas células. Es por ello que hemos desarrollado un modelo utilizando miocitos ventriculares de ratas neonatales y RNA de interferencia. Utilizando este modelo hemos observado que el déficit de frataxina en estas células causa una alteración de la red mitocondrial y estrés oxidativo. Además, los miocitos cardíacos sufren un cambio en el perfil metabólico y acumulan una gran cantidad de ácidos grasos en gotas lipídicas. Este modelo nos permitirá en un futuro estudiar los mecanismos de la enfermedad cardíaca en la ataxia de Friedreich, descubrir nuevos biomarcadores y probar posibles tratamientos. / Friedreich's ataxia is a neurodegenerative rare disease caused by a deficiency of the mitochondrial protein frataxin. Cardiomyopathy is frequent in patients and is usually the main cause of death. Currently there is no cardiac cell model to study the pathophysiology in these cells. Under these circumstances we have developed a model using neonatal rat ventricular myocytes and RNA interference. Frataxin deficiency in these cells causes an alteration of the mitochondrial network and oxidative stress. Furthermore, cardiac myocytes undergo a change in the metabolic profile and accumulate large amounts of fatty acids in lipid droplets. This model will favor the study of the mechanisms of cardiac disease in Friedreich ataxia, discover new biomarkers and test potential treatments.

β-catenin is a multifunctional protein, key component of adherent junctions and effector of the Wnt canonical pathway, was recently implicated in centrosomal functions. In the canonical Wnt pathway, when Wnt is present in the system, β-catenin escapes degradation, accumulates in the cytosol and translocates to the nucleus where, together with T-cell Factor (TCF) transcription factors, it regulates transcription of Wnt targets. Switching from adhesive to signaling functions (independent of Wnt) is achieved in part through phosphorylation of β-catenin at Tyr142 that promotes detachment of β-catenin from the adhesion complex and promotes migration by transcriptional regulation of target genes. Met receptor tyrosine kinase (the receptor for Hepatocyte Growth Factor (HGF)), is one of the kinases regulating β-catenin phosphoryation at Tyr142 during cell migration and axon outgrowth stimulated by HGF. On the other hand, β-catenin phosphorylation at Ser/Thr regulates β-catenin degradation and has been demonstrated to affect centrosomal cohesion/separation and spindle formation. Here we focus on PhosphoTyrosine142 β-catenin (PTyr142 β-cat) signaling. First, we demonstrate that chemokines of CC and CXC families promote axon outgrowth. Furthermore, chemokine signaling acts downstream to HGF/Met/β-catenin/TCF signaling to regulate axon morphogenesis in developing hippocampal neurons. We also show that CXCL2 promotes axon branching and is involved in sensory axon outgrowth from dorsal root ganglia. In the second part of the work, we find for the first time that phosphorylated Tyr142 β-catenin localizes to centrosomes in primary astrocytes and glioma cells, and that centrosomal levels drop in mitosis. We also demonstrate the novel centrosomal localization of Met phosphorylated at Tyr1234/35. Aiming at identifying which is the kinase(s) regulating centrosomal PTyr142 β-cat, we show that a Met inhibitor does not affect it. However, an inhibitor of Spleen Tyrosine Kinase (Syk) decreases centrosomal PTyr142 β-cat, suggesting that Syk regulates the phosphorylation of Tyr142 β-catenin at centrosome. In addition, β-catenin is involved in the correct positioning of centrosomes during astrocyte migration and phosphorylation of β-catenin at Tyr142 is needed for HGF-stimulated cell migration. Collectively, this work demonstrates the multiple roles of PTyr142 β-cat signaling, influencing axon morphogenesis (via regulation of chemokines expression) as well as centrosomal functions, cell polarity and migration. / β-catenina es una proteína multifuncional, componente clave de las uniones adherentes y efector de la vía canónica Wnt, recientemente implicada en funciones centrosomales. En la señalización por Wnt, cuando Wnt está presente, β-catenina se acumula en el citosol y transloca al núcleo donde, junto con factores TCF, regula la transcripción de genes diana. La interelación entre funciones adhesivas y señalizadoras (independientes de Wnt) de β-catenina se logra, en parte, a través de la fosforilación de β-catenina en Tyr142, que promueve la desunión de β-catenina del complejo de adhesión y la migración a través de la regulación transcripcional. El receptor tirosina quinasa Met (receptor del Factor de Crecimiento Hepático (HGF)) induce la fosforilación de β-catenina en Tyr142 durante la migración y el crecimiento axonal estimulados por HGF. Por otra parte, la fosforilación de β-catenina en Ser/Thr regula la degradación de β-catenina y afecta a la cohesión/separación de los centrosomas y la formación del huso mitótico. Aquí nos centramos en la señalización por β-catenina fosforilada en Tyr142. En primer lugar, demostramos que quimiocinas de las familias CC y CXC promueven el crecimiento axonal y que las quimiocinas actúan en la señalización inducida por HGF/Met/β-catenina/TCF durante la morfogénesis del axón. También mostramos que CXCL2 promueve la ramificación del axón en neuronas hipocampales y el crecimiento de axones sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal. En segundo lugar, demostramos que β-catenina fosforilada en Tyr142 localiza en centrosomas en astrocitos primarios y células de glioma, y que estos niveles centrosomales disminuyen durante la mitosis. También mostramos la localización centrosomal de Met activo. Con objeto de identificar cual es la quinasa que regula la fosforilación de Tyr142 β-catenina en el centrosoma, mostramos que un inhibidor de Syk disminuye los niveles centrosomales de esta forma de β-catenina, lo que sugiere que Syk fosforila β-catenina en Tyr142 en el centrosoma. Además, β-catenina está implicada en el posicionamiento del centrosoma durante la migración de astrocitos y la fosforilación de β-catenina en Tyr142 es necesaria en la migración celular estimulada por HGF. En conjunto, este trabajo ilustra las múltiples funciones señalizadoras de β-catenina fosforilada en Tyr142 en la morfogénesis del axón (a través de la expresión de quimiocinas), así como en funciones centrosomales y en polaridad celular y migración. / β-catenina és una proteïna multifuncional, component clau de les unions adherents i efector de la via canònica Wnt, recentment implicada en funcions centrosomals. En la senyalització per Wnt, quan Wnt està present β-catenina s'acumula en el citosol i transloca al nucli on, juntament amb factors TCF, regula la transcripció de gens diana. La interrelació entre funcions adhesives i funcions senyalitzadores (independents de Wnt) de β-catenina s'aconsegueix en part a través de la fosforilació de β-catenina en Tyr142, que promou la desunió de β-catenina del complex d'adhesió i la migració mitjançant la regulació transcripcional. El receptor tirosina quinasa Met (receptor del Factor de Creixement Hepàtic (HGF)) regula la fosforilació de β-catenina en Tyr142 durant la migració cel · lular i el creixement axonal estimulat per HGF. D'altra banda, la fosforilació de β-catenina en Ser/Thr regula la degradació de β-catenina i afecta la cohesió/separació centrosomal i la formació del fus mitòtic. Aquí ens centrem en la senyalització per β-catenina fosforilada en Tyr142. En primer lloc, demostrem que quimiocines de les famílies CC i CXC promouen el creixement axonal i que la senyalització per quimiocines és necessària en la senyalització induïda per HGF/Met/β-catenina/TCF durant la morfogènesi axonal en neurones de l'hipocamp. També mostrem que CXCL2 promou la ramificació de l'axó i que aquesta quimiocina està involucrada en el creixement d'axons sensorials dels ganglis de l'arrel dorsal. A la segona part, demostrem que β-catenina fosforilada en Tyr142 es localitza en els centrosomes en astròcits primaris i cèl · lules de glioma, i que els seus nivells centrosomals disminueixen durant la mitosi. A més, demostrem la localització centrosomal de Met actiu. Amb l'objectiu d'identificar quina és la quinasa que regula els nivells centrosomals de fosfo-Tyr142 β-catenina, mostrem que un inhibidor de Syk disminueix els nivells centrosomals de fosfo-Tyr142 β-catenina, el que suggereix que Syk fosforila β-catenina en Tyr142 al centrosoma. A més, β-catenina està implicada en el posicionament del centrosoma durant la migració d'astròcits i la fosforilació de β-catenina en Tyr142 és necessària en la migració cel.lular estimulada per HGF. En conjunt, aquest treball demostra les múltiples funcions senyalitzadores de β-catenina fosforilada en Tyr142, en la morfogènesi de l'axó (a través de la regulació de l'expressió de quimiocines), així com en funcions centrosomals i en polaritat cellular i migració.

The project entitled "Sequential and structural determinants of protein aggregation" aims to study the factors that control protein deposition but also tries to develop new strategies to facilitate its comprehension. Protein aggregation is related with an increasing number of human disorders such as Alzheimer's disease, Parkinson disease or type II diabetes. Understanding the determinants that modulate the deposition process is a necessary step to develop new strategies to tackle these debilitating pathologies. Additionally, the accumulation of heterologous protein as intracellular aggregates during recombinant expression represents one of the main problems in down stream processing. Accordingly, understanding the factors behind the production of recombinant protein might lead to new avenues to increase the solubility and functionality of recombinant proteins. During the development of the present thesis we have used a wide range of techniques to analyse protein aggregation process in three different frameworks: in vitro, in vivo and in silico. The depositional properties of polypeptides differing in structure, sequence, and function were studied. The data obtained reveal the importance of the intrinsic polypeptide chain properties to protein aggregation and reveal the general rules controlling polypeptide deposition. This information permitted the development of an algorithm able to locate key depositional regions and calculate the global aggregation propensity of a protein starting from their amino acid sequence. This tool can be used for the analysis of the aggregation properties of large protein sets as show here for cytosolic bacterial proteins. Overall, the results collected in the present thesis could be valuable for biomedicine area suggesting new therapeutic targets to fight against depositional diseases as well as new approaches to increase the protein quality during protein production. It is also shown that folding and aggregation turn two be two side of the same coin that compete with each other.

Primera, estudiar los efectos de un extracto de cacahuete rico en polifenoles y de compuestos bioactivos (alfa-tocoferol) en modelos celulares a nivel de inflamación (células monocíticas THP-1) y disfunción endotelial (células endoteliales de aorta humana; HAEC), respectivamente. Segunda, optimizar el volumen sanguíneo caracterizando el perfil de metabolitos acuosos y lipídicos, la composición de ácidos grasos, la detección de subclases de lipoproteínas y de polifenoles en plasma y glóbulos rojos. El extracto de cacahuete ejerce efectos anti-inflamatorios mediante la inhibición de la proteína del TNF-α extracelular, a través de la inhibición de la activación del factor de transcripción c-Jun. El alfa-tocoferol mejora la función endotelial mediante la inhibición de la VCAM-1 y en menor grado sobre la E-selectina e ICAM-1. El plasma y glóbulos rojos aportan información metabolómica complementaria y se elegirá uno u otro en función del objetivo de los estudios en humanos. / The thesis addresses two major issues. Firstly: The study the effects of polyphenol-rich peanut extract and bioactive compounds (alpha-tocopherol) in cellular models of inflammation (monocytic cells; THP-1) and on endothelial dysfunction (human aortic endothelial cells; HAEC), respectively. Secondly: The optimisation of blood sampling for human studies to characterise the profile of aqueous and lipid metabolites, fatty acid composition, lipoprotein subclasses, and polyphenol content of plasma and red blood cells. Peanut extract exerts anti-inflammatory effects by inhibiting extracellular TNF-α protein via the inhibition of c-Jun transcription factor activation. Alpha-tocopherol improves endothelial function by inhibiting VCAM-1 and, to a lesser extent, E-selectin and ICAM-1. Analyses of metabolites in plasma and red blood cells generate complementary information. The measurements may need to be performed in either, or both, matrices, depending on the objectives of the study.

En aquest estudi hem trobat que FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacciona amb el receptor de Slit, Robo1, de forma independent lligand. En cèl•lules HEK293T hem vist que FLRT3 i Robo1 interaccionen mitjançant els seus dominis intracel•lulars, que la co-expressió de FLRT3 amb Robo1 indueix el processament del receptor i que FLRT3 interacciona amb el fragment intracel•lular generat amb major afinitat i el segresta a la membrana. En presència de Slit, es produeix un increment en el processament de Robo1 i el fragment intracel•lular generat és captat per FLRT3. La interacció entre FLRT3-Robo1 i entre FLRT3-Robo1ICD es dóna en neurones talàmiques rostrals a E13.5. Slit indueix el processament de Robo1 per metaloproteases en aquestes neurones i FLRT3 captura el fragment generat. La interacció FLRT3-Robo1 i l'activació de ROCK són necessàries per la correcta guia axonal dels axons talamocorticals rostrals. FLRT3 regula directament i de forma negativa la senyalització repulsiva Slit/Robo i indirectament promou la senyalització atractiva Netrin/DCC / En este estudio hemos encontrado que FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacciona con el receptor de Slit, Robo1, de forma independiente de ligando. En células HEK293T hemos visto que FLRT3 y Robo1 interaccionan mediante sus dominios intracelulares, que la co-expresión de FLRT3 con Robo1 induce el procesamiento del receptor y que FLRT3 interacciona con el fragmento intracelular generado con mayor afinidad y lo secuestra en la membrana. En presencia de Slit, se produce un incremento en el procesamiento de Robo1 y el fragmento intracelular generado es captado por FLRT3. La interacción entre FLRT3-Robo1 y entre FLRT3-Robo1ICD tiene lugar en neuronas talámicas rostrales a E13.5. Slit induce el procesamiento de Robo1 por metaloproteasas en estas neuronas y FLRT3 captura el fragmento generado. La interacción FLRT3-Robo1 i la activación de ROCK son necesarias para la correcta guía axonal de los axones talamocorticales rostrales. FLRT3 regula directamente y de forma negativa la señalización repulsiva Slit/Robo y indirectamente promueve la señalización atractiva Netrin/DCC. / In this study we have found that FLRT3 (Fibronectin Leucine-Rich Transmembrane protein) interacts with the Slit receptor Robo1 ligand- independently. In HEK293T cells we have found that FLRT3 and Robo1 interact throught their intracellular domains, that the co-expression of FLRT3 with Robo1 triggers the shedding of the receptor and that FLRT3 interacts with the intracellular fragment generated with higher affinity and keeps it in the plasma membrane. The presence of Slit produces an increase in the shedding of Robo1 and the intracellular fragment that is generated is catched by FLRT3. The interaction between FLRT3-Robo1 and between FLRT3-Robo1ICD takes place in rostral thalamic neurons at E13.5. Slit triggers Robo1 shedding by metalloproteases in these neurons and FLRT3 catches the intracellular fragment generated. The interaction FLRT3-Robo1 and the activation of ROCK are necessary for the proper guidance of the rostral talamocortical axons. FLRT3 regulates directly and negatively the Slit/Robo repulsive signaling and indirectly promotes the Netrin/DCC attractive signaling

El eje central de esta tesis ha sido el estudio de los efectos que ejercen el género, la localización anatómica del depósito y la situación fisiológica u hormonal sobre la capacidad lipolítica del TAB. En ratas control, la capacidad lipolítica es superior en el depósito gonadal (visceral) que en el inguinal (subcutáneo). La gestación provoca en el TAB una disminución de los niveles de los distintos elementos de la cascada lipolítica, aunque con diferencias entre depósitos, que podrían determinar su papel durante la gestación. En su conjunto, los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis permiten establecer la existencia de claras diferencias en las capacidades lipolíticas del tejido adiposo entre depósitos con distinta localización anatómica, así como entre géneros, tanto en una situación control, como en respuesta a la sobrealimentación, y en la gestación, pudiendo jugar el entorno hormonal un papel clave en estas diferencias. / The general aim of this thesis was to study the effects of gender, anatomical tissue location and the physiological or hormonal status on WAT lipolytic capacity. In control rats, the lipolytic capacity is higher in gonadal (visceral) than in inguinal WAT (subcutaneous). Pregnancy leads to a decrease in the levels of the different elements of the lipolytic pathway in WAT, although with some differences between the depots, which could determine their role during pregnancy. In conclusion, the results reported in this thesis establish the existence of clear differences in WAT lipolytic capacity between fat depots from different anatomical locations, as well as between genders, both in a control situation and in response to overfeeding, and in pregnancy; differences in which the hormonal milieu could play a key role.

Ret és un Receptor Tirosina Cinasa (RTK) que regula el desenvolupament del sistema genito-urinari i el desenvolupament del sistema nerviós perifèric. A més, les mutacions de guany de funció d’aquest receptor cursen amb el desenvolupament del Carcinoma Medul•lar de Tiroide (MTC), una neoplàsia de la glàndula tiroide que deriva de les cèl•lules C, productores de calcitonina. En mamífers, la família de Sprouty (Spry) està composta per quatre gens diferents (Spry1-4). Diferents anàlisis genètics en ratolins demostren que els gens Spry són inhibidors de la senyalització de Ret durant el desenvolupament dels ronyons i del sistema nerviós entèric. D’altra banda, alguns membres de la família de Spry s’han proposat com a possibles gens supressors de tumors en una gran varietat de patologies cancerígenes. A la primera part del nostre treball, hem volgut estudiar si la proteïna Sprouty1 pot actuar com un gen supressor de tumors al MTC. En primer lloc hem analitzat les tiroides dels ratolins knockout per Spry1 i observem que desenvolupen una hiperplàsia de les cèl•lules C, una lesió precancerosa al desenvolupament del MTC. A més a més, demostrem que l’expressió de Spry1 redueix la proliferació d’una línia cel•lular derivada d’un MTC humà, la línia TT, degut a la inducció de la senescència cel•lular. Finalment, hem descobert que el promotor de Sprouty1 es troba freqüentment metilat en mostres humanes de MTC, cosa que provoca la disminució dels nivells d’expressió de Spry1 en aquest tipus de càncer. A la segona part del nostre treball, hem observat que la pèrdua de Spry1 provoca un augment del tamany de la tiroide dels ratolins a causa d’un increment de la proliferació de les cèl•lules fol•liculars. D’altra banda, les tiroides dels ratolins knockout per Spry1 mostren una disminució dels marcadors de senescència cel•lular, on s’hi inclou la reducció de la secreció dels factors que activen i mantenen el fenotip secretor associat a la senescència cel•lular (SASP). Finalment, hem observat una disminució de l’activació de la via NF-kB a la tiroide dels ratolins Spry1-/-, fet que correlaciona amb la disminució de la secreció dels factors IL-6 i KC. Com que la senescència cel•lular s’ha proposat com una potent barrera pel desenvolupament tumoral, hem volgut analitzar si la pèrdua de Spry1 pot accelerar el procés de tumorigènesi en ratolins susceptibles al desenvolupament tumoral. Els ratolins doble mutants per Pten i Spry1 mostren un augment de la incidència de tumors a la tiroide i a la glàndula adrenal si ho comparem amb els ratolins Pten+/-. Tot i que la pèrdua de Sprouty1 per si sola no és suficient per promoure la formació de tumors, accelera la tumorigènesi en el context d’una haploinuficiència de Pten. / Ret es un Receptor Tirosina Quinasa (RTK) que regula el desarrollo del sistema genitourinario y del sistema nervioso periférico. Además, las mutaciones de ganancia de función de estos receptores cursan con el desarrollo del Carcinoma Medular de Tiroides (MTC), una neoplasia de la glándula tiroides que deriva de les células C, productoras de calcitonina. En los mamíferos, la familia de Sprouty (Spry) está compuesta por cuatro genes distintos (Spry1-4). Análisis genéticos en ratones demuestran que los genes Spry son inhibidores de la señalización por Ret durante el desarrollo de los riñones y del sistema nervioso entérico. Por otra parte, algunos miembros de la familia de Spry se han propuesto como posibles genes supresores de tumores de una gran variedad de patologías cancerígenas. En la primera parte de nuestro trabajo, hemos querido estudiar si la proteína Sprouty1 puede actuar como un gen supresor de tumores del MTC. En primer lugar hemos analizado las tiroides de los ratones knockout para Spry1 y observamos que desarrollan una hiperplasia de las células C, una lesión precancerosa al desarrollo del MTC. Además, hemos demostrado que la expresión de Spry1 reduce la proliferación de una línea celular derivada de un MTC humano, la línea TT, por causa de la inducción de la senescencia celular. Finalmente, hemos descubierto que el promotor de Sprouty1 se encuentra frecuentemente metilado en muestras de MTC humanas, hecho que provoca la disminución de los niveles de expresión de Spry1 en este tipo de cáncer. En la segunda parte de nuestro trabajo, hemos observado que la perdida de Spry1 provoca un aumento del tamaño de la tiroides de los ratones a causa de un incremento de la proliferación de les células foliculares. Por otra parte, las tiroides de los ratones knockout para Spry1 muestran una disminución de los marcadores de senescencia celular, dónde se incluye la reducción de la secreción de los factores que activan y mantienen el fenotipo secretor asociado a la senescencia celular (SASP). Finalmente, hemos observado una disminución de la activación de la vía NF-kB a la tiroides de los ratones Spry1-/-, que correlaciona con la disminución de la secreción de los factores IL-6 i KC. La senescencia celular se ha propuesto como una potente barrera para el desarrollo tumoral, por eso hemos querido analizar si la pérdida de Spry1 puede acelerar el proceso de tumorigénesis en ratones susceptibles al desarrollo tumoral. Los ratones doble mutantes por Pten i Spry1 muestran un aumento de la incidencia de tumores a la tiroides y a la glándula adrenal si se compare con los ratones Pten+/-. La pérdida de Sprouty1 por si sola no es suficiente para promover la formación de tumores, pero acelera la tumorigénesis en el contexto de una haploinuficiencia de Pten. / Ret is a Receptor Tyrosine Kinase (RTK) that regulates several aspects of the development of the genito-urinary system and the peripheral nervous system. Moreover, gain-of-function mutations of this receptor cause the development of Medullary Thyroid Carcinoma (MTC), a rare neoplasm arising from the calcitoninproducing C-cells of the thyroid gland. Sprouty (Spry) family of genes is composed of four members in mammals (Spry1-4). Genetic analyses on mice demonstrate that Spry genes are inhibitors of Ret signalling during the development of kidneys and enteric nervous system. Moreover, some Spry family members have been proposed as candidate tumour-suppressor genes in a variety of cancerous pathologies. In the first part of our work, we wanted to elucidate whether Spry1 could act as a tumour suppressor gene in MTC. We analysed the thyroid gland of Spry1 null-mice and found that they develop C-cell hyperplasia, a precancerous lesion preceding MTC. In addition, we demonstrate that expression of Spry1 restrains proliferation of the MTCderived cell line TT by inducing cellular senescence. Finally, we found that the Spry1 promoter is frequently methylated and its expression decreased in human MTC. In the second part of our work, we found that Spry1 knockout mice present enlarged thyroid glands due to increased proliferation of follicular cells. Moreover, thyroids from Spry1 knockout mice show decreased markers of cellular senescence, including a reduction in secretion of factors that activate and maintain the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Finally, we determine that a defective activation of NF-kB signalling in Spry1 null thyroids underlie the observed effects on secretion of SASP factors IL-6 and KC. Since cellular senescence has been proposed as a potent barrier to tumorigenesis, we wanted to assess whether loss of Spry1 could accelerate the onset of tumorigenesis in a tumour-prone mouse. Pten and Spry1 double mutant mice show increased incidence of tumours of the thyroid and adrenal glands when compared to Pten+/- mice. Thus, although loss of Spry1 by itself might not be sufficient to promote tumour formation, it does accelerate tumorigenesis in the context of Pten haploinsufficiency.

Peripheral neuropaties are one of the major complications of the Peripheral Nervous System. Depsite the big importance of those pathologies, less drugs are effective for their treatment, and most of the prescribed drugs are based on the inhibition of pain. Nucleo CMP forte is a drug mainly composed of nucleotides (UMP, UDP, UTP and CMP), prescribed to patients with Peripheral Nervous System disorders. But their exact mechanism of action is still unknown. Because extracellular nucleotides can act as signalling molècules, our research group focus the studies in which are the effects of the Nucleo CMP forte drug and the triphosphate nucleotides in Schwann cells, one of the most important population in the regeneration of the Peripheral Nervous System. In response to peripheral nerve injury, Schwann cells adopt a migratiory phenotype and modify the extracellular matrix to make it permissive for cell migration and axonal regrowth. UTP and other nucleotides are released during nerve injury and activate purinergic receptors expresed on the Schwann cell surface, but little is known on the involvement of purine signalling in wound healing. Our results demonstrated that UTP treatment induces Schwann cell migration and wound healing, through the activation of the P2Y2 receptor. P2Y activation induces a biphasic MAPK activation (Early and Late) and also the activation of an extracellular metalloproteinase (MMP-2). Knockdown of the P2Y2 receptor or of MMP-2, using specific shRNAs, highly reduced cell migration and wound closure induced by UTP. MMP-2 activation evoked by injury or UTP was also mediated by the phosphorylation of all three major mitogen-activated protein kinases (MAPKs: ERK ½, p38 and JNK). Inhibition of these MAPKs decreased both MMP-2 activation and cell migration. Interestingly inhibition of MMP-2 activity, selectively blocked the late, but not the early MAPKs activation. These results suggest that MMP-2 activation and the late MAPKs phosphorylation are part of a positive feedback mechanism to maintain the migratory phenotype for wound healing. Moreover, treatment with UTP stimulates Schwann cell migration and wound repair through a MMP-2-dependent mechanism via P2Y receptors and MAPKs pathway activation.

En aquest treball de tesi hem estudiat per primera vegada l’expressió funcional dels canals de calci dependents de voltatge (CCDV) en melanòcits humans i un ampli rang de línies cel.lulars i biòpsies de melanoma humà, mitjançant tècniques de biologia molecular i d’imatge. Els nostres resultats demostren que els melanòcits control i les cèl.lules de melanoma expréssen isoformes de les famílies de gens Cav1 i Cav2. De forma destacable, l’expressió d’isoformes de la família Cav3 (canals de tipus T) es troba restringida a les cèl.lules de melanoma, en les que promouen la progressió del cicle cel.lular. Aquests resultats motiven l’anàlisi dels CCDV-T com a dianes terapèutiques contra la tumorigènesi i/o progressió tumoral del melanoma. En aquesta línea, hem trobat que mibefradil i pimozida, dos bloquejants de CCDV-T d’us clínic, inhibeixen el creixement de les cèl.lules de melanoma in vitro, i que aquest efecte és degut tant a una reducció de la proliferació cel.lular, com a una inducció de la mort dependent de caspases. Hem explorat les vies moleculars implicades en el procés apoptòtic i hem trobat que ambdues drogues indueixen estrés de reticle endoplasmàtic (RE) i la inhibició subsequent de l’autofàgia basal constitutiva present a les cèl.lules de melanoma. Finalment, hem demostrat, a través del seu silenciament gènic, que la isoforma Cav3.2 és la diana molecular dels bloquejants de CCDV-T, en el que respecta als seus efectes sobre l’estrés de RE i l’autofàgia. Conjuntament, els resultats obtinguts en el decurs d’aquesta tesi apunten als canals de tipus T como a possibles marcadors de pronòstic i/o dianes terapèutiques contra la metastasi del melanoma. / Hemos estudiado por primera vez la expresión funcional de los canales de calcio voltaje-dependientes (CCDV) en melanocitos humanos y un amplio rango de líneas celulares y biopsias de melanoma humano, mediante técnicas de biología molecular y de imagen. Nuestros resultados demuestran que los melanocitos control y las células de melanoma expresan isoformas pertenecientes a las famílias de genes Cav1 y Cav2. De forma destacable, la expresión de isoformas de la família Cav3 (canales de tipo T) se encuentra restringida a las células de melanoma, en las que promueven la progresión del ciclo celular. Estos resultados motivan el análisis de los CCDV-T como dianas terapéuticas contra la tumorigénesis y/o progresión tumoral del melanoma. En esta línea, hemos encontrado que mibefradil y pimozida, dos bloqueantes de CCDV-T de uso clínico, inhiben el crecimiento de las células de melanoma in vitro, y que este efecto es debido tanto a una reducción de la proliferación celular como a una inducción de la muerte dependiente de caspasas. Hemos explorado las vías moleculares implicadas en el proceso apoptótico y hemos hallado que ambas drogas inducen estrés de retículo endoplasmático (RE) y la inhibición subsiguiente de la autofagia basal constitutiva presente en las células de melanoma. Finalmente, hemos demostrado, a través de su silenciamiento génico, que la isoforma Cav3.2 es la diana molecular de los bloqueantes de CCDV-T en lo concerniente a sus efectos sobre el estrés de retículo endoplasmático y la autofagia. Conjuntamente, los resultados obtenidos en el curso de esta tesis apuntan a los canales de tipo T como posibles marcadores de pronóstico y/o dianas terapéuticas contra la metástasis del melanoma. / We have addressed for the first time the functional expression of voltage-gated calcium channels (VGCCs) in human melanocytes and a range of melanoma cell lines and biopsies, by molecular biology and imaging techniques. Our results show that control melanocytes and melanoma cells express channel isoforms belonging to the Cav1 and Cav2 gene families. Importantly, the expression of isoforms of Cav3 (T-type) channels is restricted to melanoma cells, in which they promote cell cycle progression. These results encourage the analysis of T-type VGCCs as targets for therapeutic intervention in melanoma tumorigenesis and ⁄or tumour progression. In this regard, we have found that mibefradil and pimozide, two clinically-used T-type Ca2+ channel blockers, inhibit the in vitro growth of melanoma cells, and that this effect is due to both a reduction in the cell proliferation rate and an induction of caspase-dependent cell death. We have further explored the molecular pathways leading to T-type channels blockers-mediated apoptosis, and found that both drugs induce endoplasmic reticulum (ER) stress and a subsequent inhibition of the basal autophagy present in melanoma cells. Finally, we have demonstrated by a gene silencing approach that the Cav3.2 isoform is the molecular target of T-type channel blocker mediated effects on ER-stress and autophagy. Altogether, the results attained in this thesis point to T-type Ca2+ channels as putative prognosis markers and/or therapeutic targets to tackle melanoma metastasis.