Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 462290.pdf: 2133615 bytes, checksum: 5c5628b9cc5fd71ee1dcc7d68f182c36 (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis. The increasing number of infected patients among immune compromised populations and emergence of drug-resistant strains has created urgent need of new strategies to treat TB. Understanding relevant pathways (as the purine salvage) will reveal details of M. tuberculosis that might be used to develop new strategies to combat this pathogen. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) is an enzyme from the purine phosphoribosyltransferase (PRTase) family and catalyzes the conversion of hypoxanthine or guanine and 5-phosphoribosyl-α-1-pyrophosphate (PRPP) to inosine 5 -monophosphate (IMP) or guanosine 5 -monophosphate (GMP), and pyrophosphate (PPi). Here we describe the mode of action of M. tuberculosis HGPRT (MtHGPRT) through kinetic and thermodynamical analysis. Experiments were also performed to determine the oligomeric state in solution, pH, temperature and solvent isotope effects. These data allows us to compare MtHGPRT to homologues from other species and look for similarities and differences in its mechanism and constants. We hope the experiments presented here will contribute to the understanding of this pathogen purine salvage pathway. / A Tuberculose (TB) ? uma doen?a infecciosa causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis. O aumento de pacientes infectados entre a popula??o imunocomprometida e a emerg?ncia de cepas resistentes a drogas criam uma necessidade de novas estrat?gias para tartar a TB. Entender como funcionam as vias metab?licas relevantes, como a via de salvamento de purinas, poder? revelar detalhes do M. tuberculosis que poder?o ser ?teis para o desenvolvimento de novas estrat?gias de combate a este pat?geno. A hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT) ? uma enzima da familia das purina fosforribosiltransferases (PRTase) e catalisa a convers?o de hipoxantina ou guanina e 5-fosforribosilpirofosfato-α-1-pirofosfato (PRPP) em inosina 5 -monofosfato (IMP) ou guanosina 5 -monofosfato (GMP) respectivamente, com a libera??o de pirofosfato inorg?nico (PPi). Aqui n?s descrevemos o modo de a??o da HGPRT de M. tuberculosis (MtHGPRT) atrav?s de an?lises cin?ticas e termodin?micas. Tamb?m foram realizados experimentos para determinar o estado oligom?rico da enzima em solu??o e os efeitos de pH, temperatura e efeitos isot?picos do solvente. Esses dados nos permitem comparar a MtHGPRT com hom?logos de outras esp?cies e procurar por similaridades e diferen?as nos seu mecanismo e constantes. N?s esperamos que os experimentos apresentados aqui contribuam para o entendimento da via de salvamento de purinas desse pat?geno.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 397347.pdf: 984527 bytes, checksum: 31dff3f15a7d672c6b5eff5f99ffff0d (MD5) Previous issue date: 2008-12-18 / A les?o pulmonar aguda (LPA) ? uma s?ndrome caracterizada por inflama??o pulmonar aguda e persistente, com edema pulmonar devido ao aumento da permeabilidade vascular. Na LPA ocorre uma les?o do epit?lio alveolar e do endot?lio capilar por diferentes mediadores pr?-inflamat?rios, principalmente, pelas citocinas liberadas em resposta ? grande variedade de insultos. A gera??o de radicais livres (RLs) ? outro importante mecanismo de les?o utilizado pelos neutr?filos, que s?o capazes de gerar muitas das altera??es encontradas na LPA. Sabe-se que a produ??o end?gena de glutamato estimula uma variedade de mediadores inflamat?rios, incluindo metab?litos do ?cido araquid?nico, RLs e ?xido n?trico (NO). O primeiro relato de que os receptores NMDA poderiam estar envolvidos na fisiopatologia pulmonar ocorreu atrav?s da demonstra??o que o tratamento com um inibidor seletivo desse receptor (MK-801) prevenia o edema pulmonar provocado pelo aumento de NMDA instilado na traqu?ia de ratos sob ventila??o mec?nica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do antagonista de receptor NMDA (MK- 801) como protetor no dano oxidativo em modelo experimental de LPA. Foram utilizados ratos Wistar, machos. Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: Grupo 1: Inje??o intratraqueal (I.T.) de 1 mL de solu??o salina (n=6); grupo 2: Indu??o da LPA atrav?s da inje??o de LPS intratraqueal (100 \g/100 g de peso corporal) e tratamento com solu??o salina intraperitoneal (I.P.) ap?s indu??o da LPA (n=6); grupo 3: Indu??o da LPA e tratamento com MK-801 (0.3 mg/kg I.P.) ap?s indu??o da LPA (n=6) e grupo 4: Indu??o da LPA e tratamento com MK-801 (0.3 mg/kg I.T.) ap?s indu??o da LPA (n=6). Doze horas ap?s o tratamento, os animais foram anestesiados para a retirada do sangue por pun??o retro-orbital, coleta do lavado broncoalveolar (LBA) e posteriormente, submetidos ? eutan?sia por decapita??o para coleta do tecido pulmonar. O tratamento com MK-801 promoveu uma diminui??o na concentra??o de prote?nas totais, uma diminui??o na atividade da lactato desidrogenase (LDH), al?m de diminuir o n?mero de c?lulas inflamat?rias no LBA. No tecido pulmonar ocorreu uma diminui??o do dano oxidativo avaliado atrav?s dos n?veis de TBARS e NO, e um aumento nos n?veis de antioxidantes como a CAT, SOD, GSH e SH. Tamb?m observamos uma melhora do processo inflamat?rio atrav?s da an?lise histopatol?gica do tecido pulmonar. Podemos concluir atrav?s de nossos resultados que o tratamento com MK-801 promoveu uma melhora do processo inflamat?rio, uma melhora nos n?veis de antioxidantes e uma diminui??o do dano oxidativo em ratos com LPA induzida atrav?s da inje??o intratraqueal de LPS.

Orientador: João Aristeu da Rosa / Banca: Maria Tercilia Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: Marcos Takashi Obara / Resumo: Estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas estejam infectadas com Trypanosoma cruzi no mundo, a maioria na América Latina, sendo a transmissão vetorial responsável ainda por, aproximadamente, 80% dos casos. Atualmente são descritas 151 espécies de triatomíneos agrupadas em cincos tribos formadas por 18 gêneros. O gênero Rhodnius conta com 19 espécies de potenciais vetores, podendo veicular T. cruzi e Trypanosoma rangeli. É considerado um dos gêneros taxonomicamente mais complexos da subfamília Triatominae, devido as semelhanças morfológicas e a distribuição geográfica que podem se sobrepor entre algumas de suas espécies dificultando seu estudo, apesar das diversas técnicas empregadas para sua distinção. Com o desenvolvimento atual das técnicas moleculares tornou-se possível a caracterização de espécies de triatomíneos por meio de marcadores mitocondriais e nucleares, tendo essa se tornado uma variável a mais para a taxonomia dos triatomíneos, assim como a já utilizada morfologia e a recentemente popularizada morfometria geométrica. A adição de novas variáveis possibilita que dados já existentes possam ser comprovados e/ou corrigidos. Neste trabalho foram obtidos subsídios que ampliam o conhecimento e que agregados aos já existentes podem proporcionar uma diferenciação mais minuciosa e precisa de espécies englobadas no gênero Rhodnius, de modo a contribuir para estabelecer uma classificação mais apropriada. A obtenção dos dados foi conduzida, por meio de estudo molecular, utiliza... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Worlwide, it is estimated that 6 to 7 million people are infected with Trypanosoma cruzi, mostly in Latin America and the vector transmission is still responsible for approximately 80% of the cases. There are currently 151 described species of triatomine, grouped into five tribes, formed by 18 genres. The Rhodnius genre includes 19 species, which can transmit T. cruzi and Trypanosoma rangeli. It is considered one of the most complex taxonomically genera of Triatominae, due to its morphological similarities and geographical distribution that may overlap among some species hindering their study, despite the various techniques used for their distinction. With the current development of molecular techniques it has become possible to characterize triatomine species through mitochondrial and nuclear markers, this became one more toll for the taxonomy of triatomines, just as the already used morphology and recently popularized geometric morphometry. The addition of new variables enables the verification and or correction of existing data. This work has generated valueable data that amplify the knowledge which in addition to the existing may provide a more accurate differentiation of species included in the genre Rhodnius, in order to help establish a more appropriate classification. Data collection was performed by DNA analysis, using mitochondrial markers - cytochrome b and cytochrome oxidase I, in addition to morphological parameters, as, median process of pygophore, the anterolat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

No description available.

Repeticions riques en leucina (RRL ) és uns seqüència conservada d'11 aminoàcids alifàtics incloent leucina implicada en la interacció proteïna-proteïna Proteïnes transmembrana (TM) amb RRLs extracel.lular (eRRLs) han sorgit recentment com a reguladors clau de diversos processos durant el desenvolupament dels circuits neuronals: en l'extensió axonal, en la funció sinàptica i en la migració neuronal. No obstant això, per a la majoria de les eRRL-TMs, el seu paper en el desenvolupament del sistema nerviós i la funció és desconeguda. Amb l'objectiu d'avaluar la seva funció, es va realitzar un estudi a petita escala de l'expressió de l'ARNm d'alguns d'aquests eRRL-TMs, per hibridació in situ, en cervell de ratolí i humà en diferents etapes del desenvolupament. Es va estudiar principalment el patró d'expressió a l'escorça, el tàlem i l'hipocamp. La majoria d'ells van mostrar mapes d'expressió discrets el que suggereix un paper putatiu en el desenvolupament del sistema nerviós i la connectivitat neuronal, en particular en la migració radial i tangencial de les neurones corticals / Leucine Rich Repeats (LRR) is a consensus sequence domain involved in protein-protein interaction characterized by the conserved sequence of 11 aliphatic amino acids including leucine. Transmembrane proteins (TM) with extracellular LRRs (eLRRs) have recently emerged as key regulators of several processes during the development of neuronal circuits:in axon extension, in synaptic function and in neuron migration.However for the majority of eLRR-TMs, their role in nervous system development and function is basically unknown. With the aim to assess the neuronal function of these uncharacterized eLRR-TMs, we performed a small scale mRNA expression study, by in situ hybridization, in the mouse and human brain at different developmental stages. We studied the expression pattern of eLRR-TMs mainly in cortex, thalamus and hippocampus. Most of them showed discrete expression maps suggesting putative roles in nervous system development and neural connectivity, in particular in radial and tangential migration of cortical neurons. / Repeticiones ricas en leucina (RRL) es una secuencia conservada de 11 aminoácidos alifáticos incluyendo leucina implicada en la interacción proteína-proteína. Proteínas transmembrana (TM) con RRLs extracelulares (eRRLs) han surgido recientemente como reguladores clave de varios procesos durante el desarrollo de los circuitos neuronales: en la extensión axonal, en la función sináptica y en la migración neuronal. Sin embargo, para la mayoría de las eRRL-TMs, su papel en el desarrollo del sistema nervioso y la función es desconocida. Con el objetivo de conocer su función, se realizó un estudio a pequeña escala de la expresión del ARNm de algunos de estos eRRL-TMs, por hibridación in situ, en cerebro de ratón y humano en diferentes etapas del desarrollo. Se estudió principalmente la expresión en corteza, tálamo e hipocampo. La mayoría de estos genes mostraron mapas de expresión discretos lo que sugiere un papel putativo en el desarrollo del sistema nervioso y la conectividad neuronal, en particular en la migración radial y tangencial de las neuronas corticales.

En aquest estudi s'ha treballat amb diferents hipòtesis que avui en dia es consideren per explicar les causes de l'Esclerosi Lateral Amiotròfica.En primer lloc, s'ha estudiat la autoimmunitat sèriques (IgG) provinents de malalts d'ELA i d'altres malalties de la Motoneurona (MN). Tractant embrions de pollastre amb sèrums i IgG de pacients afectats per ELA s'obté un rescat significatiu en el nombre de la MN de la banya ventral de la medul·la espinal lumbar que d'altra manera moririen en un procés de mort cel·lular programada per apoptosi i un augment significatiu de la ramificació nerviosa en la musculatura inervada per aquestes MN. S'ha detectat la unió de les IgG a proteïnes del sistema nerviós de l'embrió de pollastre i s'ha identificat com a antígen una proteïna implicada en la regulació i la quimiotaxis del sistema nerviós embrionari, la Semaforina. No sabem, per ara, la significació d'aquests anticossos anti Sema 3A circulants en els pacients de malalts d'ELA ni la seva relació amb la patogènia de la malaltia.En segon lloc, s'ha traballat amb l'aspecte genètic de la malaltia. Utilitzant rosegadors transgènics amb una mutació en el gen de la SOD1 s'ha comprovat que diferents tipus de cèl·lules nervioses d'animals trangènics en estadis avançats de la malatia mostren ractivitat cap a l'anticòs anti P2X4. A part de la reactivitat mostrada en MNs degenerades al còrtex celebral i tronc de l'encèfal d'animals trangènics, fet que concorda amb l'afectació clàssica descrita en la ELA, s'ha vist també reactivitat a cèl·lules de Purkinje cerebelars.Posteriorment s'ha comprovat que aquesta reactivitat és deguda a un reconeixement per part d'aquest anticòs de formes mal plegades de la proteïna SOD1, formes que es van acumulant a mesura que la malaltia avança i que la neurona degenera. Aquestes formes malplegades de SOD1 s'ha comprovat que són capaces de d'activar la microglia in vivo en nivells significativament superiors que la proteöna SOD1 nativa.Per últim, s'ha estudiat l'efecte de la transfecció amb proteïna SOD1 mutada i fenomens autofàgics dins del model de línia cel·lular neuroal NSC-34. Tot i que s'ha comprovat que en aquest model no es repeteixen els resultats obtinguts per l'anticòs anti P2X4 en models de rosegadors transgènics, s'ha pogut estudiar l'autofàgia i l'efecte beneficiós del liti en aquest model, veient-se que el liti és capaç de disminuir el nombre d'agregats de SOD1 en aquest model quan les cèl·lules són transfectades amb diferents tipus de SOD1 mutada.

Desde su descubrimiento a finales de los 90, PTEN se ha convertido en uno de los genes supresores de tumores más importantes que se conocen. Se sitúa entre los 20 supresores tumorales mutados con mayor frecuencia, un fenómeno que llega a ocurrir hasta en el 80% de los casos, en función del tipo de cáncer. Una de las herramientas esenciales para el estudio de la biología de PTEN y su papel en el proceso tumoral es el empleo de modelos animales modificados genéticamente. Su uso permite estudiar los mecanismos moleculares de la enfermedad, pero también la evaluación a nivel preclínico de nuevas terapias y fármacos antineoplásicos. Dado que la deleción en homocigosis del gen resulta letal durante el desarrollo embrionario, el uso de modelos inducibles o específicos de tejido ha supuesto un gran avance en el campo. En la primera parte de este trabajo, se han generado dos nuevos modelos murinos para el estudio de neoplasias sólidas o hematopoyéticas causadas por la pérdida de PTEN. Una vez establecidos los modelos de estudio, se emplearon para evaluar inhibidores con potencial terapéutico sobre este tipo de neoplasia. El primero de éstos fue el inhibidor de mTORC1 Everolimus, el cual mostró efectos beneficiosos sobre tumores de endometrio e hiperplasia de tiroides. Por otro lado, se estudió la respuesta al Sorafenib, un inhibidor multiquinasa, el cual resultó efectivo para el tratamiento de lesiones de tiroides y próstata, pero no para neoplasias de endometrio. Si bien ambos fármacos permitieron ralentizar la progresión tumoral, ninguno de ellos eliminó la enfermedad. Durante los últimos años, ha ganado importancia la conexión entre el proceso inflamatorio y la patología tumoral. Una de las principales vías de señalización implicadas es NF-κB. Por este motivo, en la última parte del presente trabajo, se estudió el impacto de dicha vía en neoplasias inducidas por la pérdida de PTEN. La deleción simultánea de PTEN e IKKβ provocó una disminución de la incidencia de hiperplasia de tiroides en ratones, sin afectar a la progresión de neoplasias de endometrio y próstata. Sorprendentemente, la ablación de ambos genes en el sistema hematopoyético no impidió el desarrollo de neoplasias, pero afectó gravemente al fenotipo de las mismas.

Els monoacilglicerols (MAGs) enantiomèrics són intermedis de gran interès i la seva producció mitjançant enzims ofereix vies alternatives a les reaccions químiques tradicionals. Aquesta tesi té com a objectiu la seva síntesi a partir de dos precursors dels MAGs (el rac-palmitat de solketil i el rac-palmitat de glicidil), utilitzant micelis de fongs aïllats de residus de la indústria de l’oli com a biocatalitzadors. En un primer intent d’obtenir MAGs, es va avaluar l’activitat epòxid-hidrolàsica dels micelis enfront el rac-fenil glicidil èter, el rac-benzil glicidil èter, el rac-1,2-epoxihexà i el rac-1,2-epoxioctà. A continuació, els micelis escollits es van utilitzar en la hidròlisi del rac-palmitat de glicidil. Només es va obtenir MAG amb el miceli de Penicillium sp., però com a mescla racèmica. L’efecte matriu associat a les reaccions amb micelis com ara la recuperació de l’anàlit adsorbit en la biomassa o l’extracció de components dels biocatalitzadors es van compensar realitzant l’extracció després de fortificar les mostres i patrons. En un segon intent, el palmitat de glicidil enantioenriquit i sintetitzat pel miceli de Mucor fragilis, es va hidrolitzar amb el miceli de Penicillium sp. La hidròlisi enzimàtica del MAG enantiomèric va dificultar la seva obtenció. / Los monoacilgliceroles (MAGs) són intermedios de gran interés y su producción mediante enzimas ofrece vías alternativas a las reacciones químicas tradicionales. Esta tesis tiene como objetivo su síntesis a partir de dos precursores de los MAGs (el rac-palmitato de solketilo y el rac-palmitato de glicidilo), utilizando micelios de hongos aislados de sustratos de la industria del aceite como biocatalizadores. En un primer intento de obtener MAGs, se evaluó la actividad epóxido-hidrolásica de los micelios frente al rac-fenil glicidil éter, el rac-bencil glicidil éter, el rac-1,2-epoxihexano y el rac-1,2-epoxioctano. A continuación, los micelios seleccionados se utilizaron en la hidrólisis del rac-palmitato de glicidilo. Sólo se obtuvo MAG con el micelio de Penicillium sp., pero como mezcla racémica. El efecto matriz asociado a las reacciones con micelios como por ejemplo la recuperación del analito adsorbido en la biomasa o la extracción de componentes de los biocatlizadores se compensó realizando la extracción después de fortificar las muestras y patrones. En un segundo intento, el palmitato de glicidilo enantioenriquecido y sintetizado por el micelio de Mucor fragilis, se hidrolizó con el micelio de Penicillium sp. La hidrólisis enzimática del MAG enantiomérico dificultó su obtención. / Enantiomeric monoacylglycerols (MAGs) are known to be useful intermediates of great interest. They are difficult to synthesize by traditional chemical reactions and enzymatic production provide alternative routes. This thesis reports their synthesis from two precursors of MAGs (rac-solketil palmitate and rac-glycidyl palmitate) by using fungic mycelia isolated from olive oil wastes as biocatalysts. In a first attempt to obtain MAGs, mycelia were screened towards rac-glycidyl phenyl ether, rac-benzyl glycidyl ether, rac-1,2-epoxyhexane and rac-1,2-epoxyoctane. Then, rac-glycidyl palmitate was hydrolysed by the mycelia selected by their epoxide hydrolase activity. Only Penicillium sp. mycelium yielded MAG, but as a racemic mixture. Matrix effects associated with mycelium-catalysed reactions such the need to recover the analyte adsorbed onto the biomass or the extraction of matrix components were compensated for using pre-extraction spiking approach. In a second attempt, enantioenriched glycidyl palmitate, synthesised by Mucor fragilis mycelium, was hydrolysed by Penicillium sp. mycelium. There was difficult to obtain enantiomeric MAG because of its enzymatic hydrolysis.

El objetivo principal de esta tesis es caracterizar los efectos de las hormonas sexuales sobre la función mitocondrial del tejido adiposo blanco (TAB) y del músculo, y su relación con la síntesis de adiponectina. Nuestros resultados establecen el 17beta-estradiol como estimulador de la funcionalidad mitocondrial y de la síntesis de adiponectina en adipocitos y músculo, mientras que la testosterona actúa como un elemento negativo sobre los mismos procesos en los adipocitos. Asimismo, se ha estudiado el dimorfismo sexual en la modulación de los efectos de la rosiglitazona en el TAB de ratas intolerantes a la glucosa, poniendo de manifiesto que el TAB gonadal de las hembras es más sensible a los efectos de la rosiglitazona que el de los machos. En conjunto, los resultados apoyan la existencia de una conexión entre función mitocondrial y síntesis de adiponectina en TAB y en músculo que estaría modulada por las hormonas sexuales.

L’homeòstasi cel·lular depèn, en part, de la proteòlisi regulada pel sistema Ubicuitina-Proteasoma (UPS). Aquesta proteòlisi inclou la degradació de les proteïnes defectuoses o innecessàries per la cèl·lula i consta de dues etapes. En un primer pas, molècules d’ubicuitina s’uneixen covalentment a un grup amino (ε-NH2) d’alguna lisina del substrat diana. Aquest procés depèn de l’activitat enzimàtica de tres enzims, E1, E2 i E3. Tot seguit, el proteasoma s’encarrega de la seva degradació. El proteasoma és un complex multiproteic en forma de túnel de 2,5 MDa present en el nucli i el citoplasma de totes les cèl∙lules eucariotes i Archaebacteria. La senyal típica de degradació és una cadena d’ubicuitines que es forma a través d’enllaços isopeptídics entre la glicina G76 a la part C-terminal de la molècula i la lisina K48 de la següent ubicuitina. Avui dia, s’han descrit tres receptors proteasomals de substrats poliubicuitinats, Rpn10, Rpn13 i Rpn15. La subunitat Rpn10 (Rpn10 en llevat de gemmació i S5a en humans), que també es troba en fraccions citosòliques, s’uneix a les cadenes de poliubicuitina mitjançant el domini UIM (Ubiquitin-interacting motif). Aquest domini és essencial per l’ubicuitinació del propi receptor. Els enzims involucrats en tal modificació són Uba1 (E1), Ubc4 (E2) i Rsp5 (E3). La poliubicuitinació de Rpn10 depèn de la participació d’una quarta ubicuitina lligasa, Hul5, i comporta la seva degradació proteasomal. Alhora, s’ha vist que una fracció de Rpn10 està conjugada a una sola molècula d’ubicuitina. Aquest tipus de modificació post-traduccional s’anomena monoubicuitinació. Quan Rpn10 està monoubicuitinat, deixa d’interaccionar amb substrats poliubicuitinats, afectant l’activitat proteolítica del proteasoma. Desxifrar els mecanismes pels quals Rpn10 es monoubicuitina ha estat l’objectiu d’aquesta tesi. La hipòtesi inicial és que la proteïna monoubicuitinada pateix un plegament provocat per l’interacció entre l’ubicuitina unida a Rpn10 i l’UIM. Aquest plegament bloquejaria l’UIM i no permetria l’addició de noves ubicuitines per part de la lligasa Rsp5. Per intentar validar la hipòtesi, hem començat optimitzant la reacció de monoubicuitinació de Rpn10 in vitro i hem trobat la seqüència mínima indispensable per obtenir tal monoubicuitinació. Hem observat que la meitat N-terminal de Rsp5, és dispensable per l’ubicuitinació de Rpn10 i hem vist que l’augment de la monoubicuitinació de Rpn10 causa un defecte en el creixement de les cèl·lules. Finalment, hem aconseguit poliubicuitinar Rpn10 in vitro, sense la participació de Hul5, mitjançant una mutació en bloc de la seqüència precedent l’UIM. Hem vist que aquesta seqüència està intrínsecament desestructurada i que la seva flexibilitat podria ser la raó per la qual l’UIM quedés inaccessible quan Rpn10 està monoubicuitinat. Un coneixement en profunditat del sistema ubicuitina-proteasoma és fonamental per trobar la cura de les patologies humanes derivades de seu mal funcionament. La feina que fem al nostre laboratori és la base per a que en un futur malalties que semblen estar relacionades amb l’UPS -malalties autoinmunes, neurològiques, càncer, cardiopaties...- tinguin un millor tractament. / La homeostasis celular depende, en parte, de la proteólisis regulada por el sistema Ubicuitina-Proteasoma (UPS). Esta proteólisis incluye la degradación de las proteínas defectuosas o innecesarias para la célula y consta de dos etapas. En un primer paso, moléculas de ubicuitina se unen covalentemente al grupo amino (ε-NH2) de alguna lisina del sustrato diana. Este proceso depende de la actividad enzimática de tres enzimas, E1, E2 y E3. Acto seguido, el proteasoma se encarga de su degradación. El proteasoma es un complejo multiproteico en forma de túnel de 2,5 MDa presente en el núcleo y el citoplasma de todas las células eucariotas y Archaebacteria. La señal típica de degradación es una cadena de ubicuitinas que se forma a través de enlaces isopeptídicos entre la glicina G76 en la parte C-terminal de la molécula y la lisina K48 de la siguiente ubicuitina. Hoy día, se han descrito tres receptores proteasomales de sustratos poliubicuitinados, Rpn10, Rpn13 y Rpn15. La subunidad Rpn10 (Rpn10 en levadura de gemación y S5a en humanos), que también se encuentra en las fracciones citosólicas, se une a las cadenas de poliubicuitina mediante el dominio UIM (Ubiquitin-interacting motif). Este dominio es esencial para la ubicuitinación del propio receptor. Las enzimas involucradas en tal modificación son Uba1 (E1), Ubc4 (E2) y Rsp5 (E3). La poliubicuitinación de Rpn10 depende de la participación de una cuarta ubicuitina ligasa, Hul5, y conlleva su degradación proteasomal. Asimismo, se ha visto que una fracción de Rpn10 está conjugada a una única molécula de ubicuitina. Este tipo de modificación post-traduccional se llama monoubicuitinación. Cuando Rpn10 está monoubicuitinada, deja de interaccionar con sustratos poliubicuitinados, afectando la actividad proteolítica del proteasoma. Descifrar los mecanismos por los cuales Rpn10 se monoubicuitina ha sido el objetivo de esta tesis. La hipótesis inicial es que la proteína monoubicuitinada sufre un plegamiento provocado por la interacción entre la ubicuitina unida a Rpn10 y el UIM. Este plegamiento bloquearía el UIM y no permitiría la adición de nuevas ubicuitinas por parte de la ligasa Rsp5. Para intentar validar la hipótesis, hemos empezado optimizando la reacción de monoubicuitinación de Rpn10 in vitro y hemos encontrado la secuencia mínima indispensable para obtener tal monoubicuitinación. Hemos observado que la mitad N-terminal de Rsp5 es dispensable para la ubicuitinación de Rpn10 y hemos visto que el aumento de la monoubicuitinación de Rpn10 causa un defecto en el crecimiento de las células. Finalmente, hemos conseguido poliubicuitinar Rpn10 in vitro, sin la participación de Hul5, mediante una mutación en bloc de la secuencia que precede al UIM. Hemos visto que esta secuencia está intrínsecamente desestructurada y que su flexibilidad podría ser la razón por la que el UIM quedaría inaccesible cuando Rpn10 está monoubicuitinada. Un conocimiento en profundidad del sistema ubicuitina-proteasoma es fundamental para encontrar la cura de las patologías humanas derivadas de su mal funcionamiento. El trabajo que hacemos en nuestro laboratorio es la base para que en un futuro enfermedades que parecen estar relacionadas con el UPS -enfermedades autoinmunes, neurológicas, cáncer, cardiopatías...- tengan un mejor tratamiento. / Cellular homeostasis depends, partially, on the proteolysis regulated by the Ubiquitin-Proteasome System (UPS). This proteolysis includes the degradation of misfolded, damaged or unnecessary proteins for the cell and comprises two phases. In the first stage, molecules of Ubiquitin are attached covalently to a target substrate at the amide group (ε-NH2) of some lysine residues. This process depends on the enzymatic activity of three enzymes, E1, E2 and E3. Afterwards, the proteasome takes care of the degradation of the substrate. The proteasome is a barrel-shaped multiprotein complex of 2,5 MDa present in the nucleus and cytosol of eukaryotic and Archaebacteria cells. The canonical degradation signal is a chain of ubiquitins, which is built via isopeptide bonds between the glycine G76 at the C-terminus of the molecule and lysine K48 of the next Ubiquitin. So far, three Ubiquitin proteasomal receptors, Rpn10, Rpn13 and Rpn15, have been described. The Rpn10 subunit that can also be found in an extraproteasomal pool, binds Ubiquitin chains by means of the Ubiquitin-binding motif (UIM). This domain is also essential for the ubiquitination of Rpn10 itself. The enzymes involved in this modification are Uba1 (E1), Ubc4 (E2) and Rsp5 (E3). Rpn10 polyubiquitination requires an additional Ubiquitin ligase, Hul5, and promotes Rpn10 degradation. However, a fraction of Rpn10 has been shown to be conjugated to only one Ubiquitin molecule, a type of post-translational modification that is called monoubiquitination. When Rpn10 is monoubiquitinated, its capacity to bind polyubiquitinated substrates is impaired, affecting the catalytic activity of the proteasome. The goal of this thesis is to decipher the mechanisms by which Rpn10 is monoubiquitinated. The initial hypothesis was that the monoubiquitinated protein undergoes a change in its conformation caused by the interaction between the Ubiquitin bound to Rpn10 and the UIM. This change would block the UIM and would not allow the conjugation of new ubiquitins by the ligase Rsp5. To validate the hypothesis, we started by optimizing the reaction of monoubiquitination of Rpn10 in vitro and we have determined the minimal sequence of Rpn10 required for this ubiquitination. We have shown that the N-terminus of Rsp5 is not essential for Rpn10 ubiquitination and observed that an increase in the levels of monoubiquitinated Rpn10 causes a slow-growth defect. Finally, we have been able to polyubiquitinate Rpn10 in vitro, independently of Hul5, via a mutation en bloc of the sequence that precedes the UIM. We have seen that this sequence is intrinsically unstructured and that its flexibility could be the reason why the UIM could be blocked when Rpn10 is monoubiquitinated. A detailed knowledge of the Ubiquitin-Proteasome System is essential to find the cure for the pathologies that derive from its malfunction. The work we do in our lab is the base for that, in a future, diseases that seem to be related to the UPS -autoimmune, heart or neurological diseases, cancer,…- have a better treatment.