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Amplificaci��n y an��lisis in silico de dos probables celulasas de Pseudomonas aeruginosa y Cellvibrio japonicus: b��squeda de enzimas de inter��s en la s��ntesis de biocombustibles

Hern��ndez Segura, Alejandra 13 December 2011 (has links)
La industria de los biocombustibles est�� en su apogeo dada la preocupaci��n / ambiental que existe. El bioetanol generado a partir de lignocelulosa es bastante / prometedor, sin embargo, no se han encontrado las enzimas necesarias para hacer de su / producci��n un proceso viable a nivel industrial. En este trabajo se busc�� amplificar los / genes de al menos dos posibles celulasas putativas pertenecientes a dos organismos / distintos: Cellvibrio japonicus y Pseudomonas aeruginosa. Se procedi�� a extraer el / ADN, dise��ar oligonucle��tidos y encontrar las condiciones ��ptimas para la / amplificaci��n. Una vez lograda se hizo el an��lisis in silico completo de ambas prote��nas. / Ambos genes resultaron codificantes para dos posibles endoglucanasas: la perteneciente / a C. japonicus posee dos dominios de uni��n a la celulosa (CBD2 y CBD10) y un / dominio catal��tico perteneciente a la superfamilia 45 de las glicosil hidrolasas y se / especula es capaz de degradar celulosa cristalina. Por su parte, la posible endoglucanasa / de P. aeruginosa no pudo analizarse completamente porque los trabajos sobre las / enzimas con las que presenta homolog��a a��n no han sido publicados; sin embargo, es / probablemente una enzima termorresistente. / (cont.) Ambas enzimas resultan ser prometedoras / en la industria de biocombustibles, por lo que su clonaci��n ya est�� en proceso y su / caracterizaci��n bioqu��mica se har�� consecuentemente. Se requieren estudios posteriores / para determinar si las especulaciones aqu�� realizadas son o no verdaderas.
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Detecci��n de mutaciones en el gen CEBPA por secuenciaci��n en 42 pacientes con leucemia aguda mieloide

Hegewisch Taylor, Jennifer 07 May 2012 (has links)
La Leucemia Mieloide Aguda conforma un padecimiento hematol��gico de caracter��sticas heterog��neas. Estas neoplasias, en ocasiones presentan diversas anormalidades moleculares y citogen��ticas que permiten estratificar el riesgo que representa para el paciente y proporcionar una terapia adaptada a ��ste. Dichas anormalidades funcionan como marcadores moleculares con un alto valor pron��stico para la enfermedad. Uno de los marcadores de buen pron��stico est�� representado por las mutaciones en el gen CEBPA. El objetivo principal que persigui�� este proyecto fue detectar las mutaciones en dicho gen por medio de la secuenciaci��n en 42 pacientes con LMA. Para lograr esto, se optimiz�� la amplificaci��n del gen CEBPA partiendo de lo descrito en la literatura por Ahn, J. et al en el 2009. A su vez, se determin�� la frecuencia de algunas translocaciones y mutaciones como PML-RARA, RUNX1/RUNX1T1, CBFB/MYH11, NPM1 y FLT3 y su relaci��n con el gen CEBPA. A trav��s de la secuenciaci��n, se localizaron 2 SNPs no patog��nicos reportados en m��ltiples pacientes y 5 mutaciones (12%) de variante inserci��n/deleci��n en 5 pacientes. Una de estas mutaciones se encontr�� antes del dominio de transactivaci��n del gen, provocando la formaci��n incrementada de la isoforma truncada de CEBPA, factor importante de la leucemog��nesis. / (cont.) Se reportaron dos mutaciones en el espacio intermedio entre los dominios de transactivaci��n y el dominio b��sico, 2 m��s ocurrieron entre el dominio b��sico y el cierre de leucina y otra se localiz�� en el dominio b��sico. Una mutaci��n en CEBPA se present�� junto con la translocaci��n PML/RARA y otra junto con la mutaci��n FLT3 D835X. Tres pacientes con mutaciones en CEBPA presentaron alto n��mero de blastos en general, mientras que dos de ellos presentaron CD7 aberrante y leucocitosis. En conclusi��n, el m��todo de secuenciaci��n es adecuado para localizar las mutaciones en el gen CEBPA que confieren un pron��stico favorable al paciente.
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Avalia??o da participa??o de canais de c?lcio voltagem-dependentes sobre a resposta pruritog?nica em camundongos

Maciel, Izaque de Sousa 24 January 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 455926.pdf: 1580649 bytes, checksum: 43ccab4db0f539ea4361b47f57d0cedd (MD5) Previous issue date: 2014-01-24 / We assessed the effects of pharmacological spinal inhibition of voltage-gated calcium channels (VGCC) in mouse pruritus. The epidural administration of P/Q-type MVIIC or PhTx3.3, L-type verapamil, T-type NNC 55-0396 or R-type SNX-482 VGCC blockers failed to alter the scratching behavior caused by the PAR-2 activator trypsin, injected into the mouse nape skin. Otherwise, trypsin-elicited pruritus was markedly reduced by the spinal administration of preferential N-type VGCC inhibitors MVIIA and Phα1β. C. magus-obtained toxin MVIIA displayed significant effects when dosed from 1 to 4 h before trypsin, whereas the effects of P. nigriventer-derived Phα1β remained for up to 12 h. MVIIA or Phα1β also prevented the itching elicited by intradermal (i.d.) injection of SLIGRL-NH2, compound 48/80 or chloroquine, although they did not affect H2O2-induced itching. Furthermore, the co-administration of MVIIA or Phα1β markedly inhibited the pruritus caused by the spinal injection of gastrin-releasing peptide (GRP), but not morphine. Notably, spinal MVIIA or Phα1β greatly prevented chronic pruritus allied to dry skin. However, either toxin failed to alter the edema formation or neutrophil influx caused by trypsin. In addition, epidural MVIIA or Phα1β did not modify the expression of GRP receptor (GRP-R) in the spinal cord, whilst they brought c-Fos activation to control levels. Finally, the in vitro incubation of MVIIA or Phα1β prevented the calcium influx evoked by the synthetic PAR-2 agonist AC264613 in spinal cord synaptosomes. Data brings novel evidence on itching transmission mechanisms, pointing out the therapeutic relevance of N-type VGCC inhibitors to control refractory pruritus. / Foram avaliados os efeitos da inibi??o farmacol?gica dos canais de c?lcio voltagem-dependentes (CCVD) no prurido em camundongos. A administra??o intratecal (i.t.) dos bloqueadores CCVD do subtipo P/Q (MVIIA ou PhTx3.3), subtipo L (verapamil), subtipo T (NNC 55-0396) ou do subtipo R (SNX-482) n?o alterou o comportamento de co?ar induzido pela tripsina (agonista do receptor PAR-2), aplicada na regi?o dorsal do pesco?o de camundongos. Entretanto, o comportamento de co?ar induzido pela tripsina foi significativamente diminu?do pela administra??o i.t. dos bloqueadores de CCVD do subtipo N (MVIIA e Phα1β). A toxina MVIIA, derivada do C. magus, apresentou efeitos significativos quando administrada entre 1 a 4 horas antes da aplica??o de tripsina. Por outro lado, a toxina Phα1β derivada do veneno da aranha P. nigriventer demonstrou atividade, quando injetada at? 12 h antes da tripsina. O pr?-tratamento com MVIIA ou Phα1β foi efetivo em inibir o comportamento de co?ar induzido pela aplica??o intrad?rmica (i.d.) de SLIGRL-NH2, composto 48/80 ou cloroquina; entretanto, as toxinas n?o inibiram o comportamento de co?ar induzido pela inje??o i.d. de H2O2. A co-inje??o de MVIIA ou Phα1β inibiu o comportamento de co?ar induzido pela aplica??o i.t. do pept?deo liberador de gastrina (GRP), mas n?o inibiu o prurido causado pela morfina. Relevantemente, a administra??o i.t. da toxina MVIIA ou Phα1β inibiu a coceira cr?nica induzida pelo modelo de pele seca em camundongos. A atividade anti-pruritog?nica de ambas as toxinas n?o parece estar relacionada com a modula??o do processo inflamat?rio na pele, uma vez que as toxinas MVIIA ou Phα1β n?o foram capazes de inibir o edema e a migra??o de neutr?filos induzidos pela aplica??o i.d. de tripsina. A aplica??o i.t. de MVIIA ou Phα1β n?o modificou a express?o do receptor para o GRP (GRP-R) na medula espinhal. Por outro lado, as duas reduziram a express?o de c-Fos aos n?veis do grupo controle, de acordo com a avalia??o na medula dos camundongos. Finalmente, a incuba??o de MVIIA ou Phα1β preveniu o influxo de c?lcio estimulado pelo agonista do receptor PAR-2 AC264613 em sinaptossomas de medula de camundongos. Estes resultados trazem uma nova perspectiva acerca dos mecanismos envolvidos na sinaliza??o da coceira, indicando os inibidores de CCVD do subtipo N como poss?veis estrat?gias para o tratamento do prurido, especialmente nas condi??es onde h? aus?ncia de resposta ? terapia atual.
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Modula??o da neurotransmiss?o colin?rgica como resposta aos efeitos causados pela exposi??o ao nanocomposto de carbono fulereno c60 utilizando zebrafish (danio rerio) como modelo de estudo

Forno, Gonzalo Ogliari Dal 26 August 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 435930.pdf: 928390 bytes, checksum: 7d9c63e8c3ebdc0a8df50f72dcdee9ab (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Nanocomposites derived from carbon atoms have been the focus of interest in various industrial fields such as electronic engineering, pharmaceuticals, medical devices, cosmetics, food packaging and other, since its discovery in 1985. Fullerene C60 is a nanocomposite with 60 carbon atoms, which has been the subject of numerous studies for its ability to store atoms in the interior and accept various structural modifications. The importance of understanding all the possible effects of exposure to fullerenes is very great, since its production and its use is growing every day increasing environmental exposure to this compound. The cholinergic system has as its main neurotransmitter acetylcholine (ACh). The acetylcholinesterase (AChE, EC3.1.1.7) is an important regulatory enzyme that controls the transmission of nerve impulses across cholinergic synapses by hydrolysis of the ACh. AChE levels are controlled by the interaction of ACh with its receptors, and when the interaction is enhanced, the levels of AChE are increased. Therefore, AChE can be used as a marker of cholinergic function. In this study our goal was to determine whether intraperitoneal injections of fullerene C60 at the doses of 7.5, 15 and 30 mg/kg and the time of 6h, 12h and 24h of exposure would cause a change in the modulation of the cholinergic system. We observed that the dose of 30 mg/kg in the exposure time of 24 hours showed a 84% increase in enzyme activity compared with the vehicle control group. These results suggest a possible neurotoxic effect. Further studies should be conducted to extend these findings. / Nanocompostos derivados de ?tomos de carbono t?m sido foco de interesse para aplica??es em v?rios campos industriais, tais como engenharia eletr?nica, produtos farmac?uticos, dispositivos m?dicos, cosm?ticos, embalagens de alimentos, entre outros, desde seu descobrimento em 1985. O fulereno C60 ? um nanocomposto com 60 ?tomos de carbono que tem sido alvo de in?meros estudos por suas propriedades como a capacidade de armazenar ?tomos em seu interior e aceitar diversas modifica??es estruturais. A import?ncia de entendermos todos os poss?veis efeitos de uma exposi??o aos fulerenos ? muito grande, j? que a sua produ??o e sua utiliza??o est?o crescendo a cada dia aumentando a exposi??o do meio ambiente a este composto. O sistema colin?rgico tem como principal neurotransmissor a acetilcolina (ACh). A acetilcolinesterase (AChE, E.C.3.1.1.7) ? uma importante enzima regulat?ria que controla a transmiss?o de impulsos nervosos atrav?s da sinapse colin?rgica pela hidr?lise da ACh. Os n?veis de AChE s?o controlados pela intera??o da ACh com seus receptores, sendo que quando a intera??o ? acentuada, aumentam os n?veis de AChE Portanto, a AChE pode ser usada como um marcador da fun??o colin?rgica. Neste estudo nosso objetivo foi verificar se inje??es intraperitoneais de fulereno C60 nas doses de 7,5; 15 e 30 mg/kg e nos tempos de 6h, 12h e 24h de exposi??o causaria alguma altera??o na modula??o do sistema colin?rgico. Observamos que a dose de 30 mg/kg, no tempo de exposi??o de 24h, apresentou um aumento de 84% na atividade enzim?tica quando comparado com o grupo controle-ve?culo. Estes resultados sugerem um poss?vel efeito neurot?xico, embora estudos adicionais devam ser realizados para estender estes achados.
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Efeito da cafe?na e dos receptores de adenosina na inflama??o induzida por cobre em larvas de zebrafish (Danio rerio)

Cruz, Fernanda Fernandes 22 February 2016 (has links)
Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-05-17T11:43:35Z No. of bitstreams: 1 DIS_FERNANDA_FERNANDES_CRUZ_COMPLETO.pdf: 1282066 bytes, checksum: 5b0d649de7173c518fd09040b6012a0b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T11:43:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_FERNANDA_FERNANDES_CRUZ_COMPLETO.pdf: 1282066 bytes, checksum: 5b0d649de7173c518fd09040b6012a0b (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Zebrafish (Danio rerio) is a bony fish originated in Pakistan and India with anatomical and physiological characteristics and its genome is homologous to the more developed organisms, which suggests that many genes involved in human diseases can be coincident to the zebrafish genome. Copper is a heavy metal involved in formation of ROS, responsible for the lipid peroxidation in the membrane, direct protein oxidation and cleavage of DNA and RNA molecules. Purines (ATP, ADP and adenosine) and pyrimidine (UTP and UDP) can act as extracellular signaling molecules, exerting different physiological effects when binding to purninergic receptors. There are two families of purinergic receptors: adenosine receptors or P1 (P1R), and P2 receptor (P2R). The P1R are a family of G protein-coupled receptors and are divided inA1, A2A, A2B, and A3 subtypes. Adenosine is the major ligand for P1R, and is involved in important physiological functions such as modulation of neurotransmitter release, synaptic plasticity, neuroprotection to ischemic events, hypoxia and oxidative stress. Studies suggest that drugs that interfere in adenosine signaling may weaken the protective mechanisms and lead to an exacerbation of the inflammatory response. Caffeine is the most widely consumed psychoactive substance in the world and is a nonselective antagonist of adenosine receptors. This study aimed to evaluate the effect of caffeine in copper-induced inflammation in zebrafish larvae. The animals were treated with copper at a concentration of 10 ?M and three different concentrations of caffeine (100 ?M, 500 ?M e 1 mM) to determine the survival rate and to define timepoints and concentrations for the following experiments. It was observed that high concentrations of caffeine combined with copper caused a significant decrease of larvae survival after 24 h of treatment. For the following experiments, we chose 4 and 24 h of exposure, 500 ?M caffeine and 10 ?M copper concentrations. After 4 h of treatment, caffeine was able to change the behavior parameters. It was shown that both copper and caffeine might have an anxiogenic effect on zebrafish larvae after 24 h exposure. For the evaluation of inflammatory profile, inflammation markers PGE2, COX-2, TNF, IL-6 and IL-10 were chosen. In 4 hours of exposure, PGE2 levels are increased in groups treated with copper and caffeine. Caffeine showed an additive effect on the PGE2 release. The gene expression of TNF, as well as COX-2 was increased by copper treatment, however, in treatments with caffeine there was a reduction of COX-2 gene expression. In 24 h of treatment, caffeine induced an increase in COX-2, TNF, IL-6 and decrease IL-10 expression. The treatment with copper and caffeine combined increased the expression of the four adenosine receptor subtypes, especially after 4 h of exposure. This may be a result of receptors blockade by caffeine, or a physiological response to inflammation induced by copper, since adenosine, in general, exerts an anti-inflammatory effect. Although caffeine markedly decreased animal survival when combined to copper, caffeine did not potentiate the inflammatory and behavioral effects induced by copper. Our results suggest that caffeine alone is able to exert inflammatory and anxiogenic actions in zebrafish larvae at the timepoints and concentrations assessed. / O zebrafish (Danio rerio) ? um peixe ?sseo origin?rio do Paquist?o e da ?ndia com caracter?sticas anat?micas e fisiol?gicas hom?logas aos organismos mais desenvolvidos. Possui o seu genoma mapeado, com homologia ao genoma humano, o que sugere que diversos genes envolvidos em doen?as humanas podem ser coincidentes ao do genoma do zebrafish. O cobre ? um metal pesado que est? envolvido na produ??o de esp?cies reativas de oxig?nio, respons?veis pela peroxida??o de l?pidios nas membranas, oxida??o direta de prote?nas, e clivagem de mol?culas de DNA e RNA. Purinas (ATP, ADP e adenosina) e pirimidinas (UTP e UDP) extracelulares podem atuar como mol?culas sinalizadoras end?genas exercendo diferentes efeitos fisiol?gicos. Para tais ligantes, existem duas fam?lias de receptores purin?rgicos: receptores de adenosina ou P1 (P1R), e receptores P2 (P2R). Os P1R t?m como ligante end?geno a adenosina, e s?o uma fam?lia de receptores metabotr?picos, acoplados ? prote?na G, e se dividem nos subtipos A1, A2A, A2B e A3. A sinaliza??o mediada pela adenosina est? envolvida em importantes fun??es fisiol?gicas, como a modula??o da libera??o de neurotransmissores, plasticidade sin?ptica, neuroprote??o em eventos isqu?micos, hip?xia e estresse oxidativo. Estudos sugerem que subst?ncias que interferem na sinaliza??o adenosin?rgica na hip?xia podem enfraquecer os mecanismos protetores, resultando no aumento da resposta inflamat?ria. A cafe?na (1,3,7 ? trimetilxantina) ? a subst?ncia psicoativa mais consumida no mundo e ? um antagonista n?o seletivo dos receptores de adenosina. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da cafe?na na inflama??o induzida por cobre em larvas de zebrafish. Os animais foram tratados com cobre na concentra??o de 10 ?M e com outras 3 concentra??es diferentes de cafe?na (100 ?M, 500 ?M e 1 mM). Foi observado, que altas concentra??es (500 ?M e 1 mM) de cafe?na juntamente com o cobre provocaram um aumento significativo na mortalidade das larvas ao final de 24 horas de tratamento. Para os experimentos seguintes, foram escolhidos os tempos 4 e 24 horas e a concentra??o de 500 ?M de cafe?na e 10 ?M de cobre. Em 4 horas de tratamento, a cafe?na foi capaz de alterar os par?metros de comportamento avaliados. Foi demonstrado que tanto o cobre quanto a cafe?na, podem exercer um efeito ansiog?nico nas larvas de zebrafish ap?s 24 horas. Para a avalia??o do perfil inflamat?rio, foram escolhidos os marcadores de inflama??o PGE2, COX-2, TNF, IL-6 e IL-10. Foi mostrado que em 4 horas de exposi??o h? um aumento dos n?veis de PGE2 nos grupos tratados com cobre e cafe?na, mostrando um efeito aditivo da cafe?na em rela??o ? inflama??o induzida por cobre. A express?o g?nica de TNF, bem como a de COX-2 foi aumentada pelo tratamento com cobre, por?m, nos tratamentos com cafe?na houve uma diminui??o da express?o g?nica de COX-2. Em 24 horas de tratamento, a cafe?na induziu um aumento na express?o de COX-2, TNF, IL-6 e diminui??o de IL-10. Os tratamentos com cobre e cafe?na aumentaram a express?o dos 4 subtipos de receptores de adenosina principalmente ap?s 4 horas de exposi??o. Isso pode ser devido ao bloqueio dos receptores pela cafe?na e por uma medida fisiol?gica de defesa em resposta ? inflama??o induzida pelo cobre, visto que a adenosina, de uma forma geral, exerce um efeito anti-inflamat?rio. Embora a cafe?na tenha induzido uma diminui??o significativa da sobrevida dos animais, quando adicionada ao tratamento com cobre, nos marcadores inflamat?rios e nos par?metros comportamentais estudados, n?o houve um efeito aditivo da cafe?na na inflama??o induzida pelo cobre. Nossos resultados sugerem que a cafe?na por si s? ? capaz de exercer uma a??o inflamat?ria e ansiog?nica em larvas de zebrafish nos tempos e concentra??es estudados.
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A enzima chiquimato quinase (EC 2.7.1.71) de Mycobacterium tuberculosis como alvo para o desenvolvimento de drogas

Rosado, Leonardo Astolfi 23 February 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 430225.pdf: 4266902 bytes, checksum: 4436e37d2d21598e8ed023afd34398a2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-23 / A tuberculose prevalece como uma das principais causas de morte no mundo ocasionadas por um ?nico agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. A enzima Chiquimato Quinase (MtSK) codificada pelo gene aroK de M. tuberculosis, quinta enzima da via do chiquimato. catalisa a transfer?ncia de um grupo fosfato do ATP para o carbono 3 do grupo hidroxila do chiquimato, formando chiquimato-3-fosfato e ADP. A interrup??o do gene aroK demonstrou que a enzima MfSK ? essencial para a viabilidade do M. tuberculosis. Neste trabalho, apresentamos a purifica??o da enzima MtSK at? a homogeneidade, an?lise por espectrometria de massa, sequenciamento de amino?cidos da por??o N-Terminal, determina??o do estado oligom?rico da enzima em solu??o, cin?tica em estado estacion?rio, espectroscopia de fluoresc?ncia e calorimetria de titula??o isot?rmica. Os resultados encontrados sugerem que a rea??o catalisada pela enzima monom?rica MtSK segue um mecanismo em equil?brio-r?pido aleat?rio para a adi??o dos substratos e uma libera??o ordenada dos produtos, onde a libera??o do chiquimato-3-fosfato ? seguida pela libera??o do ADP, resultando na enzima na sua forma livre. Os resultados de calorimetria demonstraram uma grande diferen?a de calor gerada na associa??o da enzima livre aos seus ligantes, revelando assinaturas termodin?micas de intera??es n?o-covalentes para cada processo de liga??o. Estes resultados ajudaram a compreender melhor o modo de a??o da enzima MtSK e podem subsequentemente serem ?teis para guiar o desenho racional de inibidores relacionados a esta enzima e que possam ser avaliados posteriormente como anti-TB.
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Estudos bioqu?micos da enzima GMP sintase (EC 6.3.5.2) de Mycobacterium Tuberculosis H37RV como primeiro passo para a obten??o de amostras atenuadas

Franco, Tathyana Mar Amorim 24 August 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 434470.pdf: 6587349 bytes, checksum: 405b1e4ec3fc9ec1beb9e4856acacdf7 (MD5) Previous issue date: 2011-08-24 / Aproximadamente 1/3 da popula??o mundial est? infectada com o Mycobacterium tuberculosis, agente etiol?gico da tuberculose humana (TB). A incid?ncia global e o constante aumento da resist?ncia ?s drogas tornam evidente a urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas, para o tratamento, e vacinas, para a preven??o desta doen?a. As enzimas das vias metab?licas fundamentais s?o vistas como atrativos alvos moleculares definidos. A enzima guanosina monofosfato sintase (GMPS), uma amidotransferase do tipo G, catalisa a amina??o da xantosina monofosfato (XMP) ? guanosina monofosfato (GMP), em uma rea??o que ocorre em dois dom?nios, o glutamina amidotrasferase e o adenosina trifosfato (ATP) pirofosfatase, onde ocorre o ataque do intermedi?rio altamente reativo adenil-XMP, levando a forma??o de GMP. O gene guaA (Rv3396c), o qual codifica a enzima GMPS, foi identificado por homologia de sequ?ncia no genoma de M. tuberculosis H37Rv. N?s evidenciamos que a forma??o do adenil-XMP causa uma inibi??o da enzima pelo aumento dos n?veis de ATP e XMP. Al?m disso, a GMPS de M. tuberculosis (MtGMPS), apresentou um comportamento alost?rico na varia??o dos n?veis de XMP, demonstrando cooperatividade positiva e diferentes aspectos cin?ticos dos j? reportados para as enzimas de humanos e Escherichia coli. O mecanismo ping-pong foi proposto com base nos resultados evidenciados pela libera??o de pirofosfato (PPi) depois da liga??o da am?nia, corroborando com os dados previamente publicados para outras GMPSs. Nossos resultados podem ser ?teis por revelar o papel desta enzima no metabolismo de purinas do M. tuberculosis, fornecendo conhecimento para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para o tratamento e preven??o, respectivamente
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Avalia??o do efeito anti-tumoral de uma s?rie de chalconas derivadas da quinoxalina sobre gliomas - estudo in vitro

Mielcke, T?nia Regina 20 January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 436876.pdf: 1707187 bytes, checksum: a5856afc9a54d87e34f88e782140d450 (MD5) Previous issue date: 2012-01-20 / Gliomas are the most common and devastating tumors of the central nervous system (CNS). Among the gliomas group, the GBM is the most prevalent, aggressive and deadly malignant. Many pieces of evidence point out the relevance of natural compounds for cancer therapy and prevention, including chalcones. Chalcones are group of natural precursors of flavonoid and display a wide variety of biological and pharmacological proprieties that include anti-proliferative and anti-cancer activities. This study aimed at evaluating the in vitro anti-proliferative activity and cell viability inhibition of nine quinoxaline derived chalcones, structurally based on the selective PI3Ky inhibitor AS605240. These synthetic compounds were tested at different time-periods of incubation (24, 48 e 72 h) and concentrations (0,1; 0,1; 1; 5 e 10 μg/mL) in glioma cell lines from human and rat origin (U-138 MG and C6, respectively). The results showed by MTT assay and cell couting revealed that four chalcones (compounds N2, N9, N10 and N12), displayed higher efficacies and potencies, being able to inhibit either cell proliferation or viability, in a time- and concentration dependent manner. These four compounds which present methoxy groups at A-ring and their efficacy was greater than that seen for the positive control compound AS605240. Flow cytometry analysis demonstrated that incubation of C6 cells with chalcone N9 led to G1 phase arrest, likely indicating an interference with apoptosis. Furthermore, chalcone N9 was able to visibly inhibit AKT activation, allied to the stimulation of ERK 1/2 MAP-kinase. The chalcones tested herein, especially those displaying a methoxy substituent at A-ring, might well represent promising molecules for the treatment of gliomas. / Os gliomas s?o os tumores do SNC mais comuns e devastadores. Dentre os gliomas, o GBM ? o mais prevalente, agressivo, maligno e apresenta um mau progn?stico. A relev?ncia dos compostos naturais, incluindo as chalconas, no tratamento e na preven??o do c?ncer est? sendo muito evidenciada. As chalconas formam um grupo de compostos naturais derivados dos flavon?ides que apresentam diferentes propriedades biol?gicas e farmacol?gicas, incluindo as atividades anti-proliferativas e anti-tumorais. O objetivo deste estudo foi avaliar a a??o anti-proliferativa e a capacidade de inibi??o da viabilidade celular in vitro de nove chalconas derivadas da quinoxalina, baseadas estruturalmente no inibidor seletivo de PI3Ky, o AS605240. Estes compostos sint?ticos foram testados em diferentes tempos de incuba??o (24, 48 e 72 h) e concentra??es (0,1; 0,1; 1; 5 e 10 μg/mL) em linhagens de glioma humano e de rato (U-138 MG e C6, respectivamente). Os resultados observados nos experimentos de MTT e na contagem celular revelaram que quatros chalconas (compostos N2, N9, N10 e N12), apresentaram grande efic?cia e pot?ncia, sendo capazes de inibir a prolifera??o e a viabilidade celular, de maneira tempo e concentra??o dependente. Estes quatro compostos que possuem radicais met?xi no anel A de sua estrutura demonstraram uma efic?cia superior ?quela do composto AS605240, usado como controle positivo. Os resultados da citometria de fluxo demonstraram que a incuba??o das c?lulas C6 com a chalcona N9 levaram a um bloqueio celular na fase G1, possivelmente indicando interfer?ncia com a apoptose. Al?m disto, a chalcona N9 foi capaz de inibir visivelmente a ativa??o da AKT, aliada ? estimula??o de ERK 1/2 MAP-quinase. As chalconas estudadas neste projeto, especialmente as que apresentam o radical metoxi no anel A, representam promissoras mol?culas para o tratamento dos gliomas.
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Estudo estrutural da enzima purina nucleos?deo fosforilase (E.C. 2.4.2.1) de Mycobacterium tuberculosis

Caceres, Rafael Andrade 18 January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437323.pdf: 4287591 bytes, checksum: a4736ecf5ed6c11a9d86f23c3c30d3b3 (MD5) Previous issue date: 2012-01-18 / Tuberculosis re-emerged in the mid 80s and currently about two million people die each year due to this disease. The resurgence of tuberculosis has become a threat to public health. The high susceptibility of HIV-infected patients and the proliferation of multi-drug resistant strains have created the need to develop new therapies. However, no new class of drugs against tuberculosis was developed in the last 45 years. Thus, it becomes imminent need to develop new antituberculosis agents. As purine metabolism could be implicated in mycobacterial latency the purine nucleoside phosphorylase (EC 2.4.2.1) has been proposed as target for development of antibacterial drugs. PNP catalyzes the reversible cleavage in the presence of inorganic phosphate of N-ribosidic bonds of the purine nucleosides and deoxynucleosides, except adenosine. This reaction generates the purine base and ribose (deoxyribose)-1-phosphate. PNP is specific for purine nucleosides in the β-configuration and cleaves the glycosidic bond with inversion of configuration to produce α-ribose-1-phosphate. In this work PNP was crystallized in association with inosine, hypoxanthine and acyclovir, substrate, product and inhibitor, respectively, and data were collected using synchrotron radiation. In addition, molecular dynamics simulations and isothermal titration calorimetry experiments were used to provide detailed information on the dynamic properties and to investigate the profile and thermodynamic affinities of MtPNP associated with these molecules. With obtained results we hope to contribute to the search of new selective inhibitors for MtPNP, since differences between the mycobacterial and human enzyme binding sites have been also identified, making structure-based drug design feasible. / A tuberculose ressurgiu na metade dos anos 80 e, atualmente aproximadamente dois milh?es de pessoas morrem por ano devido a esta doen?a. O ressurgimento da tuberculose tornou-se uma amea?a ? sa?de p?blica. A alta susceptibilidade dos pacientes infectados com HIV e a prolifera??o de cepas resistentes a m?ltiplas drogas t?m criado a necessidade de se desenvolver novas terapias. No entanto, nenhuma nova classe de drogas contra a tuberculose foi desenvolvida nos ?ltimos 45 anos. Deste modo, torna-se iminente a necessidade de se desenvolver novos agentes antituberculose. Como o metabolismo de purinas pode estar implicado na lat?ncia da micobact?ria, a purina nucleos?deo fosforilase de Mycobacterium tuberculosis (MtPNP) (EC 2.4.2.1) foi proposta como alvo para o desenvolvimento de drogas antibacterianas. A PNP catalisa a clivagem revers?vel, na presen?a de fosfato inorg?nico, de liga??es N-ribos?dicas de nucleos?deos e desoxinucleos?deos de purina, com exce??o da adenosina. Esta rea??o produz base p?rica livre e ribose (desoxiribose)-1-fosfato. A rea??o se processa com invers?o de configura??o, de β-nucleos?deos para α-ribose-1-fosfato. Neste trabalho a PNP foi cristalizada em associa??o com inosina, hipoxantina e aciclovir, substrato, produto e inibidor, respectivamente, e os dados foram coletados utilizando radia??o s?ncrotron. Al?m disso, a simula??o por din?mica molecular e experimentos de calorimetria por titula??o isot?rmica foram utilizadas para fornecer informa??es detalhadas acerca das propriedades din?micas, e investigar o perfil termodin?mico e afinidades da MtPNP associada com estas mol?culas. Com os resultados obtidos n?s esperamos contribuir para a busca de novos inibidores seletivos de MtPNP, j? que as diferen?as entre os s?tios de liga??o da enzima humana e de micobact?ria foram identificadas , tornando vi?veis projetos de desenho de drogas baseados na estrutura.
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An?lise da express?o dos receptores purin?rgicos P2X no c?ncer de bexiga

Carvalho, Daniela de Oliveira 21 February 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 458593.pdf: 1436191 bytes, checksum: b126309dee58688d2fe23cb45be67db7 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / The purinergic system can induce proliferation, differentiation and death on tumor cells. Different P2 purinergic receptors are involved in preventing the growth of these cells. Although the mechanisms are not completely known, they may represent interesting therapeutic targets to control tumors. The RT4 and T24 human tumor bladder cell lines have been used as low and high cancer malignancy phenotype models, respectively. Our research group has demonstrated that quercetin increases the ADP hydrolysis and inhibits ecto-5'-nucleotidase/ CD73, exerting an anti-proliferative effect on T24 cell lines. We also demonstrate that T24 cell lines expresses the purinergic enzymes CD39L4 and ecto-5'-nucleotidase / CD73, and have low hydrolytic activity of ATPase and ADPase in contrast to a high activity AMPase. These data suggest the involvement of the enzymes and purinergic receptors on progression the tumor of the bladder, as well as other tumor types. The objective of the present study was characterize the purinergic receptors P2X (1-7) expression profile on human bladder tumor cell lines and biopsies; and investigate the inflammatory genes that are up-regulated on high-grade human tumor bladder cells compared to low grade tumor bladder cells. Human bladder cells RT4 and T24 were obtained from the ATCC. Cells were cultured in DMEN and RPMI, respectively, supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS), under ideal conditions of cultivation Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey Kramer test. To confirm the relevance of P2X (1-7) receptors in bladder cancer, we have also assessed their expression in human biopsies. For this purpose, upon approval by the local ethics committee, specimens of bladder tumors and normal tissues were obtained from the same patients, who have been undergone surgical resection at the Hospital S?o Lucas/PUCRS. All samples were collected and rapidly frozen in -80?C with RNA holder. Tissue specimens were ground and then sonicated in a TRIzol kit. The mRNA level was analyzed using RT-PCR analysis. Real-time PCR revealed that the mRNA expression of P2X purinergic receptors, particulary P2X4R was significantly up-regulated on both T24 and RT4 cell lines. Data from human bladder tumor biopsies comparing to bladder normal tissue, showed that P2X6 and P2X7 receptors appeared to be most often up-regulated on tumor tissues. Twelve inflammation related genes, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 were significantly up-regulated on the grade III bladder tumor cell line T24 when compared to grade I bladder tumor cell line RT4. Our results indicate that the inflammation genes overexpressed may play an important role in regulating urinary bladder cancer. We can conclude that P2X purinoreceptors and inflammation genes are differentially distributed among normal bladder, low and high tumor bladder, which could contribute to the different characteristics of these different types of cells. / O sistema purin?rgico pode induzir a prolifera??o, diferencia??o e morte em c?lulas tumorais. Diferentes receptores purin?rgicos P2, est?o envolvidos na inibi??o do crescimento tumoral. Embora os mecanismos n?o sejam completamente conhecidos, estes receptores podem representar alvos terap?uticos interessantes no tumor de bexiga. As linhagens celulares derivadas de tumor de bexiga humano RT4 e T24 t?m sido usadas como modelo de baixa e alta malignidade de tumor, respectivamente. Estudos realizados pelo nosso grupo de pesquisa t?m demonstrado o envolvimento do sistema purin?rgico no tumor de bexiga. A quercetina aumenta a hidr?lise do ADP e inibe a ecto - 5' - nucleotidase / CD73, exercendo um efeito anti - proliferativo sobre as c?lulas T24. Tamb?m demonstramos que as linhagens de c?lulas T24 expressam enzimas CD39L4 e ecto - 5' - nucleotidase / CD73, e t?m baixa atividade hidrol?tica de ATPase e ADP?sica com uma elevada atividade AMP?sica. Estes dados sugerem o envolvimento das enzimas e receptores purin?rgicos na progress?o do tumor de bexiga, bem como em outros tipos de tumor. O objetivo do estudo ? caracterizar a express?o dos receptores purin?rgicos P2X (1-7) em bi?psias de c?ncer de bexiga e linhagens celulares de tumor de bexiga humano, relacionado com o perfil de genes inflamat?rios mais expressos nestas amostras. Metodologia: As linhagens celulares de bexiga humanas RT4 e T24 foram obtidas a partir da ATCC. As c?lulas foram cultivadas em meio RPMI e DMEN, respectivamente, suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB), sob condi??es ideais de cultivo. Para confirmar a relev?ncia dos receptores P2X (1-7) no tumor de bexiga, avaliou-se a express?o em bi?psias humanas. Para isso, ap?s aprova??o pelo comit? de ?tica local, amostras de tecidos normais e tumorais de bexiga foram obtidas dos mesmos pacientes, submetidos ? ressec??o cir?rgica no Hospital S?o Lucas / PUCRS. O RNA total dos tecidos foi isolado utilizando kit TRIzol . O n?vel de mRNA foi analisado utilizando an?lise RT - PCR . Resultados: O PCR em tempo real revelou que a express?o de mRNA de receptores purin?rgicos P2X, particularmente P2X4R foi significativamente up- regulada em ambas linhagens RT4 e T24. Dados a partir de bi?psias de tumores de bexiga humanos que comparam os resultados de express?o do tecido tumoral em rela??o ao tecido normal de bexiga, demonstrou que os receptores de P2X6 e P2X7 est?o superexpressos em tecidos tumorais. Doze genes relacionados com a inflama??o, CCL2, CCR2, TNF-α, MAPK3, IL-1β, IL-6, ADORA1, CD200, CD4, CHRNA4, EDNRA e ITGB2 foram significativamente superexpressos em c?lulas T24 derivadas de tumor de grau III quando comparadas com as c?lulas RT4 derivadas de tumor de grau I. Nossos resultados indicam que os genes superexpressos de inflama??o podem desempenhar um papel importante na regula??o do tumor de bexiga urin?ria. Conclus?o: Podemos concluir que purinoreceptores P2X e os genes inflamat?rios s?o diferencialmente distribu?dos entre bexiga normal e tumoral, o que pode contribuir para as diferentes caracter?sticas destes diferentes tipos de tumores.

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