Mise en contexte : Le syndrome du X fragile (SXF) résulte de la perte d’expression de la protéine FMRP. L’absence de FMRP est responsable d’une série de perturbations signalétiques, notamment une hyperactivation de la voie MAPK/ERK. La lovastatine, un médicament hypocholestérolémiant, possède comme effet pléiotrope la capacité d’inhiber la voie MAPK/ERK et a permis de corriger certains phénotypes pathologiques clés du modèle murin du SXF, mettant en lumière son potentiel thérapeutique chez l’humain. Ainsi, nous avons réalisé en 2013 une étude ouverte visant à étudier l’effet d’un traitement de 12 semaines à la lovastatine sur les troubles cognitifs et comportementaux des enfants et des adultes avec SXF. La plupart des individus ont présenté des améliorations cognitives et comportementales, telles qu’évaluées par les échelles cliniques Vineland-II Adaptive Behavior Scale (VABS-II) et Aberrant Behavior Checklist-Community (ABC-C), respectivement. Ces échelles remplies par les tuteurs et les soignants sont toutefois évaluateur-dépendantes et sujettes à l’effet expérimentateur. Ces variables parasites, qui s’ajoutent à l’effet placebo inhérent à la conception ouverte de l’essai thérapeutique, peuvent ainsi avoir faussé l’évaluation de la réponse au traitement. Nous avons donc étudié si les cascades signalétiques des plaquettes sanguines peuvent être utilisées comme biomarqueurs objectifs pour surveiller la réponse au traitement. Méthode : Des échantillons sanguins des 15 individus SXF ayant participé à l’essai clinique ont été recueillis au début et à la fin de l’étude afin d’évaluer par Western Blot l’effet in vivo de la lovastatine sur l’activité de ERK dans les plaquettes sanguines, et ainsi de pouvoir corréler les réponses biologiques et cliniques. L’état de phosphorylation de ERK a également été étudié dans les plaquettes d’une cohorte contrôle. Résultats : Nos résultats démontrent une augmentation significative de près du double de la phosphorylation basale de ERK dans les plaquettes sanguines des individus avec SXF en comparaison avec les sujets contrôles (p=0,002). De plus, nous avons observé une normalisation de la phosphorylation de ERK chez 13 des 15 individus SXF après le traitement de 12 semaines à la lovastatine (p=0,007). Notre étude fournit ainsi les premières évidences d’un effet bénéfique de la lovastatine dans le SXF chez l’humain. Nous avons également démontré que les changements de la phosphorylation de ERK étaient partiellement corrélés à la réponse clinique, et ce, pour le score total et les scores des sous-domaines ‘socialisation’ et ‘compétences de la vie quotidienne’ de l’échelle VABS-II (p=0,003). Conclusion : De façon générale, ces résultats suggèrent que les cascades signalétiques plaquettaires peuvent être utilisées comme biomarqueurs pour évaluer de façon objective la réponse au traitement lors de futurs essais thérapeutiques. / Abstract: Background: Fragile X syndrome (FXS) results from loss of FMRP expression, which causes several signaling dysregulations, including the hyperactivation of the Mitogen-activated protein kinase (MAPK)/Extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway. Lovastatin, a drug used for the treatment of hypercholesterolemia, pleiotropically inhibits the MAPK/ERK cascade and has successfully corrected key pathological phenotypes in the FXS mouse model, underscoring its ‘disease-modifying’ potential. Thereby, we conducted in 2013 the first open-label clinical trial investigating the effect of a 12-week lovastatin regimen on cognitive and behavioral disabilities in FXS. Most individuals presented subtle positive cognitive changes as assessed by the Vineland-II Adaptive Behavior Scale (VABS-II) as well as behavior improvements using the widely used scale Aberrant Behavior Checklist-Community (ABC-C). The latter two scales are filled up by caregivers making them rater-dependent and prone to observer-expectancy effect. This might result in a placebo effect which is inherent to the open-label design of the trial. We therefore investigated whether blood platelets’ signaling cascades may be used as objective biomarkers to monitor treatment response. Methods: Blood samples were gathered from 15 FXS individuals during the trial in order to evaluate by quantitative Western Blotting the in vivo effect of lovastatin on ERK activity in blood platelets, and to correlate clinical and biological responses. The basal phosphorylation status of ERK was also assessed in platelets from a control cohort. Results: Our results showed a more than two-fold significant increase in FXS blood platelet basal ERK phosphorylation as compared to controls (p=0.002). Of note, we found that this hyperphosphorylation was normalized following the 12-week lovastatin trial (p=0.007) in 13 of the 15 FXS individuals enrolled in the trial. This represents the first evidence for a beneficial effect of lovastatin in human FXS. The extent of changes in ERK phosphorylation was also found to partly correlate with the clinical response scales’ scores, especially for the VABS-II. Indeed, the composite total score and the ‘daily living skills’ as well as the ‘socialization’ subscales scores of the VABS-II were correlated with the biological response (p=0.03). In comparison, no correlation was observed with the ABC-C scale. Conclusion: Broadly, these results suggest that platelets’ signaling cascades could be used as biomarkers to objectively assess treatment response during future clinical trials.

L'apport des biomarqueurs aux urgences est bien documenté. Depuis l'apparition de la myoglobine et de la troponine pour le diagnostic de syndrome coronaire aigu (SCA), de multiples marqueurs ont été développés pour l'aide au diagnostic de multiples pathologies aux urgences. Certains biomarqueurs sont même intégrés à la définition de syndromes ou pathologies comme le SCA avec la troponine, ou le sepsis sévère avec le lactate. Nous abordons dans ce travail l'approche multimarqueurs, qui consiste à combiner le dosage de plusieurs biomarqueurs pour améliorer les performances diagnostiques ou pronostiques. L'hypothèse de base de ce travail est que l'association d'un marqueur sensible, généraliste, avec un marqueur spécifique de pathologie ou de dysfonction d'organe, permettrait d'améliorer la prise en charge diagnostique ou la stratification du risque aux urgences. On illustre cette approche dans trois cas particuliers : la prédiction du sepsis sévère, le diagnostic du syndrome coronaire aigu, et l'évaluation du risque après une crise convulsive. Plusieurs méthodes sont envisagées pour combiner plusieurs biomarqueurs, et on développera ici la détermination de la meilleure combinaison linéaire pour obtenir une discrimination optimale. / The added value of biomarkers in the emergency settings is well reported, in various pathologies. Since the burst of myoglobin and troponine for the diagnosis of myocardial infarction (MI), various biomarkers have been developed and adopted for diagnostic purposes in different pathologies. Some of them are part of the very definition of specific syndrom or disease (MI with troponin, or severe sepsis with lactate). We present here the multimarker approach in the emergency department – a strategy that combines the results of several different biomarkers to enhance diagnostic or prognostic performances. We made the hypothesis that the association of a sensitive and generalist biomarker, with an organ or syndrome specific one, would result in better performances.We illustrate here this strategy in three particular cases: the prediction of severe sepsis, the diagnosis of acute coronary syndrome, and the risk stratification after a convulsive seizure. Several methods are considered for the combination of biomarkers, and we will focus on the determination of the best linear combination.

Le diagnostic de la maladie d’Alzheimer (MA) s’appuie sur des critères clinico-biologiques combinant un déficit de la mémoire épisodique et un marqueur biologique (dosage dans le liquide céphalorachidien, imagerie nucléaire) indicateur des changements qui signent le début de la maladie. Un phénomène biologique précoce de la maladie est la production de dépôts du peptide amyloïde dont le principal site de production à partir de son précurseur, l’APP, est le compartiment endosomal. L’apparition dans le cerveau d’endosomes élargis précède celle des dépôts amyloïdes.Nous avons analysé deux marqueurs biologiques. D’abord la charge amyloïde cérébrale par fixation du ligand [PiB] en tomographie d’émission de positrons (TEP) dans le cerveau des malades atteints d’une atrophie corticale postérieure (ACP). Puis nous avons étudié les endosomes dans les cellules périphériques (leucocytes mononucléaires et fibroblastes) de patients MA, et dans des lignées lymphoblastoïdes (LCL) d’individus porteurs d’une trisomie 21 dont 45% développent une MA à l’âge de 60 ans (contre 3 % dans la population générale), principalement en raison de la présence d’une troisième copie du gène codant l’APP, localisé sur le chromosome 21. Nos travaux montrent des profils de marquage [PiB] similaires entre la MA et l’atrophie corticale postérieure (ACP) aussi bien en intensité qu’en topographie. L’étude des endosomes montre que les modifications du compartiment endosomal sont détectables en périphérie du système nerveux central et sont corrélées au marquage des dépôts amyloïdes cérébraux. Ces altérations pourraient constituer un outil de diagnostic à partir de prélèvements sanguins. / Alzheimer’s disease (AD) diagnostic is based on clinical and biological criteria, and is dependent on impairment of the episodic memory together with a marker of the underlying pathophysiologic process. One of the earliest events in AD pathology in the brain is formation of Amyloid deposits in the extracellular space. One of the main subcellular sites of amyloid-β (Aβ) production from amyloid precursor protein (APP) processing is the endosomal compartment. Appearance of endosomal abnormalities precede the formation of amyloid deposits, in the brain areas affected by disease progression in AD. In the present work we first studied brain amyloid load in patients with posterior cortical atrophy using [11C]PiB ligand retention in positron emitting tomography (PET). In a second part we studied the endosomal compartment in peripheral cells (fibroblasts and mononuclear leucocytes, PBMC) from AD patients, and in lymphoblastoid cell lines (LCL) from Down’s syndrome (DS) individuals where a third copy of amyloid-precursor-protein-coding gene located on chromosome 21 is known to initiate early Alzheimer’s pathology in most DS individuals. Our work shows similar profiles in topography and intensity of [PiB] binding in AD and posterior cortical atrophy (PCA), confirming underlying AD pathology in atypical focal presentations of AD. Analysis of endosomes yielded a significant increase in the frequency of cells with large endosomes in all analyzed cell types, and mean endosome volume correlated to [PiB] binding in PBMC. This result indicates that modifications of the endosomal compartment are seen in the periphery of central nervous system and may represent diagnostic tool from blood.

L'acide alpha-linolénique (ALA, C18:3 n-3) est présent dans les membranes lipidiques des végétaux. Lors d'un stress oxydant, l'oxydation radicalaire non-enzymatique de cet acide gras polyinsaturé pourrait conduire à la formation de métabolites tétrahydrofuraniques nommés phytofuranes (PhytoFs). Souhaitant mettre en évidence leur existence et étudier leurs potentielles activités biologiques, nous avons développé une stratégie de synthèse divergente et flexible permettant d'accéder à ces métabolites de type PhytoFs. / Alpha-linolenic acid (ALA, C18:3 n-3) is the major polyunsaturated acid in plant membranes. During an oxidative stress, the non-enzymatic radical peroxidation of this acid would lead to tetrahydrofuran metabolites called phytofurans (PhytoFs). In order to bring into light their existence and to study their biological activities, we develop a divergent and flexible strategy to access to these metabolites.

La lutte contre des pathologies, notamment inflammatoires ou chroniques, nécessite de nouvelles stratégies pour proposer une médecine améliorée et personnalisée. La recherche de biomarqueurs répond à cette problématique. Un criblage innovant basé sur une molécule scavenger activée est décrit ici. En participant à l’élimination des éléments du non-soi ou du soi altéré, cette molécule scavenger activée a la capacité d’interagir avec les biomolécules qui sont à l’origine de la pathologie ou qui résultent du déséquilibre pathologique. Il est donc probable que les ligands de ce scavenger comptent une proportion importante de biomarqueurs. Ce criblage fonctionnel peut ainsi éclairer notre compréhension de la physiopathologie et même identifier de potentiels compagnons diagnostiques ou candidats médicaments. Cette approche est appliquée à l’hépatite C, une pathologie d’étiologie virale connue, et à la sclérose en plaques, une neuropathologie plus complexe. / The fight against pathologies, especially inflammatory or chronic ones, needs new strategies to propose an improved and personalized medicine. The search for biomarkers deals with this challenge. A novel screening system based on an activated scavenger molecule is described here. Due to its implication in the elimination of non-self and altered-self, this activated scavenger has the ability to interact with biomolecules that cause pathologies or that result from the pathological imbalance. It is therefore very probable that the ligands of this scavenger count a high proportion of biomarkers. This functional screening may then help understand the physiopathology and might even identify potential diagnostic companions or drug candidates. This approach is applied to Hepatitis C, a condition of known viral etiology, and to multiple sclerosis, a more complex neuropathology.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire auto-immune du SNC qui affecte 90 000 personnes en France et génère un coût important pour la société. La forme la plus fréquente (85% des cas) est la SEP récurrente-rémittente (RRMS) caractérisée par des poussées démyélinisantes entrecoupées de périodes de rémission après un syndrome cliniquement isolé (CIS). La conversion en RRMS après un CIS, caractérisée par une nouvelle poussée ou de nouvelles lésions sur les IRM de suivi, survient après un délai variant de quelques mois à plus de 10 ans (20% des cas, « SEP bénigne »). Les traitements disponibles (immunomodulateurs et immunosuppresseurs) ont une efficacité indéniable pour la prévention des poussées et doivent être initiés dès le diagnostic pour une efficacité maximale, surtout chez les patients montrant une conversion rapide en SEP après un CIS. Leur intérêt est en revanche négligeable pour les formes bénignes. Ainsi, il existe un besoin d’identifier des biomarqueurs pronostiques précoces de la SEP pour une prise en charge optimale des patients. Le but de ma thèse est d’identifier des biomarqueurs pronostiques de SEP en utilisant différentes approches de protéomique quantitative,. Dans un premier temps, nous avons utilisé des échantillons cliniques de LCR de patients. Ces travaux m’ont permis d’identifier, en protéomique quantitative utilisant un marquage chimique des peptides (TMT), plusieurs candidats biomarqueurs de SEP. Ceux-ci incluent deux chitinase-3-like protéines, CHI3L1 et CHI3L2 dont le taux mesuré en ELISA, dans le LCR, augmente avec l’évolution de la maladie. Ces travaux ont également démontré que la concentration sanguine de CHI3L1 constituait un biomarqueur de la progression de la maladie. Dans un second temps, nous avons combiné l’analyse du LCR de différents patients SEP et contrôles en protéomique Label-Free avec un modèle préclinique analysant les modifications du sécrétome d’oligodendrocytes murins en culture primaire par approche SILAC. Les biomarqueurs potentiels, 87 protéines correspondant à 226 peptides cibles, ont été ensuite vérifiés en protéomique quantitative ciblée ou parallel reaction monitoring (PRM), à l’aide de peptides marqués servant de référence. Les 11 candidats les plus discriminants issus de cette étape ont ensuite été vérifiés en PRM sur une cohorte plus large d’échantillons de patients. Finalement, 7 candidats ont montré un profil significatif au cours de cette première validation. Ces candidats biomarqueurs permettent notamment de discriminer les différentes formes évolutives de la SEP et de distinguer cette pathologie d’autres maladies inflammatoires et neurologiques. De plus, ces derniers pourraient avoir un intérêt prognostique permettant d’identifier les patients qui vont développer une SEP après la découverte fortuite de lésions typiques de la maladie à l’IRM. Ce travail de thèse a donc caractérisé de nouveaux biomarqueurs de SEP devant être validés sur de larges cohortes multicentriques de patients et ouvre de nouvelles perspectives sur la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la SEP. / Discovery, confirmation and verification of candidate biomarkers for multiple sclerosis diagnosis and prognosis in cerebrospinal fluid.Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory disease of the central nervous system. Most often the disease initiates by a first demyelinating event called clinically isolated syndrome (CIS), followed by remission periods and relapses occurring at irregular intervals. Clinical symptoms and MRI are used for diagnosis, but clinicians lack tools to predict the rate of disease progression. This study aims at identifying biomarkers that predict the delay of conversion to MS after a CIS. We compared the cerebrospinal fluid (CSF) proteome from MS patients and symptomatic controls and the CSF from CIS patients with rapid conversion to MS (<1 year) and CIS patients with slow conversion to MS (>2 years). For the discovery step, human CSF samples (n=40) depleted of the 20 major plasma proteins were digested using a modified filter-assisted sample preparation (FASP) and analysed by high-resolution mass spectrometry using isobaric mass tag labelling or label-free quantification procedures. Proteins upregulated in CSF from MS patients included two proteins involved in tissue remodeling, namely chitinase-3-like protein-1 (CHI3L1) and chitinase-3-like protein-2 (CHI3L2). Their increased level in CSF of MS patients was confirmed by ELISA in a new cohort comprising CIS and MS patients (n=123) at different disease stages. Moreover, CHI3L1 levels in CSF and serum from CIS patients discriminated patients with rapid conversion to MS (< one year) from those with slower conversion.We also implemented a PRM method (peptide selection, dilution optimization of heavy isotope labeled non-purified peptides, reproducibility evaluation and method validation) to qualify a larger set of candidate biomarkers (226 peptides corresponding to 87 proteins) in a cohort different from the one used for the discovery step (n=60), including CSF from controls and MS patients at different disease stages. Finally, to further verify the 11 candidate biomarkers that passed this qualification step, we monitored 16 peptides in a new PRM assay, using shorter gradient and high-purity heavy isotope labeled peptides. This new PRM analysis was performed on a larger cohort (n=189) that included CSF of patients with other inflammatory and non-inflammatory neurological disorders in addition to control and MS patients. These analyses identified seven robust candidate biomarkers, which might help to discriminate patients suffering from MS or other neurological disorders.

Pour développer des biomarqueurs permettant d'estimer l'état de santé des animaux et de prévoir les effets des contaminants sur les niveaux d'organisation biologique supérieurs, le métabolisme énergétique apparaît comme un candidat de choix. En effet, il participe à la mise en place de grandes fonctions comme par exemple la reproduction ou la croissance. L'altération des processus d'allocation énergétique par la contamination peut avoir des conséquences sur le devenir des individus et de leurs populations. L'objectif de ce travail est d'analyser en laboratoire les impacts potentiels de xénobiotiques (cuivre et éthofumésate) sur le métabolisme énergétique d'un cyprinidé, le gardon Rutilus rutilus, à travers l'étude des processus participant à la formation d'énergie cellulaire(ATP). L'effet des xénobiotiques sur l'état de santé général des juvéniles de gardons a d'abord été appréhendé, et peu d'impacts ont pu être observés sur les indices généraux mesurés. L'effet des contaminants sur la formation aérobie et anaérobie de l'énergie (glycolyse, ses substrats et produits) a ensuite été évalué. Si des différences d'effet des deux contaminants ont été observées au niveau moléculaire, ils ont tous deux induit une augmentation du métabolisme anaérobie au niveau biochimique. Enfin, l'impact des contaminants sur les fonctions mitochondriales a été appréhendé.Des atteintes ont été observées au niveau de la chaîne respiratoire et des ultra-structures des mitochondries, impliquant un effet sur l'énergie cellulaire disponible. Ce travail constitue la base du développement de nouveaux marqueurs précoces de troubles physiologiques des organismes utilisables en biosurveillance. / The energy metabolism constitutes an appropriate approach for the development of biomarkers allowing to estimate the health status of animals and to predict the effects of contaminants on higher levels of biological organization. Indeed, it participates in the establishment of key functions such as reproduction or growth. Alterations of energy allocation process by the contamination can affect the fate of individuals and populations. The aim of this study was to determine in laboratory the potentials effects of chemicals (copper and ethofumaste) on energy metabolism of a cyprinid species, the roach Rutilus rutilus, through the study of processes involved in the synthesis of cellular energy (ATP). The effect of chemicals was first performed on general health status of juvenile roach, and few impacts were found on general indexes measured. Secondly, the study of aerobic and anaerobic energy production (glycolysis, substrates and products) was performed. Significant differences were observed at the molecular regulation level, depending on chemicals. However, at the biochemical level, an increase in anaerobic metabolism was observed with both contaminants. Finally, the effects of contaminants on mitochondrial functions were assessed. Mitochondrial alterations were observed either in the respiratory chain and in the ultra-structure of mitochondria;these results involved an effect on the availability of cellular energy. This work constitutes the basis for the development of new early markers of physiological disorders in organisms used in biomonitoring studies.

Les égoutiers sont exposés à une grande variété de mélanges de produits chimiques beaucoup ce sont des substances génotoxiques ou cancérigènes. Le but de cette étude transversale était d'explorer des biomarqueurs intégrés d’exposition et des effets précoces chez les égoutiers afin de mieux apprécier leur risque cancérogène (article I-protocole). L'article II expose l'étape de validation préalable effectuée sur la lignée cellulaire pour nos objectifs. Avec un recueil en 10 mois et sur une base hebdomadaire, nous avons, a) évalué l'exposition personnelle des égoutiers (n=34) et administratifs (n=30) (groupe témoin) à des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et composés organiques volatils (COV) dans l'air des lieux de travail, b) évalué la génotoxicité de leurs extraits organiques urinaire par des tests in vitro : tests des comète et des micronoyaux sur les cellules Hep G2, c) évalué la réponse à un stress oxydatif de l'ADN par la mesure du 8 oxo 2' deoxyguanosine urinaire (8 oxodG) dans les urines de 24h (Article III). Les tests ont montré la présence de plus de génotoxiques dans les urines des égoutiers (P <0,001). La moyenne du 8 oxodG urinaire chez les égoutiers était plus élevée (non significatif, P = 0,28) que les administratifs et ses valeurs moyennes ont été associées (P = 0,04) avec les années de travail dans le système des égouts. Les concentrations des HAP et COV dans l'atmosphère professionnelle des égoutiers étaient élevées par rapport à celles des administratifs (P <0,01) et il a été montré une augmentation de risque du cancer en utilisant les facteurs d'équivalence de toxicité et de risque unitaire de cancer. En conclusion, les biomarqueurs intégrés urinaire d’exposition et non spécifiques montrent que les égoutiers sont professionnellement exposés aux mélanges des substances génotoxiques. Il n’est pas possible de relier nos résultats avec l’accroissement du risque cancérogène chez les égoutiers. / Sewage workers are exposed to a wide variety of mixtures of chemicals many were shown to be genotoxicants or carcinogens. The aim of this cross sectional study was to explore integrated biomarkers of exposure and of early effects among sewage workers in order to better assess their carcinogenic risk (Paper I-protocol). Paper II, describes the validation step performed prior to choose the cellular line that meet our objectives. Over 10 months and on weekly basis, we, a) assessed the personal exposure of sewage (n=34) and office (n=30) workers (control group) to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and volatile organic compounds (VOCs) in the air of workplaces, b) evaluated the genotoxicity of organic urine extracts by in vitro comet and micronucleus assays on Hep G2 cells, c) assessed the DNA oxidative stress by the 24h urinary 8 oxo 2' deoxyguanosine (8 oxodG) (Paper III). The tests showed greater genotoxicity in the urine extracts of sewage workers (P<0.001). The 24hr urinary 8 oxodG mean level in sewage workers was higher (nonsignificant, P=0.28) than office workers and its mean values were associated (P=0.04) with working years in sewage system. Workplace air concentrations of PAHs and VOCs were elevated in sewage compared to office workplaces (P<0.01) and resulted in an increased lifetime cancer risk using toxicity equivalent factors and inhalation unit risk of cancer. In conclusion, the applied integrated and non-specific urinary biomarkers show that sewage workers experience exposure to multiple genotoxicants at the workplace. It is not possible to simply link our results with the increased cancer risk in sewage workers.

Le travail présenté ici s'est penché sur les problèmes rencontrés sur ce type d'études protéomiques, et sur les solutions qui peuvent être explorées pour améliorer le débit d'évaluation des candidats biomarqueurs. Les peptides à méthionine sont généralement évités en raison de leur sensibilité à l'oxydation. Cependant, il semblait intéressant d'étudier leur modification endogène pouvant affecter les processus biologiques. Une première évaluation de l'impact de l'oxydation des apolipoproteins dans le cas de la maladie d'Alzheimer, a permis de mettre de côté ce biomarqueur potentiel, et de faire apparaître un certain nombre de problèmes liés au prélèvement et au stockage des échantillons biologiques. L'évaluation de dispositifs DBS (Dried Blood Spot) et Vivid à partir d'un panel de 32 protéines sanguines a permis de fournir une première solution envisageable pour maîtriser ces problèmes. Par la suite, un nouveau mode de quantification des peptides appelé MRM3 a été utilisé pour dépasser la complexité de la matrice biologique, et fournir une évaluation fiable des niveaux de concentration de 2 protéines plasmatiques, la C-Reactive protein et la TIMP-1, ainsi que 2 protéines urinaires, l'aquaporin-2 et la podocin. Pour améliorer la sensibilité d'analyse et réduire les coûts de solvants nécessaires aux analyses, l'évaluation d'une plate-forme de micro-chromatographie a été réalisée par comparaison à une plate-forme narrow-bore. Cette étude a permis de mettre en évidence l'impact important de l'effet matrice sur le processus analytique, nécessitant de développer de nouvelles stratégies de travail. Enfin, afin de réduire la complexité de l'échantillon, l'évaluation de cartouches d'extraction en phase solide à base de large taille de pores a été réalisé, et un protocole développé a permis d'analyser avec succès des enzymes contenus dans un échantillon de lessive commerciale. De plus, la durée nécessaire à la préparation d'échantillons biologiques a pu être fortement réduite en combinant une digestion rapide assistée par température combinée au dessalage en ligne, afin de permettre l'analyse quantitative des protéines qu'il contient seulement quelques heures après son arrivée au laboratoire / Over the past decade, interest in the use of biomarkers in clinical studies has greatly increased. Quantification of a candidate protein biomarker in complex samples (eg. plasma) requires targeted and multiplexed assays. Immunoassays are the gold standard for their quantification. However, with the need for targeted and multiplexed methods, recent developments in mass spectrometry (MS) make a viable alternative to ELISA. The present work has addressed the problems encountered in this type of proteomic studies, and solutions that can be explored to improve the workflow of candidate biomarker’s evaluation. Methionine peptides are generally avoided due to their susceptibility to oxidation. However, it seemed interesting to study how their endogenous modifications could affect biological processes. In a first time, apolipoproteins were dismissed as a potential biomarker of Alzheimer’s disease due to oxidation impact. In the same time, problems associated with biological sample collection and storage were highlighted. DBS (Dried Blood Spot) and Vivid device evaluation from a panel of 32 blood proteins has provided a first possible solution to overcome these troubles. Thereafter, a new peptide quantification method called MRM3 was used to overcome biological matrix complexity. Reliable level determinations of 2 plasma proteins (C-Reactive protein and TIMP-1) and 2 urinary proteins (aquaporin-2 and podocin) were obtained. To improve sensitivity and reduce analysis solvent costs, performances of a micro chromatography platform were compared to a narrow-bore platform. This study highlighted the significant impact of the matrix effect on the analytical process, requiring new strategie development. Finally, to reduce sample complexity, evaluation of wide pore solid-phase extraction cartridges has been achieved. A protocol was successfully developed to analyze enzymes contained in commercial laundry samples. Finally to optimize biological sample preparation time, heated-assisted digestion and online desalting step were successfully associated. Only few hours were then required for quantitative analysis

L'insuffisance cardiaque (IC) est une maladie dont la prévalence est élevée, cette prévalence augmente avec l'âge. La découverte de la maladie se fait le plus souvent lors d'un épisode de décompensation (ou insuffisance) cardiaque aiguë (ICA). L'ICA est très fréquente chez les sujets âgés et est caractérisée par des difficultés diagnostiques quand le patient est admis avec une dyspnée aiguë. L'apport de biomarqueurs plasmatiques tels que le BNP ou le NT-proBNP a été majeur pour le diagnostic de l'ICA. La décompensation cardiaque aiguë est suivie d'un taux de réhospitalisations et d'une mortalité très élevés. Les objectifs de la thèse était 1- de préciser l'épidémiologie de l'ICA en France lors d'un observatoire d'une journée des hospitalisations pour ICA dans 170 hôpitaux français (OFICA), 2- d'identifier la puissance diagnostiques et pronostiques des peptides natriurétiques lors de l'ICA, 3-de définir l'importance des modifications post-transcriptionnelles de ces PNs lors de l'ICA, 4- de rechercher de nouveaux biomarqueurs.La comparaison des propriétés diagnostiques et pronostiques des peptides natriurétiques révèle que les 4 peptides natriurétiques commercialement accessibles (BNP, NT-proBNP, proBNP et MR-proANP) ont des qualités diagnostiques et pronostiques globalement très similaires. Néanmoins, proBNP et BNP semblent meilleurs pour le diagnostic tandis que MR-proANP apparaît meilleur pour son association avec la mortalité à 5 ans.Parmi les modifications post-transcriptionnelles du BNP, nous avons étudié l'impact de la glycosylation du pro-BNP. La O glycosylation en 71 inactive proBNP, qui est libéré hors de la cellule sans action préalable des enzymes de « cleavage » la corine ou la furine. En revanche, le proBNP non-glycosylé est scindé en BNP et NT-proBNP par la corine ou la furine. Nous avons pu montrer que la non-glycosylation du proBNP et l'activation de la furine étaient deux mécanismes très importants d'accélération de la production de peptides natriurétiques lors de l'ICA. On a pu également montrer que la production du NT-proBNP était beaucoup plus liée au niveau glycosylation du proBNP que ne l'est la production de BNP. Ainsi, nos résultats suggèrent fortement d'utiliser le NT-proBNP pour toute étude future souhaitant explorer le concept de « biomarker-guided therapy » dans l'ICA.Pour la recherche de nouveaux biomarqueurs, nous avons exploré 1-la concentration plasmatique de 5 microRNAs (miR-l/-21/-23/-126/-423-5p), chez des patients avec dyspnée aiguë. Aucun de ces miR n'a de valeur diagnostique, en revanche, le miR-423-5p apparaît être un marqueur pronostique de réhospitalisation à un an ; 2-les conséquences de la congestion cardiaque sur le foie. Les marqueurs hépatiques étudiés étaient la phosphatase alcaline et les transaminases : les marqueurs de la cholestase étaient associés à une congestion hépatique tandis que ceux de la nécrose cellulaires (transaminases) étaient liés à l'hypotension artérielle et au bas débit cardiaque. L'augmentation des transaminases a été associée à divers critères dont une surmortalité à court terme / Heart failure (HF) is highly prevalent disease, and prevalence increases with age. HF is generally discovered on presentation of an acute episode of decompensation (or insufficiency). Acute decompensated heart failure (ADHF) is very frequent in elderly subjects and is difficult to diagnose when the patient is admitted with acute dyspnoea. The advent of plasma biomarkers, such as BNP or NT-proBNP represents a major advancement in the diagnostic of ADHF. ADHF leads to high rates of re-admission and mortality. The objectives of this doctoral thesis were: (1) to describe the epidemiology of ADHF in France in a one-day observational study of admissions for ADHF in 170 French hospitals; (2) to evaluate the prognostic and diagnostic value of natriuretic peptides (NPs) in ADHF; (3) to describe the extent of post-transcriptional modifications in these NPs in ADHF; and (4) to search for new biomarkers.The comparison of the prognostic and diagnostic properties of NPs showed that the 4 commercially available NPs (namely BNP, NT-proBNP, proBNP and MR-proANP) overall have very similar prognostic and diagnostic abilities. However, proBNP and BNP seem to be more useful for diagnosis, while MR-proANP appears to be better for the association with 5-year mortality.Amongthe post-transcriptional modifications of BNP, we studied the impact of glycosylation of pro¬BNP. Threonin 71 0-glycosylation prevents cleavage of proBNP into BNP and NT-proBNP, resulting in the release of proBNP from the cell without being cleaved. Conversely, non-glycosylated proBNP is cleaved into BNP and NT-proBNP by corin or furin. We showed that non-glycosylation of proBNP and activation of furin are two important mechanisms in the acceleration of production of NPs during ADHF. We also showed that production of NT-proBNP was more closely linked to the rate of glycosylation of proBNP than to the production of BNP. Thus, our results strongly suggest that NT-proBNP should be used in future studies exploring the concept of "biomarker-guided therapy" in ADHF.To investigate new biomarkers, we explored plasma concentrations of 5 microRNAs (miR-l/-21/-23/-126/-423-5p), in patients with acute dyspnoea. None of these microRNAs were shown to have any diagnostic value. Conversely, miR-423-5p appears to be a prognostic marker for re-admission at 1 year. Secondly, we investigated the consequences of cardiac congestion on the liver. The hepatic markers studied were alkaline phosphatise and transaminases. Markers of cholestasis were associated with hepatic congestive while markers of cellular necrosis (transaminases) were related to arterial hypertension and low cardiac output. An increase in transaminases was associated with various criteria of excess mortality in the short term