Spelling suggestions: "subject:"ecossistemas"" "subject:"agroecossistemas""
61 |
Aplicação da nanotecnologia no controle de ectoparasitas : desenvolvimento e caracterização de formulações para liberação modificada de ivermectinaTavares, Evaldo José Madureira January 2015 (has links)
Orientador: Prof. Dr. Eraldo José Madureira Tavares / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Atualmente, sistemas de liberação de fármacos usando nanotecnologia tem despertado grande interesse, entretanto, uma área frequentemente ignorada pelos pesquisadores de formulações de liberação controlada é o combate de ectoparasitas em gado. Para superar essa deficiência, foram desenvolvidas neste estudo formulações de nanopartículas visando a aplicações para uso tópico. As nanopartículas foram sintetizadas e caracterizadas através da avaliação da taxa de associação, tamanho, potencial zeta e pH. A cinética de permeação de ivermectina na pele foi simulada em células de Franz. As formulações (doze) apresentaram estabilidade adequada e taxas de associação próximas a 100%. Os ensaios de permeação mostraram que a liberação da ivermectina foi alterada e os perfis de liberação variaram entre as formulações. Duas formulações, nanocápsulas de PLA e de PLGA, ambas obtidas por nanoprecipitação, iniciaram a liberação dentro das 32 h de ensaio de permeação. Essas duas nanocápsulas também apresentaram bons resultados de estabilidade, apresentando tamanho relativamente constante, potenciais zeta normalmente abaixo de -30 mV, índice de polidispersão (IPD) abaixo de 0,2 e diminuição de pH aproximadamente dentro de 1 unidade de pH. A cinética de permeação das duas formulações foi avaliada utilizando-se modelos matemáticos tais como Higuchi, difusão em esferas sólidas e cápsulas, cinética de ordem zero, modelos de dissolução e a equação generalizada de Korsmeyer-Peppas. O perfil de liberação dessas nanocápsulas sugere o possível acúmulo do fármaco no miristato de isopropila, que simula o estrato córneo da pele. As demais formulações requerem estudos adicionais para detectar seus perfis de liberação, e poderiam ser úteis para liberações extremamente longas e depender bastante da erosão dos polímeros. Os resultados obtidos nesta pesquisa são promissores como sistema alternativo para o tratamento de ectoparasitas, visando a aplicações veterinárias. / Drug release systems using nanotechnology are currently among the research programs which have aroused great interest, however, a field being frequently ignored by controlled release formulation researches is the fight against cattle ectoparasites. In order to overcome that deficiency, nanoparticle formulations for topical usage were developed in this research. The nanoparticles were synthetized and characterized with respect to association rate, size, zeta potential and pH. Ivermectin permeation kinetics in skin was simulated in Franz cells. The formulations (12) presented adequate stability and rate of association of about 100%. The release assays have shown that the release of ivermectina was modified and the release profiles varied among the formulations. Two formulations, PLA and PLGA nanocapsules, both prepared by nanoprecipitation, started the release during the 32h of the permeation assay. Both nanocapsules also had good stability results, having relatively constant size, zeta potentials usually below -30 mV, polydispersity index (PDI) below 0.2 and pH decrease within 1 pH unit. The release kinetics of both formulations was assessed using mathematical models such as Higuchi, diffusion in solid spheres and in capsules, zero order, dissolution models, and Korsmeyer-Peppas¿s generalized equation. The release profile of these nanocapsules suggests the possible accumulation of the drug in the isopropyl myristate, which simulates de stratum corneum of the skin. The remaining formulations require additional studies to detect their release profiles, and could be useful for extremely long releases and might depend quite a lot on the polymers erosion. The results of this research are promising as an alternative system for the treatment of ectoparasites, aiming for veterinary usage.
|
62 |
Expressão recombinante da cisteíno protease nsP2 do arbovírus Mayaro em células de insetoCosta, Renata Torres da January 2016 (has links)
Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O arbovírus Mayaro (MAYV), encontrado nas regiões próximas a florestas e
áreas rurais da América do Sul, é membro da família Togaviridae, gênero
Alphavirus. Este gênero é distribuído amplamente, tendo dois grupos principais:
Alphavirus do Velho Mundo (Chikungunya, Sindbis, O¿nyong-nyong, Ross River,
Semliki Forest) e do Novo Mundo (Encefalite Equina Venezuelana, Encefalite Equina
Ocidental), de acordo com a região na qual foram isolados originalmente. O
mosquito Haemagogus spp. é o principal vetor do MAYV que também já foi isolado
de mosquitos do gênero Aedes spp. Considerando a semelhança do MAYV com o
vírus Chikungunya, recentemente inserido no Brasil, e transmitido por Ae. aegypti,
há risco de que o MAYV possa ser transmitido em áreas urbanas. Cabe ressaltar
que no Brasil já foram registrados casos de co-circulação de MAYV durante surtos
epidêmicos de dengue. A infecção por MAYV causa sintomas semelhantes a outras
doenças febris, como a febre da dengue, a febre do Chikungunya, e a malária,
dificultando o diagnóstico preciso dos casos. O genoma de MAYV, com cerca de
11,7 kb, é organizado em duas principais regiões: domínio não estrutural
(extremidade 5¿ do RNA), contendo os genes que codificam as proteínas não
estruturais (nsP1-4); e domínio estrutural, contendo os genes que codificam as
proteínas estruturais. As proteínas não estruturais dos Alphavirus são necessárias
para o processamento da poliproteína e para síntese do RNA viral. Dentre as
proteínas não estruturais, as proteases virais podem ser imunogênicas além de se
constituírem em excelentes alvos terapêuticos. O estudo comparativo do genoma
dos Alphavirus indica que a proteína nsP2 de MAYV possui diversas atividades
enzimáticas, incluindo a atividade de cisteíno protease em sua região C-terminal.
Portanto, com o intuito de obter um método de diagnóstico sorológico específico
para MAYV, utilizando sistema de expressão recombinante em células de insetos, foi
realizada a construção de três baculovírus recombinantes para a nsP2 de MAYV,
para obtenção da proteína completa (nsP2FL), do domínio de cisteíno protease da
porção C-terminal (Pro38), e do domínio N-terminal (NT51) como controle negativo da
atividade proteolítica. A expressão de cada uma das formas recombinantes da nsP2
foi realizada em célula de inseto High Five¿. Os resultados foram analisados por
meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) e
Western blotting. Apenas a construção NT51 da nsP2 de MAYV foi detectada na
fração celular da cultura de High Five¿ por Western blotting. A análise de RNA das
células High Five¿ e Sf-9 infectadas com os baculovírus recombinantes para nsP2FL
e Pro38, revelou a presença de transcritos das proteínas recombinantes, indicando
que a ausência dos produtos proteicos poderia ser devido a perda da cauda de
histidina presente nas construções por atividade de proteólise na extremidade Cterminal.
Esta hipótese foi confirmada após expressão das proteínas nsP2FL e Pro38,
em célula High Five¿ infectada com baculovírus recombinantes para os genes que
codificam as respectivas proteínas, com cauda de histidina na porção N-terminal. / The arbovirus Mayaro (MAYV), found in regions close to forests and rural
areas of South America, is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus.
This genus is distributed widely, in two main groups, according to the region in which
they were originally isolated: the Old World (Chikungunya, Sindbis, O'nyong-Nyong,
Ross River, Semliki Forest) and the New World Alphavirus (Venezuelan Equine
Encephalitis, Western Equine Encephalitis). The mosquito Haemagogus spp. is the
main vector of MAYV which has also been isolated from mosquitoes of the genus
Aedes spp. Considering the similarity of MAYV with Chikungunya virus, recently
introduced in Brazil, and transmitted by Ae. aegypti, there is risk of MAYV urban
transmission. Indeed, in Brazil, co-circulation of MAYV during dengue outbreaks
have been related. Symptoms of MAYV fever are similar to other febrile diseases,
such as dengue fever, Chikungunya fever, and malaria, making an accurate
diagnosis, difficult. MAYV 11.7 kb genome is divided in two regions: non-structural
domain (5'- RNA) containing the genes encoding the nonstructural proteins (nsP1-4);
and structural domain containing genes encoding structural proteins. The Alphavirus
nonstructural proteins are required for processing of the polyprotein and for viral RNA
synthesis. Among the non-structural proteins, viral proteases may be immunogenic
besides being excellent therapeutic targets. Genome comparative studies of
Alphavirus indicates that the MAYV nsP2 protein has diverse enzymatic activities
including a cysteine protease activity in its C-terminal region. Thus, with the objective
to obtain a specific diagnostic method for MAYV, using a recombinant expression
system in insect cells, a construction of three MAYV nsP2 recombinant baculoviruses
to obtain the complete protein (nsP2FL), the C-terminal cysteine protease domain
(Pro38), and the N-terminal (NT51) domain as a proteolysis activity negative control.
The expression of each nsP2 construction was performed on Sf-9 and High Five¿
insect cells and the results were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis with
SDS (SDS-PAGE) and Western blotting. Only the nsP2 NT51 construction was
detected in the cellular fraction of Sf-9 and High Five¿ cultures by Western blotting.
RNA analysis of Sf-9 cells infected with nsP2FL and Pro38 recombinant baculoviruses
revealed the presence of transcripts, suggesting that the absence of the
corresponding protein products occurred due the proteolysis of the C-terminal portion
of the protein, resulting in histidine tail elimination. This hypothesis was confirmed by
expression of nsP2FL e Pro38, proteins in Sf-9 and High Five¿ cells infected with
recombinant baculoviruses for the genes encoding the respective proteins with
histidine tail at the N-terminal portion.
|
63 |
Efeitos do inibidor de serinoproteases rBmTI-6-d1 (Kunitz-BPTI) em um modelo experimental de enfisema pulmonarNeves, Luana de Paiva January 2015 (has links)
Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Embora a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)seja uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo, ainda não há tratamento que reverta àdestruição do parênquima pulmonarobservadas nestes pacientes. O desenvolvimento de modelos experimentais,que mimetizam as características e os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no enfisema,por meioda instilação de uma protease,éde extrema relevância uma vez que podem contribuirpara o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas. Uma das causas atribuídas para o aparecimento da doença éo tabagismo, no entanto, fatores genéticose fatoresambientais como a poluição também estão envolvidos com o aparecimento da doença em humanos. Algumas enzimas estão envolvidas no processo de instalação da doença como as metaloproteases 9 e 12 e as serinoproteases, especificamente a elastase de neutrófilos humana. Em um projeto anterior,utilizando o inibidor de serinoproteases recombinante rBmTI-Ano modelo de indução deenfisema pulmonar em camundongos,foi observado que esta molécula é capaz de interferir na progressão do enfisema pulmonar, o rBmTI-A é um inibidor pertencente à família Kunitz-BPTI e possui dois domínios inibitórios com atividade sobre tripsina, calicreína plasmática humana e elastase de neutrófilos humana.
Neste projeto,foi utilizadooinibidor rBmTI-6,também pertencente à família Kunitz-BPTI,porém contendo três domínios inibitórios com atividade sobre tripsina bovinae plasmina. Uma amostra de rBmTI-6 previamente purificada por cromatografia de afinidadeem tripsina-sepharosefoiaplicada emuma cromatografia de troca iônica, coluna Resource Q,que separou osdomínios inibitóriosem domínio 1 (rBmTI-6-d1)e domínios 2e 3 (rBmTI-6-d2/3). O rBmTI-6-d1teve suaconcentraçãoativa determinada em 1,5µMe a constante de inibição (Ki)sobre tripsina bovina determinado em 1,95nM, este domínio purificado apresentou 77% de atividade específica (inibidor ativo em relação à proteína total da amostra).
O rBmTI-6-d1 foi utilizado em um experimentono modelo experimental de enfisema pulmonar.Neste experimento o enfisema foi induzido utilizando a instilação por via nasal de elastase pancreática porcina(PPE)e 1 hora depois da instilaçãocom PPEfoi feito o tratamento coma instilaçãorBmTI-6-d1. Vinte e um dias após a instilação de PPEe rBmTI-6-d1 foi feita a analise da função respiratória para os14 parâmetros de elastância tecidual (Htis),resistência tecidual (Gtis)eresistência das vias aéreas (Raw). Animais induzidos ao enfisema e tratados com o rBmTI-6-d1apresentaram valores de elastância tecidual (Htis)e resistência tecidual (Gtis) próximasaosvalores dosgrupos controles, cujos animais não foram induzidos ao enfisema, os animais não tratados com rBmTI-6-d1 apresentaram aumento de Htis e Gtis. Para o parâmetro de resistência das vias aéreas o resultado mostra uma tendência de redução deste parâmetro para animais tratados com rBmTI-6-d1. Os resultados da medida do intercepto linear médio (Lm), apontam uma tendência ao grupo que foi induzido ao enfisema e tratado com rBmTI-6-d1 de redução da Lm em comparação com o grupo induzido ao enfisema e não tratado.Estes resultados sugerem que o inibidor teve papel de prevenir a instalação do enfisema pulmonar nos animais tratados com rBmTI-6-d1. / Although chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a major cause of morbidity and mortality worldwide, there is no treatment to reverse the destruction of the lung parenchymaobserved in these patients. The development of experimental models that mimic the characteristics and pathophysiological mechanisms of emphysema by instillationone protease is extremely important since it can contribute to the development of future therapeutic strategies. One of the causes associated with the onset of the disease is smoking, however, genetic factors and environmental factors such as pollutionare also involved in disease in humans. Some enzymes are involved in the installation process of the disease like metalloproteases 9 and 12 and serineproteases, specifically human neutrophil elastase. In a previous study using recombinant serineprotease inhibitor rBmTI-A in a pulmonary emphysema model with mice was observed that this molecule is capable of interfering with the progression of the disease, rBmTI-A is an inhibitor belongingto the Kunitz-BPTI family and has two inhibitory domains with activity towardtrypsin, human plasmakallikreinand human neutrophil elastase. In this project, a sample of rBmTI-6 inhibitor also belongs to the Kunitz-BPTI family, previously purified by affinity chromatography on trypsin-sepharose was used, the sample was purified again using an ion exchange chromatography with Resource Q column, where it was observed a separation of the inhibitory domains. The domain 1 (rBmTI-6-d1) had their active concentration determined in 1,5?M. The rBmTI-6-d1 had a Ki on certain bovine trypsin in 1,95nM this purified domain had 77% specific activity (active inhibitor in the total protein of the sample).
The rBmTI-6-d1 was selectedfor the experiments with an experimental model of pulmonary emphysema. In these experiments emphysema was induced by intranasal instillation of porcine pancreatic elastase (PPE) and 1 hour after PPE instillation, the treatment with rBmTI-6-d1. Twenty-one days after instillation of PPE and rBmTI-6-d1 was made the analysis of respiratory function to tissue elastance parameters (Htis), tissue resistance (Gtis) and airway resistance (Raw). Animals induced emphysema and treated with rBmTI-6-d1 showedtissue elastance values (Htis) and tissue resistance (Gtis) close to the values of the control groups, whose animals were not induced emphysema, untreated animals with rBmTI-6-d1 increased by Htis and Gtis. For the air way resistance the result shows a tendency to decrease in this parameter for animals treated with rBmTI-6-d1. The results of measuring the mean linear intercept (Lm), show a tendency to emphysema group that was induced and treated with -rBmTI6-d1 Lm reduced in comparison with the experimental group and the untreated emphysema. These results suggest that the inhibitory role was to prevent the development of pulmonary emphysema in animals treated with rBmTI6-d1.
|
64 |
Purificação e caracterização de um inibidor de elastase de neutrófilos do feijão-caupi (Vigna unguiculata L Walp)Ferreira, Graziele Cristina January 2017 (has links)
Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / O Feijão Caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) é uma leguminosa com importante representatividade econômica e nutricional, especialmente no Brasil. Inibidores de serino proteases, como a tripsina, já foram descritos na espécie, assim como em outras plantas. No entanto, nesta espécie, ainda não foram identificados inibidores que apresentem atividade sobre a elastase de neutrófilos humana (HNE), protease envolvida em muitos processos patológicos, como na instalação e progressão da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Nesse estudo, purificamos um inibidor a partir do extrato protéico de Vigna unguiculata que apresenta atividade sobre HNE. Inicialmente, foi realizado o processo de extração alcalina de proteínas, seguido de três passos cromatográficos distintos, utilizando as colunas Hitrap-Q (Troca-iônica), Source15RPC (Fase-Reversa) e ACE18 (Fase-Reversa). Essas etapas foram acompanhadas por testes de atividade inibitória, utilizando os substratos fluorogênicos Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (Elastase) e Z-Phe-Arg-MCA (Tripsina), além de ensaios da quantificação de concentração total de proteínas. Para determinar a massa do inibidor, foram utilizadas as técnicas de espectrometria de massa por MALDI-TOF e SDS-PAGE, o inibidor apresenta massa molecular de 10,99 KDa. O Ki para HNE foi determinado no valor de 9 pM. O inibidor não apresentou atividade inibitória sobre tripsina e trombina, porém foi observada atividade sobre subtilisina e quimotripsina. Estes dados indicam que o inibidor purificado trata-se de uma molécula ainda não caracterizada, devido às suas atividades inibitórias o nomeamos de Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI). / The cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) is a legume of important economic and nutritional representativeness, especially in Brazil. Serine protease inhibitors, such as trypsin, have been described in many species, as well as in other plants. In this specie an inhibitor with activity on human neutrophil elastase (HNE) has not yet been identified. This protease is involved in many pathological processes, such as the onset and progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). We purified and characterized an inhibitor from the protein extract of Vigna unguiculata presenting activity towards HNE. Firstly, we performed the alkaline extraction procedure for proteins followed by three different chromatographic steps using Hitrap Q (ion exchange), Source15RPC (Reversed-Phase) and ACE18 (Reversed Phase) columns. These steps were followed by the inhibitory activity tests using fluorogenic substrates, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (elastase) and Z-Phe-Arg-MCA (trypsin), and quantitation assays of protein concentration. To determinate the size of the molecule, we used MALDI-TOF mass spectrometry and SDS-PAGE. The molecular mass of the inhibitor was 10,99 kDa. The dissociation constant (Ki) toward HNE was 9 pM. HNE inhibitor showed no inhibitory activities toward trypsin and thrombin. However, the inhibitor presented activity toward subtilisin and chymotrypsin. These datas indicate that this molecule is a novel inhibitor to HNE and we named it Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI).
|
65 |
Investigação dos mecanismos de indução de morte celular por Tioridazina em células tumorais leucêmicas : alterações em vias de sinalização celular e na expressão de proteínas da família BCL2Moraes, Vivian Werloger Rodrigues de January 2016 (has links)
Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O câncer é uma das principais causas de morte da população mundial, sendo considerado um problema de saúde pública. As células tumorais adquirem diversas características que as permitem se proliferar desordenadamente e invadir outros tecidos, como a resistência à morte celular. As fenotiazinas são fármacos utilizados há muito tempo para o tratamento de desordens psiquiátricas. Dados da literatura demonstram que estes compostos apresentam diversos efeitos biológicos relevantes, como a atividade antitumoral. Estudos do nosso grupo têm evidenciado efeitos extremamente importantes das fenotiazinas e análogos sobre mitocôndrias, como aumento das concentrações de cálcio no citosol. Em nosso estudo prévio com mitocôndrias isoladas, foi demonstrado que estes compostos promovem a permabilização da membrana mitocondrial pela abertura do poro de transição de permeabilidade com consequente dissipação do potencial de membrana mitocondrial, efluxo de cálcio e liberação de citocromo c. Posteriormente, em um estudo recente, demonstramos a citotoxicidade destes compostos em células de hepatoma, acompanhada de alterações na morfologia celular, permeabilização da membrana plasmática e imediata dissipação do potencial de membrana mitocondrial. Dentre as fenotiazinas estudadas por nosso grupo, a que apresentou maior potência foi a tioridazina (TR), sendo assim a droga escolhida para este estudo, cujo objetivo foi estudar os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida pela tioridazina em células leucêmicas, investigando o papel das proteínas da família BCL-2 neste processo, bem como as alterações nas vias de sinalização associadas à morte celular, como estresse do retículo endoplasmático (RE). A TR foi capaz de induzir a apoptose de maneira concentração e tempodependente, além de inibir a progressão do ciclo celular nas células leucêmicas K562. Além disso, a morte celular induzida pela tioridazina foi acompanhada de dissipação do potencial de membrana mitocondrial e alterações na expressão das proteínas da família BCL-2 e ativação das proteínas quinases JNK, ERK1/2 e p38. Nossos resultados também demonstraram que TR é capaz de promover a ativação da proteína pró-apoptótica BAX e liberação da proteína mitocondrial Omi, eventos característicos da permeabilização da membrana mitocondrial externa. Adicionalmente, observamos que TR foi capaz de promover severo estresse do RE, acompanhado de aumento na expressão das principais proteínas envolvidas na sinalização em resposta a este evento e consequente morte celular. Neste trabalho podemos concluir que a tanto a via mitocondrial como o estresse do retículo endoplasmático contribuem para a morte celular induzida pela TR nas células K562. Estes resultados demonstraram o potente efeito citotóxico da tioridazina nas células leucêmicas e evidenciaram o promissor potencial terapêutico dessa classe de drogas como antitumorais. / Cancer is the leading cause of death worldwide and it is considered a public health problem. Tumor cells exhibit a variety of features that enable tumor growth and dissemination, like resistance to cell death mechanisms. Phenothiazines is a group of drugs that have been used in the treatment of psychiatric disorders for a long time. Literature data demonstrate that these compounds exhibit relevant biological effects including antitumor activity. Publications from our group have evidenced extremely important effects of phenotiazines and analogues on mitochondria related to the increase of calcium cytosolic concentration promoted by this drug. In our earlier work with isolated mitochondria, it was demonstrated that these drugs promote the mitochondrial membrane permeability due to the opening of permeability transition pore complex with consequent dissipation of mitochondrial transmembrane potential, calcium efflux and cytochrome c release. Additionally, in our latest publication, we demonstrated the cytotoxicity of phenothiazines in hepatoma cells, accompanied by cellular morphological alterations, plasma membrane permeability and immediate dissipation of mitochondrial transmembrane potential. Among the studied phenothiazines, the most potent was thioridazine, which was chosen for the present work. The goal of this work was to underlie the molecular mechanisms of thioridazine-induced cell death in leukemic cells, evaluating the role of BCL-2 family proteins, as well as changes in signaling pathways associated to cell death, including endoplasmic reticulum (ER) stress. This compound was able to induce apoptosis in a concentration and time-dependent manner, and also inhibit the cell cycle progression in K562 cells. Furthermore, tioridazine-induced cell death was accompanied by dissipation of mitochondrial transmembrane potential, alterations in BCL-2 proteins
expression as well as activation of the kinases JNK, ERK1/2 and p38. Our results also demonstrated that thioridazine was able to activate the pro apoptotic protein BAX and the release of the mitochondrial protein Omi, resulting in mitochondrial outer membrane permeabilization. In addition, we observed that thioridazine was able to induce a severe ER stress, promoting an increase in the expression of the major sensor proteins in this signaling pathway, leading to cell death. We can conclude that both mitochondrial and ER stress contributes to thioridazine-induced cell death in K562 cells. Besides the importance of our results to the elucidation of phenothiazines-induced tumor cells death, it also confirms the promising therapeutic potential of this class of drugs as antitumor agents.
|
66 |
Expressão e purificação da forma recombinante dos Inibidores de Serino Peptidase ISP1 e ISP2 de Leishmania infantum chagasiSantos, Juliete Vitorino dos January 2017 (has links)
Orientadora: Profª Drª Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / A leishmaniose visceral, causada pelos parasitas das espécies Leishmania infantum e Leishmania donovani, do Velho Mundo, e pela Leishmania infantum chagasi, do Novo Mundo, é uma doença infecciosa e letal se não for tratada. O número de casos desta doença está aumentando no Estado de São Paulo. Uma vez diagnosticada, o tratamento para a leishmaniose visceral tem efeitos colaterais importantes, além da ocorrência de parasitas resistentes aos medicamentos disponíveis. Sabe-se que algumas peptidases desempenham um papel importante na fisiologia e doença causada por parasitas do género Leishmania. A inibição específica destas enzimas pode constituir uma importante estratégia para a produção de potentes agentes antiparasitários. Em bactérias E. coli, inibidores de serino peptidases (ISPs) denominados ecotinas, têm sido descritos, sendo também identificados em espécies de Leishmania. A caracterização funcional da ISP1 e ISP2 de L. major mostrou o seu papel na formação de flagelo de promastigotas e na inibição da elastase de neutrófilos de hospedeiro vertebrado, respectivamente. Portanto, os objetivos deste projeto são a expressão e a purificação das proteínas ISP1 e ISP2 de L. i. chagasi (LcISP1 e LcISP2) recombinantes. A amplificação das sequências que codificam as LcISP1 e LcISP2 foi realizada por PCR a partir do DNA genômico, de L. i. chagasi extraído de uma estirpe de referência cedida pelo Laboratório Nacional de Referência de Espécies de Leishmania da Fiocruz, Rio de Janeiro. Os fragmentos de PCR foram clonados no vetor de expressão bacteriano pET28a e as proteínas recombinantes LcISP2 e LcISP1 foram obtidas na fração solúvel do extrato proteico bacteriano. Após expressão das proteínas recombinantes, elas foram purificadas por cromatografia de afinidade em níquel. / Visceral leishmaniasis, caused by the Old World parasites species Leishmania infantum and Leishmania donovani, and by the New World Leishmania infantum chagasi, is an infectious and lethal disease, if untreated. The number of cases of this disease is increasing in the State of São Paulo. Once diagnosed, treatment for visceral leishmaniasis has important side effects, besides occurrence of parasites resistant to the available drugs. It is known that some peptidases play an important role in physiology and disease caused by parasites of the genus Leishmania. The specific inhibition of these enzymes may constitute an important strategy for producing potent antiparasitic agents. In bacteria E. coli, inhibitors of serine peptidases (ISPs) called ecotins, have been described, being also identified in Leishmania species. Characterization of genes encoding ISP1 and ISP2 of L. major, showed its role in the promastigote flagellum formation and in the inhibition of vertebrate host neutrophil elastase, respectively. Therefore, the aims of this project are to produce L. i. chagasi ISP1 (LcISP1) and ISP2 (LcISP2) recombinant forms and to evaluate the its biochemical activity. Amplification of the LcISP1 and LcISP2 encoding sequences were performed by PCR from L. i. chagasi DNA extracted from a reference strain obtained from the Leishmania collection of the Leishmania National Reference Laboratory of the Instituto Oswaldo Cruz. PCR fragments were cloned into the pET28a bacterial expression vector and the recombinant LcISP1 and LcISP2 proteins were present in soluble bacterial extract fraction. After purification by niquel affinity chromatography, recombinant LcISP1 and LcISP2 proteins e were tested for biochemical activity.
|
67 |
Desenvolvimento de Vioserpina para estudo de especificidade e inibição da calicreína tecidual humana 5 recombinante, utilizando mutantes da vioserpinaAndrade, Regina Aparecida de January 2017 (has links)
Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2017. / Serpina é o nome dado à superfamília de proteínas com uma vasta diversidade de funções biológicas, que tem como principal característica a inibição irreversível de serino proteases. A característica estrutural mais marcante das serpinas é a presença de uma alça na sua porção C-terminal, composta por 20 aminoácidos denominados alça do centro reativo (RCL). A RCL é a região da serpina que se liga covalentemente ao sítio ativo da serino protease, promovendo a inibição irreversível da enzima pela desarticulação de estruturas funcionais essenciais para a catálise enzimática. As calicreínas teciduais humanas (KLKs) são um grupo de 15 serino proteases (KLK1-KLK15) expressas em uma gama de tecidos. A rKLK5, estudada neste trabalho, é expressa abundantemente na pele humana, e parece que exerce importante papel no processo de descamação epidermal, podendo estar relacionada à patologias, como a psoríase e dermatite atópica. Assim, nesse trabalho foi realizada subclonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) da serpina oriunda da cianobactéria Gloeobacter violaceus, identificada pelo nosso grupo e nomeada vioserpina. Os genes codificadores da vioserpina foram previamente clonados no vetor de expressão pET-28a e por meio da técnica de mutação sítio-dirigida foram produzidos dois mutantes substituindo os resíduos de aminoácidos arginina e alanina nas posições P1 e P2 da alça do centro reativo (RCL) da vioserpina, respectivamente, por um resíduo de aminoácido glicina (VSR344G e VSA345G). O sucesso das mutações foi avaliado através de sequenciamento de DNA. As vioserpinas mutantes foram expressas na cepa bacteriana E. coli BL21(D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel (Ni-NTA) e obtidas na forma solúvel. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a vioserpina e a KLK5 por análise em SDS-PAGE 10% confirmados pela espectrometria de massas. Também foi analisada a ação inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) frente a KLK5. Os valores de SI (estequiometria de inibição) apresentaram valores altos o que indica que é preciso uma concentração grande de inibidor, no caso os mutantes da vioserpina, para que a enzima tenha sua atividade inibida, apresentando-se desta forma uma inibição ineficiente frente a rKLK5. Nesse estudo foi possível obter um inibidor específico (vioserpina) para a rKLK5, podendo assim contribuir para o desenvolvimento de novos procedimentos terapêuticos para patologias envolvidas com o processo de descamação epidermal. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the irreversible inhibition of serine proteases. The most striking structural feature of serpins is the presence of a loop in the C-terminal portion of the protein, composed by 20 aminoacids called Reative Center Loop (RCL). The RCL is the region of the serpin that binds covalently to the serine protease active site, which causes the irreversible inhibition of the enzyme by the disarticulation of functional structures essencial for the enzymatic catalysis. Human tissue kalikreins (KLKs) are a group of 15 serine proteases (KLK1-KLK15) expressed in a plethora of tissues. The rKLK5, studied in this work, is abundantly expressed in human skin, and seems to play an important role in the epidermal desquamation process, and may be related to pathologies such as psoriasis and atopic dermatitis. Therefore, in this work the subcloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of serpin mutants (VSR344G e VSA345G) of the cyanobacteria Gloeobacter violaceus, recently described by our group and named vioserpin, was proposed. The genes coding for vioserpin were previously cloned into the pET-28a expression vector and through the site-directed mutation technique two mutants were produced by substituting the arginine and alanine amino acid residues at the P1 and P2 positions of the serine reactive center loop (RCL), respectively, by a glycine amino acid residue (VSR344G e VSA345G). The success of the mutations was assessed by DNA sequencing. The mutant vioserpin was expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the nickel resin affinity chromatography technique (Ni-NTA) and obtained in the soluble form. Covalent complex formation between vioserpin and rKLK5 could be visualized by 10% SDS-PAGE analysis confirmed by mass spectrometry. We also analyzed the inhibitory action of mutants (VSR344G and VSA345G) against rKLK5. The SI values (inhibition stoichiometry) presented high values indicating that a large inhibitor concentration is required in the case of the vioserpin mutants, so that the enzyme has its inhibited activity, thus presenting an inefficient inhibition in front To rKLK5. In this study it was possible to obtain a specific inhibitor (vioserpin) for rKLK5, thus contributing to the development of new therapeutic procedures for pathologies involved with the epidermal desquamation process.
|
68 |
Ação modulatória da co-chaperona BAG2 sobre os níveis da proteína TAU fosforilada : um estudo celular e molecular utilizando RNA de interferência e culturas primárias de hipocampoBalioni, Laiz Furlan January 2013 (has links)
Orientador: Daniel Carneiro Carrettiero. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013
|
69 |
Papel das células-tronco mesenquimais na hipertrofia cardíaca induzida por lesão isquêmica renalNakama, Karina Kaori January 2014 (has links)
Orientadora: Profa. Dra. Marcela Sorelli Carneiro Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / A ativação de fatores inflamatórios em um quadro de insuficiência renal isquêmica pode afetar outros órgãos, como o coração. Esses fatores lesionam o tecido cardíaco que, então, sofre um remodelamento, com a hipertrofia dos cardiomiócitos e pode evoluir para a hipertrofia cardíaca. O desenvolvimento de pesquisas com células-tronco demonstram que estas células secretam fatores que protegem o tecido cardíaco da injúria, modulam fatores inflamatórios e diminuem a formação de fibrose, o que despertou o interesse pelo seu uso em terapias para algumas cardiopatias. Este projeto teve como intuito avaliar as alterações ocasionadas pela introdução de células-tronco em modelos de hipertrofia cardíaca, devido um quadro de insuficiência renal. Para isso, camundongos C57BL/6 foram submetidos à oclusão unilateral do pedículo renal esquerdo por 60 minutos, com a aplicação de células-tronco mesenquimais via plexo retro-orbital um dia após a cirurgia. Os corações e rins dos modelos animais foram caracterizados por meio de estudos morfológicos. Os resultados obtidos demonstraram que as células-tronco preveniram o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca, uma vez que não se verificou o aumento de massa, aumento de volume ou diminuição do lúmen do ventrículo esquerdo dos animais que receberam uma aplicação dessas células. Além disso, verificou-se também uma ação moduladora das células-tronco nos rins direitos, que não apresentaram um aumento de massa ou volume. No entanto, nenhum dado obtido demonstrou uma ação protetora dessas células nos rins esquerdos, diretamente afetados pela cirurgia de indução de lesão isquêmica. Logo, pela primeira vez, foi demonstrado que a aplicação de células-tronco mesenquimais preveniu o desenvolvimento da hipertrofia nos grupo tratados. / Activation of inflammatory factors in ischemic renal failure condition affects other organs as well as the heart. The inflammatory factors injure the cardiac tissue, modulating heart trophism with cardiomyocytes hypertrophy and this pathologic condition may progress to cardiac hypertrophy. Development of stem cell research has shown that it secrete factors that protect cardiac tissue of the injury, modulate inflammatory factors and decreases fibrosis. These discoveries have motivated studies with stem cells in cardiac diseases. This study aimed to evaluate the morphological alterations caused by the stem cells introduction on renal ischemia/reperfusion induced cardiac hypetrophy models. To analyze the stem cell effect at this model, C57BL/6 mice were subjected to unilateral occlusion of left renal pedicle for 60 minutes and one day after surgical procedures mesenchymal stem cells were applied via retro orbital sinus. Hearts and kidneys of the animal models were characterized by morphological study. and, for the first time, we evidenced that mesenchymal stem cells treatment prevents the renal ischemia/reperfusion induced cardiac hypertrophy. The results evidenced the stem cell capacity to prevent cardiac hypertrophy development, since there were no mass increase, volume increase or decrease of left ventricular lumen area on animals that received a stem cells injection. Moreover, it was verified a modulating capacity of stem cells on right kidneys that didn't presented increase in mass or volume. However, no data indicated a protective role of these cells in the left kidneys. Thus, for the first time, we evidenced that mesenchymal stem cells treatment prevents the renal ischemia/reperfusion induced cardiac hypertrophy.
|
70 |
Análise dos efeitos da telurana RF-28 sobre o crescimento e a expressão gênica global em Paracoccidioides brasiliensisRenó, Débora Liliane de Souza January 2015 (has links)
Orientador: Prof. Dr. Luiz Roberto Nunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / Paracoccidioides brasiliensis e um fungo termodimorfico associado com a paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistemica mais comum na America Latina. O tratamento da PCM envolve quimioterapia de longo prazo e recaidas ocorrem com uma frequencia alarmante. Alem disso, o aparecimento de novas estirpes de P. brasiliensis, mostrando aumento de resistencia a muitos dos farmacos disponiveis exerce uma pressao constante sobre a necessidade de desenvolver novas alternativas para o tratamento desta micose sistemica. Neste trabalho, mostramos que um composto hipervalente de telurio, chamado organotelurana RF-28 pode inibir o crescimento in vitro de P. brasiliensis em concentracoes micromolares exercendo atividade prioritariamente fungiestatica, sendo sua concentracao inibitoria minima encontrada em torno de 20 ÊM. Alem disso, na tentativa de melhor compreender os mecanismos pelos quais RF-28 exerce essa atividade fungiestatica, utilizou-se a hibridacao em microarranjos para examinar o modo como esta substancia afeta a expressao genica deste fungo, identificando varios genes cuja expressao foi modulada em resposta a concentracoes subletais da droga. Uma analise detalhada deste conjunto de dados mostrou que a RF-28 induz a modulacao dos genes envolvidos na rede Proteostase: um conjunto de atividades metabolicas que atua de uma forma integrada para equilibrar os processos de sintese, estruturacao (gfoldingh) e reciclagem de proteinas no interior da celula. Nesse sentido, verificou-se, por exemplo, que 1/3 do total de genes codificadores de subunidades do proteassoma encontravam-se sub-regulados, enquanto 62% do total de genes codificadores de proteinas ribossomais eram superexpressos. Tais dados sugerem que a RF-28 pode exercer a sua atividade antifungica por ruptura do equilibrio do processo intracelular que coordena a homeostase proteica em celulas eucarioticas. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus associated with paracoccidioidomycosis (PCM), the most common systemic mycosis in Latin America. PCM treatment involves long term chemotherapy and relapses occur at an alarming rate. Furthermore, the emergence of new strains, showing increased resistance to many of the available drugs exerts a constant pressure on the need to develop new alternatives for the treatment of systemic mycoses. In this work, we show that a hypervalent tellurium compound, named organotellurane RF-28 may inhibit in vitro growth of P. brasiliensis yeast cells at micromolar concentrations; RF-28 exerts primarily a fungistatic activity, with its minimal inhibitory concentration found to be around 20 uM. Furthermore, in an attempt to better understand the mechanisms by which RF-28 exerts this fungistatic activity, we used microarray hybridization to examine how it affects the expression of genes in the fungus, identifying several genes whose expressions were modulated in response to sublethal concentrations of this drug. A detailed review of this dataset showed that RF-28 induces the modulation of genes involved in the proteostasis network: a set of metabolic activities which act, in an integrated way, to balance the processes of synthesis, folding and recycling of proteins within the cell. In this sense, ~1/3 of the genes encoding proteasome subunits have been found to be down-regulated in response to RF-28, while ~ 62% of genes encoding ribosomal proteins have been shown to be up-regulated. These data suggest that RF-28 may exert its antifungal activity by disrupting the balance among the intracellular processes that coordinate protein homeostasis in eukaryotic cells.
|
Page generated in 0.0514 seconds