Esta tese descreve como é possível obter emissão de luz in vitro enzimaticamente, a partir de extratos quente e frio de diferentes espécies de fungos bioluminescentes, o que indica também um mecanismo comum de bioluminescência em todos esses organismos. Dados cinéticos sugerem um mecanismo enzimático em duas etapas e corroboram a hipótese enzimática de Airth e Foerster, da década de 1960. Finalmente, utilizando-se extratos quente e frio foi possível também isolar a luciferina fúngica e obter sua massa molecular (298,1837 m/z). Essa substância isolada emite luz enzimaticamente in vitro, sendo que a sobreposição do espectro de emissão e do espectro de bioluminescência do fungo confirma que essa substância é a luciferina fúngica. / This thesis describes how in vitro light emission can be enzymatically obtained from the hot and cold extracts assay using different species of fungi, which also indicates a common mechanism of light emission for all these organisms. Kinetic data suggest a consecutive two-step mechanism and corroborate the 1960\'s enzymatic proposal of Airth and Foerster. Finally, using hot and cold extracts assay we were also able to purify and to determine the molecular weight of the fungal luciferin (298.1837 m/z). The isolated substance emits light enzymatically in vitro, whose light emission spectrum matches with the fungal bioluminescence one thus confirming that the substance is the fungal luciferin

Entre centenas de espécies brasileiras de pirilampos, o Pyrearinus termitilluminans é o único cujo ciclo de vida se passa integralmente nos cupinzeiros luminosos localizados no Brasil central claramente observados durante a estação das chuvas. A emissão de luz nos elaterídeos tem a função de atração de presas para a alimentação. A bioluminescência desses animais desaparece nos meses de seca juntamente com a nuvem de presas aladas. Assim, o metabolismo de trealose aqui estudado poderia prover informações sobre da capacidade da larva de sobreviver em ambientes edáficos. As concentrações de trealose e glicose são determinadas nos extratos de larvas com um sistema DIONEX® de cromatografia iônica. A trealase foi medida com 17 mM de trealose. O glicogênio foi estimado com uma amiloglicosidase. Paralelamente o estresse oxidativo associado com a restrição de água foi monitorado através da determinação do TBARS, juntamente com a catalase, glutationa peroxidase e glutationa redutase. Nas larvas submetidas ao ensaio na câmara climática (25% de umidade) a trealase (159,69±10,95 mU/animal) estava 80 vezes mais alta do que a do grupo controle (2,02±1,41mU/animal). As larvas sob estresse apresentaram distintos níveis de trealose e glicose (29,85±3,20 µmol/animal e 18,27±0,82 µmol/animal, respectivamente) quando comparadas com o grupo controle (64,61±1,54 µmol/animal e 2,16±0,11 µmol/animal, respectivamente). A elevação dos níveis das enzimas antioxidantes (4, 4,3 e 2,4 vezes respectivamente) com níveis invariáveis de TBARS apontam para a ação antioxidante contra a produção elevada de espécies reativas de oxigênio. Os insetos submetidos à restrição hídrica perderam aproximadamente 35% do peso. O aumento da atividade da trealase, com concomitante decréscimo dos níveis de trealose, sugerem que esse açúcar poderia ser usado como fonte hídrica. Entretanto, os níveis de glicose, 10 vezes mais elevados no grupo sob estresse poderia ser usado na via de biossíntese de trealose uma vez que os níveis de glicogênio estão diminuídos. As mudanças no metabolismo de trealose e o desbalanço no equilíbrio redox, poderiam fornecer importantes informações fisiológicas desses insetos sob estresse hídrico. / The life cycle of Pyrearinus termitilluminans (Coleoptera: Elateridae) takes place totally into the so-called luminous termite mounds located in Central Brazil, which are clearly observed during the rainy season. Light emission by the elaterid larvae acts like a trap attracting flying insects. The bioluminescence disappears in the dry months together with the food supply. The trehalose metabolism study described here could provide information about larva capacity to survive throughout hard climatic changes. Trehalose and glucose concentrations are determined in the larva extracts with a DIONEX® ion chromatography system. The trehalase activity was measured with 17 mM trehalose. The glycogen level was estimated with amyloglucosidase. In parallel oxidative stress associated to water deprivation was evaluated through determination of TBARS and the catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase activities. In larvae submitted to dryness in a growth chamber (25% humidity) we have found 80-fold higher trehalase activity (159.69±10.95 mU/animal) than in the control group raised under room conditions (2.02±1.41 mU/animal). Stressed larvae showed distinct trehalose and glucose contents (29.85±3.20 µmol/animal and 18.27±0.82 µmol/animal, respectively) when compared with the control group(64.61±1.54 µmol/animal and 2.16±0.11 µmol/animal, respectively), whereas the glycogen level was lower (11.53±2.01 mg/animal and 28.26±2.31 mg/animal, respectively). Elevation of the antioxidant enzyme levels (4-fold, 4.3-fold and 2.4-fold respectively) with maintenance of TBARS pointed to depletion to exacerbated production of reactive oxygen species. Insects submitted to water restriction lost about 35% wet weight. The observed increase of trehalase activity and concomitant decrease of trehalose level suggest that trehalose could be used as a metabolic water source. Moreover, the 10-fold higher glucose level in the stressed group could be used by the trehalose biosynthetic pathway as the glycogen level decreases in parallel. The trehalose metabolic and redox balance changes described here may shed light on the yet unknown physiological mechanisms of larval elaterid adaptation to water stress.

A bioluminescência desperta o interesse humano há muitos séculos. Presente em quatro dos sete reinos taxonômicos, Monera, Chromista, Animalia e Fungi, cada um com mecanismos muito diferentes. Pode-se dizer que o estudo químico da bioluminescência começou com os experimentos de Dubois no século XIX, que cunhou os termos luciferina e luciferase, termos genéricos para o substrato e enzima envolvidos na reação, respectivamente. No caso específico de fungos, o envolvimento de enzimas foi debatido por quase cinco décadas, após a proposta enzimática de Airth e Foerster na década de 1960 e a não enzimática por Shimomura, em 1989. Somente em 2009 a hipótese de Airth e Foerster foi confirmada pelo nosso grupo, seguido da identificação da luciferina fúngica e o envolvimento de hispidina, como molécula precursora, em 2015 pelo grupo de Yampolsky. Para conseguir elucidar mecanismos químicos, a técnica de espectrometria de massas pode ser empregada para a identificação estrutural de reagentes e intermediários destas e de outras reações orgânicas. Após a confirmação do envolvimento de hispidina na bioluminescência de fungos, utilizou-se a técnica de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas para identificar a presença de hispidina, seus derivados e intermediários precursores, em fungos e em algumas plantas. / Bioluminescence arises human interest for centuries. Occurring in four of seven taxonomical Kingdoms, Monera, Chromista, Animalia and Fungi, each of them with completely different mechanisms. The chemical study of bioluminescence starts in XIX century with Dubois, who coined the terms luciferin and luciferase, generic terms for substrate and enzyme involved in the bioluminescent reaction, respectively. In the specific case of fungi, enzyme involvement has been debated for almost five decades, after the enzymatic proposal by Airth and Foerster, during the 1960 decade, and the non-enzymatic proposal by Shimomura in 1989. It was only in 2009 when the proposal by Airth and Foerster was confirmed by our group, followed by the identification of the fungal luciferin and the involvement of hispidin, as the precursor molecule, in 2015 by Yampolskys group. To elucidate the chemical mechanisms, mass spectrometry can be employed to structural identification of reagents and intermediates on these and other organic reactions. After the confirmation of hispidin involvement in fungi bioluminescence, liquid chromatography coupled with mass spectrometry was uses do identify the presence of hispidin, its derivatives and precursor intermediates in fungi and selected plants.

Este estudo foi realizado com o objetivo de desenvolvimento e validação do método microbiológico rápido empregando a técnica de bioluminescência de Adenosina Trifosfato (ATP) como método alternativo para o teste de esterilidade. O ATP reage com o sistema enzimático luciferina/luciferase e gera um fóton de luz em presença de íons magnésio, reação que pode ser utilizada na detecção de microrganismos. A luz gerada na reação é medida por um dispositivo chamado luminômetro, que traduz o sinal em unidades relativas de luz (URL), metodologia altamente sensível que pode ser utilizada na análise de produtos estéreis com o objetivo de diminuição no tempo do ensaio. Enquanto a turbidez do meio de cultura só pode ser visualizada quando o contaminante chega à concentração de 106 UFC/ml, a tecnologia de bioluminescência de ATP pode detectar amostras com concentração em torno de 104 UFC. Foram empregados na validação dados obtidos a partir do método tradicional de esterilidade (técnica de filtração) realizado paralelamente ao método alternativo. As soluções parenterais utilizadas nos ensaios foram: solução fisiológica 0,9%; solução de dextrose 5%; ringer lactato; e solução de metronidazol 0,5%. As soluções-teste foram inoculadas intencionalmente com suspensões microbianas preparadas através da diluição de Bioballs&#174, com concentrações de 10 UFC/100 ml, 2 UFC/100 ml e 0,4 UFC/100 ml. Após a realização do teste convencional, as membranas resultantes do ensaio foram incubadas nos meios de cultura caldo caseína de soja e tioglicolato. Alíquotas destes meios foram retiradas após 96 horas de incubação para análise pelo método alternativo. Os seguintes microrganismos foram selecionados para o estudo: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea e Micrococcus luteus. A análise dos resultados obtidos mostrou que o método alternativo é capaz de detectar os microrganismos testados. Quanto à sensibilidade, o método alternativo apresentou vantagem na concentração 2 UFC/100 ml, e equivalência nas outras concentrações. A não interferência dos diferentes produtos e meios nos resultados encontrados permite vislumbrar evidência de robustez do método. Adicionalmente, em relação ao tempo de resposta, o método alternativo demonstrou ser equivalente ao convencional (p-valor=0,43). / This study is being conducted with a goal of validating and developing the fast microbiological method of ATP bioluminescence, as an alternative method to the sterility test. The ATP reacts with the enzymatic system luciferin-luciferase and produces light in the presence of magnesium ions, this reaction can be used for microorganism\'s detection. The light generated in this reaction can be measured by a device called luminometer that translates the signal in relative light units (RLU). This methodology has high sensibility and it can be used in the sterile products analysis with the objective of reducing the time of the sample. While the turbidity of the culture medium it can be visualized just when the sample reaches a concentration of 106 UCF per mL, the bioluminescence assay can detect samples at concentrations around 104 UCF per mL. The both methods, conventional (filtration technique) and alternative were done in parallel and the result data were used in the validation study. It was used in the assay the next parenteral solutions: physiological solution 0,9%, metronidazole solution 0,5%, dextrose solution 5% and Ringer lactate. The test solutions were inoculated with the microorganism suspensions, prepared by the dilution of the Bioballs® with result concentrations of 10 CFU/100 mL, 2 FU/100 mL and 0,4 CFU/ mL. After the conventional test was performed, the result membranes were incubated in thioglicollate and soybean casein broth. After 96 hours of incubation, aliquots from the broth were taken to perform the analysis by the alternative method. The following microorganisms were selected to perform the validation study: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea and Micrococcus luteus. The analysis of results shows that the alternative method can detect the test microorganisms. Regarding of the sensibility, the alternative method shows advantage in the 2 CFU/mL inoculum concentration and equivalence in the other two concentrations. The method shows evidence of robustness because the results were not affected by the products or culture media used in the assay. Additionally concerning the detection time, the alternative method was established equivalent to the conventional method (p-value=0,43).

Esta tese de doutorado descreve os estudos realizados para elucidar a biologia molecular da bioluminescência fúngica e sua relevância ecológica na natureza. A recente descoberta de que a luciferina fúngica é a 3-hidroxihispidina permitiu a caracterização do metabolismo secundário da fenilalanina nos genomas recém-sequenciados e transcriptomas de micélios das espécies luminescentes Panellus stipticus e Neonothopanus gardneri. Adicionalmente os genomas e transcriptomas de variedades não luminescente de P. stipticus e Lentinula edodes serviram como respectivos controles. Em geral, os genes envolvidos no metabolismo secundário da fenilalanina em amostras luminescentes tinham expressão igual ou superior àquela de espécies não luminescentes. Um agrupamento de genes relacionados com a biossíntese de fenilalanina foi encontrado em ambos os genomas luminescentes e não luminescentes de P. stipticus. A abundância de genes transcritos neste agrupamento foi semelhante para as espécies luminescentes e não luminescentes de P. stipticus, mas a policetídeo sintase tipo I em P. stipticus não luminescentes foi significativamente sub-regulada. Não foi encontrado agrupamento semelhante nos genomas de N. gardneri e L. edodes, sendo que os correspondentes homólogos estavam espalhados em diferentes loci. Extratos de fungos podem ser preparados in vitro, com a adição de 3-hidroxihispidina para produzir luz verde em abundância. A preparação de extratos proteicos de luciferase foi melhorada e a estrutura da luciferase, parcialmente purificada, foi investigada por espectrometria de massas. A presença de luciferase nos géis de purificação foi revelada usando-se luciferina e molécula similares à luciferina advindas de extratos de plantas. O nicho ecológico nas vizinhas de cogumelos bioluminescentes foi investigado de duas maneiras, armadilhas adesivas com cogumelos artificiais de acrílico, iluminados com luz LED verde e através da observação direta de cogumelos bioluminescentes com fotografia no infravermelho com lapso de tempo. Os estudos ecológicos foram conduzidos nos biomas da Mata Atlântica e da Mata dos Cocais, no Brasil. Baratas, aranhas, tesourinhas, grilo e vagalumes tec-tecs foram os animais mais comuns que interagiram com os cogumelos. Todos estes animais podem agir como dispersores de propágulos e, em alguns casos, como defensores dos cogumelos. / This PhD thesis describes the studies performed to elucidate the molecular biology of fungal bioluminescence and the ecological significance of the trait in the wild. The recent discovery that the fungal luciferin is 3-hydroxyhispidin has allowed for the characterization of phenylalanine secondary metabolism in the newly sequenced genomes and mycelium transcriptomes of luminescent Panellus stipticus and Neonothopanus gardneri, additionally the genomes and transcriptomes of a non-luminescent variety of P. stipticus and Lentinula edodes served as respective controls. In general the genes involved in phenylalanine secondary metabolism had greater or equal expression in luminescent samples than non luminescent. A cluster of genes related to the secondary metabolism of phenylalanine was found in both luminescent and non luminescent P. stipticus genomes. Transcript abundance of genes in this cluster was similar in both luminescent and non-luminescent Panellus stipticus, but the type I polyketide synthase in non luminescent Panellus stipticus was significantly down regulated. A similar gene cluster in the N. gardneri and L. edodes genomes was absent with corresponding homologues scattered at different genomic loci. Cell free fungal extracts can be combined in vitro with the addition of 3-hydroxyhispidin to produce abundant green light. Preparation of proteinaceous luciferase extracts was improved and partially purified luciferase samples were investigated by mass spectrometry. The presence of luciferase in the separation gel was also evidenced by using luciferin and luciferin-like molecules from plant extracts. The ecological niche surrounding bioluminescent mushrooms was investigated through two main means, glue traps with acrylic mushroom facsimiles that were internally illuminated with green LED lights and direct observation of bioluminescent mushrooms with infrared time lapse photography. Ecological studies were performed in the Atlantic rainforest (Mata Atlântica) and transitional Coconut Palm forest (Mata dos Cocais) biomes of Brazil. Cockroaches, spiders, earwigs, crickets, and luminescent click beetles were the most common animal interacting with mushrooms. All of these animals may be acting as fungal propagule dispersers and in some cases defense of the mushroom.

A enzima peroxidase (HRP) , agindo como uma oxigenase em substratos apropriados, promove a formação de espécies excitadas no estado triplete. Estes produtos excitados podem ser formados em sistemas bioquímicos e promover processos fotoquímicos no escuro. Nesta linha de estudos, investigamos a oxidação aeróbica, na presença de HRP, de substratos contendo ligações de Schiff. Esses compostos são de grande importância biológica, uma vez que participam como intermediários em diversas reações enzimáticas (transaminação, biossíntese de aminoácidos, biossíntese de profirinas), nas ligações cruzadas do colágeno e da elastina, na hemoglobina AlC, na rodopsina e bacterionodopsina e como produtos finais da lipoperoxidação. A oxidação aeróbica de quatro iminas alifáticas (BPA, i-BMA, sec-BMA e BVA) , catalisada por HRP, é quimiluminescente. A natureza triplete da espécie excitada foi sugerida pelo espectro de quimiluminescência, por meio de estudos de transferência de energia para DBAS e clorofila e pela supressão de quimiluminescência por oxigênio, sorbato, indol e p-benzoquinona. Com base nos altos valores de kETo encontrados, concluimos que a transferência de energia esteja ocorrendo provavelmente por um mecanismo a longa distância. A análise dos produtos da reação e os dados cinéticos indicam que a reação ocorre provavelmente segundo a via: (VER Esquema no arquivo) Ressalta-se que esta reação constitui um modelo mais adequado para sistemas bioluminescentes do que o proposto por McCapra e Burford (1976) com bases de Schiff aromáticas em t-butóxido e DMSO. Os sistemas aqui descritos também apresentam a possibilidade de desenvolvimento de método analítico, empregando quimiluminescência, para detectar formação de bases de Schiff em sistemas biológicos. Os estudos com base de Schiff alifáticos (sistemas modelo) foram estendidos para adutos contendo ligação de Schiff entre glicolaldeído e aminoácidos (Lys, Arg, His e Phe) ou proteínas (lisozima, BSA e protaminas). Todos os sistemas estudados são quimiluminescentes na presença de HRP; a fluorescência característica da formação do aduto decai concomitantemente com a emissão de luz; e, durante a reação, a peroxidase encontra-se principalmente na forma de composto II. Observa-se também transferência de energia dos sistemas glicolaldeído-lisozima/HRP/O2 e glicolaldeídoprotamina/HRP/O2 para clorofila. Estes estudos têm grande interesse do ponto de vista da toxicidade associada à ingestão de álcool etílico, a qual, segundo trabalhos recentes da literatura, é atribuída à formação de bases de Schiff entre proteínas de membranas e acetaldeído. E notável também, a formação de iminas durante o processo de lipoperoxidação e a quimiluminescência que o acompanha. Nossos dados levantam a possibilidade de que a toxicologia do álcool pode envolver espécies eletronicamente excitadas formadas na oxidação aeróbica dos adutos aldeído-proteínas. / Horseradish peroxidase (HRP) , acting as an oxigenase on various substracts, promotes the generation of electronically excited triplet species. These species can also be formed in many biochemical reactions and drive photochemical processes in the absence of light. Enlighted by this hypothesis (photobiochemistry in the dark) we have investigated the HRP-catalyzed aerobic oxidation of substrates containing Schiff linkage. These compounds are of utmost biological importance as they participate as intermediates of several enzymatic reactions (transamination, amino-acid biosyntheses, porphyrin biosyntheses, a.s.o.), in the crosslinking of collagen and elastin, in hemoglobin AlC, in rhodopsin and bacteriorhodopsin, and as final products from lipid peroxidation. The aerobic oxidation of four aliphatic imines (BPA, i-BMA, sec-BMA and BVA) , catalyzed by HRP, has been shown to be chemiluminescent. The triplet nature of the products is suggested by the chemiluminescence spectrum, by energy transfer studies to DBAS and chlorophyll a and by quenching of the chemiluminescence by molecular oxygen, sorbate ion, indol and p-benzoquinone. Based on the high values of ETTo found in these experiments we have concluded that the energy transfer process occur through a long range mechanism. Analyses of the products found in the spent reaction mixtures and the kinetic data indicate that the reaction follows the route: (SEE scheme file) We stress that this reaction constitutes a more realistic model for bioluminescent systems than that reported by McCapra and Burford (1976), which uses aromatic Schiff bases in DMSO/t-butoxi. In addition, the reaction described here point out for the possible development of chemiluminescent analytical procedure to detect the formation of Schiff bases in biological systems. Our studies on aliphatic Schiff bases were extended to adducts of both amino acids (Lys, Arg, His and Phe) and proteins (lyzozyme, bovine serum albumin and fish protamins) with glycolaldehyde. All these adducts are chemiluminescent when exposed to HRP in an aerated buffered solution. The fluorescence typical of the adducts decays concomitantly with light emission and, during the reaction, the enzyme remains predominantely in the form of HRP Compound II. Energy transfer to chlorophyll a from the systems glycolaldenyde-lyzozyme/O2/HRP and glycolaldehyde-protamine/ 02/HRP occur. These studies are relevant with respect to the toxicity associated to ethyl alcohol intake which, according to recent reports, is attributed to the formation of Schiff linkages between membrane proteins and acetaldehyde. Also noteworthy is the formation of imines along lipid peroxidation and the accompanying chemiluminescence. Our data raise the hypothesis that the alcohol toxicology may involve generated electronically excited species formed during aerobic oxidation of protein-aldehyde adducts.

A bioluminescência desperta o interesse humano há muitos séculos. Presente em quatro dos sete reinos taxonômicos, Monera, Chromista, Animalia e Fungi, cada um com mecanismos muito diferentes. Pode-se dizer que o estudo químico da bioluminescência começou com os experimentos de Dubois no século XIX, que cunhou os termos luciferina e luciferase, termos genéricos para o substrato e enzima envolvidos na reação, respectivamente. No caso específico de fungos, o envolvimento de enzimas foi debatido por quase cinco décadas, após a proposta enzimática de Airth e Foerster na década de 1960 e a não enzimática por Shimomura, em 1989. Somente em 2009 a hipótese de Airth e Foerster foi confirmada pelo nosso grupo, seguido da identificação da luciferina fúngica e o envolvimento de hispidina, como molécula precursora, em 2015 pelo grupo de Yampolsky. Para conseguir elucidar mecanismos químicos, a técnica de espectrometria de massas pode ser empregada para a identificação estrutural de reagentes e intermediários destas e de outras reações orgânicas. Após a confirmação do envolvimento de hispidina na bioluminescência de fungos, utilizou-se a técnica de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas para identificar a presença de hispidina, seus derivados e intermediários precursores, em fungos e em algumas plantas. / Bioluminescence arises human interest for centuries. Occurring in four of seven taxonomical Kingdoms, Monera, Chromista, Animalia and Fungi, each of them with completely different mechanisms. The chemical study of bioluminescence starts in XIX century with Dubois, who coined the terms luciferin and luciferase, generic terms for substrate and enzyme involved in the bioluminescent reaction, respectively. In the specific case of fungi, enzyme involvement has been debated for almost five decades, after the enzymatic proposal by Airth and Foerster, during the 1960 decade, and the non-enzymatic proposal by Shimomura in 1989. It was only in 2009 when the proposal by Airth and Foerster was confirmed by our group, followed by the identification of the fungal luciferin and the involvement of hispidin, as the precursor molecule, in 2015 by Yampolskys group. To elucidate the chemical mechanisms, mass spectrometry can be employed to structural identification of reagents and intermediates on these and other organic reactions. After the confirmation of hispidin involvement in fungi bioluminescence, liquid chromatography coupled with mass spectrometry was uses do identify the presence of hispidin, its derivatives and precursor intermediates in fungi and selected plants.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:48Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10890a.pdf: 1984275 bytes, checksum: 9c806a399d111fa36900927053424e9e (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:49Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10890a.pdf: 1984275 bytes, checksum: 9c806a399d111fa36900927053424e9e (MD5) Publico-10890b.pdf: 1607433 bytes, checksum: 8c8860e6bda38169d779192272e62a56 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:49Z : No. of bitstreams: 3 Publico-10890a.pdf: 1984275 bytes, checksum: 9c806a399d111fa36900927053424e9e (MD5) Publico-10890b.pdf: 1607433 bytes, checksum: 8c8860e6bda38169d779192272e62a56 (MD5) Publico-10890c.pdf: 1673660 bytes, checksum: a0d2f4bc84915ed191f7e86a2fa11945 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:49Z : No. of bitstreams: 4 Publico-10890a.pdf: 1984275 bytes, checksum: 9c806a399d111fa36900927053424e9e (MD5) Publico-10890b.pdf: 1607433 bytes, checksum: 8c8860e6bda38169d779192272e62a56 (MD5) Publico-10890c.pdf: 1673660 bytes, checksum: a0d2f4bc84915ed191f7e86a2fa11945 (MD5) Publico-10890d.pdf: 1518283 bytes, checksum: 5bd6b7757a463a7b6c64cd275e3e0014 (MD5) / É observado que a cascata de sinalização de Notch tem ativação desregulada em diversos tipos de cânceres. Em câncer, é descrito que a função específica da via de sinalização de Notch e dependente do contexto celular, dos tipos específicos expressos de receptores homólogos e do cruzamento de informação (crosstalk) entre as diferentes vias de sinalização. Nosso laboratório descreveu previamente, que a via de sinalização de Notch apresenta-se desregulada em meningiomas de todos os graus. Entretanto, a conseqüência funcional desta sinalização anormal de Notch e desconhecida. Neste trabalho, descrevemos que, em linhagens celulares de meningiomas, a expressão exógena do gene Hes-1, o componente efetor da via de Notch, esta associada à formação de células tetraplóides. De forma similar, a expressão exógena das formas ativas dos receptores Notch 1 e Notch2, induz ao aumento da expressão de Hes-l, que contribui para a formação de células tetraplóides. Células tetraplóides de meningioma exibem indícios de instabilidade genética, caracterizados pelo aumento da freqüência de figuras atípicas nucleares, como a presença de mitoses com fusos multipolares e de células com núcleos de tamanho aumentado. As células tetraplóides isoladas por citometria de fluxo demonstram ser viáveis em cultura, embora apresentem uma maior taxa de apoptose espontânea, quando comparadas as células diplóides. A técnica de cariotipagem espectral foi usada para demonstrar que, em comparação as células diplóides, as células tetraplóides desenvolvem uma taxa mais elevada de aberrações cromossômicas estruturais e numéricas. Nossos resultados identificam uma nova função para a via de sinalização de Notch na geração tetraplóidia e conseqüentemente de instabilidade cromossômica. Portanto, a via desregulada da sinalização de Notch pode ser um mecanismo genético inicial em meningiomas, contribuindo potencialmente para a tumorigênese.. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Esta tese de doutorado descreve os estudos realizados para elucidar a biologia molecular da bioluminescência fúngica e sua relevância ecológica na natureza. A recente descoberta de que a luciferina fúngica é a 3-hidroxihispidina permitiu a caracterização do metabolismo secundário da fenilalanina nos genomas recém-sequenciados e transcriptomas de micélios das espécies luminescentes Panellus stipticus e Neonothopanus gardneri. Adicionalmente os genomas e transcriptomas de variedades não luminescente de P. stipticus e Lentinula edodes serviram como respectivos controles. Em geral, os genes envolvidos no metabolismo secundário da fenilalanina em amostras luminescentes tinham expressão igual ou superior àquela de espécies não luminescentes. Um agrupamento de genes relacionados com a biossíntese de fenilalanina foi encontrado em ambos os genomas luminescentes e não luminescentes de P. stipticus. A abundância de genes transcritos neste agrupamento foi semelhante para as espécies luminescentes e não luminescentes de P. stipticus, mas a policetídeo sintase tipo I em P. stipticus não luminescentes foi significativamente sub-regulada. Não foi encontrado agrupamento semelhante nos genomas de N. gardneri e L. edodes, sendo que os correspondentes homólogos estavam espalhados em diferentes loci. Extratos de fungos podem ser preparados in vitro, com a adição de 3-hidroxihispidina para produzir luz verde em abundância. A preparação de extratos proteicos de luciferase foi melhorada e a estrutura da luciferase, parcialmente purificada, foi investigada por espectrometria de massas. A presença de luciferase nos géis de purificação foi revelada usando-se luciferina e molécula similares à luciferina advindas de extratos de plantas. O nicho ecológico nas vizinhas de cogumelos bioluminescentes foi investigado de duas maneiras, armadilhas adesivas com cogumelos artificiais de acrílico, iluminados com luz LED verde e através da observação direta de cogumelos bioluminescentes com fotografia no infravermelho com lapso de tempo. Os estudos ecológicos foram conduzidos nos biomas da Mata Atlântica e da Mata dos Cocais, no Brasil. Baratas, aranhas, tesourinhas, grilo e vagalumes tec-tecs foram os animais mais comuns que interagiram com os cogumelos. Todos estes animais podem agir como dispersores de propágulos e, em alguns casos, como defensores dos cogumelos. / This PhD thesis describes the studies performed to elucidate the molecular biology of fungal bioluminescence and the ecological significance of the trait in the wild. The recent discovery that the fungal luciferin is 3-hydroxyhispidin has allowed for the characterization of phenylalanine secondary metabolism in the newly sequenced genomes and mycelium transcriptomes of luminescent Panellus stipticus and Neonothopanus gardneri, additionally the genomes and transcriptomes of a non-luminescent variety of P. stipticus and Lentinula edodes served as respective controls. In general the genes involved in phenylalanine secondary metabolism had greater or equal expression in luminescent samples than non luminescent. A cluster of genes related to the secondary metabolism of phenylalanine was found in both luminescent and non luminescent P. stipticus genomes. Transcript abundance of genes in this cluster was similar in both luminescent and non-luminescent Panellus stipticus, but the type I polyketide synthase in non luminescent Panellus stipticus was significantly down regulated. A similar gene cluster in the N. gardneri and L. edodes genomes was absent with corresponding homologues scattered at different genomic loci. Cell free fungal extracts can be combined in vitro with the addition of 3-hydroxyhispidin to produce abundant green light. Preparation of proteinaceous luciferase extracts was improved and partially purified luciferase samples were investigated by mass spectrometry. The presence of luciferase in the separation gel was also evidenced by using luciferin and luciferin-like molecules from plant extracts. The ecological niche surrounding bioluminescent mushrooms was investigated through two main means, glue traps with acrylic mushroom facsimiles that were internally illuminated with green LED lights and direct observation of bioluminescent mushrooms with infrared time lapse photography. Ecological studies were performed in the Atlantic rainforest (Mata Atlântica) and transitional Coconut Palm forest (Mata dos Cocais) biomes of Brazil. Cockroaches, spiders, earwigs, crickets, and luminescent click beetles were the most common animal interacting with mushrooms. All of these animals may be acting as fungal propagule dispersers and in some cases defense of the mushroom.

A enzima peroxidase (HRP) , agindo como uma oxigenase em substratos apropriados, promove a formação de espécies excitadas no estado triplete. Estes produtos excitados podem ser formados em sistemas bioquímicos e promover processos fotoquímicos no escuro. Nesta linha de estudos, investigamos a oxidação aeróbica, na presença de HRP, de substratos contendo ligações de Schiff. Esses compostos são de grande importância biológica, uma vez que participam como intermediários em diversas reações enzimáticas (transaminação, biossíntese de aminoácidos, biossíntese de profirinas), nas ligações cruzadas do colágeno e da elastina, na hemoglobina AlC, na rodopsina e bacterionodopsina e como produtos finais da lipoperoxidação. A oxidação aeróbica de quatro iminas alifáticas (BPA, i-BMA, sec-BMA e BVA) , catalisada por HRP, é quimiluminescente. A natureza triplete da espécie excitada foi sugerida pelo espectro de quimiluminescência, por meio de estudos de transferência de energia para DBAS e clorofila e pela supressão de quimiluminescência por oxigênio, sorbato, indol e p-benzoquinona. Com base nos altos valores de kETo encontrados, concluimos que a transferência de energia esteja ocorrendo provavelmente por um mecanismo a longa distância. A análise dos produtos da reação e os dados cinéticos indicam que a reação ocorre provavelmente segundo a via: (VER Esquema no arquivo) Ressalta-se que esta reação constitui um modelo mais adequado para sistemas bioluminescentes do que o proposto por McCapra e Burford (1976) com bases de Schiff aromáticas em t-butóxido e DMSO. Os sistemas aqui descritos também apresentam a possibilidade de desenvolvimento de método analítico, empregando quimiluminescência, para detectar formação de bases de Schiff em sistemas biológicos. Os estudos com base de Schiff alifáticos (sistemas modelo) foram estendidos para adutos contendo ligação de Schiff entre glicolaldeído e aminoácidos (Lys, Arg, His e Phe) ou proteínas (lisozima, BSA e protaminas). Todos os sistemas estudados são quimiluminescentes na presença de HRP; a fluorescência característica da formação do aduto decai concomitantemente com a emissão de luz; e, durante a reação, a peroxidase encontra-se principalmente na forma de composto II. Observa-se também transferência de energia dos sistemas glicolaldeído-lisozima/HRP/O2 e glicolaldeídoprotamina/HRP/O2 para clorofila. Estes estudos têm grande interesse do ponto de vista da toxicidade associada à ingestão de álcool etílico, a qual, segundo trabalhos recentes da literatura, é atribuída à formação de bases de Schiff entre proteínas de membranas e acetaldeído. E notável também, a formação de iminas durante o processo de lipoperoxidação e a quimiluminescência que o acompanha. Nossos dados levantam a possibilidade de que a toxicologia do álcool pode envolver espécies eletronicamente excitadas formadas na oxidação aeróbica dos adutos aldeído-proteínas. / Horseradish peroxidase (HRP) , acting as an oxigenase on various substracts, promotes the generation of electronically excited triplet species. These species can also be formed in many biochemical reactions and drive photochemical processes in the absence of light. Enlighted by this hypothesis (photobiochemistry in the dark) we have investigated the HRP-catalyzed aerobic oxidation of substrates containing Schiff linkage. These compounds are of utmost biological importance as they participate as intermediates of several enzymatic reactions (transamination, amino-acid biosyntheses, porphyrin biosyntheses, a.s.o.), in the crosslinking of collagen and elastin, in hemoglobin AlC, in rhodopsin and bacteriorhodopsin, and as final products from lipid peroxidation. The aerobic oxidation of four aliphatic imines (BPA, i-BMA, sec-BMA and BVA) , catalyzed by HRP, has been shown to be chemiluminescent. The triplet nature of the products is suggested by the chemiluminescence spectrum, by energy transfer studies to DBAS and chlorophyll a and by quenching of the chemiluminescence by molecular oxygen, sorbate ion, indol and p-benzoquinone. Based on the high values of ETTo found in these experiments we have concluded that the energy transfer process occur through a long range mechanism. Analyses of the products found in the spent reaction mixtures and the kinetic data indicate that the reaction follows the route: (SEE scheme file) We stress that this reaction constitutes a more realistic model for bioluminescent systems than that reported by McCapra and Burford (1976), which uses aromatic Schiff bases in DMSO/t-butoxi. In addition, the reaction described here point out for the possible development of chemiluminescent analytical procedure to detect the formation of Schiff bases in biological systems. Our studies on aliphatic Schiff bases were extended to adducts of both amino acids (Lys, Arg, His and Phe) and proteins (lyzozyme, bovine serum albumin and fish protamins) with glycolaldehyde. All these adducts are chemiluminescent when exposed to HRP in an aerated buffered solution. The fluorescence typical of the adducts decays concomitantly with light emission and, during the reaction, the enzyme remains predominantely in the form of HRP Compound II. Energy transfer to chlorophyll a from the systems glycolaldenyde-lyzozyme/O2/HRP and glycolaldehyde-protamine/ 02/HRP occur. These studies are relevant with respect to the toxicity associated to ethyl alcohol intake which, according to recent reports, is attributed to the formation of Schiff linkages between membrane proteins and acetaldehyde. Also noteworthy is the formation of imines along lipid peroxidation and the accompanying chemiluminescence. Our data raise the hypothesis that the alcohol toxicology may involve generated electronically excited species formed during aerobic oxidation of protein-aldehyde adducts.