Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000426061-Texto+Completo-0.pdf: 815660 bytes, checksum: a63907607c66f42025ef148afc7c6471 (MD5) Previous issue date: 2010 / The neurotrophic factor known as BDNF has attracted considerable attention in the scientific literature, due to its involvment in critical processes related to the development and regulation of the nervous system. However, many aspects of this molecule are still unknown, while others have only been investigated in humans and model organisms. In this context, bioinformatic tools can be very useful to perform comparative analyses focusing on evolutionary, structural and functional aspects of this protein. This study aimed to characterize the patterns of conservation and variability in this molecule through the comparison of coding sequences in different mammalian lineages, as well as to investigate structural aspects by constructing a novel 3D model of a BDNF homodimer that is consistent with experimentally validated data. Our results revealed very interesting patterns of conservation and variability in different lineages, including strong evidence for the occurrence of negative natural selection (indicating constraints to evolutionary change implying functional relevance) in both the mature and the pro domains. In addition, we observed evidence of positive selection (induction of changes that are likely adaptive) in different lineages, in every case directly affecting the pro domain. These results indicate that the pro domain presents great functional relevance, and highlight the importance of focusing research efforts on this portion of BDNF. / O fator neurotrófico conhecido como BDNF tem atraído considerável atenção na literatura científica, pelo seu envolvimento em processos cruciais de desenvolvimento e regulação do sistema nervoso. Entretanto, muitos aspectos desta molécula são ainda desconhecidos, enquanto outros foram investigados apenas em humanos e organismos-modelo. Neste contexto, ferramentas de bioinformática podem ser muito úteis para realizar análises comparativas enfocando aspectos evolutivos, estruturais e funcionais. Este projeto objetivou uma caracterização de padrões de conservação e variação desta molécula através da comparação das seqüências codificantes deste gene em diferentes linhagens de mamíferos, assim como uma investigação de aspectos estruturais através da construção de um modelo 3D do BDNF consistente com dados experimentais. Os resultados revelam padrões bastante interessantes de conservação e variação de sequência em diferentes linhagens, incluindo fortes evidências da ocorrência de seleção natural negativa (indicando restrição à mudança devido à relevância funcional) tanto no domínio maduro como no domínio pro. Além disso, observou-se evidência de seleção positiva (indução de mudanças possivelmente adaptativas) em diferentes linhagens, em todos os casos afetando diretamente o domínio pro. Estes resultados indicam que o domínio pro apresenta grande relevância funcional, e salientam a importância de focar esforços de investigação experimental nesta porção do BDNF.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431346-Texto+Completo-0.pdf: 1084858 bytes, checksum: bfb1c0acb189347c0999c9608ad1773c (MD5) Previous issue date: 2011 / Introduction: Acetaminophen (APAP) is a potent antipyretic and analgesic agent, with weak anti-inflammatory effects. Despite its efficacy, the use of elevated doses of APAP is associated with severe hepatotoxicity. It has been suggested that treatment with angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors, such as captopril, might present protective effects in the acute intoxication evoked by APAP, although further studies are still required to prove this hypothesis. In this context, the present study investigated the effects of both prophylactic and therapeutic treatment with the highly potent ACE inhibitor enalapril, on the hepatotoxicity induced by APAP in mice. Methods: Male and Female C57BL/6 mice (6-10 per group, 20-25 g) were used. All the experimental protocols were approved by the Local Ethics Committee (09/00119 - PUCRS). For the prophylactic treatment, animals were pretreated orally with enalapril (30 mg/kg), once a day, during 4 days before APAP administration. On the fifth day, the hepatotoxicity was induced by a single dose of APAP (400 mg/kg, i. p. ). The animals received two additional doses of enalapril 1 h before, and 6 h after APAP administration. Mice were euthanized 24 h after APAP injection. The following parameters were assessed: macroscopic and histological alterations of livers, serum levels of alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST), determination of catalase activity (CAT) and reduced glutathione concentration (GSH), measurement of neutrophil migration (MPO) and TNFα production in liver slices, and immunohistochemistry analisys of caspase-3 liver expression. The effects of enalapril were also assessed on the same parameters of hepatotoxicity in a therapeutic protocol, in which the animals received APAP (400 mg/kg i. p. ), and enalapril (30 mg/kg) was dosed orally 3 h after administration of APAP. 16 Subsequently, mice received three additional doses of enalapril, at intervals of 3 h each. N-acetylcysteine (NAC; 50 mg/kg) was used as a positive control drug, at the same schedules of treatment. Results: The oral administration of enalapril produced a significant reduction of hepatotoxicity induced by APAP, according to the macroscopic evaluation of livers (71 ± 10%).The histological analysis revealed that samples obtained from APAP control animals presented necrosis in three to four layers of hepatocytes, accompanied by layers of centrilobular degeneration, while those pretreated with enalapril showed minimal necrosis, or no changes. The pre-treatment with enalapril also reduced the immunostaining for caspase-3, indicating an interference with liver cells apoptosis. The treatment with enalapril also displayed a marked inhibition of liver CAT and GSH (72 ± 11 % and 90 ± 11 %, respectively). Additionally, the animals pre-treated with enalapril showed a marked reduction of AST and ALT serum levels. The inhibitions observed were 86 ± 14 % and 88 ± 9 %, respectively. Furthermore, treatment with enalapril also caused a reduction of MPO activity (82 ± 13 %), whereas the production of TNF was not significantly affected. A similar reduction of all parameters of hepatotoxicity was observed with the therapeutic regimen of administration. The macroscopic evaluation demonstrated that enalapril was capable of significantly reducing the hepatotoxicity induced by APAP, as observed for the positive control drug NAC (79 ± 12 % and 80 ± 20 %, respectively). Concerning the histological analysis, the therapeutic administration of enalapril displayed comparable effects, as seen for the prophylactic schedule of treatment. The post-treatment with enalapril and NAC also diminished caspase-3 immunopositivity. Liver GSH concentrations were reduced in 86 ± 15 % and 92 ± 22 %, correspondingly, for enalapril and NAC treatments. However, both drugs failed to significantly alter liver CAT activity. The therapeutic regimen also produced a marked decrease of either AST (77 ± 5 % e 76 ± 7 %) or ALT (94 ± 3 % e 99 ± 8 %) levels, for enalapril and NAC, respectively. This scheme of treatment also resulted in a significant reduction of MPO activity, with inhibition percentages of 96 ± 6 % and 98 ± 9 %, for enalapril and NAC, whereas the production of TNFα was not significantly affected. Discussion: The present results indicate that prophylactic administration of enalapril was able to prevent the hepatotoxicity caused by APAP. Moreover, the therapeutic administration of this drug was also able to reverse the liver toxicity caused by APAP. Thus, it is possible to suggest that patients under treatment with this ACE inhibitor are less susceptible to the effects of APAP. Additionally, enalapril might well represent an innovative tool for treating APAP-induced intoxication. / Introdução: O acetaminofeno (APAP) é um potente agente analgésico e antipirético, com fraco efeito anti-inflamatório. Apesar de sua eficácia, a utilização de doses elevadas de APAP está associada à severa hepatotoxicidade. Tem sido sugerido que o tratamento com inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA), como o captopril, poderia apresentar efeitos protetores na intoxicação aguda induzida por APAP, embora não existam evidências suficientes para comprovar este efeito. Neste contexto, o presente estudo investigou os efeitos do tratamento com um potente inibidor da ECA, o enalapril, sobre a hepatotoxicidade induzida por APAP em camundongos.Métodos: Camundongos machos e fêmeos C57BL/6 (6-10 por grupo, 20-25 g) foram utilizados. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais (09/00119 – PUCRS). Para o tratamento profilático, os animais foram pré-tratados oralmente com enalapril (30 mg/kg), uma vez por dia, durante 4 dias antes da administração de APAP. No quinto dia, a hepatotoxicidade foi induzida por uma dose única de APAP (400 mg/kg, i. p. ). Os animais receberam duas doses adicionais de enalapril 1 h antes, e 6 h após a administração de APAP. Os camundongos foram submetidos à eutanásia 24 h após a injeção de APAP. Os parâmetros avaliados foram: alterações macroscópicas e histológicas dos fígados, níveis séricos de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST), atividade da catalase (CAT) e concentração de glutationa reduzida (GSH), migração de neutrófilos (MPO) e produção de TNFα em fatias de fígado e, expressão de caspase-3, por imunoistoquímica. Os efeitos do enalapril também foram avaliados sobre estes mesmos parâmetros, em um protocolo terapêutico, em que os animais receberam APAP (400 mg/kg, i. p. ) e o enalapril (30mg/kg) foi administrado 3 h após. Posteriormente, os camundongos receberam mais três aplicações de enalapril com intervalos de 3 h cada. A N-acetilcisteína (NAC; 50 mg/kg) foi utilizada como controle positivo, nos mesmos intervalos de tempo. Resultados: A administração profilática oral de enalapril produziu uma redução significativa da hepatotoxicidade induzida por APAP, de acordo com a avaliação macroscópica dos fígados (71 ± 10 %).A avaliação histológica revelou que as amostras obtidas de animais controle APAP apresentaram necrose em três a quatro camadas de hepatócitos, acompanhada por camadas de degeneração centrolobular, enquanto que os animais pré-tratados com enalapril mostraram mínima necrose ou nenhuma mudança. Ademais, o pré-tratamento com enalapril reduziu visivelmente a expressão de caspase-3, indicando interferência com apoptose de células hepáticas. O enalapril também produziu uma inibição acentuada das enzimas CAT e GSH no fígado (72 ± 11 % e 90 ± 11 %, respectivamente). Além disso, os animais pré-tratados com enalapril apresentaram uma redução acentuada dos níveis séricos AST e ALT. As inibições observadas foram 86 ± 14 % e, 88 ± 9 %, respectivamente. Ademais, o tratamento com enalapril também causou uma redução da atividade da MPO (82 ± 13 %), embora não tenha alterado a produção de TNF. Uma redução similar de todos os parâmetros de hepatoxicidade também foi observada com o esquema terapêutico de administração do enalapril. De acordo com a avaliação macroscópica, o enalapril reduziu significativamente a hepatoxicidade causada por APAP, de forma semelhante ao controle positivo, NAC (79 ± 12 % e 80 ± 20 %, respectivamente). Em relação à avaliação histológica, os resultados foram similares ao tratamento profilático. O pós-tratamento com enalapril ou NAC também reduziu a expressão de caspase-3. Para a GSH hepática, foram observadas inibições de 86 ± 15 % e 92 ± 22 %, respectivamente, para os tratamentos com enalapril e NAC. No 13 entanto, para a enzima CAT, não houve alteração significativa com ambos os tratamentos. O esquema terapêutico também produziu uma redução marcante dos níveis séricos de AST (77 ± 5 % e 76 ± 7 %) e ALT (94 ± 3 % e 99 ± 8 %), para enalapril e NAC, respectivamente.A administração terapêutica de enalapril ou NAC também causou uma redução significativa da atividade de MPO, com percentagens de inibição de 96 ± 6 % e, 98 ± 9 %, respectivamente, embora não tenha alterado a produção de TNFα.Discussão: Os resultados do presente estudo indicam que a administração profilática de enalapril foi capaz de prevenir a hepatoxicidade causada por APAP. Além disto, a utilização de um esquema terapêutico com este inibidor também foi capaz de prevenir a toxicidade hepática causada por APAP, em níveis comparáveis aos observados com o fármaco de referência NAC. Assim, é possível sugerir que pacientes sob tratamento com este inibidor são menos suscetíveis aos efeitos do APAP.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401338-Texto+Completo-0.pdf: 18195711 bytes, checksum: 8003c4d1e35f169f386872ae3d70499f (MD5) Previous issue date: 2008 / Considering that some ETS transcriptions factors regulate growth, apoptosis, angiogenesis, invasions and metastasis-related genes in tumor cells, these transcription factors we proposed and describes three-dimensional models of ETS (ETV-2, SPI-C and NERF) by applying computational homology-modeling techniques and utilizing the high-resolution crystals structures of Ets-human DNA complexes as templates. These models should be useful to establish overall structural similarities between two or more related molecules, and establish the structural key features between members of related subfamilies and their relationship with their diverse biological roles. Obtaining structural details of macromolecular interactions provide insights into static conformation of DNA-Ets domain binary complexes, which may become a molecular targeting therapy against ETS transcription factors that could be a novel approach to a selective cancer treatment in the future. / Considerando que alguns fatores de transcrição da família ETS regulam, crescimento, apoptose, angiogênese e genes relacionados a metástase em células tumorais, nós propomos modelos tridimensionais de domínios ETS (ETV- 2, SPI-C and NERF) aplicando técnicas de modelagem molecular por homologia e utilizando estruturas de cristais de Ets humana-DNA como template. Estes modelos serão úteis para estabelecer semelhanças estruturais entre duas ou mais moléculas relacionadas. A obtenção destes detalhes estruturais das interações entre proteína e DNA fornecerá pistas sobre suas consformações dos complexos binários Ets-DNA, que podem a vir tornar alvos moleculares para o desenvolvimento de fármacos seletivos para o tratamento de câncer no futuro.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000388692-Texto+Completo-0.pdf: 318684 bytes, checksum: 4515465ae3fb1256c9107ff7a04e8a0b (MD5) Previous issue date: 2007 / A esquizofrenia é uma doença neuropsiquiátrica que afeta cerca de 1% da população mundial e que, devido aos seus diversos sintomas, acarreta um enorme custo social direto (hospitalizações, atendimentos, medicações) e indireto (improdutividade, repercussões familiares). Os estudos de genética populacional indicam que a esquizofrenia tenha um componente genético relevante além da influência do ambiente. Neste sentido, além de estudos no DNA nuclear, têm sido investigadas as alterações no DNA Mitocondrial (mtDNA). O mtDNA apresenta herança materna, e por isso é muito útil em estudos populacionais. Estudos com doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer sugerem que, ao menos em parte, o mtDNA contribua para suas etiologias. Manifestações neuropsiquiátricas características de encefalopatias mitocondriais causadas por mutações do mtDNA são convulsões, demência e dor de cabeça. Além disso, um estado confusional agudo, com alguns sintomas semelhantes aos que ocorrem na esquizofrenia (desorganização mental e alucinações), às vezes é observado em MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes), uma encefalopatia mitocondrial típica. Dessa forma, o objetivo dessa pesquisa foi averiguar uma possível associação entre polimorfismos A4769G e A10398G de mtDNA, que já foram descritos como predisponentes a outras doenças neuropsiquiátricas, com o desenvolvimento da esquizofrenia. Os polimorfismos A4769G e A10398G estão respectivamente localizados nos genes ND2 e ND3, que codificam para subunidades 2 e 3 da NADH Desidrogenase. Para relacionar esses polimorfismos com a esquizofrenia, testamos 76 pacientes esquizofrênicos quanto à ocorrência ou não destas variantes polimórficas no mtDNA e comparamos com as amostras de 88 controles sadios. Esses polimorfismos foram analisados utilizado-se o seqüenciador automático de DNA “MegaBACE” 1000 (GE Healthcare™) do Centro de Biologia Genômica e Molecular da PUCRS. Os cromatogramas gerados pela corrida eletroforética das reações de seqüenciamento foram analisadas no programa Chromas para determinar a ocorrência ou não da variação polimórfica. Quanto à análise estatística, foi realizado teste do qui-quadrado para variáveis categóricas. O nível de significância estatística foi p ≤ 0,05.Em relação ao polimorfismo A4769G, foram analisadas amostras de 76 pacientes dos quais 61 (80,3%) apresentaram o alelo G e 15 (19,7%) apresentaram o alelo A nesta posição. Das 88 amostras de controles analisadas, obtivemos 82 (93,2%) com o alelo G e 6 (6,8%) com o alelo A (Qui-quadrado p=0,014, Odds ratio=2. 895). Em relação ao polimorfismo A10398G, dos 62 pacientes analisados, 17 (27,4%) apresentaram o alelo G e 45 (72,6%) o alelo A. Dos 76 controles, 34 (44,7%) apresentaram a presença do alelo mutante G e 42 (55,3%) apresentaram o alelo A para esta posição (Qui-quadrado p=0,036, Odds ratio=1. 313). O estudo mostra diferenças estatisticamente significativas na freqüência dos sistemas polimórficos estudados entre pacientes esquizofrênicos e controles. Estudos adicionais são necessários para avaliar sua relevância do ponto de vista funcional.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431437-Texto+Completo-0.pdf: 291286 bytes, checksum: aad289e4c817a0471c68e921a07ac277 (MD5) Previous issue date: 2011 / Background: The depression is a mental illness that affects the population worldwide. Also known as a mood disorder is characterized by feelings of defeat, guilt and low self-esteem, being twice as common in women than in men. One of its main consequences in the body are the cognitive dysfunctionObjectives: We investigated the effect of cognitive support on contextual memory in depression and analyzed neuropsychological and hormonal characteristics that could affect memory. Methods: Seventeen medicated patients with MDD (age 20-40 years, 14 women) and 22 controls matched for age, gender and education performed the Vocabulary subtest of WAIS-III (VWAIS), the Wisconsin Card Sorting Test (WCST) and a recognition memory task for item (object) and context (location), which was applied with or without an incidental binding cue. Salivary cortisol and DHEA were measured at 7AM, 4PM and 10PM. Results: Patients and controls exhibited performance-matched recognition scores for items, but patients showed a deficit for contextual memory in the absence of the binding cue. Worse performance on neuropsychological tests (VWAIS and WCST) and lower cortisol and cortisol/DHEA ratios in patients were not causally related to this deficit. Conclusions: Contextual memory deficits in MDD patients could be reduced by providing additional cognitive support at encoding. / Características: A depressão é uma das doenças mentais que mais afeta a população mundialmente. Também conhecida como um transtorno do humor é caracterizada por sentimentos de derrota, baixa autoestima e culpa, sendo duas vezes mais comum em mulheres do que em homens. Uma das suas principais conseqüências no organismo são as disfunções cognitivas. Objetivos: Nós investigamos os efeitos do suporte cognitivo sobre a memória contextual na depressão e analisamos as características neuropsicológicas e hormonais que podem afetar a memória.Métodos: Dezessete pacientes medicados com depressão maior unipolar (idade 20- 40 anos, 14 mulheres) e 22 controles pareados por idade, gênero e educação realizaram o subteste Vocabulário do WAIS-III (VWAIS), o Wisconsin Card Sorting Test (WCST) e um teste de memória para reconhecimento de itens (objetos) e contextos (local), o qual foi aplicado com ou sem pista incidental. Amostras de salivas para análise de cortisol e DHEA foram coletadas as 07AM, 4PM e 10PM. Resultados: Pacientes e controles apresentaram desempenho equiparado nos escores de reconhecimento de itens, mas os pacientes apresentaram um déficit de memória contextual na ausência da pista. O mau desempenho nos testes neuropsicológicos (VWAIS e WCST) e baixos níveis de cortisol e da razão cortisol/DHEA em pacientes não foram a causa relacionada a esse déficit. Conclusão: Déficits na memória contextual em pacientes com depressão maior podem ser reduzidos fornecendo suporte cognitivo adicional na codificação.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431309-Texto+Completo-0.pdf: 274622 bytes, checksum: 3b80439f799e873c987cac63d42f75ee (MD5) Previous issue date: 2011 / Studies with organisms models demonstrated that cellular, structural and behavioral changes induced by environmental enrichment are related to increased levels of BDNF in the brain. These evidences suggest that BDNF could be an interesting biomarker of the effects of lifestyle on cognition and other behavioral parameters in humans. To test this hypothesis, we analyzed the effects of environmental enrichment on long term memory for object recognition and on BDNF levels of hippocampus, frontal cortex and serum of rats exposed to an experimental protocol that could be more easily translated to human intervention studies. Animals were maintained for 10 weeks in a social (standard laboratory conditions) or enriched (increased opportunity for physical exercise an learning experiences) condition. In the 7th week they were submitted to behavioral testing (open field and novel object memory task) and at the end of the 10th week they were killed and BDNF levels were analyzed. Animals maintained in the enriched condition showed enhanced performance on the memory task in the absence of any significant alteration in central or peripheral BDNF levels. The results of this study are important to highlight the need to develop experimental protocols using animal models that more closely resemble the characteristics of studies with humans and motivate more investigations to determine the conditions under which BDNF could be a biomarker of the effects of environment enrichment. / Estudos com modelos de organismos demonstraram que o ambiente enriquecido induz mudanças celulares, estruturais e comportamentais, e aumento nos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) no sistema nervoso central. Essas evidências sugerem que BDNF possa ser um interessante marcador biológico dos efeitos de estilo de vida na cognição e outros parâmetros comportamentais em humanos. Para testar esta hipótese, analisamos os efeitos do ambiente enriquecido na memória de longa duração, através do reconhecimento do objeto, e os níveis de BDNF no hipocampo, córtex frontal e soro de ratos expostos a um protocolo experimental que pode ser mais facilmente relacionado com estudos de interação com humanos. Os animais foram mantidos durante dez semanas em condição social (condições padronizadas de laboratório) ou enriquecido (aumento da oportunidade para exercícios físicos e experiências de aprendizado). Na sétima semana os animais foram submetidos a testes comportamentais (campo aberto e teste do reconhecimento do objeto) e no final da décima semana foram eutanisados para análise dos níveis de BDNF. Os animais mantidos na condição enriquecida mostraram melhora na performance no teste de memória, mas em contrapartida não apresentaram alteração significativa nos níveis centrais e periféricos de BDNF. Os resultados deste estudo são importantes para destacar a necessidade de desenvolver protocolos experimentais usando o modelos animais que se assemelham mais próximo às características dos estudos com seres humanos e motivar mais investigações para determinar as circunstâncias sob que BDNF poderia ser um marcador biológico dos efeitos do enriquecimento do ambiente.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000426503-Texto+Completo-0.pdf: 1716586 bytes, checksum: 85d4033429c9874555c7283407951928 (MD5) Previous issue date: 2010 / Tuberculosis (TB) remains a leading infectious killer worldwide and its causative agent, Mycobacterium tuberculosis, infects one third of the world population. The HIV co-infection and the emergence of multidrug and extensivelyresistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. Pyrimidine nucleotides are essential for many biochemical reactions and its synthesis constitutes an important step in the progression of TB. Therefore, the protein UMP kinase from M. tuberculosis (MtUMPK), which catalyses the phosphorylation of UMP to UDP and does not resemble its eukaryotic counterparts, is a promising target for the rational antitubercular drug design. In the present work, we report cloning of the pyrH gene coding region, heterologous recombinant protein in E. coli and purification to homogeneity. Moreover, we confirmed MtUMPK identity and its biological activity. Size exclusion chromatography showed that the protein is a tetramer in solution and kinetic studies revealed an allosteric behavior, suggesting that MtUMPK participates in the regulation of purine versus pyrimidine biosynthesis. Isothermal titration calorimetry (ITC) experiments showed that catalysis proceeds by a sequential ordered mechanism, in which the UMP substrate binds to the enzyme after the addition of ATP molecule, followed by a random displacement of ADP and UDP products. / A Tuberculose (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis, permanece entre as principais causas de morte por doenças infecto-contagiosas no mundo e estima-se que um terço da população mundial esteja infectada. A co-infecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio a saúde pública e tem estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Os nucleotídeos pirimidínicos são moléculas essenciais em inúmeras reações bioquímicas e suas rotas de biossíntese são indispensáveis a progressão da TB. Nesse contexto, a proteína UMP quinase de M. tuberculosis (MtUMPK), que catalisa a fosforilação de UMP a UDP, é um alvo promissor para o desenho racional de drogas anti-TB. Neste trabalho é reportado a clonagem da região codificante do gene pyrH, a expressão da proteína recombinante em E. coli e a purificação da enzima. Além disso, confirmaram-se a identidade e a atividade biológica da MtUMPK. Cromatografia de exclusão por tamanho indicou que a proteína é um tetrâmero em solução e estudos cinéticos revelam um comportamento alostérico, sugerindo que a MtUMPK participa na regulação de síntese de purinas versus pirimidinas. Experimentos através da técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) revelaram que o mecanismo cinético para os substratos é sequencial ordenado, onde a molécula de ATP liga-se na enzima livre, seguido da ligação do UMP, e que a liberação dos produtos ADP e UDP ocorre de forma aleatória.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448467-Texto+Completo-0.pdf: 1354318 bytes, checksum: e98c36f8757b493a6c1604f1618bfb2d (MD5) Previous issue date: 2013 / Iron accumulation in the brain has been observed in both normal aging and in several neurodegenerative diseases. We have previously shown that brain iron loading results in persistent memory deficits, which are accompanied by oxidative stress. Due to the high metabolic rate of the nervous system, mitochondria are present in large numbers in nerve cells. It has been demonstrated that through fission and fusion of mitochondria, these organelles promote changes in their structure and this dynamic can affect mitochondrial function and vice-versa. Deficits in supplying energy to the synapses have been linked to neurodegenerative diseases and once the functionality of neural circuits is reduced, these cells may activate neuronal death cascades. Here, we analyzed the effects of neonatally iron treatment on the following targets: Dynamin-1-like protein (DNM1L) and Optic atrophy 1 (OPA1), proteins involved in regulating mitochondrial fission and fusion, respectively; Caspase 3, a key protease of the effector phase of apoptosis; and Synaptophysin, as a synaptic marker. Additionally, we investigated the effects of Cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, previously shown to improve memory in iron-treated rats, in reversing iron-induced effects on DNM1L, OPA1, caspase 3, and synaptophysin. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30mg/kg) at postnatal days 12-14. At adulthood, they were treated with vehicle or CBD (10 mg/kg) for 14 days. Hippocampal and cortical protein levels and gene expression were quantified using western blotting analysis and RT-qPCR, respectively. Quantitative measurements of proteins were made using densities of individual proteins, normalized to the density of β-actin. On RT-qPCR, samples were normalized to three reference genes (GAPDH, HPRT1 and RPL13A). Western blotting results indicated that neonatal iron treatment induced a significant reduction of DNM1L in the hippocampus and OPA1 in the cortex. Iron was also shown to increase caspase 3 both in the hippocampus and cortex, which was accompanied by a significant reduction of synaptophysin levels in the hippocampus. CBD reversed iron-induced effects, bringing hippocampal DNM1L, caspase 3 and synaptophysin levels back to values comparable to the control group. The present results suggest that iron may affect mitochondrial dynamics, possibly trigging synaptic loss and apoptotic cell death. The reversion of these effects by CBD, indicates its potential neuroprotective effect. / O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Previamente, mostramos que a sobrecarga de ferro no cérebro resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. Devido à elevada taxa metabólica do sistema nervoso, as mitocôndrias estão presentes em grande número em células nervosas. Tem sido demonstrado que, por meio da fissão e fusão, essas organelas promovem alterações na sua estrutura e essa dinâmica pode afetar a função mitocondrial e vice-versa. Déficits no fornecimento de energia para as sinapses têm sido associados a doenças neurodegenerativas e com a redução da funcionalidade de circuitos neurais essas células podem ativar cascatas de morte neuronal. No presente trabalho, foram analisados os efeitos do tratamento do ferro neonatal sobre os seguintes alvos: proteína 1 semelhante à dinamina (DNM1L) e proteína atrófica óptica 1 (OPA1), envolvidas na regulação de fissão e de fusão mitocondrial, respectivamente; caspase 3, uma protease essencial da fase efetora da apoptose; e sinaptofisina, um marcador sináptico. Além disso, nós investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, já mostrado capaz de melhorar a memória de ratos tratados com ferro, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre as proteínas DNM1L, OPA1, caspase 3 e sinaptofisina. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal. Na idade adulta, foram tratados com veículo ou CBD (10mg/kg) durante 14 dias. Os níveis proteicos e a expressão gênica no hipocampo e córtex foram quantificados através de Western blotting e RT-qPCR, respectivamente. A quantificação das proteínas foi realizada através da medida das densidades das bandas individuais, normalizadas pela densidade de β-actina. Para o RT-qPCR, as amostras foram normalizadas para 3 genes de referência (GAPDH, HPRT1 e RPL13A). Os resultados da análise protéica indicaram que o tratamento com ferro no período neonatal induziu redução de DNM1L no hipocampo e OPA1 no córtex. O ferro também aumentou os níveis de caspase 3 tanto no hipocampo quanto no córtex, acompanhado por redução dos níveis de sinaptofisina no hipocampo. O CBD reverteu os efeitos induzidos pelo ferro, trazendo os níveis hipocampais de DNM1L, caspase 3 e sinaptofisina de volta aos valores comparáveis ao grupo controle. Os resultados sugerem que o ferro pode afetar a dinâmica mitocondrial, possivelmente desencadeando perda sináptica e morte celular por apoptose. A reversão desses efeitos pelo CBD indica o seu potencial efeito neuroprotetor.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000447380-Texto+Completo-0.pdf: 675913 bytes, checksum: bfb87e6d734478e3c7bb6275c3132761 (MD5) Previous issue date: 2013 / Liver fibrosis is the wound healing response to repeated injury of the liver. It is characterized by disruption of the liver architecture associated with increased expression of extracellular matrix components. Hepatic stellate cells (HSC) play a key role in liver fibrogenesis. In normal liver, HSC are quiescent and its main function is to store vitamin A. During liver injury, these cells undergo activation, become myofibroblasts and acquire fibrogenic properties. Activation of PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) and inhibition of fibrogenic molecules are potential strategies to block HSC activation and differentiation. Aware that the process of hepatic fibrosis involves inflammatory mediators, various anti-inflammatory substances have been studied in an attempt to revert fibrosis. The purpose of this study was to investigate the in vitro effects of fructose-1,6-bisphospahte (FBP) on HSC phenotype. The results demonstrated that FBP induced quiescent phenotype in HSC via PPARγ activation. Significant decrease in type I collagen mRNA expression was observed in the first 24h of treatment. These events preceded the reduction of TGF-β1 (transforming growth factor-beta) and total collagen secretion. Thus, FBP promoted downregulation of HSC activation by its antifibrotic and anti-inflammatory actions. These findings demonstrate that FBP may have potential as a novel therapeutic agent for the treatment of liver fibrosis. / A fibrose hepática é a resposta cicatricial do fígado a lesões continuadas, caracterizada pelo rompimento da arquitetura hepática associada ao aumento da expressão dos componentes da matriz extracelular. As células estreladas hepáticas (HSC) desempenham um papel fundamental no processo de fibrogênese. No fígado normal, as HSC encontram-se em sua forma quiescente de depósito de vitamina A. Durante a lesão hepática, essas células passam por uma ativação fenotípica, tornam-se miofibroblastos e adquirem propriedades fibrogênicas. O processo de fibrose hepática envolve vários mediadores inflamatórios e, portanto, substâncias anti-inflamatórias tem sido empregadas na tentativa de reverter a fibrose e bloquear a ativação e diferenciação das HSC. A ativação de PPARγ (receptor ativado por proliferador de peroxissomo Gama) e a inibição de moléculas fibrogênicas são possíveis estratégias para estes fins.O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos in vitro da frutose-1,6-bisfosfato (FBP) sobre o fenótipo das HSC. Os resultados demonstraram que a FBP é capaz de induzir o fenótipo quiescente das HSC via ativação de PPARγ. Foi observado nas primeiras 24h de tratamento uma diminuição significativa da expressão de mRNA de colágeno tipo I. Posteriormente, houve uma redução do colágeno total e de TGF-β1 (fator de transformação do crescimento beta). Assim, a FBP diminui o estado de ativação das HSC por suas ações antifibróticas e anti-inflamatórias. Estas descobertas demonstram que a FBP pode ser um potencial novo agente terapêutico para o tratamento de fibrose hepática.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431822-Texto+Completo-0.pdf: 631602 bytes, checksum: 9d289abd63882c9ea0f089225adb5921 (MD5) Previous issue date: 2010 / Increased levels of iron in brain regions have been reported in neurodegenerative disorders as well as in normal brain aging. We have previously demonstrated that neonatal iron loading induces cognitive impairment in adult rats. Here, we evaluate the effects of neonatal iron treatment on cognition in aged rats. We also investigated the effects of a late subchronic rosuvastatin treatment on iron- and age-induced cognitive deficits. Rats received vehicle or 10. 0 mg/kg Fe2+ orally at postnatal days 12–14. When animals reached the age of 23 months, they received daily intraperitoneal injections of saline or rosuvastatin (0. 2 or 2. 0 mg/kg) for 21 days. Twenty-four hours after the last injection, they were submitted to novel object recognition training. Retention test sessions were performed 1. 5 and 24 h after training, in order to assess short-term and long-term memory, respectively. Results indicated that aged animals that received iron in the neonatal period showed more severe memory deficits than vehicle-treated ones, suggesting that iron potentiates ageassociated memory impairments. Rosuvastatin improved recognition memory deficits associated with iron loading and aging, providing evidence that statins may be considered for the treatment of age-associated cognitive decline. / Ao longo dos anos tem sido relatado o aumento dos níveis de ferro em regiões encefálicas de pacientes acometidos por doenças neurodegenerativas, assim como no envelhecimento normal. Em estudos prévios realizados em nosso laboratório foi demonstrado que a sobrecarga de ferro no período neonatal induz disfunção cognitiva em ratos adultos. No presente trabalho, nós avaliamos os efeitos do tratamento com ferro no período neonatal sobre a cognição em ratos idosos. Também investigamos os efeitos de um tratamento subcrônico tardio com rosuvastatina em ratos com déficits cognitivos induzidos por ferro e pelo envelhecimento. Ratos Wistar machos receberam veículo ou 10,0 mg/kg de Fe+2 por via oral do 12° ao 14° dia de vida pós-natal. Quando os animais atingiram a idade de 23 meses, eles receberam injeções intraperitoneais de solução salina ou de rosuvastatina (0,2 ou 2,0 mg/kg) por 21 dias. Vinte e quatro horas depois da última injeção, eles foram submetidos ao treino na tarefa de reconhecimento do objeto novo. As sessões de teste de retenção foram realizadas 1,5 e 24 h após a sessão de treino, a fim de avaliar a memória de curta duração e longa duração, respectivamente. Os resultados indicaram que os animais envelhecidos que receberam ferro no período neonatal apresentaram déficits de memória mais pronunciados do que os tratados com veículo, sugerindo que o ferro potencializa os prejuízos da memória associada ao envelhecimento. Nos grupos da rosuvastatina os déficits na memória de reconhecimento associados ao tratamento com ferro e ao envelhecimento melhoraram, fornecendo evidências de que as estatinas podem ser consideradas para o tratamento do declínio cognitivo associado ao envelhecimento.