La transplantation rénale reste le traitement de choix du stade terminal la maladie rénale chronique. Malgré la diminution très significative de l'incidence du rejet aigu à médiation cellulaire (ACR), la survie à long terme des greffons rénaux reste relativement stable probablement à cause de l'augmentation du rejet à médiation humorale. Dans cette thèse, nous avons exploré deux objectifs de l'analyse moléculaire au cours de la transplantation rénale dont les biomarqueurs font partie intégrante : la prédiction de l'épisode de rejet aigu avant même l'apparition des lésions histologiques et l'amélioration de nos connaissances sur la physiopathologie des mécanismes immunologiques afin de pouvoir adapter le mieux possible le traitement immunosuppresseur.Dans un premier travail clinique préliminaire à la recherche de biomarqueurs, nous avons analysé dans une cohorte rétrospective de 87 patients, les facteurs de risque indépendants de perte du greffon rénal après un épisode de rejet aigu à médiation humorale (AMR) C4d positif. L'analyse par régression de Cox a retrouvé deux deux facteurs de risque : le niveau initial de dégradation de la fonction du greffon rénal et la présence concomittante d'un rejet aigu à médiation cellulaire. Dans un deuxième travail, nous avons exploré la possibilité d'utiliser des biomarqueurs non invasifs plutôt que la biopsie du greffon rénal chez des patients avec dysfonction aigue du greffon, situation à risque de dysfonction chronqiue du greffon rénal. Nous avons mesuré le niveau d'expression urinaire de 26 ARN messagers préselectionnés chez 84 transplantés rénaux avec dysfonction aigue du greffon, 32 nécrose tubulaire aigue, 26 ACR et 26 AMR Puis par une analyse discriminante suivie d'une validation croisée, nous avons découvert et validé une combinaison linéaire de six ARNm CD3e, CD105, TLR4, CD14, le facteur B du complément et la vimentine différentiant efficacement le rejet aigu de la nécrose tubulaire aigue. Cette combinaison linéaire permet d'épargner un nombre significatif de biopsies du greffon non indispensables. Puis, par la même technique, nous avons découvert et validé une nouvelle combinaison linéaire d'ARNm CD3e, CD105, CD14, CD46, et l'ARNr 18S pouvant différentier efficacement l'ACR de l'AMR. A l'avenir ces signatures pourraient diminuer le recours à la réalisation d'une biopsie du greffon puis une aide au diagnostic précoce des épisodes de rejets aigus. Dans un troisième travail, nous avons analysé le phénotype lymphocytaire B de patients transplantés rénaux traités par anticalcineurines (CNI) (N=12) et belatacept (N=13), immunosuppresseur inhibiteur de la costimulation. Les patients traités par belatacept ont une meilleure survie à long terme que ceux traités par CNI. Chez les patients traités par belatacept, nous avons retrouvé un phénotype B particulier avec une augmentation significative des lymphocytes B et des lymphocytes B transitionnels CD19+ CD24hi CD38hi et CD19+ IgDhi CD38hi CD27 potentiellement régulateurs par rapport aux patients traités par CNI. Le niveau d'expression de l'ARNm de BAFF et de BAFF-R dans les PBMCs était significativement plus bas chez les patients traités par belatacept. Nos résultats pourraient expliquer en partie les meileurs résultats cliniques observés chez les patients traités par belatacept après transplantation rénale.En conclusion, au cours de cette thèse, nous avons évalué l'intérêt des biomarqueurs, dans deux domaines, la recherche de facteurs pronostiques et diagnostiques du rejet aigu à médiation humorale par l'analyse d'une cohorte clinique et du transcriptome urinaire d'une partie de cette cohorte et l'analyse des mécanismes physiopathologiques au cours de la tolérance induite par le belatacept. Nos résultats méritent d'être confirmés dans des cohortes indépendantes de patients avant leur utilisation en pratique clinique courante et l'évaluation de leur impact sur la survie des greffons rénaux. / Kidney transplantation remains the best treatment in advanced chronic kidney disease. Acute T-cell mediated rejection (ACR) decreased significantly but long-term kidney allograft survival did not increase significantly these last ten years. Antibody-mediated rejection is probably the main part of the problem. In this work, we explored two ways of the molecular analysis of kidney transplant, including biomarkers: prediction of rejection and study of the mechanisms of immunosuppressiv agents within kidney transplantation.The first one, a preliminary clinical work, identified in a retrospective cohort of 87 for-cause biopsies with C4d positive acute antibody-mediated rejection (AMR) independant risk factors for renal allograft failure after the AMR. The Cox regression analysis identified that concurrent ACR and estimated glomerular filtration rate are independent risk factors for allograft loss. The second one explored how noninvasive tests to differentiate the basis for acute dysfunction of the kidney allograft could replace invasive allograft biopsy. We measured absolute levels of 26 prespecified mRNAs in urine samples collected from kidney graft recipients at the time of for-cause biopsy for acute allograft dysfunction. We profiled 52 urine samples from 52 patients with biopsy specimens indicating acute rejection (26 ACR and 26 AMR) and 32 urine samples from 32 patients with acute tubular injury (ATI) without acute rejection. A stepwise quadratic discriminant analysis ofmRNA measures identified a linear combination ofmRNAs for CD3e, CD105, TLR4, CD14, complement factor B, and vimentin that distinguishes acute rejection from ATI; 10-fold cross-validation of the six-gene signature yielded an estimate of the area under the curve of 0.92 (95% CI, 0.86 to 0.98). In a decision analysis, the sixgene signature yielded the highest net benefit across a range of reasonable threshold probabilities for biopsy. Next, among patients diagnosed with acute rejection, a similar statistical approach identified a linear combination ofmRNAs for CD3e, CD105, CD14, CD46, and 18S rRNA that distinguishes ACR from AMR, with a cross-validated estimate of the area under the curve of 0.81 (95% CI, 0.68 to 0.93). Incorporation of these urinary cell mRNA signatures in clinical decisions may reduce the number of biopsies in patients with acute dysfunction of the kidney allograft. In the third one, we analyzed B cell phenotype in kidney transplant recipients treated with the costimulation blocker belatacept and compared them to recipients treated with calcineurin inhibitors (CNI). Phase III clinical studies have shown that patients kidney treated belatacept exhibited a better renal allograft function and lower donor-specific anti-HLA immunization when compared to recipients treated with CNI. Thirteen patients treated with belatacept and 12 with CNI were phenotyped. In belatacept group, the frequency and absolute number of transitional B cells as defined by both phenotypes: CD19+ CD24hi CD38hi and CD19+ IgDhi CD38hi CD27-, as well as naïve B cells were significantly higher compared with CNI group. B cell activating factor (BAFF) and BAFF receptor mRNA levels were significantly lower in belatacept group than in CNI group. These results show for the first time that belatacept influences B cell compartment by favoring the occurrence of transitional B cells with potential regulatory properties, as described in operational tolerant patients. This role may explain the lower alloimmunization rate observed in belatacept-treated patients.To conclude, we evaluated biomarkers analysis within two ways, acute antibody-mediated rejection prognosis and diagnosis with a clinical cohort and urinary transcriptomic analysis and mechanisms of action of belatacept induced tolerance. Our results need to be validated in an independent cohort before to be integrated in clinical decision and evaluation of their impact on long term graft survival.

Parmi les outils existants pour l'évaluation de la qualité des milieux aquatiques, les biomarqueurs permettent de détecter précocement l'exposition et/ou les effets d'une contamination. Toutefois, en raison du manque de connaissance fondamentale de leur régulation au niveau moléculaire, peu de biomarqueurs ont été spécifiquement développés chez les invertébrés, alors que ces derniers représentent 95% de la biodiversité animale. Grâce aux récentes avancées technologiques dans le domaine du séquençage de l'information génétique et protéique, la découverte de nouvelles protéines chez ces organismes est à présent possible. Centré sur l'utilisation d'une espèce d'intérêt en écotoxicologique, l'amphipode d'eau douce Gammarus fossarum, et sur la problématique de la perturbation endocrine, ce travail doctoral a pour objectif de découvrir de nouvelles protéines impliquées dans la reproduction du gammare et de proposer des biomarqueurs spécifiques de reprotoxicité. Par une première approche protéogénomique, un important catalogue de protéines a été généré. Puis, afin d'identifier de nouvelles protéines impliquées dans la reproduction, une comparaison entre les protéomes des tissus reproducteurs mâle et femelle a été réalisée, suivi de l'étude de la dynamique du protéome au cours de différents processus physiologiques : ovogénèse, embryogénèse et spermatogénèse. Enfin, une dernière expérience sur des organismes mâles exposés à différents perturbateurs endocriniens a permis d'identifier différents candidats biomarqueurs de reprotoxicité. Cette étude ouvre la voie à des développements rapides de biomarqueurs spécifiques d'une espèce animale d'intérêt en écotoxicologie / Among the tools for assessing biologic quality of aquatic ecosystems, biomarkers are ideally suited for the early detection of contaminant exposure and/or effects. Yet, because of the lack of fundamental knowledge of their molecular regulation, few specific developments have been carried out on invertebrates even though they account for more than 95% of animal biodiversity. Thanks to recent technological advances in nucleic and proteic information sequencing, discovery of new proteins is now possible for these organisms. Focussed on the use of an ecotoxicologically relevant species, the freshwater amphipod Gammarus fossarum and the problem of endocrine disruption, this doctoral thesis aims to discover new proteins involved in gammarid reproductive function and to propose specific biomarkers of endocrine disruption. With a first proteogenomic approach, an important protein catalogue was generated. Next, to identify proteins involved in gammarid reproduction, male and female reproductive tissue proteomes were compared, followed by the study of proteome dynamics in several physiological processes: oogenesis, embryogenesis and spermatogenesis. Finally, a last experiment on male gammarids challenged with different endocrine disrupter chemicals identified several candidate biomarkers of reprotoxicity. This study paves the way for quick developments of specific biomarkers for organisms of interest in ecotoxicology

L’objectif principal de ce travail de thèse est de contribuer au développement d’un outil de diagnostic miniaturisé permettant d’identifier et de quantifier une combinaison de composés organiques volatils (COVs) présents dans l’haleine et qui sont considérés comme des marqueurs chimiques du cancer du poumon. Les principaux verrous scientifiques de ce projet sont liés aux très faibles concentrations de ces composés cibles (de l’ordre de quelques ppb) et également à la présence de nombreux autres composés chimiques qui sont naturellement présents dans l’haleine. La voie de développement proposée dans ce projet est d’utiliser un micro-capteur résistif à base de SnO2 associé à un micro-préconcentrateur et une micro-colonne chromatographique afin d’aboutir à un dispositif sélectif et présentant des limites de détection très basses. Dans un premier temps, plusieurs adsorbants ont été caractérisés en vue d’être utilisés dans le micro-préconcentrateur afin de concentrer les marqueurs du cancer du poumon. Les résultats ont permis de sélectionner deux types de zéolites (DaY et NaY) ainsi que des microsphères de carbone W5. Par la suite, les unités de préconcentration et de séparation des COVs ont été développées en s’appuyant sur la technologie silicium/verre disponible en salle blanche. La dernière étape de cette étude a concerné l’évaluation des performances du système d’analyse alors assimilable à un micro-chromatographe en phase gazeuse. Après avoir déterminé les conditions optimales d’élution et de préconcentration des COVs, le système miniaturisé a permis d’analyser une haleine artificielle constituée de trois COVs présents à des concentrations proches des celles mesurées dans l’haleine (toluène (24 ppb), propanol (21 ppb) et o-xylène (5 ppb)) même en présence des interférents majeurs de l’haleine (vapeur d’eau et dioxyde de carbone). / The main goal of this research is to develop a miniaturized diagnostic equipment in order to identify some volatile organic compounds present in exhaled breath and referred as lung cancer biomarkers. The main scientific and technical obstacles of this project are linked to the very low concentrations of these chemical compounds and the presence of high concentrations of H2O and CO2 naturally present in exhaled breath. To address these issues, we suggest to use a SnO2-based gas sensor combined with a micro-preconcentrator and a chromatographic micro-column in order to engineer a low detection limit system. First, some specific adsorbents have been characterized with a view to concentrate chemical biomarkers trough the micro-preconcentrator. In accordance with research findings, two types of zeolites (DaY and NaY) and one type carbonaceous microspheres (W5) have been selected. Then micro-preconcentrators and chromatographic micro-columns have been developed on silicon wafers by using clean room facilities. The last step of this study was to evaluate the performances of the analytical device. After determining optimal elution and pre-concentration conditions of each VOCs, the miniaturized system achieved the analysis of an artificial breath constituted of toluene (24 ppb), 1-propanol (21 ppb) and o-xylene in presence of high concentrations of water vapors and carbon dioxide.

La dernière décennie a connu une révolution dans le traitement du cancer en s'éloignant des médicaments conventionnels qui ciblent directement la tumeur (comme les chimiothérapies et les thérapies moléculaires ciblées) au profit des immunothérapies, et en particulier les inhibiteurs des "checkpoint" immunitaires. Ces immunothérapies libèrent sélectivement le système immunitaire de l'hôte contre la tumeur et ont démontré une rémission durable sans précédent chez des patients atteints de cancers que l'on croyait incurables, comme le mélanome métastatique, le carcinome rénal métastatique et les stades avancés du cancer du poumon non à petites cellules. Cependant, plus de la moitié des patients ne répondent pas à ces traitements, et sont donc contraints à recevoir d’autres traitements potentiellement toxiques et coûteux. Face aux résultats prometteurs des immunothérapies anti‐PD1/PD‐L1, la recherche de nouvelles cibles/marqueurs moléculaires permettant d'améliorer l'efficacité et de permettre un traitement personnalisé s'est intensifiée. Nos travaux portent sur l’étude de la protéine Sequestosome 1 (SQSTM1/p62) qui est un substrat de l'autophagie sélective et une plateforme de signalisation impliquée dans l’agressivité tumorale. Nous mettons en évidence l’implication de SQSTM1/p62 dans l'inflammation tumorale et dans l’évasion immunitaire et ceci grâce à la stabilisation du messager de PD‐L1. Nous observons que la surexpression tumorale de SQSTM1/p62 caractérise les tumeurs infiltrées et immunosuppressives qui répondent le mieux aux anti‐PD1/PD‐L1. Ainsi, nous proposons SQSTM1/p62 en tant que biomarqueur potentiel et cible thérapeutique pour améliorer la stratification des patients susceptibles de répondre aux immunothérapies. / The past decade has witnessed a new revolution in cancer treatment by shifting away from the conventional drugs that directly target the tumor (such as chemotherapies and molecular targeted therapies) towards immune‐based therapies, and in particular the so‐called immune checkpoint inhibitors. These immunotherapies selectively release the host immune system against the tumor and have shown unprecedented durable remission for patients with cancers that were thought incurable such as metastatic melanoma, metastatic renal cell carcinoma and late stages of non‐small cell lung cancer. However, more than half of the patients fail to respond to these treatments and are therefore forced to receive other potentially toxic and costly treatments. In this era of promising anti‐PD1/PD‐L1 immunotherapies, the quest for reliable molecular markers/therapeutic targets that would enhance the effectiveness and allow a personalized adaptation of the treatments has intensified. In our work we focus on the scaffold protein and autophagy adaptor Sequestosome 1 (SQSTM1/p62), and we show that it is required for tumor inflammation and immune evasion. We find that SQSTM1/p62 tumor overexpression characterizes infiltrated and immunosuppressive tumors and predicts for response to anti‐PD1/PD‐L1 therapies. Thus, we propose SQSTM1/p62 as a potential biomarker and a therapeutic target to improve the stratification of patients to immunotherapies.

L'asthme est la pathologie chronique la plus fréquente chez l'enfant et pose de réels problèmes de santé publique. L'hétérogénéité des phénotypes de l'asthme influence le pronostic et la réponse aux traitements. Les biomarqueurs idéaux devraient être liés à des mécanismes spécifiques de phénotypes et permettre d'expliquer des pronostics différents entre les individus. Il doit s'agir d'outils utiles au diagnostic, à la prédiction d'un risque évolutif, à la personnalisation de thérapeutiques et/ou au suivi sous traitement. Plusieurs types de biomarqueurs ont ainsi été analysés dans ce travail de thèse : (1) un biomarqueur lié à la sévérité de la maladie chez une cohorte de nourrissons siffleurs récurrents ; (2) un biomarqueur prédictif de l'évolution vers l'asthme dans une cohorte de nourrissons atteints de dermatite atopique à début précoce ; (3) et enfin un biomarqueur associé au mauvais contrôle de l'asthme sévère allergique de l'enfant. Ces travaux, transversaux pour deux et longitudinal pour un, ont permis d'identifier trois biomarqueurs: (1) un polymorphisme génétique de l'interleukine 4 associé au phénotype de sifflements récurrents sévères viro-induits ; (1) la multi- sensibilisation allergénique (dosages positifs à des IgE spécifiques d'allergène) associée au risque d'asthme allergique dans une cohorte d'enfants attients de dermatite atopique ; (3) et le pourcentage de cellules T régulatrices CD4+Foxp3+(Treg) dans le sang périphérique lié au contrôle de l'asthme sévère allergique traité par omalizumab. Nous envisageons de conforter ces résultats sur d'autres cohortes européennes. / Asthma is the most frequent chronic condition in children and poses real public health problems. The heterogeneity of asthma phenotypes influences prognosis and response to treatments. The ideal biomarkers should be linked to specific mechanisms of phenotypes and allow to explain different prognoses between individuals. They must be useful tools for diagnosis, prediction of an evolutive risk, personalization of therapeutics and / or follow-up under treatment. Several types of biomarkers have been analyzed in this thesis: (1) a biomarker linked to the severity of the disease in a cohort of recurrent wheezing infants; (2) a predictive biomarker of the evolution towards asthma in a cohort of children with early-onset atopic dermatitis; (3) and finally a biomarker associated with poor control of severe allergic asthma in children. These works, transversal for two and longitudinal for one, allowed to identify three biomarkers: (1) a genetic polymorphism of interleukin 4 associated with the phenotype of severe viro-induced recurrent wheeze; (1) allergen multi-sensitization (allergen specific IgE assays) associated with the risk of allergic asthma in a cohort of children with atopic dermatitis; (3) and the percentage of CD4+Foxp3+regulatory T cells (Treg) in the peripheral blood related to control of severe allergic asthma treated with omalizumab. Further studies in larger European cohorts are planned to support these findings.

L’émergence de nouvelles technologies basées sur la microfluidique de gouttes offre l’espoir de développer des immuno-essais complexes consommant peu d’échantillon. Cette thèse est dédiée d’une part au développement d’une plateforme d’analyse qui consiste au fractionnement d’un mélange de peptides amyloïdes par focalisation isoélectrique (IEF) pour ensuite procéder à l’immuno-détection en gouttes des différentes fractions. Une méthode d’IEF en capillaire a été développée et a permis la séparation des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 ainsi que leur collecte dans des solutions individuelles. Ces solutions de collectes ont été analysées par Elisa sur particules magnétiques. L’immuno-essais a permis de déterminer la distribution des peptides dans les différentes collectes. Ces analyses ont d’abord été réalisées en « batch » où les particules magnétiques sont en suspension dans une solution non-confinée. Ensuite, un dispositif permettant de réaliser des immuno-essais en gouttes a été utilisé. Cette plateforme a été adaptée et optimisée pour le dosage des peptides Aβ 1-40 et Aβ 1-42 standard en vue de doser ces peptides dans le LCR et d’étendre l’analyse aux autres peptides (Aβ 2-40 et Aβ 5-40). D’autre part, une partie de la thèse a été dédiée à un travail sur micro-puce en vue de la conception d’un microsystème d’analyse totale intégrant en ligne les trois étapes majeures (séparation, compartimentalisation, immuno-détection en gouttes) de la plateforme d’analyse recherchée. Pour cette partie nous avons choisi le THV Dyneon qui a déjà servi au transport de bio-molécules en gouttes. Une première étude a consisté pour la première fois à réaliser des séparations électrocinétiques de protéines et de fluorophores hydrophobes dans les puces en THV Dyneon en utilisant deux modes de séparation (ECZ et NACE, respectivement). Ceci a permis de démontrer que ce nouveau matériau constitue un candidat prometteur pour le futur microsystème couplant séparation et compartimentalisation en gouttes. Une dernière étude a consisté au développement d’une méthode de marquage des peptides amyloïdes par un nouvel agent fluorescent, le Chromeo P540, particulièrement adapté pour des analyses IEF. Cet agent de marquage permettra de détecter les peptides durant la conception de l’interface de couplage (IEF/gouttes). / Emerging droplet-based microfluidic platform provide new opportunities to develop complex immunoassay with low sample consumption. This manuscript is dedicated on the development of an analytical platform for isoelectric focusing of amyloid peptides followed by their detection by immunoassay droplet-based microfluidic platform. A capillary isoeletric focusing method was developed first and allowed separation and collection of Aβ 1-40, Aβ 2-40 and Aβ 5-40 peptides in individual solutions. The fractions collected were analyzed off-line by Elisa on magnetic beads in batch-wise. This immune-detection allows the determination of peptide distribution in the different fractions collected. Then, we used a droplet-based microfluidic platform for immunoassay on magnetic beads. This platform was adapted and optimized to quantify standard Aβ 1-40 and Aβ 1-42 peptides. The next step will rely on the quantification of amyloid peptides on cerebrospinal fluid. In parallel, a study dedicated on microchip analyses to design a total-analysis-system has been performed. The final purpose is to integrate on-line three main steps; separation, compartmentalization and immune-detection in droplet. For this study, THV Dyneon has been chosen since this material was also used for the droplet-based microfluidic platform. A first study demonstrated for the first time electrokinetic separation, of biomolecules (proteins) and hydrophobic dyes in Dyneon THV chip using two separations modes (CZE and NACE respectively). This work highlighted the THV Dyneon micro-chip versatility. We can concluded that this new material is promising for further development dedicated to micro system combining separation and compartmentalization in droplet. A last work aimed to develop a labeling method for amyloid peptides with a new dye, the Chromeo P540, which is adapted for isoeletric focusing (IEF) analysis. This dye will allow peptides monitoring during the development of IEF/droplet interface.

La schizophrénie est un trouble mental, chronique et invalidant caractérisé par divers symptômes tels que des hallucinations, des épisodes délirants ainsi que des déficiences dans les fonctions cognitives. Au fil des ans, l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a été de plus en plus utilisée pour mieux comprendre les anomalies structurelles et fonctionnelles inhérentes à ce trouble. Les progrès récents en apprentissage automatique et l'apparition de larges bases de données ouvrent maintenant la voie vers la découverte de biomarqueurs pour le diagnostic/ pronostic assisté par ordinateur. Compte tenu des limitations des algorithmes actuels à produire des signatures prédictives stables et interprétables, nous avons prolongé les approches classiques de régularisation avec des contraintes structurelles provenant de la structure spatiale du cerveau afin de: forcer la solution à adhérer aux hypothèses biologiques, produisant des solutions interprétables et plausibles. De telles contraintes structurelles ont été utilisées pour d'abord identifier une signature neuroanatomique de la schizophrénie et ensuite une signature fonctionnelle des hallucinations chez les patients atteints de schizophrénie. / Schizophrenia is a disabling chronic mental disorder characterized by various symptoms such as hallucinations, delusions as well as impairments in high-order cognitive functions. Over the years, Magnetic Resonance Imaging (MRI) has been increasingly used to gain insights on the structural and functional abnormalities inherent to the disorder. Recent progress in machine learning together with the availability of large datasets now pave the way to capture complex relationships to make inferences at an individual level in the perspective of computer-aided diagnosis/prognosis or biomarkers discovery. Given the limitations of state-of-the-art sparse algorithms to produce stable and interpretable predictive signatures, we have pushed forward the regularization approaches extending classical algorithms with structural constraints issued from the known biological structure (spatial structure of the brain) in order to force the solution to adhere to biological priors, producing more plausible interpretable solutions. Such structured sparsity constraints have been leveraged to identify first, a neuroanatomical signature of schizophrenia and second a neuroimaging functional signature of hallucinations in patients with schizophrenia. Additionally, we also extended the popular PCA (Principal Component Analysis) with spatial regularization to identify interpretable patterns of the neuroimaging variability in either functional or anatomical meshes of the cortical surface.

Les protéoformes désignent toutes les formes sous lesquelles une protéine peut être présente. Cela inclut les formes portant des modifications post-traductionnelles, les isoformes et les formes résultant d’épissages alternatifs. Ces modifications peuvent influer sur la fonction d’une protéine, d’où l’intérêt de développer des méthodes sensibles, spécifiques et robustes de quantification de protéoformes pour une meilleure compréhension de mécanismes pathologiques ou la recherche de biomarqueurs. L’objectif de ce travail a été d’exploiter les avantages de la spectrométrie de masse à haute résolution pour la caractérisation et la quantification de protéoformes de protéines associées à des maladies neurodégénératives. Nous nous sommes principalement intéressés à deux protéines, la C9ORF72 et l’alpha-synucléine. Dans un premier temps, une méthode de quantification des deux isoformes de la C9ORF72 a été développée et appliquée à une cohorte de 43 cerveaux humains comprenant des cas de démences fronto-temporale (DFT) avec ou sans mutation C9ORF72. Les résultats obtenus montrent pour la première fois par spectrométrie de masse une diminution d’environ 50% de l’isoforme longue de la C9ORF72 en présence de la mutation. Dans une seconde étape, nous avons élargi l’analyse à la quantification multiplexe de 49 protéines cérébrales potentiellement impliquées dans les DFT. En parallèle, nous nous sommes intéressés aux formes tronquées de l’alpha-synucléine. Leur quantification a été réalisée par une approche top-down dans des tissus cérébraux et une approche par bottom-up dans le liquide céphalorachidien (LCR). Enfin, l’analyse a été étendue à la quantification multiplexe de l’alpha-synucléine et de la protéine tau du LCR. / Proteoforms describe the complexity of protein forms. This includes forms with post-translational modifications, isoforms and forms resulting from alternative splicing. These modifications can influence the function of a protein, hence the interest in developing sensitive, specific and robust methods for the quantification of proteoforms for a better understanding of pathological mechanisms or biomarkers discovery. The objective of this work was to take advantage of high-resolution mass spectrometry for the characterization and quantification of proteoforms associated with neurodegenerative diseases. We mainly focused on two proteins, C9ORF72 and alpha-synuclein. First, a method for quantifying the two C9ORF72 isoforms was developed and applied to a cohort of 43 human brains including cases of frontotemporal dementia (FTD) with or without C9ORF72 mutation. The results obtained show for the first time by mass spectrometry a decrease of about 50% of the long isoform of C9ORF72 in the presence of the mutation. Then, we extended the analysis to the multiplex quantification of 49 brain proteins potentially involved in FTD. In parallel, we focused on the truncated forms of alpha-synuclein. Their quantification was performed by a top-down approach in brain tissue and a bottom-up approach in cerebrospinal fluid (CSF). Finally, the analysis was extended to the multiplex quantification of alpha-synuclein and tau protein in CSF.

Bacillus cereus est une bactérie connue pour être le deuxième agent responsable de Toxi-Infections Alimentaires Collectives (TIAC) en France depuis 2012. Plusieurs cas d'infections locales et systémiques à B. cereus ont également été signalés. Par sa capacité à former des biofilms et à sporuler, B. cereus pose de vrais problèmes en agroalimentaire et en santé publique en résistant aux procédures de nettoyage et désinfection. Il reste néanmoins beaucoup d’interrogations sur les différences de toxicité observées chez les souches de B. cereus, des souches étant inoffensives pour l’Homme alors que d’autres sont mortelles. Or, les industries agroalimentaires et les hôpitaux ont besoin de savoir si une souche retrouvée dans leur environnement présente un danger et nécessite une intervention qui pourra avoir des répercussions économiques et humaines. Pour répondre à ces enjeux, mon travail a consisté à collecter et caractériser 564 souches isolées dans le cadre de TIAC et 56 souches isolées suite à des cas d’infections non-gastro-intestinales dans le but de les comparer avec des souches environnementales de B. cereus non reliées à des infections et identifier ce qui les différencie.A la suite de l’analyse complète des données épidémiologiques et cliniques des souches de B. cereus ainsi que leur typage et leur caractérisation sur un modèle de caractérisation génétique basé sur la détection de dix gènes présumés impliqués dans la virulence, des souches d’intérêts ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une étude approfondie de toxicité et de transcriptomique. Cette première partie du travail a également permis d’approfondir les connaissances portant sur les foyers de TIAC causés par B. cereus et aussi de mettre en évidence des cas de contaminations croisées survenues au sein de plusieurs hôpitaux français pouvant conduire au décès du patient.L’étude portant sur la toxicité in vitro des souches sur trois modèles cellulaire eucaryotes a montré des différences significatives entre des B. cereus qui ont causé des infections et ceux non reliés à des infections. L’étude de trancriptomique différentielle a permis d’identifier une liste de marqueurs qui pourraient être utilisés, après validation, pour différencier les souches pathogènes et environnementales considérées comme non pathogènes. À la suite d’un transfert de connaissance et de méthode, ces marqueurs pourront être utilisés par les laboratoires de terrain en agro-alimentaire et les laboratoires d’analyses médicales pour aider à la prise de décision en cas de contamination à B. cereus. / Bacillus cereus is the second cause of foodborne outbreaks (FBO) in France since 2012. Several cases of local and systemic infections caused by B. cereus were also reported. By its ability to form biofilms and spores, B. cereus arises real problems in the food industry and public health by resisting to cleaning and disinfection procedures. It remains many questions about the toxicity differences observed among B. cereus strains, several are harmless to humans while others can cause death. But the food industry and hospitals need to know if a strain found in their environment is unsafe and requires intervention that can have an economic and human impact. Face to these challenges, my work was to collect and characterize 564 strains isolated from FBO and 56 strains isolated from patients following cases of non-gastrointestinal infections in order to compare them with environmental strains of B. cereus and identify what differentiates them to others.By a full analysis of epidemiological and clinical data of B. cereus strains and their molecular typing and characterization by a genetic model based on the detection of ten genes potentially involved in virulence, interest strains have been selected to deal with toxicity and transcriptomic in depth. This first part has also allowed increasing knowledge about FBO caused by B. cereus and also to highlight cross-contaminations occurred in several French hospitals leading to death.The in vitro toxicity studies performed on three eukaryotic cell models showed significant differences between toxicity levels of B. cereus strains that have caused infections and those no linked to infections. The differential trancriptomic study has allowed identifying a list of markers that could be used, after validation, for differentiating pathogenic strains from those considering as non-pathogenic. Following the transfer of knowledge and methods, these markers could be used by food safety laboratories and medical laboratories to be a decision aid in case of B. cereus contamination.

Les lésions musculaires sont des événements fréquents. Le diagnostic repose sur la mesure de biomarqueurs sanguins. Les outils actuels présentent des limites qui justifient la recherche de nouveaux candidats biomarqueurs. Récemment, des petits ARNs non codants, les microARNs (miARNs), ont été identifiés. Détectables dans le plasma, certains sont spécifiques d’un tissu et ont été proposés comme de potentiels biomarqueurs de lésions tissulaires. Toutefois, leur intérêt dans le diagnostic des lésions musculaires chez l’individu sain n’est pas connu. Le but de ce travail était d’identifier et de caractériser la réponse des miARNs circulants à des lésions musculaires chez le rat.Nous avons premièrement étudié les profils plasmatiques des miARNs en réponse à des lésions musculaires myotoxiques chez le rat sain pour identifier des candidats biomarqueurs et leurs cinétiques de détection. Un criblage par RT-qPCR nous a conduits à identifier l’augmentation importante des niveaux plasmatiques de miARNs spécifiques du tissu musculaire, miR-1-3p, -133a-3p, -133b-3p, -206-3p, -208b-3p et -499-5p avec un pic de détection à 12 h. De plus, deux miARNs non spécifiques du muscle, miR-378a-3p et miR-434-3p, avaient des profils comparables. L’évaluation des performances diagnostiques a montré que les miARNs sélectionnés pouvaient discriminer les rats lésés des rats non lésés avec peu d’erreurs et une approche combinatoire nous permettait d’améliorer encore ces performances. Ces résultats ont été confirmés chez des rates femelles et des rats mâles âgés. Par ailleurs, nous avons évalué la robustesse des miARNs que nous avons sélectionnés. Malgré des profils d’expression différents des miARNs dans les fibres lentes ou rapides, le phénotype du muscle lésé avait une influence limitée sur la réponse des miARNs. Nous avons ensuite observé que la lésion d’une masse musculaire croissante ne s’accompagnait pas d’une réponse proportionnelle des miARNs circulants. Les miARNs sélectionnés n’augmentaient pas en réponse à des lésions musculaires traumatiques. Néanmoins, nous avons observé que miR-133a-3p et -133b-3p pourraient être des marqueurs intéressant pour détecter un remodelage musculaire précoce après des lésions neurologiques. Enfin, l’hémolyse et la contamination plaquettaire, deux paramètres préanalytiques connus pour induire des modifications des profils circulants, n’avaient pas d’effet sur les miARNs que nous avions identifiés.Pris dans leur ensemble, nos résultats montrent que les miARNs circulants spécifiques du muscle ainsi que miR-378a-3p et miR-434-3p, sont des biomarqueurs robuste et prometteur de lésions musculaires aigues chez le rat. / Skeletal muscle damage is an often-occuring event. Diagnosis is based on blood biomarkers assessment. Yet, the markers currently available suffer limitations and new biomarker candidates are needed. Recently, small non-coding RNA, microRNAs (miRNAs), were identified. Detectable in plasma, some miRNAs are tissue-specific and have been proposed as biomarkers of tissue damage. However, their relevance as biomarkers of skeletal muscle damage in healthy individuals is unknown. The aim of this work was to identify and characterize the circulating miRNAs response to muscle damage in rats.First, we studied circulating miRNAs response to myotoxic muscle damage in healthy rats in order to identify biomarker candidates and their detection kinetics. RT-qPCR profiling led to the identification of muscle-specific miRNAs that subtantially increased in plasma in response to muscle damage, namely miR-1-3p, -133a-3p, -133b-3p, -206-3p, -208b-3p, and -499-5p with a peak value at 12 h. Two non-muscle-specific miRNAs, miR-378a-3p and miR-434-3p, had similar profiles. The evaluation of the diagnostic accuracy has shown that selected miRNAs were able to discriminate damaged from non-damaged rats with almost no error and a combinatory approach was able to further increase this accuracy. Similar results were found in female and aged rats. Moreover, we sought to evaluate the robustness of selected miRNAs. Despite diferente expression of selected miRNAs in slow and fast fibers, the phenotype of injured muscle had a very limited influence on the plasma miRNA response. Then, we induced muscle damage in an increasing muscle mass and we observed that damage responsive miRNA response was not proportional to the extent of muscle damage. Selected miRNAs did not increased in response to traumatic muscle damage. However, we observed that miR-133a-3p et -133b-3p could be useful markers to detect an early muscle remodeling following neurologic damage. Finally, hemolysis and platelet contamination, two pre-analytical factors known to affect circulating miRNA profiles, had no effect on the miRNAs we selected.Taken together, our results show that circulating muscle-specific miRNAs as well as miR-378a-3p and miR-434-3p, are robust and promising biomarkers of acute muscle damage in rats.