Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4448_1.pdf: 2774975 bytes, checksum: c7c7d03caaf9547f31713e6e0e0268fc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Desde seu isolamento por Lindner em 1924, Zymomonas mobilis tem demonstrado um grande potencial probiótico. Dentre as características para seleção de um probiótico inclui-se sua tolerância ao ácido e à bile, que garante a manutenção da viabilidade durante sua passagem pelo trato gastrintestinal. Com base nestes critérios, foi objetivado a caracterização da ácido-bile tolerância de treze cepas de Zymomonas mobilis isoladas de fermentação alcoólica. Numa primeira etapa foram selecionadas cepas tolerantes ao ácido ou à bile, cuja avaliação foi realizada pela enumeração das unidades formadoras de colônias (UFC/mL), após quatro horas de contato em meio de cultura de SSDL acidificado, com diferentes valores de pH, ou pela incorporação, ao meio, de diferentes concentrações de bile bovina. A segunda etapa constou de uma avaliação da tolerância à 0,3% de bile bovina associada ao meio de SSDL acidificado (pH(s) 2,5; 3,0 e 4,0). Todas as cepas cresceram em meio contendo concentrações iguais ou inferiores à 0,5% de bile bovina ou em pH igual ou superior a 3. Todas as cepas sobreviveram em meio SSDL pH 4,0 contendo 0,3% de bile bovina, após 4 horas de contato, cujos percentuais de viabilidade variaram de 58,61% a 87,66%, dependendo da cepa estudada

Orientador : Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T23:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brandao_MariaElviraGama_M.pdf: 2783756 bytes, checksum: 91db48d95c1136163926ee194130b5a7 (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: A pirofosfatase inorgânica foi purificada do gérmen de milho cerca de 174 vezes, com rendimento de 2,6% utilizando-se centrifugações diferenciais, saturação fracionada com sulfato de amônio e cromatografias em DEAE-sephadex. Com a enzima parcialmente purificada foram determinadas as condições ótimas de reação de hidrólise do Ppi: 2 mM Ppi, 5 mM Mg2+, pH=8,3. O valor da Km aparente obtido para o Ppi foi de 59uM. A enzima é bastante específica para o Ppi e Mg2+. Observou-se que outros cátions não servem como cofatores, sendo que Ca2+ é um forte inibidor. Cátions polivalentes como as poliaminas também não substituem o Mg2+ na reação. Com relação aos cátions monovalentes. Observou-se uma inibição de 40% em presença de 100 mM de Li+. A reação catalisada pela pirofosfatase inorgânica de gérmen de milho não foi significativamente afetada por reagentes sulfidrílicos como o NEM e o DTNB. Ppi ou Mg2+, isoladamente, não protege a enzima de inativação térmica à 55 ºC. Dois valores diferentes de energia de ativação, 10165 cal/mol e 16715 cal/mol foram obtidos utilizando-se equação de Arrhenius...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The inorganic pyrophosphatase was purified from maize germ about 174-fold with a 2.6% recovery, using differential centrifugations, ammonium sulfate precipitation and chromatographies on DEAE-cellulose and DEAE-sephadez. With the enzyme partially purified it was determined the optima conditions of the Ppi hydrolysis reaction: 2 mM Ppi, 5 mM Mg2+, pH 8.3. The apparent Km value obtained for Ppi was 59 uM. The enzyme was hiphly specific in relation to Ppi ad to Mg2+. It has been observed that other divalent cations did not serve as cofactors, and Ca2+ was a strong inhibitor. Mg2+ could not be substituted for polivalent cations like polyamines. Among the monovalent cations tested a 40% inhibition was observed in the presence of 100 mM Li+. The reaction catalyzed by maize germ inorganic pyrophosphatase was not significantly affected by sulfydrylic reagents like NEM and DTNB. The enzyme was not protected against thermal inactivation, at 55 ºC, in the presence of Ppi or Mg2+. Two different activation energy values, 10165 cal/mol and 16715 cal/mol were obtained using the Arrhenius plot....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Julia Prado Franceschi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T00:31:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Donato_JoseLuiz_M.pdf: 3688292 bytes, checksum: 2e7a0147e00d44423d6b315b1646bccc (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: Peçonhas ofídicas são constituídas principalmente de proteínas. Muitas destas proteínas tem características enzimáticas como as fosfolipases, proteases, esterases, L-aminoacido oxidase, entre outras. Inicialmente, comparamos as atividades enzimáticas e biológicas da peçonha de Bothrops Lanceolatus em relação as atividades de sete espécie de bothrops brasileiras (B-alternatus, B. erythromelas, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B moojeni e B. neuwiedi). Determinados assim, que a peçonha Bothroes lanceolatus apresenta altas atividades caseinolitica, fosfolipasica, esterasica, sobre o TAME e hemorragica, Além disso, apesar de não exibir atividade coagulante sobre plasma humano citratado, esta peçonha coagula o fibrinogenio o que sugere a presença de enzima (s) tipo trombina. Verificamos que, entre as peçonhas estudadas, a atividade TAME-esterasica não está diretamente relacionada com a atividade coagulante sobre plasma. O isolamento da fração esterasica da peçonha de B.lanceolatus foi feito utilizando-se cromatografias de exclusão e de troca iônica. Em cada etapa do isolamento, as amostras foram ensaiadas em relação as atividades TAME-esterasica, caseinolitica, fosfolipasica e coagulante sobre plasma e fibrinogênio humanos. Ao Final deste processo, foi obtida uma fração (F-II-1a ) com atividade esterasica 14,5 vezes maior do que a peçonha total. O rendimento protéico foi de 4%, com uma recuperação de 58% da atividade enzimática. Utilizando-se eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, constatamos que a proteínas presente na fração F-II-1a apresenta uma única cadeia polipeptídica, com peso molecular estimado em 38.100. Em testes de imunoeletroforese e imunodifusão, esta fração reagiu com o soro especifico como com o polivalente promovendo a formação de apenas uma linha precipitação. Estes resultados sugerem elevado grau de pureza da proteína presente na fração F-II-1a Utilizando o TAME como substrato, a fração F-II-1a apresentou os valores de 8,5 X 10 ¿4 M e 38,55 umoles/min/mg para km e velocidade máxima, respectivamente. A atividade TAME esterasica foi fortemente influenciada pelo pH do meio de reação, sendo o valor de 8,05 encontrado como o pH ótimo de hidrolise.Esta atividade não foi afetada pela EDTA 10 mM, ao passo que foi totalmente inibida por PMSF 5mM. A fração F-II-1a apresentou baixa atividade coagulante sobre plasma e fibrinogênio humanos, bem como, uma discreta atividade proterminado que a fração F-II-1a apresenta atividade A'alfa¿ e B 'beta¿ fibrinogenolitica. A cadeia A 'alfa¿ foi rapidamente hidrolisada(10min de reação), enquanto que a B¿beta¿ só foi hidrolisada em tempo prolongados de reação . Esta fração não teve efeito sobre a cadeia 'alfa¿, mesmo após 4h de hidrolise / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Sineli Rita Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T01:31:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alberto-Rincon_MariadoCarmo_M.pdf: 4271206 bytes, checksum: ed39f57ac859239c67f72a24323acfa9 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Os produtos resultantes da oxidação seletiva do acetato de DL alfa-tocoferol, do calciferol e do colesterol, por oxidantes diferentes, que constituíram a base para a padronização de três técnicas dotadas de especificidade histoquímica e que permitem a demonstração topoquímica dessas substâncias, foram estudados no presente. A análise dos produtos de oxidação, efetuada com base em resultados fornecidos pela espectrofotometria ultravioleta e infravermelha, pela espectometria de massa, permitiu estabelecer as seguintes conclusões: 1. A comparação entre os produtos dotados da mesma reatividade histoquímica, mas provenientes da oxidação seletiva do acetato de DL alfa-tocoferol pelo ácido perfórmico, do calciferol pelo permanganato de potássio em meio alcalino e do colesterol pelo ácido peracético mostra que substâncias quimicamente diversas, dotadas de grupos reativos diferentes, são responsáveis por essa reatividade. Essa reatividade, portanto, embora seja semelhante, é exibida por grupos reativos diferentes. 2. Os grupos reativos responsáveis pelas propriedades histoquímicas adquiridas pela oxidação seletiva de cada uma das substâncias usadas foram identificadas, sendo os seguintes: 1 ? grupo epóxido e grupos cetônicos ligados ao anel cíclico, encontrados no alfa-tocoferol oxidado pelo ácido perfórmico; 2 grupo carbonila e grupos hidroxilas presentes no calciferol oxidado pelo permanganato de potássio em meio alcalino; 3 grupos redutores oriundos do grupo triol, presente no produto de oxidação do colesterol pelo ácido peracético / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Nilce Correa Meirelles / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T02:26:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_MarizaBoscacci_M.pdf: 2579138 bytes, checksum: c066ef8122b3a68af55b3a456800c50c (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: A hemoglobina gigante, extracelular de Glossoscolex paul istus apresenta uma massa molecular de 3 x 10 Da que se precipitação por (NH4 )250 4 , optando-se pelo primeiro para a execução dos experimentos. A apoproteína foi obtida e reconstituída na presença de hemina, observando-se estequiometria nesta ligação. Também estudamos o efeito dos íons di valentes Ca ++, Mg++ e Mri ++ sobre a afinidade da proteína pelo oxigênio tendo-se observado aumento de P50- pressão parcial de O2 para saturar 50 % dos sítios de ligação, dependente da concentração dos cátions e mudança na cooperatividade. Em presença de agentes desnaturantes (temperatura, álcalis e uréia) foram obtidos parâmetros cinéticos como K e t . d ½ Os experimentos de transição ácido-alcalina demonstraram a multiplicidade de populações da proteína na forma férrica / Abstract: The giant extracell ular hemoglobin of Glossoscolex paulistus has a molecular weight of 3 x 106 Da. Visualized by electron microscopy, the Glossoscolex paulistus hemoglobin presents two hexagonal superimposed disks In the present study, we compared two different methods of purification for this protein: ultracentrifugation and ammonium sulfate precipitation. Using the purified protein obtained by ultracentrifugation, functional and physico-chemical properties were studied. The apoprotein was obtained and reconsti tuted in the presence of hemin and a stoichiometric relation was observed for this reaction. We also studied the effects of divalent ions such as Ca++, Mg++ e Mn++ on the protein-oxygen affinity. An increase in P50 and also changes in cooperativity were observed in dependance of the cations concentration. Kinetic parameters as Kd and t 1/2 were obtained in the presence 01 denaturing agents (temperature, a1cali and urea). The experiments of the acid-a1cali transition showed the multiplicity of the protein-population in its ferric formo / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Memoria para optar el título de Bioquímico / Las microcinas son un grupo de bacteriocinas de bajo peso molecular (inferior a 10 kDa), producidas principalmente por miembros de la familia Enterobacteriaceae, que inhiben el crecimiento de otras bacterias estrechamente relacionadas con la cepa productora. Estas proteínas son resistentes a condiciones adversas como temperatura y pH extremos, resisten incluso a ciertas proteasas, son solubles en metanol y no son inducibles por el sistema SOS. De todas las microcinas conocidas, la microcina 24 es una de las menos estudiadas. Según la secuencia publicada en GenBank, la microcina 24 se sintetiza como una pre-proteína de 90 aminoácidos que contiene en su extremo amino terminal una señal de exportación, que es cortado en un motivo de doble glicina al ser exportada. La proteína madura (exportada) contiene 74 residuos y posee una masa teórica de 7527 Da. El mecanismo de acción de la microcina 24 no se conoce bien. Carlson y cols. en 2001 publicaron que posiblemente el blanco de acción de esta bacteriocina se encuentra en el citoplasma, sin embargo estudios preliminares de nuestro grupo revelan que el blanco de acción de la microcina 24 es la membrana citoplasmática. En este trabajo se planteó como objetivo caracterizar la expresión de la microcina 24 e identificar el mecanismo de acción por el cual genera la muerte bacteriana. Para caracterizar la expresión de la microcina 24 se analizó el sobrenadante de un cultivo de E. coli MC1061pGOB18, en diferentes etapas de crecimiento, en búsqueda de actividad antimicrobiana. Se determinó que la microcina 24 comienza a producirse en fase exponencial de crecimiento. Un análisis transcripcional mediante RT-PCR permitió observar que la microcina 24 se transcribe junto con su inmunidad en una sola unidad bicistrónica, lo que le permite a la cepa productora regular la expresión de la microcina 24, de manera tal que no resulte tóxica para sí misma. La purificación de esta microcina se realizó a partir del sobrenadante de un cultivo productor de microcina 24, en un sistema de cromatografía hidrofóbica en fase inversa utilizando como matriz sólida una columna de Sed-Pack C18 y diferentes concentraciones de metanol como eluyente. Las diferentes fracciones obtenidas fueron evaluadas en búsqueda de actividad antimicrobiana mediante ensayos de actividad en placa. La microcina presente en las fracciones que exhibieron actividad fueron re-purificadas mediante HPLC con columna Sed-Pack C8 como matriz sólida y acetonitrilo 40% como eluyente. Esta microcina purificada se sometió a un análisis mediante espectrometría de masa, encontrándose que la microcina 24 posee una masa experimental de 7274 Da, presentando una diferencia de 253 Da menos que la masa teórica deducida. Esta diferencia se debe a un error en la secuencia publicada en Genbank, la que fue detectada al secuenciar el sistema productor completo. La corrección de la secuencia permite deducir una masa teórica de 7293 Da, que se asemeja más al valor experimental. No sólo en la secuencia de la microcina se descubrió errores, también se observó una discrepancia en el gen mdbA que originalmente contenía un dominio incompleto de unión a DNA, pero luego de la corrección se observó que la proteína codificada contiene el dominio completo. Este dominio es común en proteínas de la familia H-NS que se unen a secuencias ricas en timinas y adeninas silenciando genes. En función a estas diferencias, los genes del sistema fueron renombrados como sigue: mcnR (antiguamente llamado mdbA), mcnI (mtfI), mcnN (mtfS), mcnA (mtfA) y mcnB (mtfB). Para determinar el mecanismo de acción de la microcina 24 se propuso como hipótesis que esta microcina genera poros en la membrana (en función a la alta identidad con la microcina E492, una microcina formadora de poros), ergo, siendo su mecanismo bactericida. Para demostrar esto se realizaron ensayos de actividad β galactosidasa en E. coli DH5a y E. coli HB101, recuento de células viables y microscopía de fluorescencia. En todos estos experimentos se concluyó que la microcina 24 permeabiliza la membrana interna de las bacterias sensibles. Considerando que todas las microcinas conocidas utilizan el sistema de transporte de hierro para ingresar a la bacteria, y que las mutantes carentes de los receptores Fep, Fiu y Cir siguen siendo sensibles a la microcina 24, se propuso que el receptor de la microcina 24 es FhuA. Analizando la sensibilidad de las cepas de E. coli C600, JM110 y P8, se demostró experimentalmente que el receptor para esta microcina es efectivamente la proteína FhuA (receptor del ferricromo hidroxamato). FhuA pertenece a un sistema de 4 miembros (FhuA, FhuC, FhuD, FhuB) encargados de la internalización del hierro, por medio del sideróforo ferricromo hidroxamato. Generando una mutante en los genes fhuCDB por el método de Wanner, se determinó que estos elementos participan en el mecanismo de acción y empleando mutantes individuales para fhuCDB se determinó que la microcina 24, al ingresar al periplasma por medio de FhuA, emplea las proteínas FhuD y FhuB para permeabilizar la membrana interna

Orientador: Ione Salgado Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:47:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gurgueira_SoniaAparecida_M.pdf: 3313451 bytes, checksum: 2ed39e393c3208651701b336b297afbe (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: A ATPase mitocondrial ligada à membrana e complexada com a proteína inibidora endígena é capaz de ligar fortemente e trocar até 3 moles de ADP por mol de 'F IND. 1¿. A maior parte desta ligação ocorre nos sítios não catalíticos da 'F IND. 1¿. Quando estas preparações são submetidas a condições que removem a PI ocorre uma queda na capacidade de ligação de ADP nos sítios não catalíticos que está linearmente correlacionada com o incremento na atividade hidrolítica da ATPase. Também, na presença de fosfoenolpiruvato (PEP) existe uma queda na ligação ADP nos sítios não catalíticos ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The membrane bound mitochondrial ATPase complex with its endogenus inhibitor protein (IP) has the capacity to bind tightly and exchange up to three mols of ADP per mol of 'F IND. 1¿, most of the binding occuring at noncatalytic sites. Qhen these preparations are submitted to conditions known to remove IP action there is a decrease of ADP binding at noncatalytic sites that is linearly correlated with an increase on the ATPase activity. In the presence of phosphoenolpyruvate there is also a decrease on the binding of ADP at noncatalytic sites. However, the ADP binding inhibition evoked by PEP did not result in an activation of the enzyme ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Aldo Focesi Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T20:11:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_HelioFrota_D.pdf: 3347626 bytes, checksum: f3808f8662ae40b47736d26baf219071 (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: A caracterização de três dos quatro componentes das hemoglobinas de Pipa pipae obtidos pela cromatografia em DEAE-sephadex mostrou que os três componentes bem como o hemolisado de eritrócitos apresentam uma afinidade pelo oxigênio na ordem de 4 mm de Hg quando em tampão bis-tris lactato 0,05M pH 7.0. A afinidade dessas moléculas pelo ligante CO apresenta uma afinidade 50 vezes maior que a apresentada pelo oxigênio e o efeito Bohr estudado nos equilíbrios com CO mostra-se praticamente nulo nas hemoglobinas isentas de cofatores e um aumento desse efeito para ¿ 0,3 é encontrado quandona presença de ATP ¿10 POT. ¿3¿M, sugerindo a existência de sítios de fosfato nos três componentes estudados. A cinética de desnaturação por benzoato de sódio 1M e uréia 7M mostra existir uma grande resistência da molécula quando isenta de cofatores e existir sensibilidade quando em presença do efetor alostérico. Com o agente desnaturante SDS a 1%, tanto a forma oxi como a forma deoxi se comportam de maneira semelhante à deoxihemoglobina humana, que sofre desnaturação de 20% das moléculas com esse tratamento, ao contrário da oxihemoglobina humana, que desnatura cerca de 80% das moléculas. Suspeitando ser as hemoglobinas de Pipa pipae estabilizadas na forma T (do modelo MWC) mesmo após a saturação, foi estudado seu comportamento frente ao ligante CO dentro dos parâmetros do esquema de Adair calculando-se as constantes intrínsecas de associação... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Three out of the four components of hemoglobin of Pipa pipae, obtained by DEAE-sephadex chromatography, were studied. The three components and the whol hemolisated showed an oxygen affinity around 4mm of HG when in bis-0,05M bis-tris-lactant buffer pH 7,0. the affinity of the molecules to CO binding is 50 times greater than that of the oxygen, the Bohr effect, studied in CO equilibria is, in practice, equal to zero in hemoglobins without cofactors. An increase of that effect of zero to ¿0,3 is observed in the presence of ¿10 POT. ¿3¿M of ATP, which indicates the existence of phosphate sites in the three components. The kinetics of denaturation by 1 M sodium benzoate and 7 M urea shows that there is a strong resistance of the stripped molecule to denaturation and there is sensibility when in the presence of the allosteric effector. With the denaturating agent SDS (1%) where both the oxy form and the deoxy form behave as the human deoxyhemoglobin which shows denaturation of 20% of the molecules, with the same treatment. Supposing that the hemoglobins of Pipi pipae are estabilezed in the T form (MWC model) even after te saturation, their behavior in the presence of the CO ligands was studied according to Adair¿s theory... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Gilberto de Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-17T08:03:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Landucci_ElenCristinaTeizem_M.pdf: 1201641 bytes, checksum: 4dfd3d2cfec465ae96a708250111e553 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: A crotoxina, o componente mais tóxico isolado do veneno de Crotalus durissus terrificus, é um complexo proteico reversível composto por um peptídeo ácido, não tóxico e sem ativadade enzimática (crotapotina) e um componente básico, responsável pela toxicidade do complexo, a fosfolipase A2 (PLA2). Sabendo-se que várias proteínas isoladas a partir de venenos interferem na coagulação sanguínea e agregação plaquetária, o objetivo deste trabalho foi o estudo da atividade da crotoxina sobre a agregação plaquetária. A crotoxina foi isolada através de gel filtração do veneno bruto em uma coluna de Sephadex G-75, eluída com tampão bicarbonato de amônio (0.1 M; pH 8.0). A agregação das plaquetas humanas lavadas foi monitorada utilizando-se um agregômetro Payton e a liberação de TXA2 foi medida através de radioimunoensaio (RIA). O fracionamento de 100 mg de veneno, resultou em três principais picos, sendo o segundo pico correspondente à crotoxina. O grau de pureza da crotoxina foi confirmado, utilizando-se o método de cromatografia de alto desempenho (HPLC) através de uma coluna C 18 µ Bondapack. Crotoxina (15-50 µg/ml), produz uma agregacão de plaquetas lavadas de modo dose-dependente e irreversível, agregação esta inibida por uma pré-incubação da suspensão de plaquetas com SNP (500 µM) ou lIoprost (100 nM). A crotoxina também induz a liberação de TXB2 (207±8 ng/ml, n=6). Nossos resultados demonstram que a crotoxina induz a agregação de plaquetas humanas lavadas, independente da liberação de produtos de ciclo-oxigenase, assim como apresenta importante atividade coagulante. / Abstract: Crotoxin, the main toxic component isolated from the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus, is a reversible protein complex composed of a non-toxic non-enzymatic acid peptide (crotapotin) and a toxic basic phospholipase A2 (PLA2). Since several venom proteins interfere in blood coagulation and platelet aggregation, the objective of this study was to evaluate whether crotoxin induces human washed platelet aggregation. Crotoxin was isolated by gel filtration of the crude venom on a Sephadex G-75 column eluted with ammonium bicarbonate buffer (0.1 M, pH 8.0). Human washed platelet aggregation was monitored in a Payton aggregometer and thromboxane release by direct RIA. Fractionation of 100 mg of Crotalus durissus terrificus venom yielded three main peaks,of which the second contained crotoxin. The purity of crotoxin was confirmed by high pressure liquid chromatography analysis on a C 18 µ Bondapack column. Crotoxin (15-50 µg/ml) produced dose-dependent and irreversible human washed platelet aggregation, which was inhibited by pre-incubation of the platelets with SNP (500 µM) or iloprost (100 nM) .Crotoxin also induced TXB2 release (207 ± 8 ng/ml, n=6), it did not inhibit crotoxin-induced aggrega!ion. Our results clearly demonstrate that crotoxin induces human washed platelet aggregation. Although previous reports state that crotoxin does not induce platelet aggregation, we presume that the difference observed is due to the procedure we have used (ammonium bicarbonate buffer instead of formate buffer) to elute crotoxin. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador : Anibal Eugenio Vercesi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T11:15:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leite_HelenaMariaFerreira_M.pdf: 5073478 bytes, checksum: f45ba206a5e644c432eb6057171da955 (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: Estudos recentes deste laboratório indicaram que o baixo grau de acoplamento entre a respiração e a fosforiIação oxidativa em mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata parece estar relacionado à existência de uma proteína de aproximadamente 35 KDa presente na membrana interna destas mitocôndrias, com a propriedade de transportar H+ por um mecanismo sensível a nucleotídeos de purina. No presente trabalho, obtivemos mitocôndrias de batata com controle respiratório mais elevado que em estudos anteriores, graças à modificações introduzidas no procedimento de isolamento. Ainda assim, a velocidade de respiração destas mitocôndrias, no estado IV, foi reduzida pela adição de ATP e ADP, mesmo na presença de carboxiatractilato (CAT). Experimentos de ligação de nucleotídeos de purina mostraram que estas mitocôndrias apresentaram a habilidade de ligar 1,3 nmol ATP.mg proteína; 1,1 nmol -1 . ¿1 ADP. mg proteína; 0,7 nmol GTP. mg ¿1 proteína. Experimentos de competição mostraram ainda: a maior afinidade de ligação destas mitocôndrias por nucleotídeos de adenina. A construção de um potencial de membrana mais elevado por mitocôndrias de batata e de cole6ptiles de milho é dependente da presença de BSA e nucleotídeos de purina. A presença destes não afeta o potencial construído por mitocôndrias de feijão, beterraba e fígado de rato. Anticorpos contra esta proteína de 35KDa isolada de mitocôndrias de batata foram obtidos e utilizando a técnica de Western Blotting foi verificado que as outras mitocôndrias vegetais em estudo neste laboratórIo como as de coleóptiles 'de milho, feijão e beterraba possuem esta proteína ou similar como mostrado pela reação cruzada com estes anticorpos. Contrariamente, uma série de mitocôndrias não vegetaIs, taIs como as de fígado de rato, coração bovino e T.cruzi epimastigotas não mostraram reação com estes anticorpos. Experimentos de reconstituição desta proteína isolada de batata e da UCP isolada de tecido adiposo marrom foram realizados e demonstraram que, no sistema por nós utilizado, elas apresentam comportamento similar, isto é, nas vesículas com proteína incorporada, a velocidade de efluxo de H + foi maior que em vesículas controle, preparadas na ausência de proteína / Abstract: Early studles from thls laboratory have lndicated that the low degree of coupling between respiration and oxidative phosphorylation in potato mitochondria seems to be related to a 35 KDa protein, present in the inner membrane of those mitochondria, with the ability to translocate H with a: mechanism sensitive to purine nucleotides. In this work, we obtained potato mitochondria with better respiratory control, thanks to modificatlons made in the isolation procedure. In spite of the lsolation method, the respiration rate of these mitochondria ln state IV decreased after additltion of ADP or ATP nucleotides ln the presence of carboxyatractylate (CAT). Binding experiments showed that the mitochondria have the ability to bind 1,3 nmol ATP.mg ¿1 protein 1,1 nmol ADP. Mg ¿1 protein; 0,7 nmol GTP. Mg -1proteln. Competition experiments showed the largest affinity of binding of these mltochondria towards adenlne nucleotides. The increase of potato and corn mitochondria membrane potential is dependent on the presence of BSA and purine nucleotides. The presence of BSA and nucleotides dld not affect the membrane potential of red beet roots (Beta vulgaris); bean (Phaseolus vulgaris) and rat liver mltochondria. Antibodies against a 35 KDa protein isolated from potato mitochondria were obtained and, using the Western blotting techique, we verified that the other plant mitochondria in studies in this laboratory, such as corn, red beet roots and bean, have this or a similar protein as shown by cross reactivity wlth these antibodies. In contrast a series of non-plant mitochondria, also studied in thls laboratory, such as those from rat liver, beef heart and T. cruzi epimastigotes did not show cross reactivity with these antibodies. Reconstitution experiments of this protéln and of UCP isolated from brown adipose tissue were performed and showed that, in the system used, they have similar behavior. In the vesicles with protein incorporated, the rate of H+ efflux was larger than in control vesicles, prepared without either protein / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas