Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422465-Texto+Completo-0.pdf: 2691735 bytes, checksum: 1455a538e61f307699a636bd9041725c (MD5) Previous issue date: 2010 / Systemic and cellular iron homeostasis is regulated by a series of proteins that control iron uptake, transport, storage and utilization. The neonatal period is critical for the establishment of iron content in the adult brain; also it is known that iron content increases in brain regions during the aging process. Abnormally high levels of iron are observed in the brain of patients suffering from neurodegenerative disorders however; the mechanisms involved in iron accumulation are poorly understood. In the present study we investigated the effects of aging and neonatal iron overload on the mRNA expression of proteins critically involved in controlling iron homeostasis: Transferrin Receptor (TfR), H-ferritin, IRP2, Divalent Metal Transporter 1 (DMT1), Ceruloplasmin (CP) and Hepicidin. Wistar rat pups received a single daily dose of vehicle (5% sorbitol in water) or iron (10 mg/kg of b. w. of Fe2+), at postnatal days 12-14. The mRNA expression of these proteins was analyzed by a semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction assay in cortex, hippocampus and striatum of rats sacrificed at three different ages (15-day-old; 90-day-old and 2-year old rats). Results indicate that TfR, H-ferritin and IRP2 mRNA expression was differentially affected by aging and by neonatal iron treatment in all three brain regions. We also found that DMT1 and CP mRNA expression is influenced by age in control rats. Moreover, our results suggest that neonatal iron treatment differentially impacts DMT1 mRNA expression in the cortex and striatum of young rats; and CP mRNA expression in the cortex of young rats, and in the hippocampus of aged rats. Hepcidin results indicate that neonatal iron treatment induced an increase in mRNA levels in hippocampus of young rats. These findings might have implications for the understanding of iron homeostasis misregulation associated with neurodegenerative disorders. / A homeostasia sistêmica e celular do ferro é regulada por uma série de proteínas que controlam a captação, o transporte, o armazenamento e a utilização deste metal. O período neonatal é crítico para o estabelecimento da concentração de ferro no cérebro adulto. Além disso, também se sabe que a concentração de ferro aumenta nas regiões cerebrais durante o processo de envelhecimento. Níveis anormalmente elevados de ferro são observados no cérebro de pacientes que apresentam doenças neurodegenerativas, entretanto os mecanismos envolvidos no acúmulo de ferro ainda não são claros. Neste estudo nós investigamos os efeitos do envelhecimento e da sobrecarga de ferro neonatal na expressão de RNAm de proteínas criticamente envolvidas no controle da homeostasia do ferro: Receptor de Transferrina (TfR), H-ferritina, IRP2, Transportador de Metal Divalente 1 (DMT1), Ceruloplasmina (CP) e Hepicidina. Ratos Wistar filhotes receberam uma única dose diária de veículo (5% sorbitol em água) ou ferro (10 mg/kg de peso corporal de Fe2+), do 12° ao 14° dia de vida pós-natal. As expressões de RNAm destas proteínas foram analisadas por RT-PCR, um método semi-quantitativo, no córtex, hipocampo e estriado de ratos sacrificados em três diferentes idades (15 dias; 90 dias e 2 anos de idade). Os resultados indicaram que a expressão de RNAm de TFR, H-ferritina a IRP2 foram diferentemente afetadas pelo envelhecimento e pelo tratamento neonatal com ferro nas diferentes regiões do cérebro estudadas. Também se observou que a expressão de RNAm de DMT1 e CP é influenciada pela idade nos ratos controle. Além disso, nossos resultados sugerem que o tratamento neonatal com ferro afeta de forma diferente a expressão de RNAm de DMT1 no córtex e estriado de ratos jovens; e a expressão de RNAm de CP no córtex de ratos jovens, e no hipocampo de ratos velhos. Com relação à Hepicidina, os resultados indicam que o tratamento com ferro no período neonatal induz um aumento nos níveis de RNAm no hipocampo de animais jovens. Estes resultados podem ajudar a entender de que maneira as alterações na homeostasia do ferro podem estar associadas à patogênese das doenças neurodegenerativas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000412283-Texto+Completo-0.pdf: 206533 bytes, checksum: d36786806733ccb638b5c63789b4581c (MD5) Previous issue date: 2009 / The zebrafish (Danio rerio) is a small freshwater teleost fish, belonging to family Cyprinidae, which can easily be kept in aquariums in laboratories. Most of its genes are already known, and its genome has a similarity with the human genome. Nicotine is an alkaloid that is present in the leaves of tobacco, binding to cholinergic nicotinic receptors in the central and peripheral nervous system that are initially activated and then inhibited. Nicotine stimulates the release of several neurotransmitters including acetylcholine (ACh), which is recognized by nicotinic cholinergic receptors, dopamine, norepinephrine, serotonin and glutamate. Pharmacological and toxicological effects of nicotine exposure have been frequently reported in literature. The neurotransmission mediated by ACh is essential for the proper functioning of the central nervous system. Based on their different affinities by agents that mimic the action of ACh, cholinergic receptors are divided into different classes: muscarinic and nicotinic. The nicotinic receptors are inotropic and recognize the ACh and nicotine. Once released in the synapses, ACh is degraded by the enzyme acetylcholinesterase (AChE) to acetate and choline, the latter being recaptured by the neuron. With the inhibition of AChE, the neurotransmitter ACh is not hydrolized in neuromuscular junctions, causing an abnormal amount of ACh in that area, leading to possible effects toxic. The gene that emodes AChE has been cloned and sequenced and this enzyme activity has been detected in zebrafish brain. Considering that: (i) exposure of nicotine may impair neurobehavioral performance and affect the central nervous system cholinergic pathways; (ii) in zebrafish, nicotine presented an inverted U-shaped dose-response curve with moderate doses improving cognitive function and higher doses having less of a positive effect, and (iii) zebrafish cholinergic system was already described, the aim of this study was to investigate the in vitro and in vivo acute effects of nicotine on acetylcholinesterase activity in zebrafish brain. The effect of nicotine in vitro promoted AChE inhibition at concentration of 500 (11, 02٪) and 1000μM (7, 73٪). The in vivo study of acute nicotine (3min and 20 min) did not alter significantly the enzyme activity in zebrafish brain at the doses tested. Still, possible effects of chronic treatment of nicotine on the activity of AChE must be searched. / O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno peixe teleósteo de água doce, pertencente à família Cyprinidae, que pode ser facilmente mantido dentro de aquários em laboratórios. A maioria dos seus genes já é conhecida, e o seu genoma tem uma relação de similaridade com o genoma humano. A nicotina é um alcalóide que está presente nas folhas do tabaco, atua nos receptores colinérgicos nicotínicos centrais e periféricos que são ativados e depois inibidos pela própria droga. A nicotina estimula a liberação de vários neurotransmissores incluindo a acetilcolina (ACh), que é reconhecida pelos receptores colinérgicos nicotínicos, dopamina, norepinefrina, serotonina e glutamato Efeitos tóxicos e farmacológicos causados pela exposição à nicotina têm sido frequentemente relatados na literatura. A neurotransmissão mediada pela ACh é fundamental para o correto funcionamento do SNC. Baseando-se em suas diferentes afinidades por agentes que mimetizam a ação da ACh, os receptores colinérgicos são divididos em duas classes distintas: muscarínicos e nicotínicos. Os receptores nicotínicos são ionotrópicos e reconhecem a ACh e a nicotina. Uma vez liberada nas sinapses, a ACh é degradada pela enzima acetilcolinesterase (AChE) em acetato e colina, sendo esta última recaptada pelo neurônio. Com a inibição da AChE, o neurotransmissor ACh não é hidrolizado nas junções neuromusculares, causando uma quantidade anormal de ACh nestes locais, levando a possíveis efeitos tóxicos. O gene da AChE já foi clonado e sequenciado e esta atividade enzimática já foi detectada em cérebro de peixe-zebra. Considerando que: (i) a exposição à nicotina pode causar danos a performace neurocomportamental e afetar o SNC, (ii) em peixe-zebra a nicotina apresenta uma curva de resposta de dose em U invertido, com moderadas doses melhorando as funções cognitivas e altas doses com menos efeitos positivos, e (iii) o sistema colinérgico em peixe-zebra já foi descrito; o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos in vitro e in vivo do tratamento agudo com nicotina sob a atividade da AChE no cérebro do peixe-zebra. O tratamento in vitro com nicotina nas doses de 500 (11,02٪) e 1000μM (7,73٪) promoveu inibição na atividade da AChE. No estudo in vivo o tratamento agudo com nicotina (3min e 20 min) não acarretou modificações significativas na atividade da enzima no cérebro do peixe-zebra, nas doses testadas. Ainda assim, possíveis efeitos do tratamento crônico da nicotina sob a atividade da AChE devem ser pesquisados.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000416220-Texto+Completo-0.pdf: 5780942 bytes, checksum: 72898bdecabb1e0a005cf610ebdcc238 (MD5) Previous issue date: 2009 / Cervix cancer is a worldwide problem, increasingly affecting women all over the globe which could lead to high mortality rates when not diagnosed in early stages. Virtually all cervical cancers has Human Papillomavirus (HPV) as a necessary cause. World Health Organization (WHO) estimates around 660 million people infected each year by the virus, besides being the most common viral Sexually Transmitted Disease (DST). HPVs are subdivided by type and subtype, carcinogenic risk (high or low risk) and by infection site (cutaneous, genital, etc). The high-risk HPV (HR-HPV) types 16 and 18 are responsible together for approximately 70% of the cervical cancer cases in the world, showing some prevalence differences among regions. Studies have provided increasing knowledge on HPV infection and oncogenic capacity, but some aspects are still to be elucidated, mainly due to technical and experimental difficulties. An important recent focus of HPV research has been the search for defining the structure and function of E6 and E7 viral oncoproteins and their molecular targets, aiming to find new targets and methodologies for the development of vaccines or drugs against HPV. In this work, our goal is to complement the available research on the tridimensional structure modeling of HPV 16 E6 protein, which interacts with tumor suppressor p53 as a main target, among others, leading to its degradation. The model on this work was developed by homology modeling, using the partial mutated experimental C-terminal model published by Nominé et al (2006) as template. The model we generated is a protein with two partially independent domains (N- and Cterminal) connected by a central linker that lacks a secondary structure. In spite the high tendency the protein has to intrinsic disorder, each domain of the final model maintained most of its topology throughout the aqueous solution simulation, indicating the good quality of our suggested model. / O câncer cervical é um problema que vem afetando cada vez mais mulheres de todo o mundo e, se não detectado em tempo, pode resultar em alta taxa de letalidade. Virtualmente todos os cânceres cervicais têm como agente causal essencial o Papilomavírus Humano (HPV). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que cerca de 660 milhões de pessoas são infectadas todos os anos, além de ser o vírus que causa Doenças Sexualmentes Transmissíveis (DST) mais comum do trato genital. Os HPVs são subdivididos em várias categorias, sendo classificados por tipo e subtipo, grau de risco (alto e baixo risco) e pelo sítio preferencial de infecção (cutâneo, genital, etc). Os HPV genitais de alto risco (HR-HPV) dos tipos 16 e 18 são responsáveis por aproximadamente 70% dos casos de câncer cervical no mundo, com alguma diferença de prevalência dependendo da região. Estudos têm aumentado muito o conhecimento acerca destes vírus nos últimos anos, mas algumas questões ainda ficam em aberto devido a dificuldades técnicas e experimentais. Um foco recente importante dos estudos sobre estes vírus tem sido buscar o entendimento sobre a estrutura e funções das oncoproteínas E6 e E7 e seus alvos moleculares, com intuito de buscar novos alvos ou metodologias para o desenvolvimento de vacinas ou fármacos contra o HPV. Neste trabalho, buscamos complementar os trabalhos já desenvolvidos na área de modelagem estrutural da proteína E6 de HPV 16, que tem como principal função a condução de p53, proteína celular supressora de tumores, à degradação. O trabalho foi desenvolvido através de modelagem por homologia utilizando como molde o modelo experimental parcial mutado publicado por Nominé et al (2006). O modelo obtido apresenta dois domínios parcialmente independentes (N- e C-terminal) ligadas por um conector central (linker) sem estrutura secundária definida. Apesar de a proteína apresentar grande tendência à desordem intrínseca, os domínios mantiveram a maior parte de suas topologias ao longo da simulação em meio aquoso, indicando boa qualidade do modelo sugerido.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000430781-Texto+Completo-0.pdf: 5344417 bytes, checksum: ac9d8005af7e08aa4f34ebcea8bacac1 (MD5) Previous issue date: 2010 / The aim of this research was to determine the role in the modulation of inflammation of Fructose-1,6-bisphosphate, in experimental C. albicans-induced sepsis, and in COX-2, IL-6 and NF-Kappa B gene expression, NOx production and expression of iNOS in macrophages. Intratracheal sepsis model was performed in CF-1 mice, using fluconazole-resistant and -susceptible strains of C. albicans. FBP (500mg/Kg) was administered to mice at the time of operation in Sepsis + FBP Group. Five to six animals from each group were killed 24h, 5 days, and 10 days after the sepsis induction. Blood was taken for assessment of complete hematological profile and cytokine assay (IL-6 and MCP-1). The rest of the mice were observed for mortality. In order to determine the possible anti-inflammatory mechanism of FBP, a series of transfections in RAW macrophages using COX-2, IL-6 and NF-Kappa B promoters has been conducted. The NO production by macrophages and iNOS expression in RAW has been determined. We also investigate the regions of COX-2 promoter gene that mediate the inductive effects of zymosan. Transient transfections with a series of COX-2 promoter–mutation constructs were performed to further elucidate the effects of zymosan on COX-2 transcription. Mortality decreased significantly in groups that received FBP in C. albicans susceptible to fluconazole group. All cytokine and hematological indexes of FBP group were similar to sepsis group, with exception of platelets count. FBP significantly prevented the decrease in platelets count. FBP does not seem to act in the transcription of COX-2, IL-6, and NF-Kappa B. FBP reduced amounts of NOx levels in BAL fluid through the inhibition of expression of iNOS. Exposure to zymosan (50 g/mL for 24 h) markedly enhanced the relative luciferase activity in RAW 264. 7 macrophages transfected with COX-2 luciferase promoter constructs. Deletion on the CCAAT-enhancer binding protein (C/EBP) and nuclear factor kappa B (NF-kappa B) binding site resulted in an important decrease in reporter gene activity and a deletion of NF-kappa B and C/EBP with mutation of the cyclic adenosine monophosphate response element (CRE) and/or activator protein-1(AP-1) totally abolished the COX-2 activity induced by zymosan. / O objetivo deste estudo foi determinar o papel da Frutose-1,6-bisfosfato na modulação do processo inflamatório na sepse induzida por C. albicans, na expressão de COX-2, IL-6 e NF-Kappa B e na produção de NO e expressão de iNOS em macrófagos. Um modelo de sepse intratraqueal foi realizado em camundongos CF-1 utilizando cepas de C. albicans sensíveis e resistentes ao fluconazol. FBP(500mg/kg) foi administrada aos animais no momento no momento da indução no grupo Sepse+FBP. Cinco a seis animais de cada grupo foram mortos 24h, 5dias e 10 dias após a indução de sepse. O sangue foi coletado para a realização do perfil hematológico completo e para o ensaio das citocinas (IL-6 e MCP-1). O restante dos animais foram utilizados para dados de mortalidade. A fim de determinar o possível efeito anti-inflamatório da FBP, uma série de transfecções utilizando promotores dos genes COX-2, IL-6 e NF-Kappa B foram realizados em células RAW. A produção de NO em macrófagos e a expressão de iNOS em RAW também foi realizada. Investigamos ainda as regiões do promotor do gene da COX-2 que realizam a mediação dos efeitos do zymosan. Transfecções transientes com uma série de contruções com mutações na região promotora da COX-2 foram realizadas para elucidar os efeitos do zymosan na transcrição da COX-2. A mortalidade diminuiu significativamente nos animais que receberam FBP após indução no grupo C. albicans sensível ao fluconazol. As citocinas e os índices hematológicos foram similares ao grupo sepse, com exceção da contagem de plaquetas. A FBP previne significativamente o decréscimo do número de plaquetas. A FBP parece não atuar na transcrição de COX-2, IL-6 e NF-Kappa B. A FBP reduziu os níveis de NO no lavado bronco-alveolar através da inibição da expressão de iNOS.A exposição ao zymosan (50μg/ml por 24h) marcadamente aumenta a atividade relativa de luciferase em macrófagos RAW transfectados com o promotor da COX-2. Deleções nos sítios de ligação C/EBP e NF-Kappa B resultam em um importante decréscimo na atividade do gene repórter e uma deleção no sítio NF-Kappa B e C/EBP com mutações nos sítios CRE e/ou AP-1 anula a atividade da COX-2 induzida por zymosan.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437674-Texto+Completo-0.pdf: 1507951 bytes, checksum: 2f5468fe0bdb2401a723df07c96e2c43 (MD5) Previous issue date: 2011 / Acinetobacter baumannii is an important opportunistic pathogen commonly associated with nosocomial infections, especially in patients hospitalized in intensive care units (ICUs). This microorganism is renowned for its ability to survive under adverse conditions in the environment for extended periods, as well as to rapidly acquire resistance to antimicrobial drugs. Nowadays, the increasing antimicrobial resistance of A. baumannii has been a great challenge for the medical community, since there are few effective options for the treatment of infections caused by this organism. The aim of this study was to evaluate the presence of the A. baumannii from an ICU environment and to characterize the antimicrobial drug resistance of the isolates obtained, as well as of the isolates from patients in ICU of the same hospital in which it was collected environmental samples. For this, 886 environmental and gloves samples were collected from an ICU of São Lucas Hospital, Porto Alegre, Brazil, and 46 clinical isolates were obtained from the Laboratory of the same hospital. After the identification of the isolates as A. baumannii by PCR using as target 16S rDNA and blaOXA-51 genes, the resistance to 20 antimicrobial drugs and the production of metallo-beta-lactamases were evaluated in isolates presenting carbapenem reduced susceptibility. Also, it was evaluated the presence of integrons and blaOXA-23 and blaIMP genes by PCR. A. baumannii was identified in 9. 6% of environmental and glove samples collected. High percentage of multiresistant (MDR) isolates was found, as well as it was detected high rates of reduced susceptibility to carbapenems. All 89 isolates integron positive were MDR. Between isolates with reduced susceptibility to carbapenems, all presented blaOXA-23, and 41. 4% non-clinical and 54% clinical carried the blaIMP. High resistance to polymyxin B was detected, mainly in non-clinical isolates. Although high prevalence has been found in clinical and non-clinical isolates, the latter constitute a great concern, because they can indicate the hospital environment as a reservoir of MDR A. baumannii. / Acinetobacter baumannii é um importante patógeno oportunista comumente associado a infecções nosocomiais, especialmente em pacientes hospitalizados em unidades de tratamento intensivo (UTIs). Este organismo é reconhecido por sua capacidade de sobreviver em condições adversas no ambiente por períodos prolongados, bem como de facilmente adquirir resistência a drogas antimicrobianas. Atualmente, a crescente resistência antimicrobiana de A. baumannii tem constituído um grande desafio para a comunidade médica, uma vez que existem poucas opções efetivas para o tratamento de infecções causadas por este microrganismo. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de A. baumannii no ambiente de uma UTI e caracterizar a resistência a drogas antimicrobianas dos isolados obtidos, bem como de isolados de pacientes internados na UTI do mesmo hospital no qual as amostras ambientais foram coletadas. Para tanto, 886 amostras ambientais e de luvas foram coletadas de uma UTI do Hospital São Lucas, Porto Alegre, Brasil, e 46 isolados clínicos foram obtidos no Laboratório do mesmo hospital. Após a identificação dos isolados como A. baumannii através de PCR utilizando como alvos os genes rDNA 16S e blaOXA-51, foram determinadas a resistência a 20 drogas antimicrobianas previstas pelo CLSI e a produção de metalo-betalactamases em isolados com suscetibilidade reduzida aos carbapenêmicos. Também foi avaliada a presença de integrons e dos genes blaOXA-23 e blaIMP através de PCR. A. baumannii foi identificado em 9,6% das amostras ambientais e de luvas coletadas. Obteve-se um alto percentual de isolados multirresistentes (MDR), assim como foram detectadas alta taxas de suscetibilidade reduzida aos carbapenêmicos. Todos os 89 isolados que apresentaram integrons foram MDR. Dentre os isolados com suscetibilidade reduzida aos carbapenêmicos, todos apresentaram o gene blaOXA-23, e 41,4% não-clínicos e 54% clínicos carrearam o gene blaIMP. Alta resistência à polimixina B foi detectada, principalmente em isolados não-clínicos. Embora alta prevalência de resistência antimicrobiana tenha sido encontrada em isolados clínicos e não clínicos, os últimos constituem grande preocupação, pois podem indicar o ambiente hospitalar como um reservatório de A. baumannii MDR.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000442974-Texto+Completo-0.pdf: 1168003 bytes, checksum: 61a64ae8027da7ef2e5ef378d8f25eb3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Breast cancer is an important cause of morbidity and mortality in Brazil and worldwide. New therapeutic strategies have been proposed and one of them is the use of cell therapy with dendritic cells (DCs), however, the literature regarding the real benefit of this approach shows great variability and inability to produce a lasting immunity. In this paper we made a detailed characterization of monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) of patients with breast cancer and monocytes that originated them. A lower yield of MoDCs was obtained from patients when compared to age matched healthy controls. Patient MoDCs exhibited decreased expressions of maturation and activation markers. Furthermore, cultures of MoDCs of patients had significantly elevated levels of spontaneous production of IL-6, which is consistent with a pro-tumor phenotype. These differences in molecule expression and cytokine production led us to postulate that the signaling pathways and / or the expression of toll like receptors (TLRs) could be altered.A decrease of TLR9 and TLR2 and an increase in the expression of NFkBp50 was found in MoDCs of patients without stimulation. After stimulation with LPS and CPG the patients did not upregulate expression of MyD88, suggesting a downregulation of the signaling pathways activated by these molecular patterns. The number of monocytes was also were decreased in patients, showing a reduced expression of GM-CSF receptors compared to monocytes of healthy controls. Cytokine production by monocytes from cancer patients was also altered, with an increased production of IL-6, IL-4 and IL-10. TLR2 and TLR9 expression was downregulated in monocytes of patients. Together these data show that monocytes are already altered in patients with cancer, and that will influence the phenotype of DCs differentiated from them. Tumor burden seems to induce a tolerogenic and pro-tumoral phenotype in patients´cells. This finding is important for the development of DC-based cancer immunotherapy. / A neoplasia mamária é uma causa importante de morbidade e mortalidade no Brasil e no mundo. Novas estratégias terapêuticas vem sendo propostas e uma delas é a utilização de terapia celular com células dendríticas (DCs), entretanto, os dados da literatura em relação ao real benefício desta abordagem apresentam grande variabilidade e inabilidade em produzir uma imunidade duradoura. No presente trabalho fizemos uma caracterização detalhada das células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) das pacientes com câncer de mama e dos monócitos que as originaram. As MoDCs das pacientes são obtidas com um menor rendimento quando comparadas a controles saudáveis pareados por idade, e exibem uma diminuição nos marcadores de maturação e ativação. Além disso, as culturas de MoDCs das pacientes apresentaram altos níveis de IL-6, o que é compatível com um fenótipo pró-tumoral. Essas diferenças na produção de citocinas nos levou a postular que as vias de sinalização e/ou a expressão de toll like receptors (TLRs) poderiam estar alteradas. Observamos uma diminuição de TLR9 e TLR2 e um aumento na expressão de NFkBp50 nas MoDCs das pacientes, sem estímulo. Após estímulo com LPS e CPG as pacientes não aumentaram a expressão de MyD88, sugerindo uma diminuição Ada via de sinalização da resposta a esses padrões moleculares. Quando analisamos os monócitos, eles também estavam diminuídos nas pacientes, e apresentavam uma expressão de receptores para GM-CSF inferior a dos controles saudáveis. A produção de citocinas pelos monócitos das pacientes com câncer também estava alterada com uma produção aumentada de IL-6, IL-4 e IL-10. A frequência de TLR9 e TLR2 estava diminuída nos monócitos das pacientes. Esses dados conjuntamente demonstram que os monócitos já estão alterados nas pacientes com câncer, assim como as DCs diferenciadas a partir deles. O crescimento tumoral parece induzir um fenótipo de tolerância nestas células. Esse dado é de fundamental importância para o desenvolvimento de imunoterapia baseada em DCs.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000445049-Texto+Completo-0.pdf: 985835 bytes, checksum: 6999f9525f1cf085ddde3a6a0fb67e0b (MD5) Previous issue date: 2012 / The presence of Bacillus spp. in milk is an important problem for the dairy industry due to their capability of sporulation and the possibility of spore resistance to heat treatment by ultra high temperature (UHT). Bacillus sporothermodurans survive to the UHT system, germinating and growing in stored milk and, if not correctly identified and quantified, can exceed the criterion established for mesophilic aerobic, besides altering the quality of dairy products when in high concentrations. On the other hand, contamination of milk by Bacillus cereus is not only an important cause of deterioration, but is also associated with the occurrence of diarrhea and emetic syndromes. Traditionally, these microorganisms are identified and quantified in food using conventional microbiological techniques, but the Polymerase Chain Reaction (PCR) based methods have been widely used for the same purpose. However, PCR cannot distinguish between viable and dead cells, which can be overcame with the use of DNA intercalating, such as propidium monoazide (PMA). PMA binds to DNA derived from cells with damaged membranes, preventing their amplification by PCR, allowing, thus, the selective detection of viable cells. Therefore, this thesis aimed to characterize the thermal resistance of B. sporothermodurans and to develop methods of detection and quantificatification of viable cells of B. sporothermodurans and B. cereus in milk samples by qPCR associated with PMA. Isothermal and non-isothermal treatments allowed the determination of the profile of heat resistance of B. sporothermodurans spores to heat UHT process, predicting that to 121°C was found a D value between 2 a 4 min. The selective detection and quantification of B. sporothermodurans and B. cereus by PMA-qPCR were developed targeting 16S rRNA gene and hemolysin gene, respectively. The treatment with PMA from pure culture and artificially contaminated UHT milk were standardized by end-point PCR for the detection of viable cells of these microorganisms. The inhibition of amplification of DNA from dead cells was obtained at a concentration of 30μg/mL PMA. The standardization of qPCR assays were performed using hydrolysis probes (TaqMan® system) specific to each target gene. The quantification limit from UHT milk artificially contaminated was 2. 5 x 102 CFU/mL for B. sporothermodurans and 7. 5 x 102 CFU/mL for B. cereus. The assays were applied to 135 samples of UHT milk of different commercial brands, comparing with the conventional method of cultivation for each microorganism. B. sporothermodurans and B. cereus were respectively detected in 14 (10. 4%) and 44 (32. 6%) of the samples by molecular methods developed, and in 11 (8. 1%) and 15 (11. 1%) by conventional culturing methods. The PMA-qPCR methods developed in this study were specific and sensitive for the detection and quantification of viable B. sporothermodurans and B. cereus cells, being applicable for the evaluation of milk samples, reducing the time for the analysis of this product. Furthermore, the results showed that B. cereus can be found in UHT milk. / A presença de Bacillus spp. em leite representa um importante problema para a indústria de laticínios devido à sua capacidade de esporulação e à possibilidade de resistência do esporo ao tratamento térmico por ultra alta temperatura (UAT). O Bacillus sporothermodurans sobrevive ao sistema UHT, germinando e se multiplicando no leite estocado e, caso não seja corretamente quantificado e identificado, pode ultrapassar o limite estabelecido pela legislação para microrganismos mesófilos aeróbios, além de alterar a qualidade dos produtos lácteos quando em altas concentrações. Por outro lado, a contaminação de leite por Bacillus cereus constitui não somente uma importante causa de deterioração, mas também está associada com a ocorrência das síndromes emética e diarreica. Tradicionalmente, estes microrganismos são identificados e quantificados em alimentos através de técnicas clássicas de cultivo, mas métodos baseados na Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) também têm sido amplamente utilizados. Entretanto, a PCR não distingue células mortas de células viáveis, o que pode ser contornado com o emprego de intercalantes de DNA, como o propídio monoazida (PMA). O PMA se liga ao DNA derivado de células com membranas rompidas, impedindo suas amplificações na PCR, permitindo, assim, a detecção seletiva de células viáveis. Portanto, a presente tese teve por objetivo caracterizar a resistência térmica de B. sporothermodurans, bem como desenvolver métodos de detecção e quantificação de células viáveis de B. sporothermodurans e de B. cereus em amostras de leite através de PCR associada ao PMA. Tratamentos isotérmicos e não isotérmicos permitiram a determinação do perfil de resistência térmica de esporos de B. sporothermodurans ao processo UHT, predizendo que a 121°C foi encontrado um valor D entre 2 a 4 min.A detecção e quantificação seletivas de B. sporothermodurans e de B. cereus através de PMA-qPCR foram desenvolvidas utilizando o gene RNAr 16S e o gene da hemolisina como alvos, respectivamente. O tratamento com PMA a partir de cultura pura e leite UHT artificialmente contaminado foi padronizado através da PCR convencional para a detecção de células viáveis destes microrganismos. A inibição da amplificação de DNA de células mortas foi obtida na concentração de 30μg/mL de PMA. A padronização dos ensaios de qPCR foram realizados utilizando sondas de hidrólise (sistema TaqMan®) específicas para cada gene alvo. O limite de quantificação a partir de leite UHT artificialmente contaminado foi de 2,2 x 102 UFC/mL para B. sporothermodurans e de 7,5 x 102 UFC/mL para B. cereus. As técnicas foram aplicadas a 135 amostras de leite UHT de diferentes marcas comerciais, comparando com a metodologia clássica de cultivo para cada microrganismo. B. sporothermodurans e B. cereus foram, respectivamente, detectados em 14 (10,4%) e 44 (32,6%) das amostras analisadas pelos métodos moleculares desenvolvidos, e em 11 (8,1%) e 15 (11,1%) pelos métodos convencionais de cultivo. Os métodos de PMA-qPCR desenvolvidos neste estudo foram específicos e sensíveis para a detecção e quantificação de células viáveis de B. sporothermodurans e de B. cereus, mostrando-se aplicáveis para serem utilizados na avaliação de amostras de leite, reduzindo o tempo de análise deste produto. Além disso, os resultados demonstraram que B. cereus pode ser encontrado em leite tratado pelo sistema de UHT.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000392209-Texto+Completo-0.pdf: 426995 bytes, checksum: 609202380687c41a2d2de632a69b5931 (MD5) Previous issue date: 2007 / Endothelial nitric oxide (NO) is an important factor for the regulation of vascular tonus and it was suggested to be involved in many events of the atherogenic process. The endothelial rupture of coronary plaque can represent the pathomorphological substratum of the acute coronary syndrome (ACS). The polymorphisms in the gene that code the eNOS (NOS3) -786T>C (in the promoter region), 894G>T (exon 7) and intron 4 a/b VNTR, can be associated with a higher susceptibility to ACS. The present study investigated the interaction of these polymorphisms (allelic frequencies, genotypes and haplotypes) and cardiovascular risk factors in 135 patients with ACS and 115 control subjects. We did not find statistical association between genotypic and allelic frequencies between the studied groups. We did find association to TT genotype (894G>T) compared to GT+GG (OR 1,4; 95% ci 1,0-1,8). No significant interactions were found among cardiovascular risk factors and both -786T>C and intron 4 a/b polymorphisms. Subjects without dyslipidemia and Intron 4 a/b genotype presented a lower chance to ACS development. Subjects without diabetes and 894TT genotype showed higher risk to ACS (OR 1. 64, 95% CI 1. 18-2. 26). Patients without dyslipidemia and 894GG genotype shows a tendency to act as a protector factor to ACS (OR 0. 77, 95% CI 0. 59-1. 00). Also, the GG genotype was a protective factor against ACS in females (OR 0. 48, 95% CI 0. 24-0. 94). Our results suggest that eNOS polymorphisms are not independent risk factor, but that act as an additional risk factor in development of ACS. / O óxido nítrico endotelial (NO) é um importante fator para a regulação do tônus vascular e foi sugerido que o mesmo está envolvido em muitos eventos de processos aterogênicos. A ruptura da placa endotelial pode representar o substrato patomorfológico da síndrome coronariana aguda (SCA). Os polimorfismos no gene que codifica para eNOS (NOS3) -786T>C (na região promotora), 894G>T (exon 7) e o VNTR no Intron 4, podem estar envolvidos com uma maior suscetibilidade a SCA. O presente estudo investigou a interação destes polimorfismos (freqüências alélicas, genotípicas e haplótipos) e fatores de risco cardiovascular em 135 pacientes com SCA e 115 controles. Não encontramos associação estatística entre as freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos estudados. Encontramos associação para o genótipo TT (894G>T) comparado ao GT+GG (OR 1,4; IC 95% 1,0-1,8).Nenhuma interação significativa foi encontrada entre os fatores de risco cardiovascular e os polimorfismos -786T>C e VNTR intron 4 a/b. Indivíduos sem dislipidemia e com o genótipo intron 4 a/b apresentaram menores chances de desenvolver SCA. Indivíduos sem diabetes e com genótipo 894TT demonstraram maior risco para SCA (OR 1. 64, IC 95% 1. 18-2. 26). Pacientes sem dislipidemia e com genótipo 894GG tiveram uma tendência a ser fator protetor para SCA (OR 0. 77, IC 95% 0. 59-1. 00). Também, o genótipo 894GG foi fator protetor contra SCA no sexo feminino (OR 0. 48, IC 95% 0. 24-0. 94). Os resultados sugerem que os polimorfismos de eNOS estudados não são fatores de risco independente, mas que eles atuam como um fator de risco adicional no desenvolvimento de SCA.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000389451-Texto+Parcial-0.pdf: 5571098 bytes, checksum: 770defaacf3399bd51f2eda83ca17963 (MD5) Previous issue date: 2007 / Protein-DNA comples assembling depends on amino acid side chains and nucleotides charge complementarity (direct readout mechanism) and on recognition by the protein os an already existing or induced three-dimensional DNA conformation (indirect readout mechanism). The PDEF protein is a transcriptional factor of genes related with cancer development in tissues under sexual hormones regulation, mainly prostate and mammary epithelia. Similar to the other proteins of the ETS family, PDEF binds DNA sequences through its ETS domain, which characterizes this family of transcription factors. Experimental studies indicate that ETS proteins are more dependable on indirect readout mechanism for complex formation, where the structure adopted by the DNA double helices has greater influence on the protein blinding affinity than the nucleotide sequence. While most ETS have high affinity for the nucleotide core seqeence 5'-GGAA-3' and low affinity to 5'-GGAT-3', PDEF blinds with high affinity the core sequence 5'-GGAT-3' and did not blind 5'-GGAT-3' sequences at all. PDEF has unique amino acid substitutions on the helix that blinds DNA in the major groove. In order to evaluate these amino acid substitutions consequences and the effect of base pair replacement on ETS blinding site on DNA's three-dimensional conformation, and consequently on protein-DNA affinity, we performed bioinformatics analyses on the ETS protein sequences and protein-DNA binding pattern analyses, as well as molecular dynamics simulation of 13 base-pairs DNA sequences with PDEF's high (GGAT), low (GGAG) and null (GGAA) affinity binding site. Bioinformatics analyses and molecular dynamics simulations results indicate that the protein amino acids substitutions and the altered hydrogen bonds donor and acceptor exposed on the major groove of the DNA (direct readout mechanism), along with conformational changes induced by base pair replacement on protein binding site position +4 (indirect readout mechanism) seems to be responsible for PDEF distinct binding pattern. However, non-conserved residues that contact DNA and the greater number of unspecific protein side chain hydrogen bonds to the DNA's main chain phosphates point out to the intramolecular readout mechanism as the most important recognition mode for ETS proteins. / A formaçao dos complexos proteína—DNA depende da complementaridade de cargas entre as cadelas laterals dos aminoácidos que compöern a protelna e os nudeotIdeos que compOern a cadeia de DNA (reconhecimento direto) e do reconhecirnento da estrutura, da conformaçao tridimensional, adotada ou capaz de ser adotada pela cadeia de DNA (reconhecimento indireto). A proteína PDEF está relacionada com o controle da transcrição de genes responsáveis pelo desenvolvimento de tumores em tecidos sujeitos à regulação por hormônios sexuais; principalmente câncer de mama e de próstata. Assim como as demais proteínas da família ETS de fatores de transcrição, a PDEF reconhece e se liga à cadeia de DNA através do domínio ETS, que caracteriza esta família. As proteínas ETS apresentam maior dependência dos fatores de reconhecimento indiretos na formação dos complexos proteína - DNA. Ou seja, a conformação adotada pela cadeia de DNA tem maior influência sobre a afinidade de ligação da proteína do que a própria seqüência de nucleotídeos. Ao contrário das demais proteínas ETS, que reconhecem com alta afinidade a seqüência 5’-GGAA-3’, e apresentam baixa ou nenhuma afinidade pela seqüência 5’-GGAT-3’, a proteína PDEF apresenta alta afinidade de ligação pela seqüência 5’-GGAT-3’ e não forma complexos com cadeias de DNA que contenham o sítio de ligação 5’-GGAA-3’. A PDEF apresenta ainda substituições únicas de aminoácidos na hélice de reconhecimento da cadeia de DNA. Para avaliar os efeitos destas substituições de aminoácidos e das substituições de pares de base no sítio de ligação da proteína na conformação tridimensional da cadeia de DNA, e consequentemente, na afinidade de ligação entre proteína e DNA, foram realizadas análises das seqüências de aminoácidos das proteínas ETS e das interações observadas experimentalmente na interface proteína-DNA e simulações pela dinâmica molecular dos tridecâmeros de DNA que contêm as seqüências de alta e de baixa afinidade pela proteína PDEF (GGAT e GGAG, respectivamente) e do sistema controle sem afinidade de ligação, GGAA. Os resultados das análises e das simulações pela dinâmica molecular indicam que as alterações na seqüência de aminoácidos da proteína, e a substituição dos grupamentos expostos no sulco maior da cadeia de DNA (padrão de reconhecimento direto, ou intermolecular), aliados a alterações na conformação da cadeia de DNA induzidas pelas substituições das bases na posição +4 do sitio de ligação (padrão de reconhecimento indireto ou intramolecular) parecem ser responsáveis pelo padrão de afinidade distinto da PDEF. No entanto, a não conservação dos resíduos que interagem com a cadeia de DNA, e a grande número de contatos não específicos com a cadeia fosfato-açúcar corroboram o padrão de leitura intramolecular como o principal mecanismo de reconhecimento da cadeia de DNA pelas proteínas ETS.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000391320-Texto+Completo-0.pdf: 471273 bytes, checksum: c2ed17923e23797f5ce8bb0432ca133d (MD5) Previous issue date: 2007 / Objetivo: Investigar se há associação entre as variantes polimórficas 896A>G (Asp299Gly) e 1196C>T (Thr399Ile) do gene que codifica para o toll like receptor 4 (TLR4) e a suscetibilidade a sepse e às disfunções orgânicas em pacientes com condições críticas de saúde. Pacientes e Métodos: Foram selecionados para este estudo 107 pacientes com sepse secundária a infecção por bactérias Gramnegativas, internados na unidade de tratamento intensivo geral (UTI) do Hospital São Lucas da PUCRS, admitidos de março de 2002 a dezembro de 2005. O grupo controle foi constituído por 111 amostras de DNA de doadores voluntários oriundos da mesma população gaúcha. A disfunção orgânica dos pacientes sépticos foi avaliada durante a primeira semana após admissão na UTI, através do escore SOFA, e foram consideradas as ocorrências de choque séptico e óbito. Os genótipos das variantes polimórficas 896A>G e 1196C>T foram determinados por análise de fragmentos de restrição dos produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR). Após, foi analisada a freqüência da distribuição dos genótipos e dos alelos entre os grupos de pacientes e de indivíduos saudáveis. Resultados: A freqüência de heterozigotos 896AG foi significativamente mais elevada entre pacientes sépticos (26%; 28/107) do que entre indivíduos saudáveis (10%; 11/111) (P=0,002; OR=3,22, CI95%: 1,43-7,38), da mesma forma como foi mais elevada se comparados pacientes com choque séptico (24%; 18/74) e saudáveis (P=0,008; OR=2. 92, CI95%: 1,20-7,17). Correspondentemente, houve maior freqüência do alelo 896G entre pacientes sépticos (13%; 28/214) que controles (5%; 11/222) (P=0,003; OR=2,89, CI95%: 1,33- 6,36), e entre pacientes com choque séptico (14%; 18/148) que indivíduos saudáveis (P=0,011; OR=2,66, CI95%: 1,15-6,23). Pacientes 1196CT+1196TT apresentaram escores SOFA médios mais altos (8. 12±3. 89) que pacientes 1196CC (6. 82±3. 52) (Mann-Whitney test, P=0,007). Portadores do alelo 1196T apresentaram durante a primeira semana de internação na UTI significativamente mais casos de escores SOFA ³ 7 (69%; 49/71) que homozigotos 1196CC (49%; 304/626) (Chi-square test, P=0,043; OR=1. 62, CI95%:0. 99-2. 67). Nós observamos que a herança de qualquer tipo de alelo não interfere nas taxas de mortalidade dos pacientes. Conclusão: As variantes polimórficas -896A>G e 1196C>T do TLR4 podem estar associadas com a uma maior suscetibilidade ao desenvolvimento de disfunções orgânicas graves e sepse nos pacientes críticos.