Esta tese contem dados biológicos, ecológicos e bioquímicos de quatorze espécies brasileiras de elaterídeos luminescentes, distribuídos em duas tribos. Os insetos foram coletados de vários habitats e criados em laboratório, em colaboração com pesquisadores do Museu de Zoologia da USP. Demonstramos inicialmente que todos os elaterídeos estudados contêm a mesma luciferina de lampirideos, independentemente da natureza da lanterna (toráxica ou abdominal) e do estágio metamórfico. Estudos da biossíntese da luciferina a partir de 14C-cistina mostraram um rendimento radioquímico de síntese da ordem de 4%. Verificamos que cada espécie tem um λmax de bioluminescência característico, o que pode ter importância taxonômica, especialmente no caso de larvas. Estudo físico-químico (\"in vitro\") da luciferase mostrou a possível existência de isozimas de luciferase nas fases da metamorfose e nas lanternas abdominal e toráxica. A intensidade de emissão por ovos e larvas aumenta logarítmicamente com o aumento da temperatura absoluta, o que deve ter importância no mecanismo de caça das larvas. Ênfase especial foi dada ao Pyrearinus termitilluminans, espécie inquilina dos conhecidos \"cupinzeiros luminescentes\" encontrados no cerrado do Brasil Central e na bacia amazônica; descreve-se o processo de infestação dos cupinzeiros, usando-se observações de campo e moldagens das galerias com poliestireno. Uma conexão interessante foi constatada entre a bioluminescência e a produção de radicais de oxigênio, acompanhada por medidas de níveis de superóxido dismutase (SOD), ao comparar-se elaterídeos luminescentes e não-luminescentes da mesma tribo e ao comparar-se os segmentos abdominais e toráxicos de larvas de Pyrearinus termitilluminans. É também interessante notar que larvas de elaterídeos habitantes de troncos em apodrecimento (onde a concentração do oxigênio < 2%) possuem menor atividade da enzima antioxidante SOD que larvas de Pyrearinus termitilluminans, encontradas nas galerias aeradas dos cupinzeiros. Discute-se possíveis mecanismos de estocagem de oxigênio nas larvas luminescentes. Finalmente descobrimos que o regurgitado injetado pelas larvas de elaterídeos nas suas presas é fortemente tamponado em pH 7,3 e contém urna mistura de proteinases (tripsina e aminopeptidase) e carbohidrases (amilase, celulase, celobiase, maltase e trealase). A injeção deste coquetel enzimático imobiliza a presa e executa digestão pré-oral. As enzimas citadas foram caracterizadas por parâmetros físico-químicos (atividade específica, pH ótimo, pI, Mw, Km e migração eletroforética relativa) e mapeadas no interior do tubo digestivo das larvas. Os dados enzimaticos são tentativamente utilizados para análise filogenética destes insetos. / This thesis contains biological, ecological and biochemical data of fourteen species of Brazilian luminescent Elateridae (two tribes, four genera). The insects were collected in different habitats and reared from eggs in laboratory at the Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo. Thin layer chromatography revealed that the luciferin from the elaterid species, at different stages of development and from either the thoracic or abdominal lanterns, is the same as that of Lampyridae. The radiochemical yield of luciferin biosynthesis from the precursor 14C-cystine, is ca 4%. In vivo and in vitro bioluminescence spectra are characteristic for each species and probably can be used as a tool in taxonomy, specially in the case of the larvae. Physical-chemical studies point to the possible existence of luciferase isozymes in the abdominal and thoracic lanterns of adult Pyrophorus divergens. The bioluminescence intensity from Pyrearinus termitilluminans eggs and larvae increases sharply upon increasing the temperature. We also describe the infestation process of the \"luminous\" termite mounds (found in the \"cerrados\" of Central Brazil and in the Amazonian basin) on basis of field observations and polymer-molds of the mound galleries. There is an interesting conection between bioluminescence and the oxygen radical production when compared the levels of superoxide dismutase (SOD) and catalase (two antioxidant enzyme) in luminescent and non-luminescent elaterids. SOD levels were found to be higher in luminescent insects. For luminescent larvae, a direct correlation between SOD activity and brightness from the segments of their body was observed. In addition, larvae of Pyrearinus termitilluminans (inhabiting aerated galleries) have higher SOD activity than Pyrophorus divergens (dwelling decaying logs). These results are interpreted in terms of SOD protection against deleterious effects of active oxygen arising from storage of molecular oxygen to sustain the bioluminescent reaction. Finally we discovered that the dark liquid regurgited by larval elaterids and injected onto their preys is highly buffered in pH 7,3 and contains a mixture of hydrolases (trypsin, aminopeptidase, amylase, cellulase, cellobiase, maltase and trehalase). The injection of this liquid immobilizes the prey and perform the pre-oral digestion. These enzymes were characterized by physico-chemical parameters (specific activity, optimum pH, pI, Mw, Km and electrophoretical relative migration) and mapped in the midgut cells. The enzymatic data is tentatively used for phylogenetical analysis of these insects.

Esta tese contem dados biológicos, ecológicos e bioquímicos de quatorze espécies brasileiras de elaterídeos luminescentes, distribuídos em duas tribos. Os insetos foram coletados de vários habitats e criados em laboratório, em colaboração com pesquisadores do Museu de Zoologia da USP. Demonstramos inicialmente que todos os elaterídeos estudados contêm a mesma luciferina de lampirideos, independentemente da natureza da lanterna (toráxica ou abdominal) e do estágio metamórfico. Estudos da biossíntese da luciferina a partir de 14C-cistina mostraram um rendimento radioquímico de síntese da ordem de 4%. Verificamos que cada espécie tem um λmax de bioluminescência característico, o que pode ter importância taxonômica, especialmente no caso de larvas. Estudo físico-químico (\"in vitro\") da luciferase mostrou a possível existência de isozimas de luciferase nas fases da metamorfose e nas lanternas abdominal e toráxica. A intensidade de emissão por ovos e larvas aumenta logarítmicamente com o aumento da temperatura absoluta, o que deve ter importância no mecanismo de caça das larvas. Ênfase especial foi dada ao Pyrearinus termitilluminans, espécie inquilina dos conhecidos \"cupinzeiros luminescentes\" encontrados no cerrado do Brasil Central e na bacia amazônica; descreve-se o processo de infestação dos cupinzeiros, usando-se observações de campo e moldagens das galerias com poliestireno. Uma conexão interessante foi constatada entre a bioluminescência e a produção de radicais de oxigênio, acompanhada por medidas de níveis de superóxido dismutase (SOD), ao comparar-se elaterídeos luminescentes e não-luminescentes da mesma tribo e ao comparar-se os segmentos abdominais e toráxicos de larvas de Pyrearinus termitilluminans. É também interessante notar que larvas de elaterídeos habitantes de troncos em apodrecimento (onde a concentração do oxigênio < 2%) possuem menor atividade da enzima antioxidante SOD que larvas de Pyrearinus termitilluminans, encontradas nas galerias aeradas dos cupinzeiros. Discute-se possíveis mecanismos de estocagem de oxigênio nas larvas luminescentes. Finalmente descobrimos que o regurgitado injetado pelas larvas de elaterídeos nas suas presas é fortemente tamponado em pH 7,3 e contém urna mistura de proteinases (tripsina e aminopeptidase) e carbohidrases (amilase, celulase, celobiase, maltase e trealase). A injeção deste coquetel enzimático imobiliza a presa e executa digestão pré-oral. As enzimas citadas foram caracterizadas por parâmetros físico-químicos (atividade específica, pH ótimo, pI, Mw, Km e migração eletroforética relativa) e mapeadas no interior do tubo digestivo das larvas. Os dados enzimaticos são tentativamente utilizados para análise filogenética destes insetos. / This thesis contains biological, ecological and biochemical data of fourteen species of Brazilian luminescent Elateridae (two tribes, four genera). The insects were collected in different habitats and reared from eggs in laboratory at the Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo. Thin layer chromatography revealed that the luciferin from the elaterid species, at different stages of development and from either the thoracic or abdominal lanterns, is the same as that of Lampyridae. The radiochemical yield of luciferin biosynthesis from the precursor 14C-cystine, is ca 4%. In vivo and in vitro bioluminescence spectra are characteristic for each species and probably can be used as a tool in taxonomy, specially in the case of the larvae. Physical-chemical studies point to the possible existence of luciferase isozymes in the abdominal and thoracic lanterns of adult Pyrophorus divergens. The bioluminescence intensity from Pyrearinus termitilluminans eggs and larvae increases sharply upon increasing the temperature. We also describe the infestation process of the \"luminous\" termite mounds (found in the \"cerrados\" of Central Brazil and in the Amazonian basin) on basis of field observations and polymer-molds of the mound galleries. There is an interesting conection between bioluminescence and the oxygen radical production when compared the levels of superoxide dismutase (SOD) and catalase (two antioxidant enzyme) in luminescent and non-luminescent elaterids. SOD levels were found to be higher in luminescent insects. For luminescent larvae, a direct correlation between SOD activity and brightness from the segments of their body was observed. In addition, larvae of Pyrearinus termitilluminans (inhabiting aerated galleries) have higher SOD activity than Pyrophorus divergens (dwelling decaying logs). These results are interpreted in terms of SOD protection against deleterious effects of active oxygen arising from storage of molecular oxygen to sustain the bioluminescent reaction. Finally we discovered that the dark liquid regurgited by larval elaterids and injected onto their preys is highly buffered in pH 7,3 and contains a mixture of hydrolases (trypsin, aminopeptidase, amylase, cellulase, cellobiase, maltase and trehalase). The injection of this liquid immobilizes the prey and perform the pre-oral digestion. These enzymes were characterized by physico-chemical parameters (specific activity, optimum pH, pI, Mw, Km and electrophoretical relative migration) and mapped in the midgut cells. The enzymatic data is tentatively used for phylogenetical analysis of these insects.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-21T11:12:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 336431 bytes, checksum: 887553804bbe90d701abf5a9a80de79d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T11:12:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 336431 bytes, checksum: 887553804bbe90d701abf5a9a80de79d (MD5) Previous issue date: 2001-10-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foram avaliadas pela técnica de ATP-bioluminescência i) a qualidade microbiológica da água do manancial de captação para tratamento na ETA/UFV, da água de resfriamento de amônia e da água industrial de uso em um laticínio, ii) a adesão de Escherichia coli K12 e de esporos de Bacillus sporothermodurans, em suspensões, contendo cerca de 10 4 e 10 6 UFC/mL, em aço inoxidável e em polietileno de baixa densidade a 37°C e tempo de adesão de 24h. e, iii) o procedimento de higienização em superfícies de caminhão tanque, tanque de resfriamento de leite cru, tanque de equilíbrio do pasteurizador, desnatadeira, tanque de armazenamento de leite pasteurizado e tanque de equilíbrio para empacotamento de leite pasteurizado. Nas águas foram efetuadas, também, as contagens de mesófilos aeróbios, expressos em UFC/mL e coliformes totais, expressos em NMP/100mL. Nas superfícies foram determinados os números de mesófilos aeróbios aderidos, expressos em UFC/cm 2 . Foi utilizado o luminômetro UNILITEX-cel (BIOTRACE), para os testes de determinação de ATP, expressos em Unidades Relativas de Luz (URL), incluindo ATP total e livre. Em relação à água industrial, houve a concordância entre os métodos de bioluminescência e de contagem de mesófilos aeróbios e coliformes totais. As amostras de água de manancial e de resfriamento não apresentaram diferença (p<0,05), pelo teste de Tukey, para as quantidades de ATP total, livre e também para as contagens microbianas. Constataram-se concentrações de ATP microbiano diferentes para essas amostras de água. Os resultados indicam que teste de ATP total é mais recomendado e sugerem que qualidade físico-química da água diminui a medida de luz. A bioluminescência não foi apropriada para avaliar a presença de esporos de B. sporothermodurans e de E. coli nas superfícies avaliadas. A determinação das URL foi afetada pelas condições de adesão da E. coli. Os resultados mostram que tanto a concentração de ATP total e a contagem de mesófilos aeróbios foram diferentes (p<0,05) quando se comparou antes - 9772 URL e 1,20 X10 3 UFC/cm 2 - e após - 2511 URL e 1,10x10 1 UFC/cm 2 - o procedimento de higienização. A bioluminescência considerou 100% das superfícies em condições higiênicas insatisfatórias e contagem em placas apenas detectou 50%, considerando a recomendação da APHA e 28% a recomendação da OMS. Não houve concordância entre bioluminescência e a contagem microbiana na classificação quanto às condições higiênicas das diferentes superfícies. Observou-se grande variação na leitura de URL, sugerindo a necessidade de se efetuar mais de uma análise na superfície avaliada. A técnica de ATP-bioluminescência pode ser usada como indicadora das boas condições de limpeza, não apresentando relação com a contagem microbiana, indicando também a possibilidade de adesão microbiana e formação de biofilmes. / ATP-bioluminescence techniques were used to evaluate i) the microbiological quality of the ETA/UFV, treatment water, ammonia-cooling water and industrial water at a dairy, ii) the adhesion of Escherichia coli K12 and Bacillus sporothermodurans spores, in suspensions containing around 10 4 to 10 6 UFC/mL on stainless steel, at 37oC and adhesion time of 24 h and, iii) hygiene monitoring of truck surfaces, raw milk cooling tanks, pasteurizering tanks, milk centrifuge, pausterized milk storing tank and pausterized milk packaging tank. Aerobic mesophyllic and total coliform countings were also conducted in the water samples, respectively, expressed as UFC/mL and NMP/100 mL. The numbers of Aerobic mesophylls, expressed in UFC/cm 2 were determined on the surfaces. The UNILITEX-cel (Biotrace) luminometer was used for determining ATP, expressed as Relative Units of Light (RUL), including total and free ATP. For industrial water, there was an agreement between the bioluminescence and the counting methods of aerobic mesophylls and total coliforms Treatment and cooling water samples did not present any difference (p > 0.05) by the Tukey test for total and free ATP amounts nor for the microbial countings. Different microbial ATP concentrations were found for these water samples. The results indicate that the total ATP test is more adequate, suggesting that the physical chemical quality of water decreases light measurement. Bioluminescence was not appropriate to evaluate the presence of B. sporothermodurans and E. coli spores on the surfaces evaluated. RUL determination was affected by E. coli adhesion conditions. The results show that both total ATP and aerobic mesophyll countings were different (p < 0.05) when hygiene monitoring was compared before - 9772 RUL and 1.20 x 10 3 UFC/cm 2 - and after - 2511 RUL and 1.10 x 10 1 UFC/cm 2 . Biolominescence considered 100% of the surfaces to be under inadequate hygiene conditions while plate counting detected only 50%, based on APHA recommendation and 28%, based on WHO recommendation. There was no agreement between bioluminescence and microbial counting for hygiene condition classification under different surfaces. A great variation in RUL reading was observed, suggesting the need to carry out more than just one analysis on the surface evaluated. / Dissertação importada do Alexandria

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-24T18:54:19Z No. of bitstreams: 1 2017_MayaraSimonellyCostadosSantos.pdf: 16495247 bytes, checksum: d8de0cf05e99d2db52ce818eab46feab (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-24T19:33:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MayaraSimonellyCostadosSantos.pdf: 16495247 bytes, checksum: d8de0cf05e99d2db52ce818eab46feab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-24T19:33:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MayaraSimonellyCostadosSantos.pdf: 16495247 bytes, checksum: d8de0cf05e99d2db52ce818eab46feab (MD5) Previous issue date: 2018-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Financiadora de Estudos e Projetos (Finep); Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF) e Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia (INCT). / As fototerapias têm se mostrado como uma abordagem promissora frente às terapias convencionais para o tratamento do câncer. O presente estudo teve como objetivo produzir e avaliar a eficácia de ação da plataforma de nanofolhas de óxido de grafeno carboxilado associadas ao azul de metileno (NanoGO-AM) no uso das terapias fotodinâmica (TFD) e fototérmica (TFT) combinadas contra modelo de carcinoma mamário murino ortotópico singênico. In vitro, NanoGO-AM apresentou produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) após irradiação com luz de LED de 660 nm, e aumento de temperatura de 35,6 ° C seguido de irradiação com luz de laser. Os ensaios in vivo demonstraram um efeito aditivo obtido por NanoGO-AM com uso das TFD/TFT combinadas, que promoveram a ablação completa do tumor em 5/5 camundongos portadores de tumores de células 4T1-Luciferase. Até 30 dias após o último tratamento, não houve recidiva do tumor comparado aos grupos de TFD ou TFT apenas, que apresentaram bioluminescência tumoral 63 vezes maior que o grupo de tratamento para TFD/TFT combinadas. Estudos histológicos confirmaram que as terapias combinadas foram capazes de prevenir o crescimento tumoral e as metástases no fígado, pulmão e baço. Todos os dados sugerem o potencial de NanoGO-AM no tratamento de câncer de mama e prevenção de metástases. Na segunda parte do estudo, utilizou-se o cloreto de ftalocianina de alumínio (AlClFt), que é um fotossensibilizador hidrofóbico com alto rendimento quântico de oxigênio singleto. A combinação de nanofolhas de óxido de grafeno com AlClFt resultou em um dispositivo no qual o fotossensibilizador e o agente fototérmico estão em uma única nanoestrutura com potencial para uso em terapias combinadas. As nanofolhas de óxido de grafeno (NanoGO) foram produzidas a partir do método de Hummers tradicional e AlClFt foi adsorvido a sua superfície. Sob irradiação para TFD, NanoGO-AlClFt apresentou considerável produção de ERO em ambiente biológico. Células normais e tumorais (humanas e murinas), como MCF-7 (carcinoma mamário humano), MCF-10A (células normais de mama humana), 4T1-Luciferase (carcinoma mamário murino bioluminescente) e NIH/3T3 (célula de fibroblasto de embrião de camundongo) foram tratadas com NanoGO-AlClFt e irradiadas para TFD, TFT ou TFD/TFT combinadas. Houve uma redução significativa na viabilidade das células tumorais de até 90\%, mostrando o potencial da plataforma NanoGO-AlClFt em produzir danos celulares irreversíveis em células de carcinoma de mamário humano e murino. Os ensaios in vivo com camudongos portadores de tumor de células 4T1-Luciferase demonstraram a eficiência do NanoGO-AlClFt na mediação da ablação parcial do tumor e na prevenção da progressão tumoral com o uso da TFD/TFT combinadas. / Phototherapies have been shown as a promising alternative to the conventional therapies for cancer treatment. The present study aimed to prepare and use the nanographene oxide carboxylated-methylene blue platform (NanoGO-MB) to promote tumor ablation using combined photodynamic (PDT) and photothermal (PTT) therapies against a syngeneic orthotopic murine breast cancer model. In vitro, NanoGO-MB presented reactive oxygen species (ROS) production after LED light irradiation, and a temperature increase of approximately 40 °C followed by laser light irradiation. In vivo assays demonstrated an additive effect obtained by NanoGO-MB with the combined PDT/PTT therapies, which promoted complete tumor ablation in 5/5 4T1- Luciferase tumor-bearing mice. Up to 30 days after the last treatment, there was no tumor regrowth compared with PDT or PTT only groups, which displayed tumoral bioluminescence 63-fold higher than the combined PDT/PTT treatment group. Histological studies confirmed that the combined therapies were able to prevent tumor growth and liver, lung, and spleen metastasis. All data suggest the potential of NanoGO-MB in the treatment of breast cancer and metastasis prevention. In the second part of the study, it was used aluminum phthalocyanine chloride (AlPc), which is a hydrophobic photosensitizer with a high singlet oxygen species quantum yield. The combination of nanographene oxide and AlPc resulted in a device which the photosensitizer and the photothermal agent are in a single nanostructure with potential for use in the combined therapies. Graphene oxide nanosheets (NanoGO) were produced from a traditional Hummers method and AlPc was adsorbed on its surface. NanoGO-AlPc upon irradiation for PDT therapy displayed considerable ROS production in a biological environment. Normal and tumor cells (human and murine), as MCF-7 (human breast carcinoma cells), MCF-10A (human breast normal cells), 4T1-Luc (murine mammary tumor bioluminescent cells) and NIH/3T3 (murine embryo fibroblast cell) were treated with NanoGO-AlPc and irradiated for single PDT or single PTT and combined PDT/PTT therapies. There was a significant decrease in tumor cells viability of up to 90% showing the potential of platform NanoGO-AlPc in produce irreversible cell damage in human and murine breast carcinoma cells. In vivo assays with 4T1-Luc tumor-bearing mice demonstrated the efficiency of NanoGO-AlPc in mediating partial tumor ablation and preventing tumor progression with PDT and PTT combined therapies.

Entre centenas de espécies brasileiras de pirilampos, o Pyrearinus termitilluminans é o único cujo ciclo de vida se passa integralmente nos cupinzeiros luminosos localizados no Brasil central claramente observados durante a estação das chuvas. A emissão de luz nos elaterídeos tem a função de atração de presas para a alimentação. A bioluminescência desses animais desaparece nos meses de seca juntamente com a nuvem de presas aladas. Assim, o metabolismo de trealose aqui estudado poderia prover informações sobre da capacidade da larva de sobreviver em ambientes edáficos. As concentrações de trealose e glicose são determinadas nos extratos de larvas com um sistema DIONEX&#174; de cromatografia iônica. A trealase foi medida com 17 mM de trealose. O glicogênio foi estimado com uma amiloglicosidase. Paralelamente o estresse oxidativo associado com a restrição de água foi monitorado através da determinação do TBARS, juntamente com a catalase, glutationa peroxidase e glutationa redutase. Nas larvas submetidas ao ensaio na câmara climática (25% de umidade) a trealase (159,69&#177;10,95 mU/animal) estava 80 vezes mais alta do que a do grupo controle (2,02&#177;1,41mU/animal). As larvas sob estresse apresentaram distintos níveis de trealose e glicose (29,85&#177;3,20 &#181;mol/animal e 18,27&#177;0,82 &#181;mol/animal, respectivamente) quando comparadas com o grupo controle (64,61&#177;1,54 &#181;mol/animal e 2,16&#177;0,11 &#181;mol/animal, respectivamente). A elevação dos níveis das enzimas antioxidantes (4, 4,3 e 2,4 vezes respectivamente) com níveis invariáveis de TBARS apontam para a ação antioxidante contra a produção elevada de espécies reativas de oxigênio. Os insetos submetidos à restrição hídrica perderam aproximadamente 35% do peso. O aumento da atividade da trealase, com concomitante decréscimo dos níveis de trealose, sugerem que esse açúcar poderia ser usado como fonte hídrica. Entretanto, os níveis de glicose, 10 vezes mais elevados no grupo sob estresse poderia ser usado na via de biossíntese de trealose uma vez que os níveis de glicogênio estão diminuídos. As mudanças no metabolismo de trealose e o desbalanço no equilíbrio redox, poderiam fornecer importantes informações fisiológicas desses insetos sob estresse hídrico. / The life cycle of Pyrearinus termitilluminans (Coleoptera: Elateridae) takes place totally into the so-called luminous termite mounds located in Central Brazil, which are clearly observed during the rainy season. Light emission by the elaterid larvae acts like a trap attracting flying insects. The bioluminescence disappears in the dry months together with the food supply. The trehalose metabolism study described here could provide information about larva capacity to survive throughout hard climatic changes. Trehalose and glucose concentrations are determined in the larva extracts with a DIONEX&#174; ion chromatography system. The trehalase activity was measured with 17 mM trehalose. The glycogen level was estimated with amyloglucosidase. In parallel oxidative stress associated to water deprivation was evaluated through determination of TBARS and the catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase activities. In larvae submitted to dryness in a growth chamber (25% humidity) we have found 80-fold higher trehalase activity (159.69&#177;10.95 mU/animal) than in the control group raised under room conditions (2.02&#177;1.41 mU/animal). Stressed larvae showed distinct trehalose and glucose contents (29.85&#177;3.20 &#181;mol/animal and 18.27&#177;0.82 &#181;mol/animal, respectively) when compared with the control group(64.61&#177;1.54 &#181;mol/animal and 2.16&#177;0.11 &#181;mol/animal, respectively), whereas the glycogen level was lower (11.53&#177;2.01 mg/animal and 28.26&#177;2.31 mg/animal, respectively). Elevation of the antioxidant enzyme levels (4-fold, 4.3-fold and 2.4-fold respectively) with maintenance of TBARS pointed to depletion to exacerbated production of reactive oxygen species. Insects submitted to water restriction lost about 35% wet weight. The observed increase of trehalase activity and concomitant decrease of trehalose level suggest that trehalose could be used as a metabolic water source. Moreover, the 10-fold higher glucose level in the stressed group could be used by the trehalose biosynthetic pathway as the glycogen level decreases in parallel. The trehalose metabolic and redox balance changes described here may shed light on the yet unknown physiological mechanisms of larval elaterid adaptation to water stress.

Este tese descreve métodos para a purificação e determinação da massa molecular do precursor da luciferina fúngica, a partir dos corpos de frutificação do fungo bioluminescente Neonothopanus gardneri. A molécula em questão é o substrato da primeira etapa da reação enzimática responsável pela emissão de luz em fungos, fenômeno conhecido como bioluminescência. Ao longo do projeto, foi otimizado um ensaio analítico qualitativo para detecção do precursor da luciferina em solução, e também foram desenvolvidos métodos de extração e purificação da molécula de interesse, levando sempre em consideração a baixa quantidade da molécula disponível in vivo e a susceptibilidade de degradação da molécula quando exposta a oxigênio, luz e pH extremos. Após estabelecer diversas condições cromatográficas para a purificação do precursor da luciferina, foi possível correlacionar uma molécula de massa molecular 246,05 u com uma atividade positiva no ensaio analítico qualitativo para detecção da luciferina em solução. Posteriormente, foi descoberto por um grupo russo que o precursor da luciferina tinha massa molecular 246,05 u e fórmula molecular C13H10O5. Também foram realizados experimentos a fim de corroborar a estrutura molecular do produto da reação de emissão de luz em fungos, assim como determinar o seu mecanismo de formação. / This thesis describes methods for purification and determination of molecular mass of fungal luciferin precursor from fruiting bodies of bioluminescent fungus Neonothopanus gardneri. The molecule it is the substrate of enzymatic reaction first step responsible for light emission in fungi, phenomenon known as bioluminescence. During PhD, it was optimized a qualitative assay in order to detect the luciferin precursor in solutions and also were developed methods for extraction and purification of the molecule of interest, always considering the low amount of molecule available in vivo and the susceptibility of molecule degradation when exposed to oxygen, light and extremes pH\'s. After establishing several chromatographic conditions for purification of luciferin precursor, it was possible to correlate a molecule with molecular mass of 246.05 u with a positive activity in the qualitative analytical assay. Later, a Russian group describe that the precursor of luciferin had molecular mass 246.05 u and molecular formula C13H10O5. Experiments were also performed in order to corroborate the molecular structure of the reaction product of light emission in fungi as well as determine its formation mechanism.

Esta tese descreve como é possível obter emissão de luz in vitro enzimaticamente, a partir de extratos quente e frio de diferentes espécies de fungos bioluminescentes, o que indica também um mecanismo comum de bioluminescência em todos esses organismos. Dados cinéticos sugerem um mecanismo enzimático em duas etapas e corroboram a hipótese enzimática de Airth e Foerster, da década de 1960. Finalmente, utilizando-se extratos quente e frio foi possível também isolar a luciferina fúngica e obter sua massa molecular (298,1837 m/z). Essa substância isolada emite luz enzimaticamente in vitro, sendo que a sobreposição do espectro de emissão e do espectro de bioluminescência do fungo confirma que essa substância é a luciferina fúngica. / This thesis describes how in vitro light emission can be enzymatically obtained from the hot and cold extracts assay using different species of fungi, which also indicates a common mechanism of light emission for all these organisms. Kinetic data suggest a consecutive two-step mechanism and corroborate the 1960\'s enzymatic proposal of Airth and Foerster. Finally, using hot and cold extracts assay we were also able to purify and to determine the molecular weight of the fungal luciferin (298.1837 m/z). The isolated substance emits light enzymatically in vitro, whose light emission spectrum matches with the fungal bioluminescence one thus confirming that the substance is the fungal luciferin

Este tese descreve métodos para a purificação e determinação da massa molecular do precursor da luciferina fúngica, a partir dos corpos de frutificação do fungo bioluminescente Neonothopanus gardneri. A molécula em questão é o substrato da primeira etapa da reação enzimática responsável pela emissão de luz em fungos, fenômeno conhecido como bioluminescência. Ao longo do projeto, foi otimizado um ensaio analítico qualitativo para detecção do precursor da luciferina em solução, e também foram desenvolvidos métodos de extração e purificação da molécula de interesse, levando sempre em consideração a baixa quantidade da molécula disponível in vivo e a susceptibilidade de degradação da molécula quando exposta a oxigênio, luz e pH extremos. Após estabelecer diversas condições cromatográficas para a purificação do precursor da luciferina, foi possível correlacionar uma molécula de massa molecular 246,05 u com uma atividade positiva no ensaio analítico qualitativo para detecção da luciferina em solução. Posteriormente, foi descoberto por um grupo russo que o precursor da luciferina tinha massa molecular 246,05 u e fórmula molecular C13H10O5. Também foram realizados experimentos a fim de corroborar a estrutura molecular do produto da reação de emissão de luz em fungos, assim como determinar o seu mecanismo de formação. / This thesis describes methods for purification and determination of molecular mass of fungal luciferin precursor from fruiting bodies of bioluminescent fungus Neonothopanus gardneri. The molecule it is the substrate of enzymatic reaction first step responsible for light emission in fungi, phenomenon known as bioluminescence. During PhD, it was optimized a qualitative assay in order to detect the luciferin precursor in solutions and also were developed methods for extraction and purification of the molecule of interest, always considering the low amount of molecule available in vivo and the susceptibility of molecule degradation when exposed to oxygen, light and extremes pH\'s. After establishing several chromatographic conditions for purification of luciferin precursor, it was possible to correlate a molecule with molecular mass of 246.05 u with a positive activity in the qualitative analytical assay. Later, a Russian group describe that the precursor of luciferin had molecular mass 246.05 u and molecular formula C13H10O5. Experiments were also performed in order to corroborate the molecular structure of the reaction product of light emission in fungi as well as determine its formation mechanism.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-04T15:03:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 242374 bytes, checksum: e0a0f909b979452d08aa2d7671aa36d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-04T15:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 242374 bytes, checksum: e0a0f909b979452d08aa2d7671aa36d4 (MD5) Previous issue date: 2004-06-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Avaliou-se a interferência da caseína, lipídeo, sacarose, Staphylococcus carnosus e esporos de Bacillus subtilis na determinação da bioluminescência. As substâncias orgânicas e os microrganismos em suspensões ou aderidos ao aço inoxidável, AISI 304, n° 4 foram analisados isoladamente e em combinações. A bioluminescência foi determinada em luminômetro comercial, com os resultados expressos em Unidades Relativas de Luz (URL). Em relação às suspensões preparadas com três substâncias orgânicas, houve um aumento (p<0,05) no número de URL com a presença de caseína e lipídeo. A sacarose reduziu a bioluminescência. Neste mesmo tipo de suspensão aderida ao aço inoxidável, o número de URL aumentou (p<0,05) com a presença de caseína e sacarose. O lipídeo reduziu a bioluminescência. Constatou-se um maior (p<0,01) número de URL nas suspensões com 5,4x104 CDM.mL-1 de S. carnosus em relação aquelas com 2,9x104 CDM.mL-1 de esporos de B. subtilis. No que se refere às suspensões de células vegetativas ou esporo bacteriano aderidas ao aço inoxidável, adicionadas ou não das três substâncias orgânicas, a bioluminescência para S. carnosus foi sempre maior (p<0,05) do que para os esporos de B. subtilis, independente da concentração estudada. As três substâncias orgânicas reduziram o número de URL (p<0,05) quando combinadas com 5,4x104 CDM.mL-1 de S. carnosus. Quando se utilizou esporo de B. subtilis, as três substâncias orgânicas não tiveram nenhum efeito significativo (p>0,05) na determinação da bioluminescência. Três resultados diferentes foram observados quando se compararam as suspensões contendo simultaneamente as três substâncias mais célula vegetativa e aquelas que continham somente o microrganismo, todas aderidas ao aço inoxidável: redução (p<0,05) no número de URL, quando a bactéria estava na concentração de 5,4x103 CDM.cm-2, aumento na bioluminescência (p<0,05) nas suspensões onde S. carnosus estava presente na concentração de 5,4x102 CDM.cm-2 e nenhuma diferença significativa (p>0,05) foi detectada em presença de célula vegetativa na concentração de 5,4x101 CDM.cm-2. Foi detectado um aumento no número de URL nas suspensões de caseína, lipídeo e sacarose adicionadas de 2,9x103 CDM.cm-2 esporos de B. subtilis em relação à suspensão com as três substâncias orgânicas, todas aderidas ao aço inoxidável. Na comparação envolvendo as outras duas concentrações de esporo bacteriano e a suspensão com as três substâncias, percebeu-se uma redução no número de URL. As substâncias orgânicas, os microrganismos e as combinações entre eles, tanto em análises em suspensão quanto aderidos ao aço inoxidável interferiram em maior ou menor grau na técnica de bioluminescência. A determinação de ATP nas superfícies não deve ser a única técnica usada para monitorar a eficiência da higienização em indústrias de alimentos. Ela pode ser utilizada como uma ferramenta complementar da avaliação microbiológica tradicional. Além disso, para a obtenção de informações confiáveis, deve-se entender as limitações dessa técnica. / The casein, lipid, sucrose, Staphylococcus carnosus and Bacillus subtilis spores interference in the bioluminescence measurement was evaluated. The organic substances and the microorganisms, presents in suspensions or adhered to the stainless steel, were analyzed separately and in combinations. A commercial luminometer was used, with the results expressed in Relative Units of Light (RUL). In relation to the suspensions with the three organic substances, there were an increase (p<0,05) in the RUL measurements with the casein and lipid addition. The sucrose reduced the bioluminescence. In this same suspension, adhered to the stainless steel, the RUL measurements were increased (p <0,05) with the casein and sucrose addition. The lipid reduced the bioluminescence. It was verified (p <0,01) a higher RUL measurement in the suspensions with 5,4x104 CDM.mL-1 of S. carnosus in relationship those with 5,4x104 CDM.mL-1 of B. subtilis spores. For the suspensions of vegetative cells or bacterial spores adhered to the stainless steel, added or not of the three organic substances, the RUL measurements for S. carnosus were always higher (p <0,05) than for the B. subtilis spores. The suspension containing the three organic substances decreased (p <0,05) the RUL measurement when added of 5,4x104 CDM.mL-1 of S. carnosus. When the microorganism was B. subtilis spores, the three organics substances did not showed difference (p>0,05) in the bioluminescence measurement. Three different results in the bioluminescence were observed in the comparison among the suspensions containing the three substances added of vegetative cell and those that contained only the microorganism, all of them adhered to the stainless steel: it was a reduction (p <0,05) in the measurement of RUL, when the bacteria were in the concentration of 5,4x105 CDM.mL-1, it was observed an increase in the bioluminescence (p <0,05) in the suspensions when S. carnosus was present in the concentration of 5,4x104 CDM.mL-1 and it was not observed difference (p>0,05) when the vegetative cell was in the concentration of 5,4x103 CDM.mL- . An increase was detected in the RUL measurement in the casein suspensions, lipid and sucrose added of 2,9x10-3 CDM.cm-2 of B. subtilis spores in relation to the suspension with the three organic substances, all adhered to the stainless steel. In the comparison involving the other two concentrations of bacterial spore and the suspension with the three substances, it was observed a decrease in the RUL measurement. The organics substances, microorganisms and their combinations, in suspensions or adhered to stainless steel, showed an interference on ATP bioluminescence measurements. This technique should be used as an auxiliary tool associated to traditional microbiological analysis. / Não foi localizado o cpf do autor.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6253.pdf: 5729447 bytes, checksum: f2e05373166926e6816bed92f8f5d53f (MD5) Previous issue date: 2014-10-01 / Universidade Federal de Minas Gerais / The origin and evolution of Elateridae bioluminescence is uncertain, especially the evolution of the luciferases of different phases and lanterns of Elateridae, the relationship between structure and bioluminescence spectra and the phylogeny of neotropical species. In this study, the cDNA containing the genes of Fulgeochlisus bruchi and Pyrophorus angustus luciferases, which presente different kinetic characteristics, such as high pH optimum and a high affinity for ATP and Luciferin, were cloned. Analyses of Elateridae luciferases suggest that, regardless of the stage of life or organ (dorsal or ventral lanterns), these luciferases displayed a higher identity degree to the luciferases that present closer bioluminescence spectra, probably, due to intergenetic recombination effects. The luciferase primary sequences alignments and site-directed mutagenesis studies suggested important residues to modulate color in Elateridae, such as S247. Our phylogenetic analyzes indicated a closer relationship between Elateridae and Phengodidae, however there are diverngence between the markers used. The sequencing of mitochondrial genomes showed that the Phengodidae genomes displayed several rearrangements and gene duplication, indicating the need for further studies on this family. Our data also suggest that bioluminescence arised at least three times independently in Elateoridea from ancestors similar enzymes. / A origem e evolução da bioluminescência em Elateridae é incerta, especialmente a evolução das luciferases das diferentes fases e lanternas de elaterídeos, a relação entre estrutura e espectros de bioluminescência e a filogenia de espécies neotropicais. Neste trabalho os cDNA contendo os genes das luciferases de Fulgeochlisus bruchi e de Pyrophorus angustus, as quais possuem características cinéticas distintas, como elevado pH ótimo e alta afinidade com ATP e Luciferina, foram clonados. Comparando as luciferases de Elateridae sugerimos que, independentemente da fase de vida ou órgão (lanterna dorsal ou ventral), essas luciferases apresentam maior grau de identidade quanto mais próximos forem os espectros de bioluminescência, provavelmente, devido a efeitos de recombinação gênica. Os alinhamentos das sequências primárias das luciferases e de estudos de mutagênse sítiodirigida sugerem possíveis resíduos importantes para a modulação de cor em Elateridae, como o resíduo S247. Nossas análises filogenéticas indicaram uma maior proximidade entre as famílias Elateridae e Phengodidae, porém existem divergências entre os marcadores utilizados. O sequenciamento dos genomas mitocondriais mostrou que os genomas dos Phengodidae possuem diversos rearranjos e duplicações gênicas, indicando a necessidade de mais estudos sobre essa família. Nossos dados também sugerem que a bioluminescência se originou pelo menos três vezes independentemente em Elateoridea, a partir de enzimas ancestrais similares.