Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012

Orientador: Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014

Orientador: Maria Cristina Carlan da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Orientador: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014

Orientador: Luciana Campos Paulino / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014

Orientadora: Profa. Dra. Luciana Campos Paulino / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014.

Orientador: Prof. Dr. Luis Paulo Barbour Scott / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / A Tioredoxina (Trx) é uma proteína presente desde bactérias até humanos. Esta proteína multifuncional está relacionada a diversos processos como transcrição, apoptose, estresse oxidativo, etc. Seu principal papel é a redução de pontes dissulfeto de seus substratos. A Trx em humanos (hTrx) está relacionada a regulação de processos fisiológicos e doenças, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e envelhecimento, o que a torna alvo de grande interesse para desenvolvimento de fármacos. Na tioredoxina citosólica e nuclear (hTrx1), apesar das cisteínas 62 e 69 estarem parcialmente enterradas, resultados experimentais mostraram que elas podem formar complexos covalentes com pequenas moléculas e até mesmo com proteínas. Devido a estes fatos, a descrição de sítios de ligação e de mecanismos de exposição das cisteínas pode contribuir na elaboração de estratégias e no design de fármacos. Com esta finalidade, foi empregada a Análise de Modos Normais (NMA) para investigar as mudanças conformacionais que levam à exposição das cisteínas e a exposição de regiões candidatas a sítios de ligação. Com a NMA foi possível identificar movimentos que levam a exposição de regiões hidrofóbicas e a exposição das cisteínas 62 e 69. Os resultados mostraram também a exposição de duas regiões hidrofóbicas, uma devida à abertura da hélice 3 e outra à abertura das hélices 2 e 4. Duas estruturas cristalográficas presentes no PDB, de mutantes da Trx, mostram a abertura da hélice 3, sugerindo esta como uma região para o design de inibidores. Os resultados mostram que este movimento pode ocorrer na estrutura nativa. A abertura das hélices 2 e 4 levou à exposição da região hidrofóbica, sugerindo esta como um novo local para o design de fármacos. A NMA se mostrou de grande valia para o estudo de sítios de ligação, sendo que os resultados apresentados estão de acordo com os dados experimentais. Os resultados do servidor web FTMAP reforçaram estas regiões hidrofóbicas como de interesse para o design de fármacos, uma vez que encontrou conjuntos de pequenos ligantes orgânicos nestas regiões. Os resultados de docking molecular de Fenotiazinas e Tiossemicarbazonas indicaram estas como bons compostos para testes in vitro. Os resultados do docking desses compostos nas estruturas geradas para o modo 16 e sítio H1H3 podem indicar o mecanismo da diminuição do número de grupos tióis livres através do bloqueio do acesso a Cys 69 e possível alteração da dinâmica da exposição da Cys 62. O resultado do virtual screening do sítio H1H3 com a biblioteca Diversity Set II sugeriu uma nova classe de compostos para testes in vitro. / Thioredoxin (Trx) is a protein that can be found from bacterias to human beings. This multifunctional protein is related to several processes, such as: transcription, apoptose, oxidative stresses, among others. The protein¿s main role is to reduce the substrate¿s disulfide bridges. Trx in human beings (hTrx) is related to physiological regulation processes and diseases - including cancer, cardiovascular diseases and aging - which makes this protein of great interest for drug development. Despite cysteines 62 and 69 being partially buried, nuclear and cytosolic thioredoxin (hTrx1) experimental results show that they can form covalent bonds with small molecules and even with proteins. Due to these facts, a description of the binding sites and cysteines exposure mechanisms can contribute in the elaboration strategy and drug design. For this purpose, Normal Modes Analysis (NMA) was applied in order to investigate conformational changes that expose cysteines and hydrophobic regions candidates to binding site. With NMA it was possible to identify motions that expose hydrophobic regions as well as cysteines 62 and 69. Results also show the exposure of two hydrophobic regions, one due to the opening of helix 3 and another one due to the opening of helices 2 and 4. Two crystallographic structures of mutants, found in the PDB database, showthe opening of helix 3, suggesting that this region is stable enough to be a target for inhibitors design. Results show that this motion can occur in the wild type structure. The opening of helices 2 and 4 lead to the exposure of the hydrophobic region, suggesting the region as a new site for drug design. NMA showed to be valuable in the study of binding sites, once results obtained are in accordance with experimental data. Results from the FTMAP web service reinforce these hydrophobic regions as interesting ones as sites for drug design, since clusters of small organic ligands were found in these regions. The Phenothiazines and Semithiocabazones molecular docking results indicate those compounds as good candidates for in vitro tests. The docking results in structures of mode 16 and binding site H1H3 can indicate the free thiol decrease mechanism through block access of Cys 69 and possible modification of Cys 62 exposure dynamic. Virtual screening results of H1H3 binding site with Diversity Set II compounds library suggested a new class of compounds for in vitro tests.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / A febre do Oropouche, causada pelo vírus Oropouche (OROV), é uma arbovirose de grande interesse para a saúde pública devido à alta incidência nas áreas tropicais da América do Sul e Central. Devido à inespecificidade dos sintomas, a febre do Oropouche é facilmente confundida com a dengue e uma série de arboviroses. Tais semelhanças sintomáticas dificultam o diagnóstico preciso para OROV, requerendo o desenvolvimento de estudos diferenciais. O diagnóstico laboratorial por isolamento viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações cruzadas com outros vírus da mesma família. Portanto, com o intuito de realizar o diagnóstico sorológico específico para a febre causada por OROV, esse projeto teve por objetivo a construção de antígenos recombinantes a partir dos genes que codificam as proteínas estruturais Ns, G1 e G2 utilizando sistema de expressão eucariótico em células de insetos. Como resultados foram obtidos os baculovírus recombinantes para as proteínas Ns, G1 e G2 de OROV. O baculovírus correspondente à proteína G1 de OROV demonstrou instabilidade, provavelmente devido ao grande tamanho da construção recombinante. Testes de expressão das proteínas Ns e G2, em células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) e High Five, com crescimento em suspensão, revelaram que em Sf-9 a proteína Ns foi exportada para o meio extracelular, enquanto que a proteína G2 foi encontrada na fração sólida da cultura. Não foi detectada expressão das proteínas Ns e G2 de OROV em células High FiveTM. A proteína recombinante Ns foi expressa pela primeira vez em sistema eucariótico, porém a quantidade obtida foi insuficiente para iniciar os ensaios sorológicos. A investigação da interação da proteína Ns com ácidos nucleicos sugere que no sistema de expressão em células de insetos, a mesma está associada ao DNA. Estudos estruturais serão necessários para confirmar os resultados obtidos. / Oropouche fever (OF), caused by Oropouche virus (OROV),is an arboviruse of great interest to public health due to the high incidence in tropical areas of Central and South America. Due to its unspecific clinical signs, OF is usually mistaken with dengue fever and others arboviruses. Such symptomatic similarities hinder accurate diagnosis for OROV, requiring the development of differential studies. Laboratory diagnosis by viral isolation is hard and depends on infrastructure and trained personnel available in few Brazilians laboratorie's. The immuno diagnostic tests present limitations due the use of infectious viral particles and also produce cross reactions with other viruses of the same family. Therefore, in order to perform specific serological diagnosis of OF, the aim of this project was the construction of recombinant antigens based on the structural proteins Ns, G1 and G2 using an eukaryotic insect cells expression system. The results correspond to the achievement of recombinant baculovirus for the proteins Ns, G1 and G2 OROV. The G1 recombinant baculovirus showed instability, probably due to large size of the construct. NS and G2 proteins expression experiments in Spodoptera frugiperda 9 (Sf-9) and High Five, grown in suspension revealed that in Sf-9 NS protein was exported into the extracellular environment, while the G2 protein was found in the culture solid fraction. We did not detect expression of Ns and G2 OROV proteins in High Five cells. The Ns recombinant protein was expressed for the first time in an eukaryotic system, but the amount of protein obtained was insufficient to perform serological assays. The investigation of the interaction of the Ns protein with nucleic acids suggests that in the Baculovirus expression system, it is associated with DNA. Structural studies are needed to confirm the results.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula de Mattos Arêas Dau / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / Infeccoes causadas por Staphylococcus aureus representam uma grande preocupacao, principalmente aquelas relacionadas ao ambiente hospitalar. Normalmente, a fase inicial consiste em colonizacao assintomatica da parte nasal da faringe, o que pode resultar na disseminacao para outras superficies mucosas ou invasao de locais estereis, tais como o sangue. O estabelecimento da infeccao depende da obtencao de nutrientes, assim como ligacao e dano a matriz extracelular (MEC). A proteina MntC e altamente conservada em S. aureus, sendo caracterizada como uma proteina de superficie relacionada ao transporte do ion manganes, indispensavel para a sobrevivencia da bacteria. Assim como outras proteinas transportadoras de metal, MntC pertence ao Cluster 9, uma grande familia de proteinas bacterianas de ligacao a metais pertencentes a sistemas de transporte ABC. Os estudos teoricos sobre o comportamento dinamico da MntC e de proteinas homologas utilizando as tecnicas de Modelagem Comparativa, Modos Normais e Dinamica Molecular mostram que a ligacao ao metal nao afeta muito a flexibilidade das proteinas. As mudancas estruturais e dinamicas sofridas por estas ao se ligarem ao metal podem ser pequenas e em regioes proximas ao sitio de ligacao ao metal, principalmente nas estruturas em loops, corroborando o observado em trabalhos experimentais ja publicados. Neste trabalho, foi demonstrado que alem de sua funcao como transportadora de manganes, MntC e uma eficiente proteina de ligacao a MEC, moleculas da cascata da coagulacao, e ao regulador negativo do Sistema Complemento Fator H. Este estudo mostrou uma capacidade acentuada da MntC de ligar a laminina, colageno tipo IV, fibronectina celular e plasmatica, plasminogenio e fibrinogenio por ELISA. MntC tambem foi capaz de ligar ao Fator H observado em Western blot. A ligacao da MntC ao plasminogenio parece ser mediada, pelo menos parcialmente, pelas lisinas expostas na superficie da proteina, uma vez que previa incubacao com um analogo da cadeia lateral do residuo de lisina, acido ¿Ã-aminocaproico, ou o aumento da forca ionica afeta a interacao entre MntC e plasminogenio, por ELISA. A proteina tambem contribui para a ativacao da plasmina a partir do plasminogenio observada em reacao cromogenica, na presenca do ativador de plasminogenio uroquinase (uPA). A plasmina recem gerada, por sua vez, atuou na clivagem do fibrinogenio, observada em membranas de difluoreto de polivinilideno coradas com Coomassie. A enzima tambem foi capaz de clivar C3b, observado por Western blot. Em conclusao, neste trabalho foi demonstrado que na MntC, e em outros membros da familia cluster 9, a ligacao ao metal induz mudancas conformacionais bastante restritas as regioes envolvidas na coordenacao do metal. Neste estudo tambem foi descrita uma nova funcao para MntC que pode auxiliar a bacteria na colonizacao de mucosa e posterior estabelecimento de doencas invasivas. Alem disso, a interacao de MntC com proteinas do sistema complemento pode auxiliar a bacteria na evasao imune. Estes dados sugerem que a proteina MntC e um fator de virulencia relevante para as infeccoes de S. aureus e por isso, pode ser um bom candidato para compor uma formulacao vacinal anti-estafilococica para humanos. / Infections caused by Staphylococcus aureus represent a great concern, mainly those related to nosocomial environment. Usually, the early stage of pathogenesis consists on asymptomatic nasopharynx colonization, which could result in dissemination to other mucosal niches or invasion of sterile sites, such as blood. This pathogenic route depends on scavenging of nutrients as well as binding to and disrupting extracellular matrix (ECM). The MntC is a highly conserved protein on the surface of S. aureus, involved in the transport of manganese ion, essential for survival of the bacterium. As other metal-transport proteins, MntC belongs to cluster 9, a large family of bacterial metal binding proteins that composes ABC transport systems. Theoretical studies on the dynamic behavior of MntC and homologous proteins using Comparative Modeling, Normal Modes and Molecular Dynamics techniques show that the flexibility of the proteins is not greatly affected by metal binding. The structural and dynamic changes suffered by cluster 9 proteins upon binding of metal may be restricted to regions close to the metal binding site. It is especially relevant in loops structures, corroborating results previously observed in experimental studies published elsewhere. This work provided evidence of a novel function of MntC besides manganese-binding activity. MntC was shown to be an efficient ECM, coagulation cascade components, and complement regulatory factor H binding protein. This study showed a marked ability of MntC to bind to laminin, collagen type IV, cellular and plasma fibronectin, plasminogen and fibrinogen by ELISA. MntC was also able to bind to complement factor H observed in Western Blot. The MntC binding to plasminogen appears to be, at least partially, related to the presence of lysines, since previous incubation with an analogue of lysine residue, å-aminocaproic acid, or increasing ionic strength affected the interaction between MntC and plasminogen, assayed by ELISA. The protein also contributed to the activation of plasmin from plasminogen observed in a chromogenic reaction in the presence of urokinase plasminogen activator (uPA). The newly released plasmin, in turn, acted in the cleavage of fibrinogen observed in polyvinylidene difluoride membranes stained with Coomassie. This enzyme was also able to cleave C3b observed by Western Blot. In conclusion, it was demonstrated that in MntC, and in other cluster 9 members, metal binding event induces conformational changes very restricted to regions involved in metal coordination. This work also described a new role for MntC that can aid mucosal colonization and the establishment of invasive diseases as well. Moreover, the interaction of MntC with complement system proteins could contribute to host immune evasion. These data suggest that MntC is a relevant virulence factor to staphylococcal infections and, therefore, could be an adequate candidate to compose an anti-staphylococcal human vaccine formulation