Schlafen 11 (SLFN11) est une ADN/ARN hélicase décrite pour la première fois pour son rôle dans le développement et la différenciation des thymocytes chez la souris. Elle fait partie d'une famille de protéines présentant divers degrés d'homologie entre les espèces, mais qu’est présente de façon constante chez les mammifères. Le rôle de cette ADN/ARN hélicase, SLFN11, a été associé de façon causale à la sensibilité de réponse aux différents agents alkylants (agents endommageant l'ADN, les inhibiteurs de topo-isomérase I et II) dans le NCI-60. Dans la première étude, nous avons développé un protocole d’immunohistochimie (IHC) sur des biopsies paraffinées de carcinome séreux de l'ovaire de haut grade (HGSOC), afin de valider un anticorps (Ab) anti-SLFN11 et d’en déterminer l'expression. En IHC, nous avons testé et validé un Ab anti-SLFN11, en choisissant entre deux anti-SLFN11 Ab utilisés normalement pour le Western Blot. Premièrement, il a été développé dans une culture cellulaire (CCB) de HGSOC et, successivement, dans une série indépendante de micro-array (TMA) de HGSOC. Pour chaque cas, nous avons évalué soit le score d'intensité (IS) que le score de distribution (DS) en évaluant au moins 300 cellules. Un score histologique (HS) a été obtenu comme suit : HS=IS x DS. Successivement, nous avons appliqué notre protocole à une plus large série d'échantillons de HGSOC pour confirmer nos résultats préliminaires. Nous avons trouvé un anticorps fiable dans les séries CCB et TMA permettant de déterminer l'expression IHC de SLFN11. Ces résultats ont été confirmés dans notre plus large série de HGSOC. Brièvement, comme pour les séries indépendantes de TMA, nous avons constaté que la HS de l'expression de SLFN11 est présente dans environ 60%. En parallèle, le SLFN11 n'a pas été exprimé dans 40 % des cas qui, cliniquement, correspondent, dans environ 60 % de ces cas (16/27), aux patients résistant aux sels de platine. Une faible expression de SLFN11 en IHC pourrait être corrélée à la réponse à la chimiothérapie(CT) à base de platine. Dans la deuxième étude, nous étudions l’état transcriptionnel du SLFN11 dans le cancer du sein en effectuant une méta-analyse de plus de 7000 cas à partir de 35 étudies publiquement disponibles. Par l’analyse de corrélation, nous avons identifié 537 transcrits qui corrèle, au-delà du 95e percentile selon le coefficient de Pearson, avec l’expression de SLFN11. En particulier, voie l’analyse par “Gene Ontology” SLFN11 est lié au transcrits impliqués dans le système immunitaire : "réponse immunitaire", "l’activation lymphocytaire" et "l’activation des lymphocytes T". En outre, voie le “likehood lasso regression ”, nous avons signalé une très forte association entre le SLFN11 et les signatures immunitaires dans le cancer du sein. Enfin, grâce à la “multiple corresponded analysis ”, nous avons découvert un sous-groupe de patients, défini "SLFN11-Hot cluster", caractérisé par une expression élevé de SLFN11, récepteurs d'œstrogènes(ER) négatives, un phénotype basal, un jeune âge, une signature élevée de CD3D et de STAT1. En utilisant la "Cox proportional hazard regression", l’expression élevé de SLFN11, l’indice de prolifération élevé et le ER négative sont des paramètres indépendants lié à la survie sans maladie chez les patients soumises à la CT. Notre deuxième travail decrit un rôle spécifique pour le SLFN11 dans le cancer du sein probablement en relation avec la modulation du système immunitaire et une forte corrélation entre l’expression de SFLN11 et un sous-type moléculaire spécifique de cancer du sein (récepteurs négatifs aux œstrogènes, phénotype de type basal). Autres études devront être réalisées afin de: 1) mieux comprendre la fonction du SLFN11 dans les cellules cancéreuses, 2) valider un protocole IHC fiable et standardisé pour évaluer l’expression de SLFN11, 3) utiliser SFLN11 comme biomarqueur prédictif de réponse aux DDA et PARP inhibiteurs et 4) établir sa relation avec le système immunitaire / Schlafen 11 (SLFN11) is a putative DNA/RNA helicase, first described for its role in thymocyte development and differentiation in mouse models. SLFN11 is part of a family of proteins with various degree of homology across species, but intriguingly being consistently present only in vertebrates and especially in mammals. Recently, the role of this putative DNA/RNA helicase, SLFN11, was causally associated with sensitivity to DNA damaging agents, such as platinum salts, topoisomerase I and II inhibitors, and other alkylators in the NCI-60 panel of cancer cell lines. In the first study, we validate an anti-SLFN11 antibody in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) high-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) samples, developing an immunohistochemistry (IHC) protocol in order to determinate the expression of SLFN11 in our series of HGSOC. Indeed, we tested and validated a reliable SLFN 11 antibody (Ab) in IHC choosing between two anti-SLFN11 Ab used normally for Western Blot (WB) in culture cell block (CCB) of ovarian carcinoma and in an independent series of HGSOCs tissue micro-array (TMA). For each case, we evaluated both the Intensity Score (IS) and the Distribution Score (DS) evaluating at least 300 cells. A Histological Score (HS)was obtained as follow: HS=IS x DS. Successively, we applied our protocol to a large case series of HGSOC samples to confirm our preliminary results. We found one antibody to be reliable in CCB and TMA series allowing to determinate clearly IHC expression of SLFN11. These results were confirmed in our large case series of FFPE HGSOC samples. Briefly, as for TMA independent series, we found that the HS for SLFN11 expression presents a normal distribution with a prevalent (≈ 60%) intermediate expression. Parallel SLFN11 was not expressed in practically 40% of cases that clinically corresponded to the platinum resistant patients in about 60% of cases (16/27). So, we believe that low IHC expression of SLFN 11 should be correlated to response to the platinum-based chemotherapy. In the second study, we investigate the transcriptional landscape of SLFN11 in breast cancer performing a gene expression microarray meta-analysis of more than 7000 cases from 35 publicly available data sets. By correlation analysis, we identified 537 transcripts in the top 95th percentile of Pearson’s coefficients with SLFN11 identifying “immune response”, “lymphocyte activation” and “T cell activation” as top Gene Ontology enriched processes. Furthermore, we reported very strong association of SLFN11 with immune signatures in breast cancer through penalized maximum likelihood lasso regression. Finally, through multiple corresponded analysis we discovered a subgroup of patients, defined “SLF11-hot cluster”, characterized by high SLFN11 levels, estrogen receptor(ER) negativity, basal-like phenotype, elevated CD3D, STAT1 signature, and young age. Using Cox proportional hazard regression, we characterized that SLFN11 high levels, high proliferation index, and ER negativity are independent parameters for longer disease-free interval in patients undergoing chemotherapy. We believe that our second work supports proof of concept that: i) A clear and specific role for SLFN11 in breast cancer, in likely connection with the immune system modulation in such disease entity, ii) a strong correlation between high SFLN 11 and specific molecular subtype of breast cancer (estrogen receptor negativity, basal-like phenotype). Further studies will be performed to confirm our hypothesis in order to: 1) better understand the function of SLFN 11 in cancer cell, 2) validate an easy, reliable and standardized IHC protocol to assessment SLFN11, 3) use SFLN11expression as a predictive biomarker of response to DDA and PARP inhibitors and 4) determinate the relationship with immune system

En France, la recherche contre le cancer est un enjeu majeur de santé publique. On estime notamment que le nombre de nouveaux cas de cancer a plus que doublé entre 1980 et 2012. L’hétérogénéité des caractéristiques tumorales, pour un même cancer, impose des défis complexes dans la recherche de traitements efficaces. Dans ce contexte, des espoirs importants sont placés dans la recherche de biomarqueurs prédictifs reflétant les caractéristiques des patients ainsi que de leur tumeur afin d’orienter le choix de la stratégie thérapeutique. Par exemple, pour les cancers colorectaux métastatiques, il est maintenant reconnu que l’ajout de cetuximab (un anti-EGFR) à la chimiothérapie classique (ici le FOLFOX4), n’apporte un bénéfice qu’aux patients dont le gène KRAS est non muté. Le gène KRAS est ici un biomarqueur prédictif binaire, mais de nombreux biomarqueurs sont le résultat d’une quantification ou d’un dosage. L’objectif de cette thèse est dans un premier temps, de quantifier la capacité globale d’un biomarqueur quantitatif à guider le choix du traitement. Après une revue de la littérature, une nouvelle méthode basée sur une extension des courbes ROC est proposée, et comparée aux méthodes existantes. Son principal avantage est d’être non paramétrique, et d’être indépendante de l’efficacité moyenne des traitements. Dans un second temps, lorsqu’un biomarqueur prédictif quantitatif est étudié, la définition d’un seuil de marqueur au-delà duquel la première option de traitement sera préférée, et en-deçà duquel la deuxième option de traitement sera préférée se pose. Une approche reposant sur la définition d’une fonction d’utilité est proposée permettant alors de tenir compte de l’efficacité des traitements ainsi que de leur impact sur la qualité de vie des patients. Une méthode Bayésienne d’estimation de ce seuil optimal est proposée / In France, the cancer research is a major public health issue. The number of new cancer cases nearly doubled between 1980 and 2012. The heterogeneity of the tumor characteristics, for a given cancer, presents a great challenge in the research of new effective treatments. In this context, much hope is placed in the research of predictive (or treatment selection) biomarkers that reflect the patients’ characteristics in order to guide treatment choice. For example, in the metastatic colorectal cancer setting, it is admitted that the addition of cetuximab (an anti-EGFR) to classical chemotherapy (the FOLFOX4), only improve the outcome of patients with KRAS wild-type tumors. In that context, the KRAS gene is a binary treatment selection marker, but plenty of biomarkers result from some quantifications or dosage measurements. The first aim of this thesis is to quantify the global treatment selection ability of a biomarker. After a review of the existing litterature, a method based on an extension of ROC curves is proposed and compared to existing methods. Its main advantage is that it is non-parametric, and that it does not depend on the mean risk of event in each treatment arm. In a second time, when a quantitative treatment selection biomarker is assessed, there is a need to estimate a marker thereshold value above which one treatment is preferred, and below which the other treatment is recommended. An approach that relies on the definition of a utility function is proposed in order to take into account both efficacy and toxicity of treatments when estimating the optimal threshold. A Bayesian method for the estimation of the optimal threshold is proposed

La maladie de Fabry est une maladie génétique lysosomale causée par une mutation dans le gène GLA codant pour la protéine alpha-galactosidase A. Cette déficience a pour effet de mener à l’accumulation de plusieurs métabolites dans les liquides biologiques et différents organes. Les patients présentent, entre autres, de l’acroparesthésie, des angiokératomes, des problèmes ophtalmologiques, ainsi que des problèmes rénaux, cardiaques et du système nerveux central pouvant mener à une mort prématurée, si le patient n’est pas traité. Afin de permettre un dépistage, un diagnostic et un suivi adéquat des patients, plusieurs biomarqueurs spécifiques à la maladie sont utilisés. Présentement, le dépistage à haut risque est fait à l’aide du globotriaosylcéramide (Gb[indice inférieur 3]), du globotriaosylsphingosine (lyso- Gb[indice inférieur 3]) et de ses analogues. Toutefois, il arrive que ces biomarqueurs ne soient pas retrouvés en quantité élevée chez certains patients, d’où l’intérêt de continuer les investigations pour trouver d'autres biomarqueurs qui seraient plus spécifiques face à la sévérité et à la progression de la maladie. Une récente étude métabolomique effectuée par spectrométrie de masse en temps de vol a mis en évidence la présence de plusieurs biomarqueurs qui n’avaient pas encore été identifiés chez les patients Fabry. Parmi ceux-ci, se trouve une classe de biomarqueurs appelés les isoformes méthylés du Gb[indice inférieur 3] (masse/charge (m/z): 1150, 1148, 1122, 1120, 1094, 1066, and 1038). Ceux-ci présentent un intérêt particulier puisqu'ils semblent faire partie de la voie métabolique entre le Gb[indice inférieur 3] et le lyso-Gb[indice inférieur 3]. Les objectifs de ce projet sont donc: 1) de développer et de valider une méthode d’analyse quantitative des isoformes méthylés et non-méthylés du Gb[indice inférieur 3] et de la créatinine urinaire par spectrométrie de masse en tandem; 2) de doser ces biomarqueurs sur une large cohorte de patients atteints de la maladie de Fabry et de contrôles sains; 3) de comparer la concentration des isoformes méthylés du Gb[indice inférieur 3] urinaire avec la concentration de Gb[indice inférieur 3] non- méthylés et; 4) d’identifier s’il y a des corrélations entre lesdits biomarqueurs quantifiés et l’âge, le sexe, le traitement et le génotype des patients. Une méthode de quantification par spectrométrie de masse en tandem a été développée et validée, en multiplex avec la créatinine urinaire. En plus d’avoir le potentiel d’aider au dépistage à haut risque, ces biomarqueurs ont permis d’établir des corrélations avec la réponse au traitement et nos résultats montrent qu’ils sont anormalement excrétés chez les patients portant la mutation à variante cardiaque p.N215S, pour qui les niveaux de Gb[indice inférieur 3] non-méthylés sont habituellement normaux.

En recherche clinique ou environnementale, les biomarqueurs protéiques présentent un intérêt croissant. Bien que les immuno-dosages restent les méthodes de référence pour leur quantification, les récentes avancées en spectrométrie de masse (MS) font de cette technique une alternative crédible à l’ELISA. Ce travail apporte quelques éléments méthodologiques pour repousser certaines limitations de la MS. D’abord, deux dosages ont été proposés. Celui réalisé chez G. fossarum représente le premier exemple de dosage de la Vitellogénine chez un invertébré par LC-MS/MS. L’un des défis de la méthode présentée est de doser spécifiquement une protéine dans un organisme dont le génome est majoritairement inconnu. Le second dosage concerne les peptides contenant une méthionine. Nous avons développé un protocole d’oxydation des méthionines afin de s’affranchir du biais lié à leur oxydation partielle. Cette méthode a ensuite été appliquée à une protéine impliquée dans la maladie d’Alzheimer (l’Apolipoprotéine E4) dans une cohorte de 673 plasmas. Ce dosage est à ce jour l’une des plus grandes études réalisées par LC-MS/MS et montre toute la robustesse de cette approche. Enfin, l’influence de la phase mobile sur la sensibilité des dosages de peptides a été étudiée : d’abord en phase inverse, où le méthanol est une bonne alternative à l’acétonitrile ; ensuite en HILIC, où les difficultés liées à l’étude d’ions multichargés en milieu majoritairement organique ont été abordées. Les problèmes liés à la capacité de charge des colonnes ont également été soulevés. La chromatographie HILIC reste prometteuse pour la quantification de peptides puisqu’un facteur dix en sensibilité peut être apporté. / Both in clinical and environmental research, protein biomarkers are of growing interest. Although immunoassays are the gold standard for their quantification, recent advances in mass spectrometry (MS) make this technique a viable alternative to ELISA. This work provides some methodological elements to eliminate some limitations of the MS approach. First, two assays have been proposed. The first one achieved for G. fossarum represents the first example of quantification of vitellogenin in an invertebrate by LC-MS/MS. One of the challenges of the presented method is to specifically assay a protein in an organism whose genome is largely unknown. The second assay relates to methionine-containing peptides. A protocol was developped for total oxidation of methionines in order to overcome the bias due to their partial oxidation. This method was then applied to a protein involved in Alzheimer's disease (Apolipoprotein E4) in a cohort of 673 plasma samples. This assay is to date one of the largest study carried out by LC-MS/MS and shows all the robustness of this approach. Lastly, the influence of the mobile phase on the sensitivity of peptides assays was studied: first in reversed phase, where methanol is a good alternative to acetonitrile; then in HILIC, where the difficulties associated with the study of multicharged ions in a mainly organic content were discussed. Problems related to the carrying capacity of the columns were also raised.

Il existe une variabilité interindividuelle de la relation dose - effet chez les patients atteints de maladies inflammatoires rhumatismales traités par les inhibiteurs du Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-a). Dans la première partie de cette thèse, la physiopathologie du TNF-a dans le processus inflammatoire est présentée. Ensuite, le travail se concentre sur la relation concentration-effet en utilisant la modélisation pharmacocinétique-pharmacodynamique (PK-PD) modèles. À la fin, après une discussion sur les biomarqueurs d'imagerie, la thèse traite de l'utilité d'une nouvelle technique permettant de détecter la réponse précoce au traitement, à savoir la tomographie par émission de positons (TEP). En résumé, ce travail décrit la relation PK-PD dans les maladies inflammatoires rhumatismales traitées par anticorps monoclonaux en utilisant les marqueurs cliniques et biologiques, et démontre également l'influence de fortes concentrations d'anticorps monoclonaux pour la maintenance au traitement. La TEP est une technique prometteuse pour identifier la réponse précoce aux antagoistes du TNF-a. / There is an interindividual variability of the dose - response relationship in patients with inflammatory rheumatic diseases treated by Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-a) inhibitors. In the first part of this thesis, the pathophysiology of TNF-a in inflammatory processes is presented. Then, the work focuses on the concentration-effect relationship using pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) models. At the end, after discussion on imaging biomarkers, the thesis discusses the usefulness of a new technique to detect the early response to treatment, namely the positron emission tomography (PET). In summary, this work describes the PK-PD relationship in rheumatic inflammatory diseases treated by monoclonal antibodies using clinical and biological markers and demonstrates also the influence of high concentrations of monoclonal antibodies on maintenance to treatment. PET is a promising technique to identify early response to TNF-a antagonists.

Identifier rapidement des microorganismes pathogènes dans des échantillons environnementaux est un enjeu majeur dans le domaine de la biodéfense. Dans ce contexte, la spectrométrie de masse MALDI-TOF peut offrir une réponse simple, rapide et peu coûteuse. L'enjeu de la thèse, dans le cadre du projet ANR franco-allemand GEFREASE, a été de développer des méthodes permettant l'identification des microorganismes pathogènes et notamment de mettre en place des approches ciblées pour la préparation d'échantillon à l'aide d'anticorps en amont de la spectrométrie de masse. Dans un premier temps, l'étude du protéome de la bactérie modèle, Francisella tularensis subsp. holarctica LVS, responsable de la tularémie, a permis d'identifier les protéines et les peptides les plus abondants donnant un signal intense par spectrométrie de masse. Ensuite l'étude protéogénomique de douze protéines cibles a permis de choisir trois biomarqueurs dont le profil des masses par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (approche top-down) est spécifique de l'espèce et de la sous-espèce des bactéries du genre Francisella. Par cette méthode la virulence d'une souche est donc rapidement déterminée puisqu'elle est dépendante de la sous-espèce à laquelle la bactérie appartient. Ce test mis au point présente l'avantage d'être simple et rapide. Dans un deuxième temps, la mise au point d'un protocole d'enrichissement de la bactérie modèle par immunocapture magnétique a permis de montrer qu'il est possible de concentrer des bactéries grâce à des billes magnétiques couplées à des anticorps dirigés contre la bactérie entière. Cette approche a été expérimentée dans le cas de mélanges de bactéries où la bactérie modèle était largement minoritaire et dans des échantillons de matrices alimentaires diverses telles que de l'eau minérale ou du lait. La méthodologie a été validée sur un agent de classe 3, Francisella tularensis subsp. tularensis. / The rapid identification of pathogenic microorganisms in environmental samples is a major issue in the biodefense field. MALDI-TOF mass spectrometry can offer a fast, straightforward and inexpensive answer. In the framework of the Franco-German ANR project GEFREASE, the purpose of the thesis was to develop methodologies allowing identification of pathogenic microorganisms and particularly to set up targeted approaches using antibodies for sample preparation beforehand mass spectrometry. First of all, the proteome study of Francisella tularensis subsp. holarctica LVS, responsible for tularemia, allowed us to identify the most abundant proteins and peptides, and for which the most intense signals are observed when using mass spectrometry. The proteogenomic study of twelve of these proteins enable us to choose three biomarkers for which the masses monitored by MALDI-TOF mass spectrometry (top down approach) allow deciphering the Francisella species and subspecies. The interest of this work is being able to conclude on a strain virulence based on the knowledge of the subspecies it belongs. The finalized test is easy and fast. Secondly, the development of a magnetic immunocapture of Francisella tularensis subsp. holarctica LVS allowed us to show that it is possible to concentrate bacteria using magnetic beads coupled to antibodies raised against the entire bacterium. This approach has been experimented in the case of bacterial mixtures where the model bacterium was largely in minority and for samples containing various food matrices such as mineral water or milk. The methodology has been validated on a class 3 agent, Francisella tularensis subsp. tularensis.

L’escarre est une pathologie liée à l’immobilité des patients, accidentelle ou associée à des comorbidités. Les premières lésions apparaissent dans le muscle avant de se développer en plaie cutanée sans que les mécanismes physiopathologiques de cette atteinte ne soient encore connus. L’objectif principal de cette thèse était d’identifier des voies de signalisation intervenant de manière précoce dans le développement des escarres au travers d’une étude transversale. Nous formulons l’hypothèse qu’une compression musculaire induit une altération de l’homéostasie calcique musculaire par atteinte des canaux calciques du réticulum sarcoplasmique (les récepteur de la ryanodine de type 1, RyR1) conduisant à la lésion du tissu musculaire et une inflammation du tissu sous-cutané.Sur un modèle animal de compression de 2 heures, à 100 mmHg, nous avons identifié une initiation des voies apoptotiques et une augmentation du stress oxydant des muscles de la paroi abdominale. Le RyR1 y est hyper-nitrosylé et hyper-oxidé et sa protéine régulatrice, calstabin1 se dissocie sous l’action de ce remodelage, ce qui entraîne une fuite calcique du réticulum sarcoplasmique vers le cytosol. Cette dysfonction n’est pas réversible à 3 jours post-compression mais il est possible de la prévenir en traitant les souris avec un rycal qui bloque la déplétion de la calstabin1. En clinique, chez une cohorte de patients paraplégiques, porteurs d’escarres, nous avons identifiés un remodelage du RyR1 dans les muscles paralysés (comparaison intra patient avec une biopsie saine) et une hypoxie des tissus sous la lésion médullaire. La dissociation de la calstabin1 au RyR1 a pu être corrélée à la pression moyenne et maximale exercée sur la peau de la zone sacrée du patient allongé en regard du muscle biopsié.Ce travail de thèse a permis de préciser les voies de signalisation intervenant de manière précoce dans le développement des escarres dans le muscle squelettique. Une compression mécanique induit une augmentation du stress oxydant, un remodelage du RyR1 et une dysfonction du canal à cause de la perte de l’interaction RyR1/calstabin1. Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes sur des traitements préventifs pharmacologiques et de suivi non-invasif qui permettront de retarder l’apparition des premières lésions musculaires. / Pressure ulcer is a pathology related to patient immobility, which can be either accidental or incidental to comorbidities. The first damage are located in muscle tissue before developing in cutaneous breakdown per an unclear pathophysiology. The core objective of my PhD was to identify the early signaling pathways involved in pressure ulcer development, through a transversal study. We hypothesized that muscle compression will induce a calcium imbalance in muscles by a dysfunction of calcium channels from the sarcoplasmic reticulum (Ryanodine receptor isoform 1, RyR1) which will lead to muscle damage and sub-cutaneous inflammation.Mice model of a 100 mmHg, 2 hours compression of abdominal muscles was used to identify the apoptotic pathway initiation and a rise of oxidative stress. RyR1 is hyper-nitrosylated and hyper-oxydated thus this remodeling induces depletion of RyR1 stabilizing protein, calstabin1, and the resulting leaky phenotype increases intracellular calcium concentration. This channel functional impairment was not reversible up to 3 days post-compression but it was possible to prevent it through rycal treatment, protecting the binding calstabin1/RyR1. In a clinical trial, we identified from a paraplegic population with existing pressure ulcers, a RyR1 remodeling in paralyzed muscles (intra patient comparison with a healthy muscle biopsy) and a hypoxia of tissues below the spinal cord injury. Calstabin1 dissociation was correlated to the mean and peak pressure intensity of interface pressure applied over the sacrum skin of the bedridden patient directly above the biopsy location.This thesis project focused on early signaling pathways participating in pressure ulcer in skeletal muscle. A mechanical strain induces an increase of the intracellular redox state, post translational RyR1 modifications and a channel dysfunction because of calstabin1 depletion. The significance of my work is to propose both pharmacology and non-invasive monitoring solutions to prevent first muscle damage in pressure ulcer development.

Ce travail de thèse fait partie d’un effort pour le développement des biomarqueurs, actuellement largement inexistants, pour une meilleure classification, pour une détermination plus précise du pronostic, et pour la prédiction de la réponse au traitement des tumeurs gliales malignes de l’enfant (épendymomes et gliomes de haut grade). Dans certains cas, ces biomarqueurs peuvent aussi devenir des cibles thérapeutiques.Dans ces études, nous avons pu montrer que la surexpression fréquente des marqueurs neuronaux distingue les épendymomes supratentoriels des formes infratentorielles. Parmi les épendymomes supratentoriels, une forte expression de neurofilament 70 (NF) est corrélée avec une meilleure survie sans récidive. La tenascine C (TNC) est surexprimée dans les épendymomes infratentoriels. Une étude de collaboration européenne multi-institutionnelle a été mise en place, permettant d’analyser une cohorte pédiatrique de 250 patients atteints d’un épendymome, et de démontrer la forte immunoexpression de TNC comme un marqueur robuste, associé a des survies globale et sans récidive plus péjoratives, particulièrement parmi les enfants âgés de moins de trois ans. Ceci a été validé dans une cohorte indépendante. Des immunomarquages pour NF et TNC pourraient être utilisés en clinique pour aider à déterminer le pronostic des épendymomes chez l’enfant.Une analyse des marqueurs pour la prédiction de la réponse à une thérapie ciblée anti-EGFR (erlotinib) a été réalisée par imunnohistochimie et FISH. La perte fréquente de PTEN dans les gliomes infiltrants du tronc cérébrale et la confirmation des caractéristiques des certains sous groupes (avec une forte expression de EGFR ou avec une différentiation oligodendrogliale) nous a permis de dessiner le protocole pour la prochaine étude de phase III pour cette maladie dans le cadre d’un futur essai thérapeutique de phase I/II. Nous rapportons par ailleurs des mutations du gène PI3KCA dans certains gliomes infiltrants du tronc cérébral, qui comme la perte d’expression de PTEN pourrait entrainer une activation de la voie mTOR qui devient donc une cible thérapeutique majeure théorique dans cette maladie. Des études ultérieures seront nécessaires pour définir le rôle de l’interaction entre la perte de PTEN, la surexpression de EGFR, la différentiation oligodendrogliale, les mutations de PI3KCA et d’autres altérations récemment décrites, (gains et amplifications de PDGFRA/MET mutations de TP53) et leur relation avec le devenir des patients sous traitement ciblé et les thérapies ciblées les plus intéressantes dans cette maladie uniformément fatale.Ce travail de thèse nous a permis d’explorer le rôle de la pathologie moléculaire dans la prise en charge des épendymomes et gliomas de haut grade chez l’enfant. / Biomarkers for the classification, clinical management and prognosis of pediatric brain tumors (ependymoma and high grade glioma, (HGG)) are lacking. To address this, biomarkers were developed and explored in view of classification, prognostication, target identification and prediction of the efficacy of treatment for patients with such tumors.We show that overexpression of neuronal markers distinguishes supratentorial from infratentorial ependymoma, and among the former higher immunoexpression of neurofilament 70 (NEFL) is correlated with better progression free survival (PFS). Tenascin-C (TNC) is significantly overexpressed in infratentorial ependymoma. A multi-institutional European ependymoma collaboration group was established and analyses were performed in a pediatric cohort of 250 patients, where immunohistochemistry (IHC) for TNC showed to be a robust marker of poor overall survival (OS) and PFS, particularly among children under 3 years, this being further validated in an independent cohort. Techniques and scoring performed in different laboratories were highly reproducible. IHC for NEFL and TNC could be used for prognostication of pediatric ependymoma.The analysis of putative predictive markers for the response to targeted therapies in pediatric HGG in the setting of a clinical trial with the anti-EGFR agent erlotinib was performed by IHC and fluorescent in situ hybridization. The frequent loss of PTEN in diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) and the confirmation of the biological singularity of the certain subgroups (expressing EGFR, displaying oligodendroglial differentiation) which seem to be associated with better response to erlotinib have helped our group to establish the design of the next Phase III protocol for this disease at our institution. We report mutations in PI3KCA constituting the first identification of oncogene mutations in some DIPG, which further highlight their biological heterogeneity. Further studies are needed to define the interaction between PTEN loss, EGFR overexpression, oligodendroglial differentiation, PI3KCA mutations and other recent findings such as PDGFRA/MET gains/amplification and TP53 mutations in these heterogeneous lesions and their relationship to the outcome of patients under new targeted therapies for this largely fatal disease.This thesis has allowed us to explore the molecular pathology in the context of biology and clinical setting of pediatric brain tumors.

Le vieillissement cardiaque est fortement associé à l’apparition d’une fibrose pouvant entrainer une dysfonction progressive du remplissage et de l’éjection ventriculaire. Le dépistage du remodelage et du vieillissement cardiovasculaire sont primordiaux afin de proposer des stratégies de prévention et de prises en charge spécifiques visant à retarder l’apparition ou ralentir la progression d’une insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Les outils cliniques, biologiques ou d’imagerie sont insuffisamment performants à l’heure actuelle pour dépister ces modifications précoces ou prédire l’apparition de remodelage ultérieur de façon efficace. La réalisation d’une méta-analyse avec revue de la littérature, nous a permis de montrer la valeur de la déformation myocardique comme marqueur du remodelage cardiovasculaire dans le post-infarctus, mais nous a aussi éclairé sur la complexité du phénomène et le manque de preuves sur sa potentielle valeur additionnelle en pratique clinique. Après avoir validé les différents outils de quantification du remodelage dans nos cohortes, nous avons montré l’importance d’une expertise précise de la morphologie et de la fonction cardiaque lors d’un évènement aigu pour prédire un remodelage ultérieur. Nous avons précisé le rôle de la déformation myocardique dans la quantification de la taille de l’infarctus, sa sévérité et son éventuelle extension au ventricule droit. Enfin, nous avons mis en relation les paramètres de contractilité et de fonction vasculaire en montrant la valeur du couplage ventriculo artériel mesuré en IRM. Ces travaux ouvrent la voie pour une stratégie d’évaluation d’imagerie précoce en post-infarctus pouvant orienter les thérapeutiques de revascularisation et/ou de réhabilitation / Cardiovascular aging is strongly associated with myocardial fibrosis and progressive LV systolic/diastolic dysfunction including vascular stiffening. Cardiac remodeling with left ventricular parietal stress and hypertrophy take place over several years and can ultimately lead to the occurrence of heart failure. Clinical, biological or imaging tools are currently insufficient to detect early changes or to predict the onset of subsequent remodeling in an effective manner. However, if subclinical structural and functional cardiac abnormalities are not detected by conventional echocardiographic techniques, they may be evaluated by others imaging tools with the measurement of myocardial deformation parameters. We performed a systematic review suggesting that deformation imaging is associated with left ventricular volume and function changes regardless the mechanisms and deformation direction. But added strain predictive value over other clinical, biological and imaging variables remains to prove. After validation of various remodeling indices, we proved the add value of a comprehensive assessment of ventricule geometry and function to evaluate remodeling after an acute event. We confirmed the central role of myocardial deformation for infarct size quantification and detect right ventricle extension. Finally, we used vascular function measured by MRI to demonstrate the relation between ventriculo-arterial coupling and remodeling. Further studies are needed to assess the gain in information provided by strain and these new biomarkers.

La dyspnée aigue due à une congestion pulmonaire dans le cadre d’une insuffisance cardiaque aiguë (ICA) est un motif d’admission fréquent aux Urgences. Actuellement, l’ICA est deux fois plus fréquente et est associée à un risque deux fois plus élevé de décès (8%) que les syndromes coronariens aigus (SCA). La prise en charge en pré hospitalier et aux urgences est devenue une étape clé du parcours de soin de ces patients. Ces dernières années ont vu émerger de nouveaux paradigmes autour de la prise en charge de l’ICA mettant en perspective la complexité de cette pathologie. On parle désormais de syndrome d’insuffisance cardiaque aiguë (SICA), terminologie qui souligne la pluralité des situations cliniques et la diversité des profils congestifs. Cependant, l’évaluation de la répartition de la congestion au cours d’un SICA, même s’il existe peu de données sur ce sujet, est actuellement principalement faite sur des arguments cliniques ; l’échographie pulmonaire et l’estimation du volume plasmatique (ePVS, basé sur un calcul intégrant hémoglobine et hématocrite) pourraient permettre de mieux préciser les profils congestifs. Plusieurs études rapportent que la rapidité et l’exactitude du diagnostic étiologique de dyspnée aigue sont associées au pronostic des patients. Malgré l’existence d’outils diagnostiques (biomarqueurs, examens de radiologie), l’incertitude quant au diagnostic étiologique reste importante dans le contexte d’un service d’urgence, ce qui rend difficile la diminution du « Time to therapy » promue par les recommandations de la société européenne de cardiologie 2016. Les objectifs de notre travail étaient d’identifier des profils de congestion distincts d’insuffisance cardiaque aigue, de préciser la valeur diagnostique et pronostique de ces profils dans le contexte d’une dyspnée aigue, et de déterminer si l’effet thérapeutique des modalités de prise en charge initiale en urgence est dépendant de ces profils congestifs. Dans le cadre de notre travail, nous avons pu montrer sur la base des analyses réalisées dans la cohorte DeFSSICA que les outils permettant de mieux préciser le profil congestif des patients (notamment l’échographie pulmonaire et l’ePVS) sont peu utilisés aux urgences. Dans un deuxième travail, nous avons montré sur la cohorte PARADISE (NCT02800122) – conçue dans le cadre de ce doctorat, que l’altération de fonction rénale, l’hyponatrémie et la dysglycémie sont associée de façon significative au pronostic des patients atteints de dyspnée aigue. Dans un troisième travail, nous avons montré que le volume plasmatique estimé est un outil diagnostique performant de SICA et qu’un niveau plus important de congestion évaluée par l’ePVS est associé à une mortalité intra-hospitalière des patients admis pour dyspnée aigue plus élevée. Notre travail a aussi permis de concevoir et démarrer l’étude PURPLE (Pathway and Urgent caRe of dyspneic Patient at the emergency department in LorrainE district – NCT NCT03194243) qui collecte les données cliniques et paracliniques des patients admis pour dyspnée aigue aux urgences de façon prospective dans la région Lorraine. Par ailleurs, ce travail de thèse a aussi permis de concevoir et faire financer le projet EMERALD-US (Evaluation de la faisabilité de la Mise en œuvre et de la performance d’un algorithme d’EchogRraphie Aux urgences pour Le diagnostic de Dyspnée aigue-UltraSound) qui vise à valider un algorithme spécifique aux urgences utilisant l’échographie pulmonaire, cardiaque et vasculaire pour le diagnostic étiologique de dyspnée aigue / Acute dyspnea due to pulmonary congestion in acute heart failure (AHF) is a common reason for admission to the ER. Currently, AHF is twice as common and associated with a twofold higher risk of death (8%) than acute coronary syndromes (ACS). Pre-hospital and emergency care has become the cornerstone of care of these patients. In recent years, new paradigms have emerged surrounding AHF management, highlighting the complexity of this disease. Hence the use of the term acute heart failure syndrome (AHFS), a terminology underscoring the plurality of clinical situations and the diversity of congestive profiles. However, the assessment of congestion distribution during an AHFS is currently predominantly based on clinical arguments in spite of limited data. Alternatively, lung ultrasound (LUS) and estimation of plasma volume (ePVS, based on hemoglobin and hematocrit) could allow for a better assessment of congestive profiles. Several studies report that the rapid and accurate etiological diagnosis of acute dyspnea is associated with prognosis. Despite the availability of diagnostic tools including clinical exam, biomarkers and radiology, there is still considerable uncertainty regarding etiological diagnosis in the emergency department (ED) setting, hence rendering it difficult in reducing the « Time to therapy » advocated by the recommendations of the European Cardiology Society 2016 for AHF. The objectives of the present work were to identify distinct congestion profiles of AHF, to clarify the diagnostic and prognostic value of these profiles in the context of acute dyspnea, and to determine whether the therapeutic effect of initial emergency management modalities is dependent on these congestive profiles. In the course of our work, we were able to demonstrate in the DeFSSICA cohort that the tools allowing a better assessment of the patient's congestive profile (particularly LUS and ePVS) are rarely used in ED. In a second study, we showed in the PARADISE cohort (NCT02800122) - designed as part of this PhD research project - that impaired renal function, hyponatremia and dysglycemia are significantly associated with prognosis in patients with acute dyspnea. In a third study, we showed that the ePVS is an effective AHF diagnostic tool and that a higher congestion level assessed by ePVS is associated with higher in-hospital mortality of patients admitted for acute dyspnea. Our work also enabled us to design and initiate the PURPLE (Pathway and Urgent caRe of dyspneic Patients at the emergency department in LorrainE district - NCT03194243) study, which collects clinical and paraclinical data of patients admitted for acute dyspnea on a prospective basis. Lastly, this PhD research project enabled designing and obtain funding for the EMERALD-US project (Evaluation of the feasibility of implementing and performance of an Emergency Echography algorithm for the diagnosis of Acute Dyspnea-UltraSound) which aims to validate an original algorithm specific to emergency situations using lung, cardiac and vascular ultrasound for the etiological diagnosis of acute dyspnea