Yes / Background: Carbon (δ13C) and nitrogen (δ15N) isotope ratios of collagen from teeth and bone are used to study human nutrition and health. As bones are constantly remodelling throughout life, isotopic values of bone collagen represent an average of several years. In contrast, human teeth do not remodel and their primary dentine contains only the isotopic data from the time of formation. In contrast to all other bones, human auditory ossicles also appear not to remodel. As they develop in utero and finish formation in the first 2 years of life, their collagen should also represent isotopic values of these two relatively short periods. Aim: By comparing δ13C and δ15N data from ossicles and incremental dentine, this study aims to investigate how two developmental periods of the ossicles, in utero and the first 2 years of life, reflect in collagen obtained from the ossicles. Subject and methods: Ossicle and tooth samples of 12 individuals aged 0.5 ± 0.4 years to 13 ± 1 years from the nineteenth century St. Peter’s burial ground in Blackburn were collected and processed to obtain bulk bone and incremental dentine collagen which was measured for δ13C and δ15N. Results: Averaged δ13C and δ15N of ossicles are lower when compared to every age group except after 3 years of age. Average offset between ossicles and dentine of different groups ranges from 0.4–0.9‰ for δ13C and from 0.3–0.9‰ for δ15N, with highest counterbalance at birth and after the first 5 months after birth. Conclusions: There appears to be a systematic offset between the dentine and ossicle data. It seems that the second phase of development does not influence the isotopic values of collagen significantly and the data we are obtaining from ossicles represents the in utero period. / Research grant from The Society for the Study of Human Biology.

L’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie auto-immune multifactorielle du foie de pathogenèse inconnue. Cette maladie est caractérisée par une perte de la tolérance immunologique envers des antigènes du soi hépatiques entraînant une destruction progressive du parenchyme hépatique en absence de traitements. La prednisone avec l’azathioprine est le traitement de première ligne pour les patients atteints d’HAI. Cette combinaison d’immunosuppresseurs permet de réduire l’inflammation du foie et permet d’induire une rémission chez environ 80 à 90% des patients. Bien que la majorité des patients atteints d’HAI répondent bien à long terme aux traitements disponibles, 10 à 20% de ceux-ci ne répondront pas aux traitements, développeront une cirrhose et pourront nécessiter éventuellement d’une greffe hépatique. Puisqu’à l’heure actuelle aucun test clinique, biologique ou histologique n’est capable de prédire s’il y aura réponse aux traitements et rémission chez les patients atteints d’HAI, il est important d'identifier des biomarqueurs capables de prédire la réponse au traitement et l'activité de la maladie chez ces patients. L’hypothèse de ce projet est que la rémission clinique et une réponse favorable au traitement chez les patients HAI sont influencées par des médiateurs immunologiques (cellules et/ou cytokines) qui, lorsqu’identifiés, pourraient être utilisés pour évaluer la réponse au traitement. Le but de ce projet est donc d’identifier un ou plusieurs biomarqueurs de l'activité de la maladie et de la réponse au traitement chez les patients HAI. Selon les résultats obtenus, il est possible de suggérer que l’IL-16 pourrait influencer l’activité de l’HAI en affectant à la fois les voies pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Les résultats obtenus suggèrent aussi que l’IL-10, l’IL-16 et certaines sous-populations de lymphocytes T CD4 effecteurs et régulateurs pourraient être des biomarqueurs potentiels de l'activité de la maladie et de la réponse au traitement chez les patients HAI. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour valider l'utilité de ces biomarqueurs dans la prédiction de la réponse au traitement et de l'activité de la maladie chez les patients atteints d’HAI. / Autoimmune hepatitis (AIH) is a multifactorial autoimmune liver disease of unknown pathogenesis characterized by a loss of immunological tolerance towards hepatic self-antigens leading to progressive destruction of the liver parenchyma in the absence of treatment. Prednisone with azathioprine is the first-line treatment for AIH patients. This combination of immunosuppressants helps reduce liver inflammation and induces remission in approximately 80 to 90% of patients. Although most AIH patients respond to available treatments, 10 to 20% will not respond to treatment and will develop cirrhosis and may eventually require a liver transplant. Currently, no clinical, biological, or histological parameters can predict the initial response to treatment or long-term remission of patients with AIH. Therefore, there is a crying need for reliable biomarkers capable of predicting response to treatment and disease activity in these patients. The hypothesis of this project is that clinical remission and a favorable response to treatment in AIH patients are influenced by immunological mediators (cells and/or cytokines) which, when identified, could be used to evaluate the response to treatment. The aim of this project is therefore to identify biomarker(s) of disease activity and treatment response in AIH patients. According to our results, we believe that IL-16 could influence AIH activity by affecting both proinflammatory and anti-inflammatory pathways. Our results also suggest that IL-10, IL-16 and subpopulations of effector and regulatory CD4 T cells could be putative biomarkers of disease activity and response to treatment in AIH patients. However, further research is needed to validate the usefulness of these biomarkers in predicting treatment response and disease activity in AIH patients.

Das SHT ist eine ubiquitär vorkommende, häufige Unfallfolge mit einer jährlichen Prävalenz von mehreren Millionen Fällen weltweit und massiven Kosten für die Gesundheitssysteme. Auch in vielen rechtsmedizinischen Obduktionen stellt es eine potenzielle Todesursache dar, welche hierbei bestätigt oder ausgeschlossen werden muss. Trotz der hohen Fallzahlen im Arbeitsalltag existieren neben der Autopsie bisher kaum laboranalytische Methoden zur Identifikation eines SHTs. Die vorliegende Dissertation befasst sich daher mit der Frage, ob ein massenspektrometrischer Nachweis gewisser Metabolite in der CSF geeignet ist, um als zuverlässiger Surrogatmarker im Rahmen einer Obduktion postmortal ein SHT als Todesursache zu identifizieren - beziehungsweise dieses von der Kontrollgruppe des akuten Herztodes zu unterscheiden. Die Untersuchung diente zur Prüfung der Hypothese, ob der Quotient einer bestimmten CSF-Metaboliten-Kombination ein SHT zuverlässig von der genannten Kontrollgruppe abgrenzen und somit als Biomarker verwendet werden kann. Die LC/MS-Analyse der autoptisch gewonnenen CSF mittels MeOH/H2O- und modifizierter Bligh/Dyer (B/D)-Extraktion, die anschließende statistische und graphische Auswertung und die Bildung des SHT-Herztod-Quotienten zeigten hierbei vielversprechende Ergebnisse. So konnten 212 Metabolite identifiziert werden, die eine signifikante Konzentrationsänderung bei letal verlaufenem SHT im Vergleich zur Kontrollgruppe aufwiesen. Des Weiteren konnte ein Quotient aus insgesamt zehn Metaboliten gebildet werden, der nach Festlegung des Cut-off-Wertes auf ≥ 8,626 93,3% der SHTs und 100% der akuten Herztodesfälle richtig positiv erkannt hat (SHT-Sensitivität: 93,3%, SHT-Spezifität: 100%). Viele Metaboliten-Messwerte nach letal verlaufenem SHT können anhand wissenschaftlicher Publikationen und physiologischer Modelle erklärt und begründet werden. Die vorliegende Arbeit stellt hierzu aber auch einige neue Theorien auf, die spezifische posttraumatisch-metabolische Abläufe des menschlichen Körpers zu erklären versuchen. Die LC/MS-Analyse des Metaboloms kann zukünftig in der Rechtsmedizin als innovative und erfolgversprechende Methode zur Detektion von posttraumatischen und postmortalen Stoffwechselabläufen angesehen werden. Darüber hinaus kann sie zu einem verbesserten Grundverständnis physiologischer Abläufe beitragen und hierbei auch zur Entwicklung neuer klinischer Therapiemethoden eines SHTs führen. / TBI is a ubiquitous and frequent consequence of accidents with an annual prevalence of several million cases worldwide and massive costs for healthcare systems. It is also a potential cause of death in many forensic autopsies, which must be confirmed or ruled out. Despite the high number of cases in everyday work, there are hardly any laboratory analysis methods for identifying a TBI apart from autopsies. This dissertation therefore deals with the question of whether mass spectrometric detection of certain metabolites in CSF is suitable as a reliable surrogate marker in the context of a post-mortem autopsy to identify a TBI as the cause of death - or to distinguish it from the control group of acute cardiac death. The study served to test the hypothesis as to whether the quotient of a specific CSF metabolite combination can reliably differentiate a TBI from the aforementioned control group and thus be used as a biomarker. The LC/MS analysis of the autopsy-derived CSF using MeOH/H2O and modified Bligh/Dyer (B/D) extraction, the subsequent statistical and graphical evaluation and the formation of the SHT cardiac death quotient showed promising results. 212 metabolites were identified that showed a significant change in concentration in lethal TBI compared to the control group. Furthermore, a quotient was formed from a total of ten metabolites, which, after setting the cut-off value at ≥ 8.626, correctly recognised 93.3% of TBIs and 100% of acute cardiac deaths (TBI sensitivity: 93.3%, TBI specificity: 100%). Many metabolite measurements after lethal TBI can be explained and justified on the basis of scientific publications and physiological models. However, this study also presents some new theories that attempt to explain specific post-traumatic metabolic processes in the human body. In future, LC/MS analysis of the metabolome can be seen as an innovative and promising method for detecting post-traumatic and post-mortem metabolic processes in forensic medicine. In addition, it can contribute to an improved basic understanding of physiological processes and also lead to the development of new clinical treatment methods for TBI.

1-Methylpyren (MP) ist hepatokanzerogen in neugeborenen männlichen Mäusen. Durch Hydroxylierung an der benzylischen Stelle und anschließende Sulfonierung wird MP zu DNA-reaktivem 1-Sulfooxymethylpyren (SMP) aktiviert. In der Ratte führt die Exposition des benzylischen Alkohols, 1-Hydroxymethylpyren (HMP), zur DNA-Adduktbildung in verschiedenen Geweben. Eventuelle Konsequenz der Toxifizierung ist die Ausscheidung entsprechender Mercaptursäure und Nukleosidaddukt im Harn, welche aufgrund ihrer Herkunft als Biomarker eignen könnten. In dieser Arbeit wird die Ausscheidung der Mercaptursäure und des N2-Desoxyguanosinadduktes in HMP-exponierten Ratten untersucht. <br /> Nach der Applikation von HMP bzw. MP wurden weniger als 1 % der Dosis als MPMA über Urin und Faeces ausgeschieden (0 - 48 h). Die Ausscheidung erfolgt hauptsächlich in den ersten 24 h nach der Applikation. MPdG konnte weder in Urin noch in Faeces der HMP-behandelten Tieren identifiziert werden. Nach direkter SMP-Applikation wurde MPdG nur in sehr geringe Menge (weniger als 0,9 ppm in 12 h) im Urin gefunden. <br /> Aufgrund der geringen Menge eignet sich MPdG nicht als Biomarker. MPMA dagegen, lässt sich analytisch gut erfassen. Es sollte daher untersucht werden, ob MPMA die Toxifizierung des HMP wiederspiegelt. Die Voraussetzung dafür ist die Kenntnisse über das Metabolismusmuster von HMP. <br /> Es wurde daher umfassende Untersuchungen zum Metabolismus des HMP durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass mehr als 80 % der Metaboiten in ihrer oxidierten Form (PCS, deren Glucuronsäure-Konjugate sowie phenolische Sulfatester der PCS) ausgeschieden wurden. Demnach spielt die Oxidation des HMP zu PCS eine sehr wichtige Rolle bei der Detoxifizierung und Ausscheidung von HMP. Ferne konnte nachgewiesen werden, dass die Enzyme Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenase an der Oxidation von HMP beteiligt waren. Die Inhibitoren Disulfiram und Ethanol der o. g. Enzyme wurde daher zur Modulation der Detoxifizierung in vivo eingesetzt. Die Veränderungen in der Toxifizierung von HMP zu SMP wurden durch die SMP-Konzentration im Plasma, die DNA-Addukthäufigkeit und die MPMA-Ausscheidung erfasst. Die Vorbehandlung von Disulfiram und Ethanol führte zu tendentielle Erhöhung der SMP-Konzentration im Plasma, DNA-Addukthäufigkeit in der Leber und die MPMA-Ausscheidung. Bemerkenswert ist jedoch, dass bereits eine Dosis von 0,2 g Ethanol/kg Körpermasse bereits zu statistisch signifikanten Erhöhungen der MPMA-Ausscheidung bei weiblichen Ratten. / 1-Methylpyrene is hepatocarcinogenic in rodents. It is metabolized primarily to 1-hydroxymethylpyrene (HMP) by various cDNA-expressed rat and human cytochromes P450. HMP is activated to a highly reactive sulfuric acid ester, 1-sulfooxymethylpyrene (SMP), by sulphotransferases. In the rat, this activation pathway leads to the formation of DNA adducts in various tissues. Possible consequences of the toxification could be the excretion of the corresponding mercapturic acid and nucleosidadduct in urine and feces. Because of their origin, these substances should reflex the toxification process may be used as biomarkers. We investigate the excretion of 1-methylpyrenyl-mercapturic acid (MPMA) and the excretion of N2-(1-methylpyrenyl)-desoxyguanosin (MPdG) in urine and feces of HMP-treated rats. These studies showed that only a minor portion (< 1 %) of the administered dose of 1-HMP was excreted as mercapturic acid. MPdG could not be identified in urine and feces of HMP-treated rats. Treating rats with the active spieces sulfooxymethylpyrene, 0.9 ppm of the dose was found excreted within 12 h. I now investigated the alternative metabolic pathways of HMP. More than 50 % of the dose (administered intraperitoneally) was excreted as free 1-pyrenyl carboxylic acid and its glucuronic acid conjugate primarily in the urine. Other major urinary metabolites were phenolic sulpho conjugates of ring-oxidized 1-pyrenyl carboxylic acid (> 30 %). Minor metabolites were phenolic sulpho conjugates of HMP (< 5 %). The glucuronic acid conjugate of HMP was found in very small amounts. In total, > 80 % of the metabolites excreted were oxidized at the exocyclic carbon. This side-chain oxidation, probably catalyzed by alcohol and aldehyde dehydrogenases, appears to represent a detoxification pathway. Indeed, administration of ethanol shortly before the administration of HMP to rats increased the levels of SMP detected in blood, of DNA adducts formed in tissues and of mercapturic acid excreted. These effects were observed even at very low dose levels of ethanol (0.2 g per kg body weight). Similar effects were shown after administration of Disulfiram, an inhibitor of aldehyde dehydrogenase.

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Der Morbus Parkinson bzw. das idiopathische Parkinson-Syndrom ist pathophysiologisch durch eine progressive Degeneration der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra und im Locus coeruleus charakterisiert. Obwohl die genaue Ursache der Erkrankung bis heute unbekannt ist, wird eine multifaktorielle Genese bei polygenetischer Prädisposition angenommen. Des Weiteren liefert die sogenannte Braak-Hypothese eine mögliche Kausalkette. Diese Hypothese besagt, dass unbekannte Erreger die Fehlfaltung von physiologischem α-Synuclein im peripheren Nervensystem, insbesondere auch im enterischen Nervensystem, initiieren können, welche sich dann retrograd durch axonalen Transport über den Nervus vagus zu dem dorsalen motorischen Kern des Nervus vagus ausbreitet. Von dort werden zusätzliche Hirnregionen, einschließlich der Substantia nigra, beeinträchtigt. Es wird vermutet, dass diese neuronale α-Synuclein-Aggregation im Gehirn ein zentraler Bestandteil der Pathogenese des Morbus Parkinson darstellt. Als histopathologisches Korrelat des Morbus Parkinson können in der Substantia nigra sogenannte Lewy-Körperchen im Zytoplasma der Nervenzellen nachgewiesen werden, die aus intrazellulären Proteinablagerungen und hauptsächlich aus unlöslichem und aggregiertem α-Synuclein bestehen. α-Synuclein-Aggregate im Magen-Darm-Trakt wurden als potenzieller Biomarker für die Früherkennung eines Morbus Parkinson vorgeschlagen. Postuliert wurde hier, dass die α-Synuclein-Pathologie im Darm zeitlich bereits vor der Pathologie in der Substantia nigra nachweisbar ist. Studien, die diese Hypothese weiter untersuchten, führten jedoch zu divergierenden Ergebnissen. Die Zielsetzung der vorgelegten Studie war es, Ablagerungen des α-Synucleins und des phosphorylierten α-Synucleins im menschlichen Gastrointestinaltrakt mithilfe von Immunhistochemie zu untersuchen, um eine Aussage darüber treffen zu können, ob α-Synuclein als potenzieller prädiktiver Biomarker für die Erkrankung geeignet sein könnte. Verwendet wurden hierzu einerseits Antikörper gegen natives α-Synuclein und andererseits Antikörper gegen das an Serin 129 phosphorylierte α-Synuclein, welche die pathologische, aggregierte Form des Proteins besser darstellt. Es sollte festgestellt werden, ob sich die Prävalenz der (phosphorylierten) α-Synuclein-Ablagerungen im Darm von Parkinson-Patienten und Kontrollpatienten unterscheiden. Eine mangelnde Spezifität des Antikörpers gegen das phosphorylierte α-Synuclein wurde dabei durch die Implementierung eines Kontrollexperiments mit einer proteolytischen Vorbehandlung an Gewebeproben histopathologisch bestätigter Parkinson-Patienten ausgeschlossen. In dieser retrospektiven Studie wurde die α-Synuclein-Expression in post-mortem entnommenen Hirn-, Dünn- und Dickdarmproben von 25 neuropathologisch bestätigten Parkinson-Patienten und 20 alters- und geschlechtsspezifisch abgestimmten Kontrollpatienten untersucht. Die Immunoreaktivität wurde durch einen neuen Ansatz quantifiziert, der die detaillierte Bewertung von a-Synuclein-positiven morphologischen Strukturen des enterischen Nervensystems beinhaltet. Alle immungefärbten Schnitte wurden von zwei Untersuchern unabhängig evaluiert. Beide waren bezüglich der Gruppenzuordnung (Gewebeproben von Parkinson-Patienten oder von Kontrollpatienten) verblindet. Zu diesem Zweck wurden von jedem Präparat jeweils 10 zufällig ausgewählte, nicht selektive mikroskopische Bilder/HPF (High-power Fields) in einer 100-fachen Vergrößerung aufgenommen. Insgesamt wurden 1620 HPFs von jedem Untersucher hinsichtlich einer positiven Immunoreaktivität in den drei morphologischen Strukturen „Nervenfasern/Einzelfasern“, „Plexus“ und „Ganglienzellen“ beurteilt. Die Auswertung der Ergebnisse ergab, dass die Immunoreaktivität von α-Synuclein und phosphoryliertem α-Synuclein bei Parkinson-Patienten im Vergleich zu den Kontrollen in fast jeder der untersuchten morphologischen Strukturen signifikant reduziert war. Bis auf die Einzelfasern im Dickdarm bei der immunhistochemischen Färbung mit Antikörper gegen nativem α-Synuclein, sah man durchgehend signifikant weniger Immunoreaktivität in den verschiedenen morphologischen Strukturen im Darmgewebe der Parkinson-Patienten verglichen zu denen der Kontrollpatienten. Der immunhistochemische Nachweis von α-Synuclein und phosphoryliertem α-Synuclein scheint demzufolge ein häufiger und potenziell normaler Befund zu sein. Weder α-Synuclein noch phosphoryliertes α-Synuclein kann daher als molekularer Biomarker der Parkinson-Pathologie betrachtet werden. Die reduzierte intestinale Immunoreaktivität bei Parkinson-Patienten spiegelt eher die Parkinson-bedingte neuronale Degeneration wider. Das Resultat dieser Studie legt nahe, dass der Nachweis von α-Synuclein- und phosphoryliertem α-Synuclein in intestinalen Nervenfasern, dem intestinalen Plexus und intestinalen Ganglienzellen einem Normalbefund entspricht und nicht einer Morbus Parkinson-assoziierten Pathologie. Als bis heute größte Post-mortem-Studie, welche α-Synuclein und phosphoryliertes α-Synuclein in Gewebeproben des Gastrointestinaltraktes von histopathologisch bestätigten Parkinson-Patienten untersuchte, liefert die vorliegende Studie einen wichtigen Beitrag zur Erforschung von α-Synuclein im Gastrointestinaltrakt bei Parkinson-Patienten. Der Nachweis von α-Synuclein in gastrointestinalem Gewebe erscheint für die Diagnostik, insbesondere für die klinische Prädiktion einer Parkinson-Krankheit, ungeeignet.:1. Einführung 1.1. Morbus Parkinson 1.2. Ätiologie und Epidemiologie des idiopathischen Parkinson-Syndroms 1.3. Neuropathologie des idiopathischen Parkinson-Syndroms 1.4. α-Synuclein und phosphoryliertes α-Synuclein 2. Die Bedeutung von (phosphoryliertem) α-Synuclein als molekularer Biomarker bei Morbus Parkinson: aktuelle Studienlage 3. Ableitung der Rationale für die publizierte Studie 3.1. Grundlagen 3.2. Studienziele 3.2.1. Nachweis von α-Synuclein und phosphoryliertem α-Synuclein im Dünndarm und Dickdarm von Parkinson-Patienten und Kontrollpatienten 3.2.2. Vergleich von α-Synuclein und phosphoryliertem α-Synuclein im Dünndarm und Dickdarm von Parkinson-Patienten und Kontrollpatienten 4. Methodik 4.1. Patientenkollektiv 4.2. Gewebeverarbeitung 4.3. Immunhistochemie 4.3.1. α-Synuclein 4.3.2. phosphoryliertes α-Synuclein 4.4. Beurteilung der immunhistochemischen Färbung und Quantifizierung der morphologischen Strukturen 5. Publikationsmanuskript 6. Zusammenfassung der Arbeit 7. Literaturverzeichnis Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit Lebenslauf Danksagung

Background: Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) are complex and highly aggressive tumours that develop in the mouth, throat, salivary glands and nose. HNSCCs account for more than half a million cases annually and are the sixth most common cancer worldwide. Alcohol, tobacco and human papilloma virus (HPV) infection are the well-known causes for HNSCC. The current options for treatment are surgery, radiotherapy, chemotherapy or a combination of therapies. Locally advanced HNSCC patients show heterogenous response to standard treatments and the survival after 5 years is about 50%. Therefore, there is a need to identify biomarkers to predict outcome and improve personalised therapies. The recent advancement in next generation sequencing technologies has allowed for understanding the molecular characteristics of the tumour and identify patients at high risk that are unresponsive to the standard treatment. HPV-associated oropharyngeal carcinoma have shown a very high rate of loco-regional control (LRC) and overall survival (OS) after postoperative radio- chemotherapy (PORT-C) and are being assessed for treatment de-escalation strategies to reduce toxicity in clinical trials. The treatment response of HPV-negative HNSCC, however, is still heterogeneous and novel biomarkers are required to identify subgroups of patients for treatment adaptation. Objectives: The overall aim of the thesis is to develop biomarkers to identify patients at high risk for future treatment adaptations and improve personalised radiotherapy based on the biological differences in HNSCC patients. For this purpose, novel gene signatures were developed and validated using machine learning approaches and biological information in order to predict LRC in patients with locally advanced HNSCC. The novel gene signatures will help to identify patients at high risk that do not respond to standard treatments and to further understand the molecular mechanisms involved in heterogenous treatment response. Materials and methods: The data from a total of 504 locally advanced HNSCC patients of the German Cancer Consortium - Radiation Oncology Group (DKTK-ROG) treated with postoperative radiotherapy (PORT) or postoperative radiochemotherapy (PORT-C) were evaluated. Data from 60 mice bearing xenografts of ten established human HNSCC cell lines were also evaluated. Gene expression analyses was performed using the GeneChip Human Transcriptome Array 2.0 and nanoString analyses. Differential gene expression analysis, Cox regression analysis and machine learning algorithms were used to develop gene signatures. Models were built on the training cohort and then applied on an independent validation cohort. Results: The patients with HPV-negative HNSCC that were treated with PORT-C were classified into the four molecular subtypes basal, mesenchymal, atypical and classical that were previously reported for HNSCC patients treated with primary radio(chemo)therapy or surgery and were related to LRC. The mesenchymal subtype had the worst prognosis as compared to the other subtypes. These tumours were associated with overexpression of epithelial-mesenchymal transition genes and DNA repair genes. A novel 6-gene signature was developed and validated based on full-transcriptome data using machine-learning approaches that was prognostic for LRC in patients with HPV-negative HNSCC treated with PORT-C. The 6-gene signature consisted of four individual genes CAV1, GPX8, IGLV3-25, TGFBI and one metagene combining the highly correlated genes, INHBA and SERPINE1. The identified gene signature was combined with the clinical parameters, T stage and tumour localisation as well as the stem-cell marker CD44 and the 15-gene hypoxia- associated classifier and this improved the performance of the model. Previously identified prognostic gene signatures and molecular-subtype classification were back-translated from HNSCC patients to pre-clinical tumour models. The tumour models were classified into the four subtypes basal, mesenchymal, atypical and classical, similar to the patients. The mesenchymal tumours were significantly associated with a higher TCD50 as compared to other subtypes. A novel 2-gene signature consisting of FN1 and SERPINE1 was developed based on tumour models and patient data using differential gene expression analysis. The 2-gene signature was prognostic for the TCD50 in tumour models and was successfully validated on an independent PORT-C patient cohort for LRC. A matched-pair analysis was performed between patients that were treated with postoperative radiochemotherapy and patients that were treated with postoperative radiotherapy. A 2- metagene signature, consisting of KRT6A, KRT6B, KRT6C forming one metagene and SPRR1A, SPRR1B, SPRR2A, SPRR2C forming the second metagene, was identified. The novel predictive signature stratified patients into high and low risk groups. The high-risk group patients that received PORT-C showed higher LRC as compared to the high-risk patients that received PORT. Thus, the predictive gene signature identified patients that were considered to be at intermediate risk according to clinical factors but were at biologically high risk for the development of loco-regional recurrences after PORT. These patients might benefit from PORT-C treatment. Conclusions: In this thesis, novel gene signatures were identified by combining machine learning and biological information to stratify locally advanced HNSCC patients into high and low risk groups for loco-regional control. This information could be used in the future, e.g. to adjust radiotherapy doses based on the risk group. The developed gene signatures could be combined with other gene signatures or the molecular subtype stratification to develop potential combined treatment approaches. Within the DKTK-ROG framework, the gene signatures will be incorporated with biomarkers developed on the same cohort at the other DKTK-ROG partner sites using the data from different omics platforms in the future. This would help to better understand the molecular basis of heterogenous treatment response in HNSCC patients and uncover novel targets for therapies. The thesis also provides a valuable insight into the applicability of preclinical tumour models to study the efficacy of personalised radiotherapy treatments. Overall, the gene signatures identified in this thesis were from retrospective studies and have to be validated in prospective studies before their application in interventional clinical trials to improve personalised radiotherapy treatments. Additionally, the methods used in the thesis to identify the gene signatures could be used and applied across different cancer datasets for identification of biomarkers. Therefore, this thesis has provided a basis for future studies on personalized treatment of HNSCC based on their genetic profile.:Content Abbreviations VII Tables XII 1 Introduction 1 2 Biological and statistical background 6 2.1 Head and neck squamous cell carcinoma 6 2.1.1 Tumourigenesis 6 2.1.2 Biomarkers: clinical and genomics 9 2.2 Statistics 12 General statistical analyses 17 2.3 Gene expression analyses 18 3 Molecular subtypes and mechanisms of radioresistance 20 3.1 Introduction and motivation 20 3.2 Patient cohort and experimental design 21 3.2.1 Patient cohort 21 3.2.2 Clinical endpoints and statistical analysis 23 3.2.3 Experimental design 23 3.3 Results 26 3.3.1 Prognostic factors for LRC and OS 26 3.3.2 Death as competing risk 26 3.3.3 Multivariable Cox regression for improved prognosis 29 3.3.4 Molecular subtypes in HPV-negative HNSCC patients 31 3.3.5 Molecular subtypes are prognostic for LRC after PORT-C 33 3.4 Discussion 36 4 A novel 6-gene signature for LRC prognosis 39 4.1 Introduction and motivation 39 4.2 Patient cohort and experimental design 40 4.2.1 Patient cohorts 40 4.2.2 Clinical endpoints and statistical analysis 41 4.2.3 Experimental design 41 4.3 Results 44 4.3.1 Characteristics of the patient cohorts 44 4.3.2 Development of the 6-gene signature prognostic for LRC 45 4.3.3 Combination of the 6-gene signature and clinical parameters 47 4.3.4 Extension with CD44 and the 15-gene hypoxia signature 48 4.3.5 Prognostic for secondary endpoints 49 4.3.6 Technical validation using nanoString technology 52 4.3.7 Death as competing risk 56 4.4 Discussion 58 5 Biomarker development in preclinical tumour models and HNSCC patients 62 5.1 Introduction and motivation 62 5.2 Patient cohort and experimental design 64 5.2.1 Patient derived xenograft tumour models 64 5.2.2 Patient cohorts 64 5.2.3 Clinical endpoints and statistical analysis 65 5.2.4 Experimental design 65 5.3 Results 68 5.3.1 Molecular subtypes 68 5.3.2 Development of the 2-gene signature 70 5.3.3 Technical validation using the nanoString technology 71 5.3.4 Back-translation of gene signatures in xenograft models 75 5.4 Discussion 79 6 PORT-C improves LRC in intermediate-risk patients 82 6.1 Introduction and motivation 82 6.2 Patient cohort and experimental design 83 6.2.1 Patient cohorts 84 6.2.2 Clinical endpoints and statistical analysis 84 6.2.3 Experimental design 84 6.3 Results 87 6.3.1 Characteristics of the patient cohorts 87 6.3.2 Propensity score matching analysis 88 6.3.3 Development of the predictive 2-metagene signature 90 6.4 Discussion 93 7 Conclusion and future perspectives 96 8 Summary 99 9 Zusammenfassung 102 Appendix 105 A. Supplementary Figures 105 B. Supplementary Tables 110 Bibliography 116 Erklärungen 149

Während der Klimawandel und die globale Erwärmung das östliche Afrika schon heutzutage beeinflussen, ist das Wissen über die klimatischen Veränderungen der Vergangenheit begrenzt. Vor allem in den letzten 15.000 Jahren hat das östliche Afrika räumlich komplexe klimatische Veränderungen erlebt. Obwohl in Ostafrika mehrere paläoklimatische Studien durchgeführt wurden, welche die Temperaturänderungen und die hydrologische Vergangenheit von Seearchiven rekonstruierten, sind die treibenden Mechanismen und Telekonnektionen noch nicht vollständig verstanden. Ein tieferes Verständnis wird verhindert durch (i) das Fehlen von zeitlich weit zurückreichenden, qualitativ hochwertigen wissenschaftlichen Daten bezüglich Umweltveränderungen, insbesondere in der Region des Horns von Afrika, (ii) das Fehlen solcher Daten aus großen Höhen und (iii) unzureichend untersuchte Regionen wie der östliche Teil Äthiopiens und Somalia. Eines der am wenigsten untersuchten Hochgebirgsgebiete der Region sind die Bale Mountains, obwohl sie das größte Gebiet des Kontinents oberhalb von 4000 m ü. NN umfassen. Diese Dissertation zielt darauf ab, den derzeitigen Mangel an paläoklimatischen Rekonstruktionen in Hochgebirgen in der untersuchten Region am Horn von Afrika weiter zu verringern. Hochgelegene perennierende Seen, insbesondere Karseen, sind wertvolle Archive für paläoklimatische und ökologische Rekonstruktionen, da sie kontinuierliche Sedimente liefern, die durch menschliche Aktivitäten nicht gestört wurden. Der einzige ganzjährige See in den Bale Mountains, der Garba Guracha, liegt in der afro-alpinen Zone auf 3950 m ü. NN. Frühere paläolimnologische Untersuchungen ergaben, dass die kontinuierlichen Sedimente des Garba Guracha paläoklimatische und ökologische Informationen seit der letzten Vergletscherung beinhalten. Um das paläoklimatische Wissen über die Bale Mountains und damit über das östliche Afrika zu erweitern, wurden neue innovative Proxies, z. B. brGDGTs, δ18Ofucose, δ18Odiatom und δ2Hn-alkane, auf neu geborgene Sedimentkerne des Garba Guracha angewendet. Die Interpretation der Ergebnisse dieser Analysen ermöglichen ein tieferes Verständnis des Sedimentkerns, vor allem in Bezug auf die Sedimentologie, die Chronologie und die Quellen abgelagerten organischen Materials. Die hochauflösende Chronologie des Garba Guracha, die unter Verwendung verschiedener Datierungsmethoden und -komponenten (210Pb-Datierung, Radiokohlenstoffdatierung an der Gesamtsedimentfraktion, an Holzkohle und komponentenklassenspezifisch an n-Alkanen) erstellt wurde, ergibt ein basales Alter von ∼ 16 cal ka BP. Die geochemische Korrelation der Tephra-Schichten in den Garba-Guracha-Sedimenten mit datierten Tephra-Schichten aus anderen Seen der Region liefert eine externe Alterskontrolle, die die Robustheit der neuen Garba-Guracha-Chronologie und die Abwesenheit von systematischen Altersverschiebungen weiter untermauert. Ähnliche Altersangaben für n-Alkane und der Gesamtsedimentfraktion deuten darauf hin, dass die Biomarker in dem sehr kleinen afro-alpinen Einzugsgebiet kein Pre-aging vorweisen, was auf eine kurze Verweildauer oder/und eine hohe aquatische Produktivität schließen lässt. Die vorherrschende autochthone Produktion von organischem Material in dem im Vergleich zur Größe des Einzugsgebiets relativ großen See wurde durch relativ niedrige TOC/N Verhältnisse, relativ positive δ13C Werte und niedrige Werte der Zucker-Biomarker-Verhältnisse nachgewiesen. Der aquatische Ursprung von Fucose wird außerdem durch einen methodischen Vergleich von δ18Ofucose mit dem rein aquatischen δ18Odiatom Rekord unterstützt. Die gute Korrelation und ähnliche Amplitude von δ18Odiatom und δ18Ofucose (7,9 ‰ bzw. 7,1 ‰) unterstreichen nicht nur das Potenzial von δ18O-Zucker-Analysen in paläoklimatischen Studien, sondern lassen auch den Schluss zu, dass δ18Ofucose im Garba Guracha δ18OSeewasser widerspiegelt. Ohne den Einfluss des 'Amount effects' und des 'Source effects' völlig auszuschließen, interpretieren wir den δ18O-Datensatz des Garba Guracha daher als das Verhältnis von Niederschlag zu Verdunstung. Die hydrologische Vergangenheit des Garba Guracha wird von regionalen und nordhemisphärischen klimatischen Veränderungen beeinflusst. Zu Beginn des Holozäns nahmen die Niederschläge zu, was zu einem überlaufenden See zwischen ∼ 10 und ∼ 7 cal ka BP führte (erkennbar an den negativsten δ18O-Werten im gesamten Kern). Diese Phase entspricht der African Humid Period, einer räumlich unterschiedlich ausgeprägten feuchten Phase im äquatorialen und nördlichen Afrika, die durch eine verstärkte Aktivität des Westafrikanischen Monsuns und, im Fall der östlich gelegenen Bale Mountains, des Ostafrikanischen Monsuns bedingt wurde. Während die hydrologischen Veränderungen der AHP in Ostafrika durch meridionale Klimaprozesse angetrieben zu werden scheinen, zeigt das hochgelegene Garba Guracha Archiv zusätzliche Ähnlichkeiten mit rekonstruierten Monsunveränderungen in Oman. Eine kontinuierliche Verschiebung hin zu positiveren δ18O-Werten beginnt um 7 cal ka BP und deutet auf einen allmählichen Übergang von feuchtem zu trockenem Klima hin. Die Temperaturen am Garba Guracha wurden mit Hilfe einer modifizierten MBT'5ME Kalibrierung durch Hinzunahme von 6-Methyl-brGDGT IIIa' rekonstruiert (MBT'5ME Bale-Mountain-Index - r2 = 0,93, p < 0,05). Eine Anpassung der Kalibration war nötig, da die 6-Methyl-brGDGTs in den modernen Seesedimenten der Bale Mountains in bislang unbekannten Mengen auftreten und die Temperatur-Kalibrierung beeinflussen. Die rekonstruierten Temperaturänderungen sind stark von überregionalen klimatischen Einflüssen, wie Insolationsveränderungen und der AHP beeinflusst. Zusätzliche lokale Einflüsse, wie noch nicht abgeschmolzene Eismassen im Einzugsgebiet oder die Veränderungen der Hydrologie sind nicht auszuschließen. Im hochgelegenen Garba Guracha herrschten kalte Temperaturen, bis es kurz nach Beginn des Holozäns zu einer deutlichen Erwärmung (3,0 °C in weniger als 600 Jahren) kam. Zwischen 9 und 6 cal ka BP herrschte ein thermisches Maximum, das mit feuchten Bedingungen zusammenfiel und gefolgt war von einem Temperaturrückgang der bis 1.4 cal ka BP andauerte. Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen regionale und globale Antriebsmechanismen für klimatische Veränderungen in den Bale Mountains auf und erweitern damit das paläoklimatische Wissen über das Horn von Afrika. Der innovative methodische Ansatz dieser Arbeit hebt das Potenzial von δ18O-Zuckeranalysen und n-Alkan-Datierungen hervor. Darüber hinaus unterstreichen die Ergebnisse die Notwendigkeit einer verstärkten Grundlagenforschung, wie z. B. lokaler brGDGT-Kalibrierungsstudien, um die bestehenden wissenschaftlichen Konzepte voranzutreiben und zu präzisieren.:1.1 Table of Content List of Abbreviations v List of Tables vi List of Figures vii List of papers ix Abstract x Zusammenfassung xii Acknowledgements xiv 1 Introduction 1 1.1 Motivation 2 1.2 Objectives of the thesis 5 1.3 Background – The Bale Mountains and biomarker 6 1.3.1 Study area and archive 6 1.3.2 A short introduction to selected biomarkers applied in environmental geochemistry 8 1.4 Methods used in the thesis 10 1.4.1 Monosaccharide sugar biomarkers 11 1.4.2 Total lipid extraction for n-alkane and brGDGTs analyses 11 1.4.3 Branched Glycerol Dialkyl Glycerol Tetraether analyses 12 1.4.4 Biogeochemical analyses 13 1.4.5 Radiocarbon dating 13 1.4.6 Age depth model 13 1.5 Structure of the thesis 15 1.6 References 16 2 Revisiting afro-alpine Lake Garba Guracha in the Bale Mountains of Ethiopia: rationale, chronology, geochemistry, and paleoenvironmental implications 27 Abstract 28 2.1 Introduction 29 2.1.1 Study site 29 2.2 Material and Methods 31 2.2.1 Chronology and dating 31 2.2.2 XRF scanning 34 2.2.3 Biogeochemical analyses 34 2.2.4 n-Alkane and sugar quantification 35 2.3 Results 35 2.3.1 The sedimentary sequence – Master core and lithofacies 35 2.3.2 Chronology 37 2.3.3 Geochemistry 39 2.4 Discussion 41 2.4.1 Chronology 41 2.4.2 Origin of organic matter 43 2.4.3 Environmental implications 45 2.4.4 Comparison with lake level and other records 49 2.5 Conclusions 50 2.6 Acknowledgements 50 2.7 References 51 3 The Holocene lake-evaporation history of the afro-alpine Lake Garba Guracha in the Bale Mountains, Ethiopia, based on δ18O records of sugar biomarker and diatoms 61 Abstract 62 3.1 Introduction 62 3.1.1 Regional setting 64 3.2 Material and methods 66 3.2.1 Material and sampling 66 3.2.2 Compound-specific δ18O analyses of sugar biomarkers 66 3.2.3 δ18O analyses of diatoms 67 3.3 Results 68 3.3.1 δ18Ofuc record of Garba Guracha 68 3.3.2 δ18Odiatom record of Garba Guracha 69 3.4 Discussion 69 3.4.1 The Garba Guracha δ18Osugar record - lake or leaf water? 69 3.4.2 The Garba Guracha δ18Odiatom record 70 3.4.3 Comparison of reconstructed δ18Olake water from δ18Ofuc versus δ18Odiatom 71 3.4.4 Paleoclimatic significance and proxy interpretation 72 3.4.5 Comparison with other records 75 3.5 Conclusions 77 3.6 Acknowledgements 78 3.7 References 78 4 A Holocene temperature (brGDGT) record from Garba Guracha, a high-altitude lake in Ethiopia 89 Abstract 90 4.1 Introduction 90 4.1.1 Regional setting 93 4.2 Material and Methods 94 4.2.1 Material and Sampling 94 4.2.2 Sample preparation and analysis 95 4.2.3 BrGDGTs – structure, statistical methods and proxy calculation 96 4.2.4 Quantitative data analyses 97 4.3 Result 97 4.3.1 BrGDGT patterns of surface sediments from lakes in the Bale Mountains 97 4.3.2 BrGDGT patterns of the Garba Guracha sediment core 100 4.4 Discussion 103 4.4.1 Possible MAT calibration functions inferred from the expanded eastern African surface sediment dataset 103 4.4.2 Paleotemperature reconstructions for the Garba Guracha sedimentary record - comparison of the different calibrations 104 4.4.3 Paleotemperature reconstructions for the Garba Guracha sedimentary record – regional comparison 106 4.5 Conclusions 111 4.6 Acknowledgements 111 4.7 References 112 5 Synthesis 121 5.1 Sedimentation and chronology - What is the time frame and age depth function of the Garba Guracha core? 122 5.2 Source identification What is the origin of the organic material in the Garba Guracha sediment core? 125 5.3 Hydrology δ18O as a proxy for Garba Guracha evaporation history 126 5.4 Hydrology δ2H – as a proxy for the Garba Guracha precipitation history 128 5.5 Temperature - brGDGTs - as a proxy for Garba Guracha MAT history 129 5.6 Garba Guracha environmental and climate reconstruction – Why and how has the climate changed? 131 5.6.1 Deglaciation 132 5.6.2 North hemisphere forcings in the Garba Guracha catchment during the Younger Dryas period 132 5.6.3 Changing climatic conditions beginning of the Holocene 133 5.6.4 The warm African Humid Period 133 5.6.5 The termination of the African Humid Period 134 5.6.6 The Late Holocene 135 5.7 Garba Guracha – Climatic implications and driving mechanisms 136 5.7.1 Comparison of high and low altitudes in eastern Africa 136 5.7.2 Atmospheric circulation 138 5.8 References 144 6 Conclusions and Outlook 157 A Supplements to Chapter 2 162 B Supplements to Chapter 3 168 C Supplements to Chapter 4 173 D Supplements to Chapter 5 182 / While climate change and global warming are affecting eastern Africa today, the understanding of past climatic changes is limited. Especially during the last 15.000 years, eastern Africa has experienced spatially complex climatic changes. Although several paleoclimatic studies have been conducted in eastern Africa, reconstructing temperature changes and the hydrological history of lake archives, the driving mechanisms and teleconnections are yet not fully understood. A deeper understanding is precluded by (i) the lack of long, high-quality records of environmental change, especially in the Horn of Africa region, (ii) the lack of high altitude records, and (iii) insufficiently studied regions like eastern Ethiopia and Somalia. One of the region's most understudied high-altitude areas are the Bale Mountains, even though they encompass the continent's largest area above 4000 m a. s. l. This dissertation aims to further reduce the current lack of paleoclimatic reconstructions in high altitudes in the understudied Horn of Africa region. High-altitude perennial lakes, especially cirque lakes, are valuable archives for paleoclimate and environmental reconstructions, yielding continuous sedimentation undisturbed by human activity. The only perennial lake in the Bale Mountains, the Garba Guracha, lies in the afro-alpine zone at 3950 m a. s. l. Previous paleolimnological research revealed that Garba Guracha comprises a continuous paleoclimatic and environmental sedimentary record since the last deglaciation. In order to enhance the paleoclimatic knowledge of the Bale Mountains and hence of eastern Africa, new innovative proxies, e.g. brGDGTs, δ18Ofucose, δ18Odiatom, and δ2Hn alkane were applied to newly retrieved sediment cores of Garba Guracha. The application of these analyses and the interpretation of the results imply a deeper understanding of the retrieved sediment cores, concerning mainly sedimentology, chronology and organic matter source identification. The high resolution chronology of Garba Guracha, established using different dating methods and compounds (210Pb dating, radiocarbon dating of bulk sedimentary OM, compound class specific n alkanes, and charcoal), yields a basal age of ∼ 16 cal ka BP. The geochemical correlation of tephra layers in the Garba Guracha sediments to dated tephra layers of the region provides an external age control, further supporting the robustness of the new Garba Guracha chronology and the non existence of systematic age offsets. Similar ages obtained for n alkanes and bulk sediments suggest no pre aging of the biomarker in the very small afro-alpine catchment indicating short residence times or/and high aquatic productivity. Predominant autochthonous production of organic matter in the relative large lake compared to the catchment size has been proven by relatively low TOC/N ratios and relatively positive δ13C values. The aquatic origin of the sugar biomarker fucose is further supported by a methodological comparison of δ18Ofucose to a pure aquatic δ18Odiatom record. The good correlation and similar ranges of δ18Odiatom and δ18Ofucose (7.9 ‰ and 7.1 ‰, respectively) not only highlight the potential of δ18Osugar analyses in paleoclimatic studies but also lead to the conclusion that the Garba Guracha δ18Ofucose record reflects δ18Olake water. Therefore, without completely excluding the influence of the ‘amount effect’ and the ‘source-effect’, we interpret the record to reflect primarily the precipitation to evaporation ratio (P/E). The hydrological history of Garba Guracha is influenced by regional and northern hemisphere climatic changes. Precipitation increased at the onset of the Holocene, resulting in an overflowing lake between ∼ 10 and ∼ 7 cal ka BP (noted by the most negative δ18O values in the record). This humid phase corresponds to the African Humid Period (AHP), a spatially complex humid phase across equatorial and northern Africa, driven by enhanced West African Monsoon (WAM) and, in the case of the easterly-situated Bale Mountains, East African Monsoon (EAM) activity. While hydrological changes during the AHP in eastern Africa seem to be driven by meridional climatic processes, the high-altitude Garba Guracha archive shows additional similarities to reconstructed monsoonal changes in Oman. A continuous transition towards more positive δ18O values begins at 7 cal ka BP and indicates a gradual shift from humid to drier climate. The reconstructed temperature history is strongly linked to supraregional climatic changes associated with insolation forcing and the AHP, as well as with local anomalies associated with catchment deglaciation and hydrology. Cold temperatures prevailed in the high-altitude Garba Guracha until significant warming (3.0 °C in less than 600 years) occurred shortly after the Holocene onset. A thermal maximum prevailed between 9 and 6 cal ka BP, coinciding with humid conditions, followed by a temperature decrease until 1.4 cal ka BP. The temperatures at the Garba Guracha were reconstructed using a modified MBT'5ME calibration by adding 6 methyl brGDGT IIIa' (resulting in the MBT'5ME Bale Mountain index, r2 = 0.93, p < 0.05) due to an uncommon variation in 6 methyl brGDGTs in the modern lake surface sediment samples. The results of this dissertation reveal regional and global driving mechanisms of climatic changes in the Bale Mountains, further expanding paleoclimatic knowledge about the Horn of Africa. The innovative methodological approach of this thesis highlights the potential of δ18Osugar analyses and n alkane dating. Moreover, the results underline the need for intensified basic research like local brGDGT calibration studies to advance and specify existing scientific concepts.:1.1 Table of Content List of Abbreviations v List of Tables vi List of Figures vii List of papers ix Abstract x Zusammenfassung xii Acknowledgements xiv 1 Introduction 1 1.1 Motivation 2 1.2 Objectives of the thesis 5 1.3 Background – The Bale Mountains and biomarker 6 1.3.1 Study area and archive 6 1.3.2 A short introduction to selected biomarkers applied in environmental geochemistry 8 1.4 Methods used in the thesis 10 1.4.1 Monosaccharide sugar biomarkers 11 1.4.2 Total lipid extraction for n-alkane and brGDGTs analyses 11 1.4.3 Branched Glycerol Dialkyl Glycerol Tetraether analyses 12 1.4.4 Biogeochemical analyses 13 1.4.5 Radiocarbon dating 13 1.4.6 Age depth model 13 1.5 Structure of the thesis 15 1.6 References 16 2 Revisiting afro-alpine Lake Garba Guracha in the Bale Mountains of Ethiopia: rationale, chronology, geochemistry, and paleoenvironmental implications 27 Abstract 28 2.1 Introduction 29 2.1.1 Study site 29 2.2 Material and Methods 31 2.2.1 Chronology and dating 31 2.2.2 XRF scanning 34 2.2.3 Biogeochemical analyses 34 2.2.4 n-Alkane and sugar quantification 35 2.3 Results 35 2.3.1 The sedimentary sequence – Master core and lithofacies 35 2.3.2 Chronology 37 2.3.3 Geochemistry 39 2.4 Discussion 41 2.4.1 Chronology 41 2.4.2 Origin of organic matter 43 2.4.3 Environmental implications 45 2.4.4 Comparison with lake level and other records 49 2.5 Conclusions 50 2.6 Acknowledgements 50 2.7 References 51 3 The Holocene lake-evaporation history of the afro-alpine Lake Garba Guracha in the Bale Mountains, Ethiopia, based on δ18O records of sugar biomarker and diatoms 61 Abstract 62 3.1 Introduction 62 3.1.1 Regional setting 64 3.2 Material and methods 66 3.2.1 Material and sampling 66 3.2.2 Compound-specific δ18O analyses of sugar biomarkers 66 3.2.3 δ18O analyses of diatoms 67 3.3 Results 68 3.3.1 δ18Ofuc record of Garba Guracha 68 3.3.2 δ18Odiatom record of Garba Guracha 69 3.4 Discussion 69 3.4.1 The Garba Guracha δ18Osugar record - lake or leaf water? 69 3.4.2 The Garba Guracha δ18Odiatom record 70 3.4.3 Comparison of reconstructed δ18Olake water from δ18Ofuc versus δ18Odiatom 71 3.4.4 Paleoclimatic significance and proxy interpretation 72 3.4.5 Comparison with other records 75 3.5 Conclusions 77 3.6 Acknowledgements 78 3.7 References 78 4 A Holocene temperature (brGDGT) record from Garba Guracha, a high-altitude lake in Ethiopia 89 Abstract 90 4.1 Introduction 90 4.1.1 Regional setting 93 4.2 Material and Methods 94 4.2.1 Material and Sampling 94 4.2.2 Sample preparation and analysis 95 4.2.3 BrGDGTs – structure, statistical methods and proxy calculation 96 4.2.4 Quantitative data analyses 97 4.3 Result 97 4.3.1 BrGDGT patterns of surface sediments from lakes in the Bale Mountains 97 4.3.2 BrGDGT patterns of the Garba Guracha sediment core 100 4.4 Discussion 103 4.4.1 Possible MAT calibration functions inferred from the expanded eastern African surface sediment dataset 103 4.4.2 Paleotemperature reconstructions for the Garba Guracha sedimentary record - comparison of the different calibrations 104 4.4.3 Paleotemperature reconstructions for the Garba Guracha sedimentary record – regional comparison 106 4.5 Conclusions 111 4.6 Acknowledgements 111 4.7 References 112 5 Synthesis 121 5.1 Sedimentation and chronology - What is the time frame and age depth function of the Garba Guracha core? 122 5.2 Source identification What is the origin of the organic material in the Garba Guracha sediment core? 125 5.3 Hydrology δ18O as a proxy for Garba Guracha evaporation history 126 5.4 Hydrology δ2H – as a proxy for the Garba Guracha precipitation history 128 5.5 Temperature - brGDGTs - as a proxy for Garba Guracha MAT history 129 5.6 Garba Guracha environmental and climate reconstruction – Why and how has the climate changed? 131 5.6.1 Deglaciation 132 5.6.2 North hemisphere forcings in the Garba Guracha catchment during the Younger Dryas period 132 5.6.3 Changing climatic conditions beginning of the Holocene 133 5.6.4 The warm African Humid Period 133 5.6.5 The termination of the African Humid Period 134 5.6.6 The Late Holocene 135 5.7 Garba Guracha – Climatic implications and driving mechanisms 136 5.7.1 Comparison of high and low altitudes in eastern Africa 136 5.7.2 Atmospheric circulation 138 5.8 References 144 6 Conclusions and Outlook 157 A Supplements to Chapter 2 162 B Supplements to Chapter 3 168 C Supplements to Chapter 4 173 D Supplements to Chapter 5 182

Die Niere ist ein lebenswichtiges Organ, das für die Homöostase des Körpers unentbehrlich ist. Bei einem Funktionsverlust, entweder kongenital oder durch ein akutes oder chronisches Nierenversagen, muss die Funktion ersetzt werden. Für die Nierenersatztherapie gibt es als Ersatzverfahren die Dialyse und die Nierentransplantation. Da eine Dialyse nicht alle Funktionen der Niere ersetzen kann sowie eine hohe Belastung für den Patienten darstellt, ist die Nierentransplantation der Goldstandard im Organersatz. Das vorhandene Angebot an Spenderorganen kann den aktuellen Bedarf allerdings nicht decken, sodass die aktuelle durchschnittliche Wartezeit auf ein postmortal gespendetes Organ in Deutschland derzeit bei etwa sieben bis zehn Jahren liegt. Erschwerend kommt hinzu, dass die verfügbaren Organe häufig von älteren Spendern mit Komorbiditäten stammen. Diese Nieren haben oft eine unklare Funktionsfähigkeit. Aus diesem Grund werden diese Nieren nicht immer für eine Transplantation angenommen oder gar nicht erst entnommen. Eine Methode, den verfügbaren Spenderpool zu vergrößern, ist daher, diese Nieren so gut als möglich nutzbar zu machen. Dafür müssen die Nieren vor der Transplantation medizinisch bewertet werden. Die Maschinenperfusion (MP) ist eine Methode der dynamischen Konservierung und Konditionierung von Organen. Die Vorteile einer Lagerung mittels hypothermer MP für die Niere sind bereits bekannt. Bei der normothermen MP wird die Niere mit einer oxygenierten, temperierten Perfusionslösung durchströmt. So wird der Metabolismus der Zellen aufrechterhalten und die Ischämiezeit verkürzt. Damit bietet die normotherme MP eine Plattform, um Nieren unter reperfusionsähnlichen Bedingungen zu observieren. Für diese Arbeit wurden die Nieren aus Schlachthofschweinen gewonnen und autologes Vollblut als Perfusionslösung verwendet. Die Perfusion erfolgte mittels einer eigens dafür vom Kooperationspartner (Institut für Biomedizinische Technik) konzipierten Perfusionsmaschine. Es konnte gezeigt werden, dass die Nieren damit stabil für 4 h mit Vollblut perfundiert werden können. Die Level verschiedener Biomarker wurden im Gewebe (Biopsien nach 0 und 4 h Perfusion), Urin (1 h-Sammelurin nach 1, 2 und 4 h Perfusion) und Plasma (nach 0, 1, 2 und 4 h) analysiert. Die Nieren wurden anhand verschiedener Kriterien in jeweils zwei Gruppen (gut und schlecht) eingeteilt. So erfolgte eine direkte Bewertung der Makroskopie nach der Perfusion durch einen anwesenden Arzt. Während diese direkte Bewertung der Situation dem klinischen Alltag ähnelt, ist diese jedoch subjektiver Art. Um diese Subjektivität zu relativieren, wurden die Nieren weiterhin durch mehrere Gutachter nach einem Makroskopischen Score eingeteilt. Dabei zeigte sich teilweise eine große Varianz zwischen den Gutachtern. Neben der Makroskopie wurden die Nieren auch nach ihrer Histologie bewertet. Hierfür wurden diese über den Remuzzi-Score klassifiziert. Dabei zeigte sich, dass die Nieren zum größten Teil sehr gut bewertet wurden und nur wenige Schäden aufzeigten. Da die Tubuli besonders schnell unter Ischämie geschädigt werden, wurden die Nieren insbesondere nach der Tubulus-Atrophie histologisch bewertet. Hierbei konnten häufiger und schneller Schäden an den Nieren beobachtet werden. Auch die Information über die Filtrationsleistung der Niere stellt einen wesentlichen Wissensgewinn dar, ist jedoch nur aufwändig bestimmbar. Mittels Inulin-Clearance-Bestimmung während der MP wurden die Nieren anhand dieser in eingeschränkt und nicht funktionsfähig eingeteilt. Auffällig dabei war, dass die einzelnen Klassifikationen nur eine vergleichsweise geringe Übereinstimmung hatten. Insbesondere die als Inulin-Clearance gemessene Funktionsfähigkeit korrelierte in keiner Weise mit der Makroskopie oder der Histologie. Im Gewebe wurden die Level der Biomarker für oxidativen Stress, 8-OHdG, und für Schäden des Epithels des proximalen Tubulus, KIM-1, mittels IHC untersucht. Der Ischämie-Reperfusionsschaden spiegelte sich hierbei in der Zunahme der Intensität der 8-OHdG-Färbung wider. Es zeigten sich jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den guten und schlechten Nieren. Die immunohistochemische KIM-1-Färbung nahm in histologisch guten Nieren häufiger ab als in histologisch schlechten Nieren. In den anderen Klassifizierungen zeigten sich keine Unterschiede. Aus dem Gewebe wurde die mRNA isoliert und die Expressionslevel mehrerer Biomarker vor und nach der Perfusion analysiert. Die Kim-1-mRNA war nicht nachweisbar. Die mRNA-Level der Marker EDN-1, TLR 4 und IL-6 nahmen im Verlauf der Zeit zu. Bei den meisten Klassifikationen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den jeweiligen Gruppen. Einzig in den Nieren, welche nach dem Remuzzi-Score eingeteilt wurden, waren die NGAL-mRNA-Level in den schlechten Nieren signifikant höher als in den guten. Dieser Unterschied trat jedoch nur bei der 0 h-Probe auf, am Ende der Perfusion war er nicht mehr zu beobachten. Im Urin wurden die Level von IL-6, KIM-1, NAG und NGAL bestimmt. Die Level der vier Biomarker nahmen im Verlauf der Zeit zu. Die jeweiligen Gruppen der verschiedenen Klassifizierungen unterschieden sich in den Urinsammelproben nicht anhand der IL-6-, NAG- und KIM-1-Level. Einzig in den guten und schlechten Nieren nach dem Makroskopischem Score waren die NGAL-Level signifikant unterschiedlich. Dieser Unterschied war nur im Sammelurin der 1 h-Probe nachzuweisen. Die gleichen Biomarker wurden ebenfalls im Plasma untersucht. Auch hier kam es zu einem Anstieg der Level aller Marker im Verlauf der Perfusion. KIM-1 unterschied sich in keiner Klassifikation in den jeweiligen guten und schlechten Nieren. NGAL war hingegen nach 1 h in Nieren, die nach dem Makroskopischen Score als schlecht beurteilt wurden, signifikant höher als in Nieren, die nach dem Score als gut eingeteilt wurden. In Nieren, welche von dem anwesenden Arzt als nicht transplantabel bewertet wurden, waren die Level von IL-6 und NAG in der 4 h-Plasmaprobe signifikant höher als in potentiell transplantablen Nieren. Dies weist darauf hin, dass die Plasma-basierten Marker IL-6 und NAG nach 4 h robust makroskopisch schlechte und gute Nieren differenzieren konnten. Dahingegen zeigte sich ein Unterschied in den NGAL-Leveln frühzeitig, aber nicht robust. Es konnte noch kein Marker gefunden werden, der frühzeitig und robust zwischen den jeweils stärker und schwächer geschädigten Nieren unterscheiden konnte. Trotzdem könnten sie nach einer Validierung dafür geeignet sein, in einem experimentellen Setting als Parameter dienen zu können, die die Qualität einer Niere unter NMP bewerten können. Weitere Biomarker, welche prädikativ für die Funktionalität oder Histologie des Organs sind, müssen in zukünftigen Versuchen evaluiert werden.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungen V 1 Einleitung 1 1.1 Die Niere 1 1.1.1 Aufgaben und Funktion der Niere 1 1.1.2 Das Nephron 1 1.2 Ausfall der Nierenfunktion 3 1.2.1 Akutes Nierenversagen 3 1.2.2 Chronische Niereninsuffizienz 4 1.3 Nierenersatztherapie 5 1.3.1 Die Dialyse 5 1.3.2 Leben unter Dialyse 5 1.4 Die Nierentransplantation 6 1.4.1 Aktueller Stand der Nierentransplantation in Deutschland 6 1.4.2 Allokation in der Eurotransplant-Region 7 1.4.3 Spendernieren 8 1.4.4 Transplantatfunktion 9 1.5 Ischämie und Reperfusion 11 1.5.1 Warme Ischämiezeit 11 1.5.2 Kalte Ischämiezeit 12 1.5.3 Ischämie-Reperfusionsschaden 12 1.6 Organkonservierung 14 1.6.1 Static cold storage 14 1.6.2 Hypotherme Maschinenperfusion 15 1.6.3 Normotherme Maschinenperfusion 15 1.6.4 Perfusionsgeräte 16 1.6.5 Die Maschinenperfusion als Bewertungstool 18 1.7 Biomarker 19 1.7.1 8-Hydroxyl-Desoxyguanosin 19 1.7.2 Endothelin-1 20 1.7.3 Toll-like receptor-4 20 1.7.4 Interleukin-6 21 1.7.5 Kidney injury molecule 1 22 1.7.6 N-Acetyl-/β-glucosaminidase 22 1.7.7 Neutrophile Gelatinase-assoziiertes Lipocalin 23 2 Zielstellung der Arbeit 24 3 Material 25 3.1 Geräte 25 3.2 Verbrauchsmaterial 26 3.3 Software 27 3.4 Chemikalien und Reagenzien 27 3.5 Kits 28 3.6 Medien, Puffer und Lösungen 29 3.7 qPCR-Assays 30 3.8 Antikörper 31 4 Methoden 32 4.1 Normotherme Maschinenperfusion 32 4.1.1 Nieren- und Vollblutentnahme bei Schlachthof-Tieren 32 4.1.2 Lagerung und Transport 33 4.1.3 Vorbereiten der Nieren 33 4.1.4 Vorbereiten des Perfusionskreislaufes 34 4.1.5 Nierenperfusion 38 4.1.6 Probenentnahme 40 4.2 Histologische Färbungen von Biopsien 42 4.2.1 Einbetten der Biopsien und Anfertigung von Schnitten 42 4.2.2 Hämalaun-Eosin-Färbung 44 4.2.3 Etablierung eines geeigneten IHC-Färbeprotokolls 45 4.2.4 Immunohistochemische Färbungen 46 4.2.5 Mikroskopie 47 4.2.6 Semi-quantitative Auswertung der Färbungen 48 4.3 RNA-Isolation aus Biopsien 48 4.3.1 Gewebeaufschluss der Biopsien 48 4.3.2 RNA-Aufreinigung mittels RNAeasy lipid tissue-Kit 48 4.4 RNA-Konzentrationsbestimmung 50 4.4.1 RNA-Konzentrationsbestimmung über Spektralphotometrie 50 4.4.2 Prüfen der RNA-Qualität mittels automatisierter Elektrophorese 50 4.5 cDNA-Synthese aus RNA mittels Superskript III Reverse Transkriptase 51 4.6 Real Time quantitative PCR 52 4.7 Quantifizierung der Markerkonzentration mittels ELISA 53 4.7.1 Prinzip des ELISA 53 4.7.2 Interleukin-6-ELISA 55 4.7.3 KIM-1-ELISA und NAG-ELISA 55 4.7.4 NGAL-ELISA 56 4.8 Gesamtprotein-Bestimmung mittels BCA-Assay 56 4.9 Bestimmung der Inulin-Clearance 57 4.10 Nierenklassifikation 61 4.10.1 Direkte makroskopische Bewertung 61 4.10.2 Bewertung nach dem Makroskopischen Score 61 4.10.3 Bewertung nach Remuzzi-Score 62 4.10.4 Bewertung nach Tubuli-Atrophie 63 4.10.5 Bewertung nach Funktionalität 64 4.11 Sequenzen und Alignments 64 4.12 Statistik 65 4.12.1 Signifikanzberechnungen 65 4.12.2 Receiver operated characteristic-Kurven 65 5 Ergebnisse 66 5.1 Ergebnisse der Methodenetablierung 66 5.1.1 Immunohistochemie 66 5.1.2 Eine gute RNA-Aufarbeitung kann allein durch Mörsern der Biopsie erreicht werden 71 5.1.3 GAPDH und RPL19 sind als Referenzgene für die qPCR geeignet 73 5.2 Ergebnisse der Klassifikation der Nieren 74 5.2.1 Die Nieren wurden anhand verschiedener Merkmale in fünf Gruppen eingeteilt 74 5.2.2 Die Übereinstimmung zwischen direkter Bewertung, Makroskopischem Score und Remuzzi-Score ist nicht hoch 75 5.2.3 Die Filtrationsleistung ist nicht mit den makroskopischen Bewertungen assoziiert 77 5.3 Analyse der mRNA-Level der potentiellen Biomarker im Gewebe von perfundierten Nieren 79 5.3.1 EDN-1-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 79 5.3.2 TLR-4-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 81 5.3.3 IL-6-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 83 5.3.4 KIM-1-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 85 5.3.5 NGAL-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 85 5.4 Auswertung der histologischen und immunohistochemischen Färbungen 87 5.4.1 Leichte Zunahme des Remuzzi-Scores über die Zeit 87 5.4.2 In histologisch wenig geschädigten Nieren kommt es häufiger zu einer Abnahme der KIM-1-Färbung 88 5.4.3 Der 8-OHdG-Gehalt steigt im Verlauf der Zeit an 88 5.5 Analyse der potentiellen Biomarker im Urin im Verlauf der NMP 89 5.5.1 IL-6-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 90 5.5.2 KIM-1-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 91 5.5.3 NAG-Aktivitätsverlauf im Urin während der NMP 93 5.5.4 NGAL-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 94 5.6 Analyse der potentiellen Biomarker im Plasma im Verlauf der NMP 96 5.6.1 IL-6-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 96 5.6.2 KIM-1-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 96 5.6.3 NAG-Aktivitätsverlauf im Plasma während der NMP 98 5.6.4 NGAL-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 100 5.7 ROC-Analysen der statistisch signifikanten Biomarker 101 6 Diskussion 104 6.1 Evaluation der Methodenetablierung 104 6.1.1 Kritische Betrachtung der Nutzbarkeit der Immunohistochemie 104 6.1.2 Wahl der Methodik für eine maximale RNA-Ausbeute 105 6.2 Das Modell „Schlachthofschwein“ 105 6.3 Setting der Maschinenperfusion im Vergleich zur Literatur 106 6.4 Vergleich der verschiedenen Klassifikationen 107 6.5 Evaluation der Biomarker auf ihre Eignung 108 6.5.1 8-OHdG als Biomarker für oxidative Schäden in der NMP 108 6.5.2 Endothelin-1 als Biomarker für die Endothelaktivierung in der NMP 110 6.5.3 TLR-4 als Biomarker für die Aktivierung der Immunantwort in der NMP 111 6.5.4 IL-6 als Biomarker für die akute Phase in der NMP 112 6.5.5 NAG als Biomarker für Zellschäden in der NMP 114 6.5.6 KIM-1 als Biomarker für Schäden am proximalen Tubulus in der NMP 116 6.5.7 NGAL als Biomarker für Schäden am proximalen Tubulus in der NMP 119 6.6 Kritische Betrachtung der Faktoren, welche die Aussagekraft einschränken können 121 6.7 Andere Parameter zur Vorhersage der Nierenqualität 122 6.8 Aussichten auf einen Bewertungsscore und Zukunft der NMP 122 7 Zusammenfassung 124 8 Summary 127 9 Literatur 129 Danksagung 160 Eigenständigkeitserklärung 161 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 162 Anhang 163 10.1 Abbildungsverzeichnis 163 10.2 Tabellenverzeichnis 164

In dieser Arbeit werden verschiedene Aspekte der Bedeutung von Fettsäuren für Daphnien betrachtet. Für physiologische, ernährungs- und reproduktionsbiologische Untersuchungen wurden die Fettsäuren aus Daphnien, Seston bzw. Algen gaschromatographisch analysiert. Mit Daphnien wurde in batch- und Durchflusskulturen experimentiert. Aufgrund ihrer heterogenen Zusammensetzung enthielten sämtliche Sestonproben eine Vielzahl omega-6- und omega-3-Fettsäuren. Die durch die Veränderungen der Phytoplanktonzusammensetzung der Talsperre Bautzen und des Großen Vätersees (GV) zu erwartende Veränderungen der Fettsäuremuster des Sestons wurden nur selten gefunden. Gewässerspezifische Unterschiede der Fettsäuremuster konnten nicht nachgewiesen werden. Das Fettsäuremuster von Daphnien wird sehr stark von dem der aufgenommenen Nahrung bestimmt. Allerdings wird mit der Nahrung aufgenommene DHA vollständig in kürzer kettige omega-3-Fettsäuren umgewandelt. Dies stellt möglicherweise eine Anpassung an die Prädation durch Fische dar. Das Wachstum der juvenilen Daphnien war im GV 1998 während der gesamten Untersuchungszeit aufgrund qualitativer Eigenschaften der Nahrung limitiert. Jedoch konnte keine Fettsäure und auch kein weiterer bekannter Nahrungsqualitätsfaktor für die Limitation verantwortlich gemacht werden. Ob die Fettsäuren alpha-Linolensäure und/oder EPA die Transfereffektivität von Stoffen und Energie zwischen Seston und Daphnien beeinflussen, erscheint fraglich. Die Nahrungskonzentration und die Umgebungstemperatur bestimmen die Gelegegröße von Daphnien. Die saisonalen Veränderungen der spezifischen Fettsäurekonzentration adulter Daphnien [µg/Ind.] konnten im GV am besten durch Veränderungen der Dauer der Eientwicklungszeit und damit der Wassertemperatur erklärt werden. Die Daphnien hatten fast ausschließlich bei niedrigen Temperaturen große Gelege. / This work considers variable aspects on the implication of fatty acids for daphnids. Fatty acids from seston, algae, and daphnids were analysed by gas chromatography for investigations in respect to nutrition, physiology, and reproduction. Experiments with daphnids were carried out in batch and flow-through cultures. Due to their heterogenic composition, lake seston contained always a vast number of omega-6- and omega-3-fatty acids. Despite great differences in phytoplankton composition of Bautzen Reservoir and Lake Großer Väter, lake specific patterns of sestonic fatty acid composition were not detected. The fatty acid composition of daphnids is strongly influenced by their food. Nevertheless, nutritional DHA was transformed completely to shorter chained omega-3-fatty acids. This transformation is possibly an adaption against fish predation. The growth of juvenile daphnids was limited by food quality in Lake Großer Väter 1998. Neither fatty acids nor another known factor of food quality were responsible for this limitation. According to the results it seems questionable that alpha-linolenic acid and/or EPA are essential for daphnids. Further, it was demonstrated that food concentration and temperature determine clutch size in daphnids. In Lake Großer Väter the seasonal changes of specific fatty acid concentration [µg per individual] of adult daphnids could be explained by changes in the duration of egg development time which is determined by temperature. Large clutches were found nearly exclusively at low temperatures.