L'ARN antisens CopA régule le taux de réplication du plasmide bactérien R1 en contrôlant la synthèse de la protéine initiatrice de la réplication, RepA. CopA se fixe à sa séquence complémentaire (CopT) dans la région 5' non traduite de l'ARNm repA. Cette interaction induit principalement une inhibition de la traduction de l'ARNm repA et favorise sa dégradation par la RNase III. L'efficacité du contrôle est directement reliée à la vitesse de formation du complexe CopA-CopT. Nous avons montré que les deux ARN interagissent via une interaction de type boucle-boucle, mais que celle-ci doit être rapidement convertie pour former un complexe irréversible et fonctionnel. Celui-ci n'est pas un duplexe étendu mais contient une jonction à quatre hélices stabilisée par une longue hélice intermoléculaire. Plusieurs intermédiaires réactionnels menant au complexe stable ont été caractérisés, ainsi que les déterminants structuraux de CopA et de CopT nécessaires à cette conversion qui est essentielle au contrôle. Ainsi, nous proposons un mécanisme de formation du complexe stable qui implique plusieurs étapes dans un ordre hiérarchique. Ce mode d'appariement ARN-ARN insoupçonné apparaît être une règle plutôt qu'une exception. En effet, nous avons montré qu'il est conservé dans de nombreux plasmides homologues à R1. L'ARN-III contrôle l'expression des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus. Cette deuxième partie de mon travail de thèse a eu pour but de déterminer la structure secondaire de cet ARN en solution et in vivo, et de définir des domaines fonctionnels. En combinant différentes approches in vitro, nous avons établi que l'ARN-III contient 14 structures en tige-boucle et trois interactions à longue distance. Nous avons également identifié un sous domaine fonctionnel impliqué dans le contrôle de la synthèse de la protéine A.

La génomique structurale a donnée accès à un nombre remarquable d'informations sur le protéome. De nature essentiellement combinatoire---il apparaît que certaines protéines interagissent en complexe, elles gagnent à être complémentées par des modèles tridimensionnels pour étendre la connaissance jusqu'au niveau structural. Récemment, de tels modèles ont été reconstruits pour le pore nucléaire, en intégrant diverses données biophysiques et biochimiques. Cependant, la nature qualitative de ces modèles empêche une complète synergie entre ceux-ci et les données expérimentales. Cette thèse propose trois développements répondant à ces limitations. Premièrement, nous introduisons les modèles tolérancés pour représenter des formes aux contours incertains par un continuum de modèles. Nous montrons qu'un modèle tolérancé est équivalent à un diagramme de Voronoi additif multiplicatif, et nous développons le lambda-complexe, l'équivalent de l'alpha-complexe, pour un tel diagramme. Deuxièmement, nous utilisons les modèles tolérancés pour représenter des assemblages protéiques. Nous expliquons comment un modèle tolérancé peut être utilisé pour évaluer la stabilité des contacts entre les protéines et pour valider la cohérence d'un tel modèle vis à vis de données expérimentales. Troisièmement, nous proposons des outils pour comparer des graphes de contact entre protéines, issus d' une part d'un modèle tolérancé, et d'autre part d'un modèle connu à résolution atomique. L'ensemble de ces concepts et outils est utilisé pour sonder les reconstructions du pore nucléaire mentionnées ci-dessus.

L'objectif de cette thèse était de mettre en évidence les caractéristiques structuro-fonctionnelles d'un type cellulaire précis, les hémocytes de bivalves. Les outils analytiques tels que la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et la chromatographie en phase gazeuse (CPG) ont permis une investigation approfondie des composants lipidiques membranaires. La composition détaillée des classes et sous-classes de phospholipides ainsi que les spécificités de leur composition individuelles en acides gras ont été mises en évidence. De plus, l'utilisation de la cytométrie en flux a permis de caractériser un certain nombre de fonctions hémocytaires ainsi que la ploïdie des hémocytes. La composition lipidique des membranes d'hémocytes chez quatre espèces de bivalves ; l'huître creuse Crassostrea gigas, la palourde Japonaise, Ruditapes philippinarum, la coque Cerastoderma edule et la mye Mya arenaria a été finement caractérisée. Parmi les particularités principales, une forte teneur en plasmalogènes enrichis en acides gras " non methylene interrupted " (NMI) et en 20:1n-11 a été mise en évidence pour la première fois dans des hémocytes. Ces acides gras présentent la particularité d'être biosynthétisés de novo par les bivalves marins. Les membranes des hémocytes sont également très riches en céramide aminoéthylphosphonate (CAEP) et en stérols. La seconde étape a consisté à étudier les modifications des compositions lipidiques membranaires et des fonctions cellulaires potentiellement induites par la néoplasie disséminée, afin de dégager des liens structuro-fonctionnels au niveau membranaire. Pour ce faire, les cellules circulantes provenant d'animaux sains et d'animaux atteints par la néoplasie disséminée ont été comparées chez la coque du Bassin d'Arcachon et la mye de l'Ile du prince Edouard (Canada). Dans le cas des coques, une proportion beaucoup plus faible d'espèces moléculaires plasmalogènes-acides gras NMI a été observée dans les membranes des cellules néoplasiques. Cette observation était associée à une activité phagocytaire plus faible et à une origine subcellulaire d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) différente. Chez les myes, une plus faible proportion de l'espèce moléculaire phosphatidylsérine plasmalogène-20 :1n-11 associée une plus faible activité phagocytaire a été détectée dans les cellules circulantes des animaux affectés par la néoplasie disséminée. Les caractéristiques de la néoplasie disséminée chez la coque du Bassin d'Arcachon sont apparues très différentes de celles observées chez la mye de l'Ile du Prince Edouard, notamment au niveau de la ploïdie des cellules néoplasiques mais aussi de la prolifération cellulaire et de la prévalence des différents stades de développement de la maladie. Une progression différente de cette pathologie entre les deux espèces a été suggérée. Ceci pourrait expliquer les différences d'altérations des structures lipidiques membranaires des cellules néoplasiques entre ces deux espèces.

Les Attines ou fourmis champignonnistes sont d'importants ravageurs des cultures du monde néotropical. L'indispensable effet retard, à conférer aux insecticides chimiques ou biologiques pour une lutte efficace pourrait être obtenu par une encapsulation dans une enveloppe digestible par les sécrétions des fourmis. Quelques aspects de la physiologie digestive d'une Attine, Acromyrmex octospinosus (Reich), ont été étudiés dans ce but. 1- L'étude morphologique du tube buccal et l'observation de la prise de nourriture ont permis de localiser, de décrire et de comprendre le mécanisme du filtre infrabuccal. La poche infrabuccale, remplie pendant l'alimentation et lors des différents comportements de nettoyage, se vide en moyenne une fois par jour en raison de la gêne causée par sa distension. Cette fréquence ne permet pas à la microflore de digérer les déchets organiques, mais peut être suffisante pour certaines hydrolyses salivaires. 2- Après une étude anatomique du tractus digestif des adultes et des larves, les enzymes digestives des sécrétions stomacales et glandulaires sont mises en évidence par une microméthode semi-quantitative. Les glandes labiales des adultes possèdent une activité béta-N-acétylglucosaminidasique et alpha-1-4-glucosadique. En plus de cette dernière, l'estomac sécrète des exopeptidases et lipases. Les autres glandes reliées au tractus alimentaire ne produisent pas d'enzymes digestives. Aucune endopeptidase n'est révélée chez l'adulte, par contre l'estomac des larves possède une activité chymotrypsique. 3- Une béta-N-acétylglucosaminidase, une chitobiase et une chitinase sont présentes dans les glandes labiales. Les caractéristiques (pH optimum, température optimale, Km) de ces enzymes permettent de les différentier nettement de celles qui sont décrites à ce jour. Ceci peut être lié au fait que ces fonctions digestives restent exceptionnelles chez les insectes. Pour A. octospinosus, les activités béta-N-acétylglucosaminidasique et chitobiasique sont le fait de deux enzymes différentes. L'action chitinolytique n'est pas liée à une microflore endosymbiotique. 4- L'activité alpha-1-4-glucosadique des glandes labiales et de l'estomac est précisée. Les glandes ne possèdent que l'amylase et l'estomac sécrète maltase et tréhalase. Les caractéristiques de ces enzymes sont étudiées. Amylase et tréhalase paraissent être des enzymes inductibles. 5- Suite à ces travaux, un schéma catabolique, tenant compte de l'association avec un champignon symbiotique, est proposé pour A. octospinosus. Les données sur la filtration buccale et l'enzymologie de la partie antérieure du tube digestif permettent de définir la taille des microcapsules et la nature des polymères digestibles à utiliser pour induire un effet retard des insecticides.

Ces dernières années ont vu le développement de techniques expérimentales permettant l'analyse quantitative de systèmes biologiques, dans des domaines qui vont de la neurobiologie à la biologie moléculaire. Notre travail a pour but la description quantitative de tels systèmes à travers des outils théoriques et numériques issus de la physique statistique et du calcul des probabilités. Cette thèse s'articule en trois volets, ayant chacun pour but l'étude d'un système biophysique. Premièrement, on se concentre sur l'infotaxie, un algorithme de recherche olfactive basé sur une approche de théorie de l'information proposé par Vergassola et collaborateurs en 2007: on en donne une formulation continue et on en caractérise les performances. Dans une deuxième partie on étudie les expériences de micromanipulation à molécule unique, notamment celles de dégraffage mécanique de l'ADN, dont les traces expérimentales sont sensibles à la séquence de l'ADN: on développe un modèle détaillé de la dynamique de ce type d'expérience et ensuite on propose plusieurs algorithmes d'inférence ayant pour objectif de caractériser la séquence génétique. Finalement, on donne une description d'un algorithme qui permet l'inférence des interactions entre neurones à partir d'enregistrements à électrodes multiples et on propose un logiciel intégré qui permettra à la communauté des biologistes d'interpréter ces expériences a partir de cet algorithme.

L'objectif de cette thèse consiste à inhiber la voie de signalisation liée aux protéines Ras, très fréquemment impliquée dans les tumeurs humaines, en concevant des inhibiteurs d'interactions protéine-protéine. Au sein de cette voie, la protéine RasGAP joue un rôle particulier, à la fois régulateur négatif et effecteur de Ras. La cible thérapeutique constituée par le domaine SH3 de la protéine RasGAP avait déjà été identifiée par plusieurs équipes (Tocqué et al., 1997). Plus récemment, notre laboratoire a complété ces travaux par l'identification des protéines Aurora comme partenaires de RasGAP-SH3. En collaboration avec Aptanomics, en mettant en oeuvre la technique des aptamères peptidiques, nous avons apporté une nouvelle validation de cette cible : nous avons obtenu par un crible double-hybride de nouvelles protéines synthétiques (aptamères) interagissant spécifiquement avec le domaine SH3 de RasGAP, et dont l'expression dans des cellules tumorales provoque une diminution de la capacité à former des colonies et de la viabilité cellulaire. Afin d'amorcer une démarche de conception rationnelle d'inhibiteurs de ce SH3, nous avons synthétisé les peptides exposés à la surface de ces aptamères et responsables de leur interaction avec RasGAP-SH3. Nous avons ensuite mesuré l'affinité de ces peptides pour RasGAP-SH3 par anisotropie de fluorescence. Nous avons ainsi obtenu un peptide cyclique dont l'affinité pour le domaine SH3 est de l'ordre de quelques centaines de nanomolaire, et dont nous avons déterminé l'empreinte sur ce domaine enrichi en 15N par RMN, en nous appuyant sur la structure du domaine, déjà résolue au laboratoire (Yang et al., 1994). Les données structurales que nous avons obtenues devraient permettre, dans un court délai, de proposer des modifications de ces peptides, afin d'augmenter l'affinité de nos inhibiteurs et de les vectoriser pour leur conférer une activité sur cellules tumorales en culture. Enfin, ces peptides, rendus fluorescents par leur couplage à un fluorophore, vont être utilisés comme ligands de référence dans un crible de chimiothèque à haut débit, afin de découvrir de petites molécules inhibitrices du domaine SH3 de RasGAP.

La motivation première de mes travaux de recherche est de combiner des approches expérimentales et théoriques dans le domaine de la chimie physique pour atteindre une meilleure compréhension des phénomènes à l'échelle atomique. Mes travaux en cours traitent de systèmes d'intérêt biologique concernant les processus membranaires et des phénomènes accessibles par des méthodes de nanomanipulation. Les problèmes de la biophysique et biochimie sont au c?ur de mes recherches. J'ai effectué des simulations complexes de protéines membranaires dans une bicouche lipidique qui se sont montrées tout à fait complémentaires et révélatrices par rapport aux études expérimentales de biologie structurale. Une récente collaboration exploitant cette complémentarité a donné lieu à une publication dans la revue Nature en début 2009. [[i]] Les travaux récents visent à développer des approches combinant la réalité virtuelle avec les simulations moléculaires. [[ii]] Les systèmes biologiques étudiés présentent à la fois un intérêt physico-chimique, biologique et médical et peuvent atteindre un grand nombre d'atomes. En parallèle, je mène un travail de fond sur les méthodes de simulation et des approches novatrices. ----------------------- [[i]] N. Bocquet, H. Nury, M. Baaden, C. Le Poupon, J.P. Changeux, M. Delarue et P.J. Corringer: "X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation", 2009, Nature, 457, 111-114. [[ii]] O. Delalande, N. Férey, G. Grasseau et M. Baaden : "Complex Molecular Assemblies at hand via Interactive Simulations", 2009, J. Comput. Chem., 30, 2009, 2375-2387.

En biologie structurale, il est couramment admit que la structure tridimensionnelle d'une protéine détermine sa fonction. Ce paradigme permet de supposer que deux protéines possédant des structures tridimensionnelles similaires peuvent partager un ancêtre commun et donc posséder des fonctions similaires. Déterminer la similarité entre deux structures de protéines est une tâche importante qui a été largement étudiée. Parmi toutes les méthodes proposées, nous nous intéressons à la mesure de similarité appelée “maximisation du recouvrement de cartes de contacts” (ou CMO), principalement parce qu'elle fournit des scores de similarité pouvant être utilisés pour obtenir de bonnes classifications automatiques des structures de protéines. Dans cette thèse, la comparaison de deux structures de protéines est modélisée comme une recherche de sous-graphe dans des graphes k-partis spécifiques appelés graphes d'alignements, et nous montrons que cette tâche peut être efficacement réalisée en utilisant des techniques avancées issues de l'optimisation combinatoire. Dans la seconde partie de cette thèse, nous modélisons CMO comme une recherche de sousgraphe maximum induit par les arêtes dans des graphes d'alignements, problème pour lequel nous proposons un solveur exact qui surpasse les autres algorithmes de la littérature. Même si nous avons réussi à accélérer CMO, la procédure d'alignement requière encore trop de temps de calculs pour envisager des comparaisons à grande échelle. La troisième partie de cette thèse est consacrée à l'accélération de CMO en utilisant des connaissances issues de la biologie structurale. Nous proposons une approche hiérarchique pour résoudre CMO qui est basée sur les structures secondaires des protéines. Enfin, bien que CMO soit une très bonne mesure de similarité, les alignements qu'elle fournit possèdent souvent de fortes valeurs de déviation (root mean squared deviation, ou RMSD). Pour palier à cette faiblesse, dans la dernière partie de cette thèse, nous proposons une nouvelle méthode de comparaison de structures de protéines basée sur les distances internes que nous appelons DAST (pour Distance-based Alignment Search Tool). Elle est modélisée comme une recherche de clique maximum dans des graphes d'alignements, pour laquelle nous présentons un solveur dédié montrant de très bonnes performances.

Chez les insectes, les chitinases sont des enzymes principalement impliquées dans la dégradation de la chitine, lors des processus de croissance. Les chitinases représentent donc des cibles d'intérêt dans le développement de moyens de lutte alternatifs aux pesticides utilisés contre les ravageurs des cultures. Au cours de ces travaux de thèse, nous avons été amené à évaluer la pertinence de la dérégulation des activités chitinases chez les pucerons. L'impact des chitinases sur le développement du puceron M. persicae a été évalué par des tests de prise alimentaire réalisés in planta, sur des plantes de pommes de terre exprimant une chitinase d'insecte (Phaedon cochleariae, Coléoptère) et in vitro, en incorporant une chitinase bactérienne (Serratia marcescens) dans un milieu artificiel. Des effets probiotiques ont été mis en évidence dans les deux cas, remettant en cause l'utilisation des chitinases en tant que biopesticide pour lutter contre les pucerons. Compte tenu de ces effets inattendus, nous avons étudié les effets d'une stratégie antagoniste, basée sur l'utilisation d'inhibiteurs de chitinases. Quatre inhibiteurs de chitinases, d'origine et de nature variées, ont ainsi été testés via un milieu artificiel. Nos résultats rapportent pour la première fois une activité inhibitrice de ces molécules sur des pucerons. Nous avons donc orienté nos recherches dans cette voie, afin d'identifier de nouveaux inhibiteurs de chitinases. Deux approches ont été initiées avec d'une part la purification des chitinases du puceron M. persicae et d'autre part par l'évaluation des effets d'oligosaccharides mimétiques de la chitine et des inhibiteurs de chitinases. Les résultats obtenus nous laissent à penser que les inhibiteurs de chitinases constituent une voie prometteuse dans l'élaboration de nouveaux bioinsecticides.

A long terme, le succès évolutif d'une lignée ne dépend pas seulement de la valeur adaptative de ses fondateurs. Il dépend également de la capacité des descendants à transmettre le génotype ancestral sans mutation délétère, tout en découvrant parfois des mutations favorables. Un niveau intermédiaire de variabilité mutationnelle peut donc être, de fait, indirectement sélectionné. En simulant, à l'aide d'un modèle individu-centré, l'évolution de génomes soumis à la fois à des mutations locales et à des réarrangements chromosomiques, nous montrons que la structure du génome est un levier d'ajustement du degré de variabilité : le nombre de gènes et, de façon plus surprenante, la quantité de non codant s'ajustent en fonction du taux de mutation et de l'impact moyen des mutations géniques, maintenant ainsi un niveau constant de variabilité mutationnelle. L'émergence de ces couplages surprenants suggère que les génomes ne sont pas seulement façonnés par les biais mutationnels et les coûts sélectifs directs, mais aussi, à plus long terme, par des pressions plus indirectes.