Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T20:04:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289069.pdf: 722734 bytes, checksum: e7dbc3e1a0538c756cfe254ff14b6aac (MD5) / Candida glabrata é uma levedura encontrada normalmente no trato digestivo humano e mucosas humanas, mas em pacientes imunocomprometidos pode causar infecções sistêmicas de alta morbidade e mortalidade. Esta levedura perdeu vários genes envolvidos no metabolismo de açúcares, sendo capaz de assimilar somente glicose e trealose, uma característica importante no diagnóstico laboratorial deste patógeno emergente. Nosso trabalho se propôs a analisar o metabolismo da trealose, e as enzimas intracelulares (trealase neutra e trealase ácida) envolvidas na degradação deste açúcar. Nossos resultados indicam que embora C. glabrata metabolize a trealose de forma semelhante a outras leveduras (a trealose acumulada na fase estacionária do crescimento é prontamente degradada após suprir as células com glicose), a atividade da trealase neutra nestas células aparentemente não seria responsável pela degradação da trealose uma vez que sua atividade não aumentava no período de maior hidrólise deste açúcar. Nossos resultados também mostram que a alta atividade da trealase ácida presente nas células de C. glabrata, atrapalha a determinação da trealase neutra nestas células (baseado apenas na diferença de pH ótimo da atividade). Neste contexto a utilização de uma linhagem (RY01) deletada no gene CgATH1, e portanto sem atividade trealase ácida, foi fundamental para melhor caracterizar a atividade trealase neutra nesta levedura, e sua possível regulação. Esta enzima não mostrou maior atividade na fase exponencial do crescimento quando a glicose está presente como fonte de carbono, nem ativação por AMPc via proteína cinase A, embora os resultados indiquem que a trealase neutra de C. glabrata degrada trealose na fase exponencial, pois na cepa deletada RY01 observou-se um queda brusca nos níveis de trealose durante esta fase do crescimento. Diferenças significativas foram também observadas na metabolização de trealose durante o estresse térmico em C. glabrata, quando comparada a outras leveduras. / Candida glabrata is a yeast normally found in the human digestive tract and mucous membranes, but in immunocompromised patients can cause systemic infections with high morbidity and mortality. This yeast has lost many genes involved in sugar metabolism, being able to assimilate only glucose and trehalose, an important feature in the laboratory diagnosis of this emerging pathogen. Our study aimed to analyze the metabolism of trehalose, and the intracellular enzymes (neutral trehalase and acid trehalase) involved in its hydrolysis. Our results indicate that although C. glabrata metabolizes trehalose in a similar way as other yeasts (trehalose accumulated during the stationary phase of growth is rapidly hydrolyzed after supplying the cells with glucose), the neutral trehalase activity in this cells seemed not to be involved in trehalose degradation as its activity did not increase during the period of higher sugar hydrolysis. Our results also show that the high activity of the acid trehalase present in C. glabrata cells, impairs the accurate determination of the neutral trehalase in these cells (based only in optimal pH activity differences). In this context, the use of a strain (RY01) deleted in the CgATH1 gene, and consequently without acid trehalase activity, was pivotal to better characterize the neutral trehalase activity in this cells, and its possible regulation. This enzyme did not show higher activity during the exponential phase of growth when glucose is present as carbon source, neither AMPc activation through protein cinase A, although our results indicate that the C. glabrata neutral trehalase hydrolyses trehalose during the exponential phase, since in the RY01 deleted strain a rapid drop in trehalose levels during this growth phase was observed. Significant differences were also observed in trehalose metabolism during heat stress in C. glabrata, when compared with other yeasts.

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.

No presente estudo, foi avaliada a hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP em soro de ratos em presença dos seguintes flavonóides: resveratrol, quercitina e rutina in vitro. Também avaliamos os efeitos do resveratrol, administrado na forma de suco de uva sobre a hidrólise dos nucleotídeos em soro de ratos adultos. Por último foi avaliado o efeito do resveratrol sobre a hidrólise dos nucleotídeos, administrado na forma de suco de uva, antes dos ratos serem submetidos ao tratamento com arginina. A hidrólise dos nucleotídeos em soro de ratos in vitro, em presença do resveratrol, aumentou para o substrato ATP em aproximadamente 40% e para o substrato ADP em aproximadamente 60%, mas não mostrou qualquer efeito sobre a hidrólise do AMP, ou seja, a enzima NTPDase foi ativada, enquanto a 5’-nucleotidase não sofreu qualquer alteração. Para a quercitina e para a rutina, outros flavonóides testados in vitro nas mesmas condições, observamos que a hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP diminuiu. Foi avaliado também, o efeito do suco de uva sobre a hidrólise dos nucleotideos em soro de ratos submetidos a cinco, dez e quinze dias de tratamento. Após quinze dias de tratamento, observou-se aumento na hidrólises de ATP, ADP e AMP. Com esse resultado então, tentamos avaliar se animais recebendo injeções de arginina (tratamento que já mostrara redução na hidrólise dos nucleotídeos em trabalho anterior), tendo previamente acesso ao suco de uva durante quinze dias, poderiam recuperar as atividades de hidrólise dos nucleotídeos. Concluimos que o resveratrol pode aumentar a hidrólise destes nucleotídeos em soro de ratos e que o suco de uva se administrado no lugar da água, também leva a um aumento na hidrólise de ATP, ADP e AMP. Nos protocolos onde houve diminuição na atividade de hidrólise do nucleotídeos por tratamento com arginina, observamos que o tratamento prévio com suco de uva preveniu o decréscimo na atividade das enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase.

O impacto da contaminação e/ou poluição do solo por metais pesados deve ser avaliado não somente pela concentração total dos metais, mas sobretudo pela sua biodisponibilidade, sendo esta uma propriedade relacionada com a mobilidade no solo e absorção pelas plantas. Assim, este estudo teve por objetivo avaliar, mediante extrações químicas seqüenciais e atividade das espécies dos metais em solução, preditas pelo modelo MinteqA2, a biodisponibilidade dos metais cádmio, chumbo, cobre, níquel e zinco em seis solos do Estado do Rio Grande do Sul. Para isto, utilizaram-se amostras destes solos, nas quais foram adicionados, a 10 anos, diferentes níveis desses metais em experimento conduzido ao ar livre. As frações químicas em que os metais se encontravam no solo (solúvel, trocável, orgânicas e residual) e as espécies em solução (cátions livres e ligados a complexantes orgânicos e inorgânicos) foram relacionadas com a mobilidade dos metais no perfil do solo e com as quantidades absorvidas pelas plantas. As formas solúvel em água, trocável e ligadas a fração orgânica relacionaram-se com a absorção por plantas e apresentaram maior mobilidade no perfil do solo. O modelo de especiação MinteqA2 predisse que as formas livres dos metais cádmio, cobre, níquel e zinco bem como as formas destes metais unidas a ligantes orgânicos podem ser potencialmente biodisponíveis, pois se relacionaram com as quantidades de metais absorvidas pelas plantas. / The hazard environment impact and soil pollution by heavy metals should be evaluated not only by total concentration but mainly by its bioavailability. This indicator is better related with heavy metal movement trough the soil profile and plant uptake. Therefore, the main aim of this research was evaluate, trough sequential chemical extractions and concentration in soil solution of metal species, specify by the MinteqA2 model. In this research the bioavailability of the following metals: cadmium, lead, copper, nickel and zinc was investigated in six Rio Grande do Sul State soils. The soil samples investigated come from a long term experiment in which 10 years ago different levels of these metals were applied. The metal chemical fractions (soluble, exchangeable, organic and residual) and metal species in soil solution (free cations, cations bonded to organic and inorganic complexes) were related with metal mobility trough the soil profile and plant uptake. The metal water soluble, metal exchange and bonded to organic fraction were related with plant uptake and they show higher soil movement trough the soil profile. The speciation model MintequA2 indicate that the free fractions of cadmium, copper, nickel and zinc as well the bonded with organic fraction would be bioavailability, because they were related with the metal plant uptake.

As análises hematológicas e bioquímicas são de extrema, auxiliando no diagnóstico de doenças e estados nutricionais dos animais. O perfil hematológico e valores bioquímicos sanguíneos foram determinados em três populações de vida livre de Ctenomys lami (tuco-tuco), de três regiões distintas: Região A (Distrito de Itapuã), Região B (Município de Viamão) e Região C (Município de Viamão, Unidade de Conservação Refúgio de Vida Silvestre Banhado dos Pachecos, distrito de Águas Claras), sendo as áreas A e B, impactadas pela bovinocultura, e área C, sem impacto antrópico, ambas no sul do Brasil. Amostras de 62 animais foram coletadas ao total para as análises hematológicas. Os valores de hematócrito (Ht), hemoglobina (Hb) e eritrócitos apresentaram diferenças significativas entre machos (n=23) e fêmeas (n=39). O Ht e a Hb encontrados na espécie foram mais baixos em comparação com outras espécies de roedores subterrâneos, podendo estes valores estarem relacionados ao habitat de forrageio ou a características do solo. Diferenças significativas também foram detectadas na hemoglobina, CHCM e linfócitos das amostras coletadas de animais das regiões A e B em relação às da C. O valor da média dos hematócritos das amostras dos animais das regiões A e B foram mais elevados, porém diferenças significativas foram detectadas entre as amostras dos animais das regiões A e C. Algumas dessas alterações sugerem a relação dos valores encontrados com a compactação do solo e estresse dos animais em relação a áreas impactadas. Diferenças significativas no VCM foram encontradas nas amostras coletadas dos animais da região A em relação a C, e também nas plaquetas de animais da região A em relação a B. Não foram observados Corpúsculo de Kurloff nos animais analisados. Para análises bioquímicas foram coletados amostras de 45 animais, sendo 15 animais por região, agrupados em três pools. Foram realizadas determinações bioquímicas para as enzimas AST, ALT, GGT e enzima FA. Além desses, também foram avaliados creatinina, potássio, colesterol, triglicerídeos, uréia, albumina, proteínas totais, cálcio e fósforo. Diferenças significativas foram encontradas na atividade enzimática da fosfatase alcalina entre o pool de amostras dos animais da região A em relação a B (P<0,05). Também houve diferença significativa nos valores de colesterol, sendo que o pool de amostras dos animais da região B apresentou significância estatística em relação aos pools das regiões A e C (P<0,05). Dentre os minerais analisados, apenas o potássio teve alteração significativa, sendo esta encontrada entre o pool de amostras dos animais da região A em relação a C (P<0,05). Os valores hematológicos encontrados nesses espécimes de Ctenomys lami fornecem informações importantes sobre a espécie. O uso de pools demonstrou-se eficiente na avaliação bioquímica das populações, evidenciando uma diferença em alguns metabólitos. Os resultados encontrados sugerem possíveis alterações na dieta das populações e também diferença de habitat encontrado, devido ao impacto causado pelo homem. Desta maneira, este estudo poderá fundamentar pesquisas futuras, elucidando melhor as relações existentes entre a fisiologia dos animais e variações no habitat de vida destes. / Hematological profile and biochemical are very important to diagnosis of sickness and animal nutrition of animals in general. The hematological and biochemichal profile were determined in three populations of Ctenomys lami that inhabits three different areas nominated as A and B, affected by cattle production, and C, without human impact, all of them in south Brazil, under the same geologic formation. Sample of 62 individuals were collected. The packed cell volume (PCV), hemoglobin (Hb) and red blood cell (RBC) count presents statistic significant differences between males and females. PCV and Hb values founded were lower in comparison with other subterranean rodents, which could be related to the food searching behavior or soil characteristic of the species. Significant differences were found to for Hb, mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) and lymphocytes between A and C areas. The PCV values were more elevated in areas A and B, with significance only between A and C. Some of these alterations may suggest a modification on stress levels of the animals inhabiting areas A and B with anthropic alterations, or maybe just an inherited characteristic. Significant statistic differences were found either in mean corpuscular volume (MCV) between A and C areas, and plateletes between A and B areas. No Kurloff cells (Kurloff bodies) were observed in the blood smear from analyzed individuals. Biochemical parameters were determined from 45 animals, fifteen from each area (A, B and C), grouped in serum pools of five animals (one male and four females) for the analyses. The biochemical parameters analyzed were aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma glutamyl transferase (GGT), alkaline phosphatase (ALP),creatinine, potassium, cholesterol, triglicerides, urea, albumin, total proteins, calcium and phosphorus. Significant statistic difference was found in ALP activity between areas A and B. Also significant differences were found in cholesterol levels, area B presented higher values when compared to the others, and in potassium levels between areas A and C. The use of serum pools demonstrated to be useful in the biochemical population analyzes, showing differences for some metabolites. The hematological values founded for Ctenomys lami are an important information for this species, which can be used for future research and management. These results suggest possible alterations on the diet and physiology of the populations that inhabits the areas with the presence of exotic grasslands introduced by man. This data will be important in future research, as an additional information about animal health and conditions, aggregating information on the physiological differences, adaptation and habitat variations that are inherent to Ctenomys lami.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290493.pdf: 1377229 bytes, checksum: f31b828d766c78322c4be4d70267bb08 (MD5) / A contaminação ambiental por metais é um fator de risco para a saúde pública, sendo o sistema nervoso central (SNC) um importante alvo desses compostos. Exposição excessiva ao manganês (Mn2+) pode causar uma síndrome semelhante ao Parkinson, com perda de neurônios dopaminérgicos, chamada manganismo. Estresse oxidativo e alteração de vias de sinalização intracelular em resposta ao Mn2+ têm sido demonstrados em vários modelos de culturas celulares. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade do Mn2+ (1-1000 µM) de gerar morte celular e alterar a atividade de proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) após incubações in vitro de fatias hipocampais e estriatais obtidas de ratos imaturos e ratos adultos. Avaliamos também a viabilidade celular pelo teste do MTT em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y indiferenciadas expostas ao metal. Os resultados mostraram que o Mn2+ (1-1000 µM) não causou alteração na viabilidade das células SH-SY5Y avaliada em 12 e 24h. Os testes de liberação da lactato desidrogenase (LDH) e endocitose do corante vermelho neutro realizados após 3 horas de incubação com Mn2+ não demonstraram alteração da viabilidade celular das fatias estriatais de ratos imaturos. Os resultados do teste do MTT demonstraram uma queda de 19% da viabilidade em fatias estriatais obtidas de ratos adultos e após 6 horas de exposição ao metal. Esse efeito foi acompanhado por um aumento na fosforilação de p38MAPK, avaliada por western blotting. Nas fatias estriatais obtidas de ratos imaturos não houve alteração da viabilidade, entretanto, ocorreu aumento na fosforilação de ERK2 e JNK1/2 após 6 horas de incubação com o Mn2+. Estes dados reforçam a idéia do estriado como região vulnerável à neurotoxicidade do Mn2+. Além disso, mostram que o Mn2+ pode alterar a atividade de vias de sinalização intracelular dependentes de MAPKs em fase crítica do desenvolvimento neural. Os resultados obtidos com o modelo de cultura celular não estão de acordo com a literatura, porém é preciso confirmar se as células SH-SY5Y indiferenciadas são ideais como modelo de neurônios dopaminérgicos. / Environmental contamination by metals is a risk factor for public health, and the central nervous system (CNS) is an important target. Excessive exposure to manganese (Mn2+) can cause a syndrome similar to Parkinson's disease, with loss of dopaminergic neurons, called manganism. Oxidative stress and alteration of intracellular signaling pathways in response to Mn2+ have been demonstrated in various models of cell cultures. The aim of this study was to evaluate the ability of Mn2+ (1-1000 µM) to generate cell death and alter the activity of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) after in vitro incubations of hippocampal and striatal slices obtained from immature rats and adult rats. We also evaluated cell viability by the MTT assay in undifferentiated human neuroblastoma cells SH-SY5Y exposed to the metal. The results showed that Mn2+ (1-1000 µM) did not change the SH-SY5Y cells viability after 12 and 24 hours. Tests for release of lactate dehydrogenase (LDH) and endocytosis of neutral red dye showed no changes in cell viability of the striatal slices from immature rats after 3h exposure to Mn2+. The results of the MTT assay showed a 19% decrease in the cell viability of striatal slices obtained from adult rats after 6 hours of exposure to the metal. This effect was accompanied by an increase in phosphorylation of p38MAPK, assessed by western blotting. In striatal slices obtained from immature rats Mn2+ did not alter the cell viability, however, it induced an increase in ERK2 and JNK1/2 phosphorylation after 6 hours of incubation. These data reinforce the striatum as a vulnerable region to Mn2+ neurotoxicity. Moreover, it suggests that Mn2+ can alter the activity of cell signaling pathways dependent on MAPKs in a critic neurodevelopmental period. The results obtained with the cell culture model are not in agreement with the literature. However, we must confirm that the undifferentiated SH-SY5Y cells are a suitable model of dopaminergic neurons.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O ácido desoxirribonucléico (DNA) é alvo constante de estudo nas áreas de bioquímica, biotecnologia e biologia molecular por sua importância biológica, por isso a busca por novas ferramentas para sua manipulação torna-se necessária. Com este objetivo foram estudadas a interação e clivagem de DNA por complexos metálicos de Cu(II), Cu(acac)dppz](ClO4), [Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O, [Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O e Tb(III), [Tb(tdzp)(acac)3]. Para avaliar a capacidade de clivagem dos complexos foram realizados testes com diferentes concentrações destas moléculas e na presença e ausência de luz UV-A. O mecanismo de clivagem foi avaliado pelo aumento de força iônica, adição de sequestradores de radicais livres e ligantes do sulco maior e menor do DNA às reações. Testes na presença e ausência de oxigênio também foram realizados. Os ensaios cinéticos ocorreram no abrigo e na presença de luz UV-A. Os complexos de Cu(II) foram avaliados quanto à sua interação ao CT-DNA, para tanto foram realizadas titulações espectrofotométricas do complexo na presença e ausência de CT-DNA, desnaturação térmica de CT-DNA na ausência e presença dos complexos e avaliação de alterações na estrutura do DNA na presença dos complexos por espectroscopia de dicroísmo circular. Os quatro complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial em concentrações micromolares em cinco minutos de reação quando fotoativados por luz UV-A. O aumento de força iônica reduziu a atividade dos complexos e o mecanismo de clivagem ocorre pela formação de espécies reativas de oxigênio e carbono-centrados. Os ensaios cinéticos revelaram tempos de meia-vida do DNA abaixo dos cinco minutos quando as reações foram fotoativadas. Os complexos de Cu(II) com ligantes dppz forneceram Kb de ~105 M-1 e o Kb para o complexo de Cu(II) com ligante dpq foi de ~104 M-1. Os três complexos de Cu(II) promoveram aumento da Tm do DNA e alterações na estrutura do CT-DNA foram observadas pelos espectros de dicroísmo circular

COURA, C. C. Atividades antinociceptiva e antiinflamatória dos polissacarídeos sulfatados da alga marinha vermelha Gracilaria cornea J. Agardh. 2011, 123 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-06-26T15:40:05Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_cocoura.pdf: 2791613 bytes, checksum: 5d1789474b426fcb8028bdcdcfcdd1d2 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-07-19T20:21:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_cocoura.pdf: 2791613 bytes, checksum: 5d1789474b426fcb8028bdcdcfcdd1d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-19T20:21:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_cocoura.pdf: 2791613 bytes, checksum: 5d1789474b426fcb8028bdcdcfcdd1d2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Marine algae are natural sources of sulfated polysaccharides possessing several biological activities (anticoagulant, antithrombotic, antinociceptive, anti-inflammatory etc.) and that exhibit minimal toxicity and are considered of great interest to the pharmaceutical and food industries. This study aimed to evaluate the effects of sulfated polysaccharides total (SPT) from the red seaweed Gracilaria cornea (Gc) in classical models of animal experimentation. Swiss mice male (18-25g) and male Wistar rats (120-260g) in nociception and acute inflammation assays were used. The SPT-Gc yield extraction obtained by enzymatic digestion (6 h, 60 ° C) was 16.75 ± 0.98%. The SPT-GC was able to reduce (p<0.05) the number of writhing induced by 0.8% acetic acid (66.2, 65.3 and 96.3% for 3, 9 and 27 mg kg-1 (i.v.), respectively). In formalin test, the SPT-Gc inhibited (p<0.05) licking time in both phases of testing (56.1 and 93.2% first-phase, 88.2 and 98.0% second- phase for 9 and 27 mg kg-1 (i.v.), respectively), whereas the dose 3 mg kg-1 had only effect in the second phase of the trial. In the hot plate test, the antinociceptive effect of SPT-Gc were seen only in treatment with 27 mg kg-1 (i.v.). These tests in mice suggest that the analgesic effects occur through mechanism of action of central and peripheral. The model of peritonitis demonstrated that SPT-Gc exert effects on the migration of total leukocytes (52.7%) and neutrophils (59%) at a dose of 3 mg kg-1 (s.c.). On the other hand, the doses (3 and 9 mg kg-1, s.c.) appear able to inhibit the paw edema induced by carrageenan, particularly at the third hour, with the effects confirmed by MPO activity in paw tissue (p<0.05) and the occasional reduction (p<0.05) of paw edema of mice induced by dextran in the first hour at all doses tested. Finally, subchronic toxicity test was conducted in groups of 6 mice (males), which received: Saline (0.15 M, i.p.) and SPT-Gc (9 mg kg-1, i.p.) for 14 consecutive days. The results showed that the administrations of SPT-Gc did not show to differences in body mass (p>0.05). Additionally, the SPT did not produce changes in organ weights (heart, liver, kidney, spleen and thymus) in relation to body mass of animals, except the spleen (p<0.05), suggesting an immunomodulatory property. No change for liver biochemical tests (AST and ALT) or renal function was also observed (p>0.05), or on the hematological parameters (erythrocytes, hemoglobin, hematocrit, MCV, HGM, MCHC, leucocytes, lymphocytes, monocytes, neutrophils and platelets) considered, except hemoglobin (p<0.05). Therefore, the red seaweed Gracilaria cornea sulfated polysaccharides present security and antinociceptive and antiinflammatory activities / As algas marinhas são fontes naturais de polissacarídeos sulfatados detentores de diversas atividades biológicas (anticoagulante, antitrombótica, antinociceptiva, antiinflamatória etc) e que exibem mínimos efeitos tóxicos, sendo considerados de grande interesse para as indústrias farmacêuticas e alimentícias. O presente trabalho teve como finalidade avaliar os efeitos dos polissacarídeos sulfatados totais (PST) da alga marinha vermelha Gracilaria cornea (Gc) em modelos clássicos de experimentação animal nos ensaios de nocicepção e inflamação aguda. Foram utilizados camundongos Swiss machos (18-25g) e ratos Wistar machos (120-260g). O rendimento de PST-Gc obtidos da extração por digestão enzimática (6 h; 60°C) foi 16,75 ± 0,98%. Os PST-Gc mostraram-se capazes de reduzir (p<0,05) o número de contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,8%) em 66,2; 65,3 e 96,3% para as doses 3, 9 e 27 mg kg-1 (i.v.), respectivamente). No teste de formalina, os PST-Gc inibiram (p<0,05) o tempo de lambedura em ambas as fases do teste (56,1 e 93,2%-primeira fase; 88,2 e 98,0%-segunda fase para as doses 9 e 27 mg kg-1 (i.v.), respectivamente), enquanto a dose de 3 mg kg-1 mostrou efeito apenas na segunda fase do ensaio. No teste da placa quente, o efeito antinociceptivo dos PST-Gc foi observado apenas no tratamento com a dose de 27 mg kg-1 (i.v.). Estes resultados sugerem que os efeitos analgésicos das diferentes doses dos PST-Gc ocorram por mecanismo de ação central e periférica. O modelo de peritonite demonstrou que os PST-Gc reduziu a migração de leucócitos totais em 52,7%) e de neutrófilos em 59% na dose de 3 mg kg-1 (s.c.). Por outro lado, as doses (3 e 9 mg kg-1; s.c.) inibiram o edema de pata induzido por carragenana, especialmente na terceira hora, sendo os efeitos confirmados pela atividade de MPO no tecido da pata (p<0,05), além da redução (p<0,05) do edema de pata induzido por dextrana no intervalo de 30min e na primeira hora em todas as doses testadas. Finalmente, ensaio de toxicidade subcrônica foi realizado em grupos de 6 camundongos (machos), os quais receberam: Salina (0,15 M; i.p.) e PST-Gc (9mg kg-1; i.p.), durante 14 dias consecutivos. Os resultados mostraram que as administrações dos PST-Gc não traduziram diferenças em termos de massa corpórea (p>0,05). Adicionalmente, os PST não proporcionaram alterações no peso dos órgãos (coração, fígado, rim, baço e timo) em relação à massa corpórea dos animais, exceção ao baço (p<0,05), sugerindo uma propriedade de função imunomoduladora. Nenhuma alteração hepática pelas dosagens bioquímicas (TGO e TGP) ou renal também foi observada (p>0,05), ou sobre os parâmetros hematológicos (hemácias, hemoglobina, hematócrito, VCM, HGM, CHCM, leucócitos, linfócitos, monócitos, neutrófilos e plaquetas) considerados, exceção da hemoglobina (p<0,05). Portanto, a alga marinha vermelha Gracilaria cornea apresenta polissacarídeos sulfatados seguros e detentores de atividades antinociceptiva e antiinflamatória.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326936.pdf: 1176389 bytes, checksum: 9bb7a6e55887bfd16e61a0b78d34325f (MD5) Previous issue date: 2014 / Abstract : This work confirmed the high toxicity of the storage protein from the seeds of the common bean Phaseolus vulgaris (phaseolin) on the larvae of the seed beetle Callosobruchus maculatus. When incorporated into the diet of the larvae at physiological concentrations (0.5 %) larval mortality of C. maculatus increased. The main factor involved seems to be the accumulation of vesicles containing phaseolin in the enterocytes leading to the impairment of vesicular traffic. The fate of the seed storage globulins from cowpea Vigna unguiculata (vicilin) and from P. vulgaris (phaseolin) was monitored by fluorescence microscopy after cryostat microtomy. By feeding bean beetle larvae with vicilin/ FITC and phaseolin/ FITC noticed a difference in the absorptive process of globulins among the tested diets. The intestinal epithelium of larvae fed phaseolin/ FITC showed higher fluorescence than larvae fed vicilin. A membrane bound protein has been isolated from the intestinal epithelium of larval C. maculatus by using an affinity column where the vicilin was covalently mobilized to sepharose. This protein has a high homology with the a-tocopherol (vitamin E precursor) transfer protein. These data suggest that the vicilin molecule binds to receptors in the microvillar membrane and subsequently it may be absorbed inside vesicles within the epithelial cells of the larval midgut. This process may be a case of receptor-mediated endocytosis. These findings suggest a new mechanism of antibiosis, involving accumulation of vicilin variants and phaseolin in the intestinal epithelium of the C. maculatus larvae and commitment of endocytic processes. This mechanism probably involves the binding of vicilin/phaseolin protein homologous to a a-tocopherol transfer protein, thereby killing the insect by the lack of absorption of important nutrients for development,such as the vitamin E.

BATISTA, A. B. Potenciais fungicida e inseticida de proteínas presentes em sementes de Dioclea megacarpa Rolfe. 2009. 125 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-09-30T20:59:28Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_abbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-10-01T18:50:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_abbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-01T18:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_abbatista.pdf: 1701467 bytes, checksum: abfe96b694704dbc9dc0aed6b729f9f6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Dioclea megacarpa Rolfe é usada como sinonímia de D. relexa var. grandiflora, uma espécie pertencente à família Fabaceae (Leguminosae). Estudos prévios, realizados por nosso grupo de pesquisa, demonstraram a presença em suas sementes de proteínas ativas contra fungos fitopatogênicos, dentre esses Aspergillus niger. Assim, o presente trabalho foi proposto no intuito de avaliar a bioatividade de proteínas de sementes de D. megacarpa contra fungos, conduzindo à sua purificação e caracterização parcial, bem como à investigação de seu mecanismo de ação. Outro objetivo deste trabalho foi examinar o potencial inseticida da lectina com especificidade por glucose-manose, isolada de sementes de D. megacarpa (Moreira et al., 1983), contra o bruquídeo do feijão-caupi Callosobruchus maculatus. Para tanto, farinha de sementes foi posta em contato com NaCl 0,15 M (1:5, p/v), seguida de agitação contínua por 3 h, filtração em pano de trama fina, re-extração por 1 h e centrifugação a 11.500 x g, 30 min, 4 oC. O sobrenadante obtido, denominado de extrato total, se mostrou ativo contra A. niger e apresentou várias proteínas bioativas, compreendendo lectina (129,27 UH/mgP, com eritrócitos tripsinizados de coelho), inibidor de tripsina (18,91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47,50 U/gF), toxina (DL50 119,60 mgP/Kg de peso corpóreo de camundongo), quitinase (1,66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0,55 nKat/mgP). Por outro lado, atividades peroxidásica e proteolítica não foram detectadas. Para purificação da proteína antifúngica, foram realizadas cromatografias em matrizes de Sephadex G-50, Quitina e Resource-Q, essa última acoplada ao sistema de FPLC. A proteína antifúngica purificada de sementes de D. megacarpa, denominada de Dm-PAF, com massa molecular aparente de 67-68 kDa (PAGE-SDS), não mostrou atividades hemaglutinante e quitinásica e apresentou sua seqüência NH2-terminal bloqueada. Dm-PAF, em concentração baixíssima (0,015 µgP/µL), se mostrou capaz de inibir o crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis, cuja investigação do mecanismo de ação não revelou envolvimento dessa proteína com bombas de H+-ATPase. Em adição, a lectina ligante a glucose-manose, obtida na cromatografia em Sephadex G-50, mostrou potente atividade inseticida contra C. maculatus, interferindo em parâmetros importantes relacionados ao ciclo de vida do inseto. Os dados apresentados mostram as sementes de D. megacarpa como uma rica fonte de proteínas interessantes, possivelmente envolvidas no mecanismo de defesa das plantas. / Dioclea megacarpa Rolfe is the correct synonym for D. relexa var. grandiflora. This species belongs to Fabaceae, the legume family. Previous studies, realized in our research group, showed the presence of active proteins for several phytopathogenic fungi in the seeds of this species, among of them Aspergillus niger. Thus, the present work was proposed with the objective of determining the bioactivity of protein(s) from D.megacarpa seeds against fungi, leading to its/their purification and partial characterization and further investigation of its/their action mechanism. Another approach of this work it was analyze the insecticidal potential of glucose/mannose-specific lectin, isolated from D.megacarpa seeds (Moreira et al., 1983), against the cowpea bruchid Callosobruchus maculatus. For this, seed flour was placed in contact with 0.15 M NaCl (1:5, w/w), followed by stirring for 3 h, filtration through a nylon cloth, re-extraction for 1 h, centrifugation at 11,500 x g, for 30 min, at 4 oC. The supernatant obtained, named total extract, showed antifungal activity against A. niger and presented several bioactive proteins, including lectin (129.27 UH/mgP, using trypsinized rabbit erythrocytes), trypsin inhibitor (18.91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47.50 U/gF), toxin (LD50 119.60 mgP/Kg mice body weight ), chitinase (1.66 nKat/mgP) e β-1,3-glucanase (0.55 nKat/mgP). On the other hand, peroxidasic and proteolytic activities were not detected. For purification of antifungal principle, several chromatographies were performed on Sephadex G-50, Chitin and Resource Q, this last connected to an FPLC system. The purified antifungal protein, named Dm-PAF, with apparent molecular mass of 67-68 kDa (SDS-PAGE), did not show any haemagglutinating or chitinolytic activity and presented its NH2-terminal sequence blocked. Dm-PAF, at a very low concentration (0.015 µgP/µL), it was able to inhibit the growth of Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis yeasts. The investigation of the antifungal action mechanism excluded the possibility of interaction between Dm-PAF and H+-ATPase pumps. In addition, the glucose/mannose-specific lectin, obtained from Sephadex G-50 column, exhibited a potent insecticidal activity against C. maculatus, interfering in important parameters related to life cycle of this insect. These data show to be the D. megacarpa seeds a rich source of biologically interesting proteins, possibly involved in the defense mechanism of plants.