En pathologie tumorale, l'étude du micro-environnement tumoral doit prendre en compte différents modes de communication cellulaire : contacts directs entre membranes plasmiques, émission et réception de cytokines et enfin émission et internalisation d'objets biologiques plus complexes comme les microvésicules et les exosomes qui peuvent être assimilés à de véritables organites extra-cellulaires. Le virus d'Epstein-Barr (EBV) participe à l'oncogenèse de plusieurs affections malignes humaines d'origine épithéliale (carcinomes nasopharyngés ou NPC) ou lymphocytaire (lymphomes post-transplantation). Dans ces tumeurs, les cellules malignes qui sont infectées de façon latente par EBV libèrent des exosomes et des microvésicules qui contiennent des protéines et des acides nucléiques d'origine virale. L'étude de ces éléments doit permettre de mieux comprendre les interactions hôte-tumeur et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic précoce et la surveillance de la maladie sous traitement. Le premier objectif de ma thèse consistait à étudier la sécrétion par les cellules malignes d'une famille de microARN viraux appelés miR-BART et leur diffusion dans le sang périphérique chez les sujets porteurs de tumeurs associées à EBV. Pour la première fois j'ai mis en évidence une sécrétion d'exosomes porteurs de miR-BART par les cellules de NPC en culture in vitro. J'ai également montré que les miR-BART, particulièrement miR-BART7, sont détectables dans le plasma de sujets porteurs de NPC. Contrairement à ce qui se passe in vitro les miR-BART plasmatiques ne sont pas transportés par des exosomes. Des données obtenues chez la souris montrent qu'ils peuvent être transportés par des complexes extra-cellulaires que l'on peut précipiter au moyen d'anticorps anti-ago2. Nous cherchons à confirmer ces données sur des échantillons de plasma provenant de patients porteurs de NPC. Ces données pourront guider à l'avenir l'utilisation des miR-BART circulants comme source de biomarqueurs.Le deuxième volet de ma thèse avait pour but d'étudier les modifications du protéome des exosomes induites par une oncoprotéine du virus d'Epstein-Barr appelée LMP1 (latent membrane protein 1). J'ai montré que la LMP1, lorsqu'elle est exprimée dans les cellules lymphocytaires ou épithéliales, infectées ou non par EBV, induit la libération de la protéine PARP1 dans le milieu extra-cellulaire. Cette PARP1 extra-cellulaire n'est pas associée aux exosomes ni aux microvésicules mais à des nano-objets non-vésiculaires contenant notamment des histones et de l'ADN. Nous avons désignés ces objets sous le terme de complexes ADN-protéines extra-cellulaires. Nous ne savons presque rien de la biogenèse de ces complexes ; nous pensons qu'ils ne proviennent pas uniquement de cellules en apoptose. En revanche, des expériences préliminaires suggèrent que la présence de PARP1 dans ces complexes coïncide avec une activation permanente de la PARP1 induite dans les cellules productrices par l'expression de l'oncoprotéine LMP1. Cette hypothèse est en cours de vérification grâce à des expériences menées sur des lignées cellulaires exprimant différentes formes sauvages ou mutées de la LMP1. Ces données sur l'activation de la PARP1 et sur sa sécrétion induite par la LMP1 auront des retombées intéressantes pour notre compréhension des mécanismes d'oncogenèse et d'auto-immunité liés à l'infection par le virus d'Epstein-Barr.

L'évaluation de l'impact des polluants dans l'environnement est une des préoccupations majeures qui s'inscrit dans la Directive Européenne Cadre Eau 2000. Les réglementations préconisées ont notamment pour objectif de parvenir au bon état chimique et écologique des masses d'eau. Dans ce contexte, notre étude a consisté à développer une approche multibiomarqueur sur des juvéniles de poisson afin d'évaluer les effets biologiques de la pollution chimique en milieu littoral. Des paramètres moléculaires de détoxification (EROD, GST) et une enzyme antioxydante (CAT) ont été utilisés en tant que "système d'alarme " susceptibles de détecter une perturbation avant l'apparition de signes pathologiques irréversibles. En parallèle, différents biomarqueurs physiologiques (croissance somatique et récente, rapport ARN/ADN, indices morphométrique et lipidique) ont été analysés en considérant que ceux-ci pourraient révéler les dommages induit par les polluants sur l'état de santé des juvéniles. La sensibilité et la pertinence des biomarqueurs moléculaires et physiologiques ont été testés expérimentalement sur des juvéniles : i) de bar exposés à une pollution aigüe de pétrole, ii) de bar et de turbot soumis à des mélanges de contaminants en concentrations environnementales en conditions contrôlée et semi-contrôlée (" caging "). Nos résultats montrent la capacité de l'EROD, et à un degré moindre de la GST, à détecter une exposition courte (2 et 4 jours) des organismes au pétrole et à refléter ses effets délétères sur leur état de santé. Cette relation entre biomarqueurs moléculaires et physiologiques a par contre été plus difficilement établie dans un contexte de pollution multiple. Les indices de croissance et de condition utilisés se sont avérés plus sensibles aux différents niveaux de contamination analysés (métaux et HAPs). Leur utilisation a permis d'évaluer la condition affaiblie des organismes mis en cage en milieu portuaire pendant 38 jours. Cette expérience de " caging " s'est révélée concluante, notamment pour les juvéniles de bar, sur lesquels aucun stress physiologique de la mise en cage n'a été détecté dans la station de référence. Les effets délétères des contaminants chimiques sur l'état de santé des juvéniles de turbot ont également été observés en condition contrôlée après exposition de 21 jours aux mêmes sédiments portuaires et à un sédiment estuarien. En complément de ces expériences, une étude de terrain a été réalisée sur des juvéniles de flet prélevés dans des estuaires le long de la côte française et belge. Une diminution des indices morphométrique et lipidique des juvéniles de flet, issu des trois estuaires anthropisés, a été observée en relation avec des bioconcentrations en métaux plus élevées que l'estuaire de référence. Les résultats issus de ces différentes études montrent la potentialité des indices de croissance et de condition à révéler les effets biologiques des contaminants chimiques sur les juvéniles de poissons marins. Cependant, leur spécificité vis à vis des polluants étant plus faible que les paramètres de détoxification, leur utilisation peut être limitée. Ces travaux montrent ainsi le besoin d'utiliser des biomarqueurs à différents niveaux d'organisation biologique dans les programmes de biosurveillance.

Le Rhône est la principale source d'eau douce et de matériels terrigènes vers le bassin méditerranéen. Le prodelta du Rhône est caractérisé par des taux d'accumulation sédimentaire élevés et par une reminéralisation intense de la matière organique sédimentée, ce qui est typique des environnements deltaïques. Une question est soulevée sur le devenir de ces grandes quantités de carbone organique délivrées par le fleuve vers le milieu marin et en particulier leur impact sur les communautés microbiennes benthiques et l'intensité du recyclage de la matière organique. Le programme multi-disciplinaire "Climate and Human-induced Alterations in Carbon Cycling at the River seA connection" (CHACCRA) a été conçu pour étudier le devenir des éléments nutritifs et de la matière organique délivrée par le Rhône sur la marge continentale adjacente. Lors de quatre campagnes de terrain réalisées en avril 2007, mai 2008, décembre 2008 et juin 2009, des carottes de sédiments ont été prélevées à l'embouchure du fleuve et sur le plateau adjacent. La contribution des apports continentaux et leur distribution ont été étudiées à l'aide de paramètres globaux (granulométrie, azote total et carbone organique), tandis que les descripteurs moléculaires (pigments, acides gras, acides aminés totaux et biodisponibles) ont permis de déterminer l'origine, et d'évaluer la qualité ainsi que l'état de dégradation de la matière organique dans les sédiments. La structure de la communauté bactérienne a été caractérisée par la technique de polymorphisme de conformation des simples brins par électrophorèse capillaire (CE-SSCP). Ces travaux mettent en évidence des gradients d'origine et de qualité depuis l'embouchure vers le large. De plus, l'influence des événements de crue est clairement visible dans les sédiments, et les signatures biochimiques des dépôts sont différentes selon le type de crue. Enfin, l'incubation des sédiments a permis d'évaluer la dégradabilité en condition oxique de la matière organique sédimentaire à l'embouchure et de montrer que la fraction labile était très réactive à la dégradation.

Le cancer pulmonaire non à petites cellules (CNPC) est la première cause de décès par cancer dans le monde. Ce cancer est souvent découvert tardivement, il est agressif, et il est chimio-résistant. La découverte de biomarqueurs pourraient représenter une percée majeure pour la prise en charge de ces patients, en facilitant le diagnostic, le pronostic et orienter vers le choix du traitement le plus approprié. Nous avons exploré plusieurs aspects liés à la progression tumorale dans le but d'identifier de nouveaux biomarqueurs dans les CNPC. Nous avons démontré un impact antagoniste sur l'évolution des CNPC des anhydrases carboniques IX et XII, induites par l'hypoxie tumorale. Une forte expression tissulaire et plasmatique de CAIX est un biomarqueur de mauvais pronostic chez les patients présentant un CNPC, tandis que l'expression tissulaire de CAXII serait prédictive d'une évolution favorable. De plus, nous avons montré que la réoxygénation dynamique des tumeurs serait à l'origine de cet antagonisme. Deuxièmement, la composante cellulaire du microenvironnement tumoral a été étudiée et plus particulièrement nous avons démontré qu'un recrutement par les cellules tumorales des neutrophiles exprimant un marqueur spécifique CD66b pourrait avoir un signal positif au cours de la progression tumorale des CNPC. Troisièmement, le compartiment sanguin a été évalué en relation avec l'évolution des tumeurs et plus particulièrement nous avons démontré la valeur majeure diagnostique et pronostique des cellules tumorales circulantes (CTC) chez les patients atteints d'un CNPC. Enfin, les CTC semblent représenter également le support idéal pour la mise en évidence de biomarqueurs théranostiques dans les CNPC. En conclusion, ces travaux explorent les possibilités et les limites de l'identification de biomarqueurs, en soulignant l'importance de la qualité des échantillons et de l'exactitude et l'exhaustivité des données cliniques afin d'obtenir des résultats reproductibles.

Les pathologies du vieillissement prostatique (cancer de la prostate, hyperplasie bénigne de la prostate, déficit androgénique lié à l'âge) sont fréquentes, représentant un problème de santé publique. Leur prévalence s'accroit au gré du vieillissement de la population. Si leur coïncidence épidémiologique est claire, les liens physiopathologiques les unissant restent mal connus. Grâce aux progrès de la génétique, et notamment les associations d'étude du génome entier, la quantification du risque génétique du cancer de la prostate sporadique a été documentée par la découverte de loci de susceptibilité. Néanmoins, l'utilisation de ces marqueurs en pratique courante n'a pas fait la preuve de sa rentabilité, dans le complexe débat du dépistage du cancer de la prostate. La prédisposition génétique au vieillissement pathologique bénin de la prostate, en particulier vers l'HBP, est encore très peu étudiée. De plus amples travaux sont nécessaires pour caractériser la genèse et l'évolution du vieillissement prostatique. Du point de vue du traitement, la prise en charge diagnostique du vieillissement prostatique évolue avec de nouveaux biomarqueurs. Le poids respectif de ces outils diagnostiques multiples reste à déterminer avec un triple objectif : (i) mettre en place des arbres de décision permettent de cibler les biopsies prostatiques, (ii) intégrer à la prise en charge diagnostique les pathologies bénignes comme l'HBP dont le bilan, le traitement et le suivi sont connexes à la problématique du CaP et (iii) considérer tout au long de la prise en charge les pathologies associées tel le syndrome métabolique, dans l'objectif d'une démarche multidisciplinaire.

Les avancées récentes dans l'étude des phénomènes aboutissant au cancer montrent que chaque tumeur possède des caractéristiques physiopathologiques qui lui sont propres. L'apport de biomarqueurs, permettant de réaliser des diagnostics moléculaires précis est donc un enjeu primordial. Une analyse protéomique quantitative globale basée sur l'utilisation du marquage iTRAQ TM a été réalisée sur des tumeurs colorectales congelées. Ces tumeurs ont été analysées en fonction de leur stade TNM d'une part, et de leur statut concernant l'oncogène KRAS d'autre part. Afin de compléter notre analyse nous avons également analysé le protéome de lignées cellulaires colorectales. Nous avons également examiné le stroma de ces tumeurs, et nous avons développé une technique d'analyse d'un sous-protéome : le glycoprotéome. L'ensemble de ces résultats nous a conduit à proposer une base de données des protéines identifiables dans ce modèle constituée de 3 168 protéines. 513 des protéines que nous avons identifiées sont susceptibles d'être sécrétées par les tumeurs et constituent une base de données de candidats biomarqueurs pour le cancer colorectal. Nous avons également validé l'un d'entre eux : l'OLFM4. Il s'agit d'un candidat biomarqueur potentiel pour la détection précoce des cancers colorectaux, et nous avons également mis en évidence que son niveau d'expression était modifié lorsque la tumeur était mutée sur l'oncogène KRAS. Nous nous sommes également intéressés à ses fonctions cellulaires, et nous avons montré qu'elle participait à la résistance des tumeurs aux traitements, et il est probable qu'elle joue un rôle dans la dissémination tumorale.

L'auteur n'a pas fourni de résumé en français / L'auteur n'a pas fourni de résumé en anglais

Le déclin de la fonction pulmonaire et la destruction progressive des tissus des voies aériennes sont les premières causes de morbidité et de mortalité dans la mucoviscidose (CF). Grâce à un suivi régulier et à des traitements symptomatiques, la qualité de vie et l'espérance de vie des patients CF ont considérablement augmenté. Pour le suivi des patients, les cliniciens utilisent principalement des paramètres cliniques et biologiques. L'objectif principal de ce projet de thèse était d'identifier des biomarqueurs de l'atteinte pulmonaire basés sur la méthylation de l'ADN. Par une approche tout-génome (Infinium 450K), nous avons mesuré la méthylation de l'ADN dans les cellules épithéliales nasales de patients CF et d'individus contrôles sains (cohorte MethylCF, 51 patients, 24 contrôles). Nous avons montré que les profils de méthylation différaient entre patients et contrôles mais aussi entre patients à atteinte pulmonaire modérée et sévère. Les changements de méthylation ont principalement eu lieu dans des régions régulatrices (enhancers) et dans des gènes associés à l'adhésion cellulaire et aux réponses inflammatoire et immunitaire. En combinant données épigénomiques et données cliniques, nous avons sélectionné des potentiels biomarqueurs de sévérité de l'atteinte pulmonaire, et des potentiels biomarqueurs de l'évolution de la fonction pulmonaire. Pour valider les biomarqueurs, nous avons constitué une cohorte longitudinale, MethylBiomark, de 50 patients CF suivis pendant 18 mois. A partir d'échantillons d'expectoration recueillis tous les six mois environ, nous avons mesuré la méthylation de l'ADN des potentiels biomarqueurs par pyroséquençage. Deux biomarqueurs corrélaient avec la sévérité de l'atteinte pulmonaire (VEMS et CVF), et un biomarqueur corrélait avec l'évolution de la fonction pulmonaire (variation de VEMS). Le second objectif de cette thèse était d'étudier l'impact des variations de méthylation d'ADN sur l'expression des gènes, en croisant des données épigénomiques et transcriptomiques générées à partir des mêmes échantillons (sang total, cohorte MethylCF). L'analyse transcriptomique a permis d'identifier (i) des gènes différentiellement exprimés entre patients et contrôles, qui étaient associées aux réponses inflammatoire et immunitaire, et (ii) des modules de co-expression (WGCNA) qui corrélaient fortement avec des paramètres cliniques, dont le diabète. / Lung function decline and progressive destruction or airway tissues are the main causes of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF). Quality of life and life expectancy of CF patients greatly increased over the last decades, because of a regular follow-up and symptomatic treatments. For the follow-up of patients, clinicians usually use clinical or biological parameters. The main goal of this thesis was to identify DNA methylation biomarkers of CF lung disease. We measured genome-wide DNA methylation (with Infinium 450K) in nasal epithelial cells from CF patients and healthy controls (MethylCF cohort, 51 patients, 24 controls). We showed that DNA methylation profiles differed between CF patients and controls, but also between patients with mild and severe lung disease. DNA methylation changes mainly occurred in regulatory regions (enhancers) and in genes associated with cell adhesion and inflammatory and immune responses. By combining epigenomic and clinical data, we selected potential biomarkers of lung disease severity, and potential prognostic biomarkers of the evolution of the lung function. To validate these biomarkers, we built a new longitudinal cohort of 50 CF patients followed for 18 months. We measured the DNA methylation level of the biomarkers by pyrosequencing in sputum samples collected every 6 months. Two biomarkers correlated with lung disease severity (measured by FEV1 and FVC) and one biomarker correlated with the evolution of the lung function (FEV1 variation). The second goal of this thesis was to investigate the impact of DNA methylation changes on gene expression, by combining epigenomic and transcriptomic data from the same samples (whole blood, MethylCF cohort). The transcriptomic analysis revealed (i) differentially expressed genes between patients and controls, that were mainly involved in inflammatory and immune responses, and (ii) co-expression gene modules (WGCNA) highly correlated with clinical parameters, and notably CF-related diabetes.

Le cadre réglementaire défini par la Directive Cadre sur l’Eau impose le développement de méthodologies fiables d’évaluation et/ou de caractérisation de l’état de santé des écosystèmes aquatiques. L’objectif de ce travail de thèse était d’identifier les rôles relatifs des paramètres des milieux aquatiques (température, cycle saisonnier, minéralisation), des caractéristiques des populations et des pressions anthropiques sur les réponses des biomarqueurs chez un organisme aquatique modèle, la moule zébrée (Dreissena polymorpha). Une espèce sœur, Dreissena rostriformis bugensis, arrivée plus récemment dans nos cours d’eau, a été suivie en parallèle et son potentiel en tant que biomoniteur a également été évalué. Pour cela, une batterie d’une douzaine de biomarqueurs sub-cellulaires a été mesurée dans différentes populations des deux espèces vivant dans des milieux contrastés, à différentes périodes de l’année, mais aussi lors de stress standardisés en laboratoire. Les biomarqueurs choisis correspondaient à différentes fonctions physiologiques et/ou antitoxiques, et des réponses à fortes pertinence écologiques, telles que la consommation d’oxygène ou l’activité de filtration, ont ponctuellement été suivies. Ces différents paramètres ont permis d’interroger les notions de sensibilité et de vulnérabilité des populations et de mieux comprendre les facteurs déterminant les réponses des biomarqueurs. Les différences inter-populationnelles montrent que l’accumulation des contaminants par les organismes et leurs réponses biologiques sont bien dépendantes de la qualité du biotope propre à chaque population, mais aussi de la saison, un facteur confondant qui doit donc être pris en compte lors de campagnes de biosurveillance. De fortes différences de réponse des biomarqueurs entre les deux espèces ont aussi été observées, aussi bien in situ que lors des expositions en laboratoire, soulignant la nécessité de bien différencier ces deux espèces, pourtant très proches. La nouvelle arrivée, D. r. bugensis, présente des réponses plus plastiques in situ, mais semble moins capable de gérer des stress aigus lors d’expositions en laboratoire. A l’inverse, D. polymorpha, arrivée il a 200 ans en France, semble mieux adaptée, avec une variabilité de réponse moins marquée et une meilleure tolérance aux contaminants. Ces travaux de thèse s’inscrivent dans le cadre de la convention BIOMICS, réalisée en collaboration avec l’ONEMA. Ils montrent que ces deux espèces sont aptes à nous renseigner sur l’état de contamination du milieu dans lequel elles vivent, même si les grilles d’interprétation peuvent être différentes de l’une à l’autre. Les variations des réponses des biomarqueurs au niveau sub-cellulaire témoignent de façon précoce de modifications de la qualité du milieu. Certains biomarqueurs semblent toutefois plus informatifs que d’autres, la batterie mesurée pourrait donc être réduite. A l’avenir, ces travaux permettront une meilleure lecture et interprétation des biomarqueurs mesurés dans des populations autochtones ou transplantées, et attestent de l’intérêt des biomarqueurs en tant qu’outils d’évaluation de la qualité des milieux aquatiques / The regulatory framework defined by the Water Framework Directive requires the development of reliable methodologies for assessing and / or characterizing the health status of aquatic ecosystems. The objective of this thesis was to identify the relative roles of environmental parameters (temperature, seasonal cycle, mineralization), population characteristics and anthropic pressures on biomarker responses in a model aquatic organism, the zebra mussel (Dreissena polymorpha). A sister species, Dreissena rostriformis bugensis, which invaded more recently our waterways, has been used in parallel and its potential as a biomonitor has also been evaluated. For this purpose, a battery of a dozen sub-cellular biomarkers was measured in different populations of the two species living in contrasting environments, at different times of the year, but also under laboratory stresses. The selected biomarkers corresponded to different physiological and / or antitoxic functions, and responses with high ecological relevance, such as oxygen consumption or filtration activity, were occasionally followed. These various parameters allowed to question the concepts of sensitivity and vulnerability of the populations and to understand the factors determining biomarker responses. Inter-population differences showed that the accumulation of contaminants by organisms and their biomarker responses depend on environmental quality at the originating site of each population, but also on the season, a confounding factor which must therefore be taken into account during biomonitoring programs. Strong differences in biomarker responses between the two species were also observed, both in situ and during laboratory experiments, emphasizing the need to differentiate the two species, so close they are. The recent invader, D. r. bugensis, presents more plastic responses in situ, but appears less able to manage acute stress in laboratory. Conversely, D. polymorpha, which is about 200 years old in France, appears to be better adapted, with less response variability and a better tolerance to contaminants. This thesis work is part of the BIOMICS convention, carried out in collaboration with ONEMA. It shows that these two species are able to inform about the contamination status of their environment. Variations in biomarker responses at the sub-cellular level indicate early changes in environmental quality. Some biomarkers, however, seem more informative than others do, so the measured battery could be reduced. In the future, this work will allow a better reading and interpretation of biomarkers measured in autochthonous or transplanted populations, and attest the value of biomarkers as tools for assessing aquatic environment quality

En raison du vieillissement de la population, la maladie d’Alzheimer (MA) est devenue un problème majeur en santé public. Le dosage des biomarqueurs présents dans le liquide céphalorachidien (Ab 1-42, tau et hepcidine) étant de bons indicateurs précoces de l’apparition et de l’évolution de la MA, il paraît essentiel de disposer de mesures fiables. Etablir la traçabilité métrologique des résultats aux unités du système international par le biais de méthodes de référence primaires ou de matériaux de référence certifiés d’ordre supérieur est un moyen privilégié pour évaluer et améliorer la fiabilité et la comparabilité des résultats dans le temps et entre les laboratoires. Des méthodes de dosages par LC-MS/MS pour ces trois biomarqueurs ont été développées et validées. Pour le dosage de l’hepcidine, la pureté de l’étalon peptidique a fait l’objet d’une caractérisation approfondie par spectrométrie de masse haute résolution qui permettra de standardiser les dosages de routine à l’échelle internationale.Mots clés : Peptides b amyloïdes, Protéine tau, Hepcidine, Biomarqueurs, Protéomique Clinique, Traçabilité métrologique, Spectrométrie de masse / Due to the aging of population, Alzheimer’s disease (AD), is becoming a major public health concern. Measurement of biomarkers (Amyloid Beta, tau and hepcidin) in cerebrospinal fluid being early diagnostic indicators of AD, reliable measurements are needed to detect and quantify them accurately. Establishing metrological traceability of results to the International System of Units through primary reference methods or higher-order certified reference materials is a privileged mean to assess and improve results accuracy and comparability across laboratories. Assays for these three biomarkers were set up and validated by LC-MS/MS. The hepcidin standard was further characterized by high resolution mass spectrometry, paving the road toward standardization at the international scale of results.Key words : b amyloids peptides, Tau protein, Hepcidin, Biomarkers, Clinical proteomic, Metrological traceability, Mass spectrometry