Orientadora: Profa. Dra. Marcela Sorelli Carneiro Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / As doencas cardiovasculares correspondem ao maior risco de morte subita em todo o mundo, a populacao mundial tem se tornado cada vez mais sedentaria e junto as doencas cardiovasculares outros problemas de saude publica aumentam como a obesidade e diabetes mellitus. Os gastos com a saude publica aumentam muito devido a maior incidencia de doencas associadas ao sedentarismo, obesidade, tabagismo, estresse, hipertensao arterial entre outros. Especificamente a obesidade e considerada uma epidemia mundial, que esta associada aos habitos alimentares e sedentarismo, e esta amplamente relacionada ao fator de risco cardiovascular como hipertensao arterial, resistencia insulinica, dislipidemia e diabetes mellitus, que favorecem o processo aterosclerotico e a ocorrencia de eventos cardiovasculares. Ha uma maior prevalencia de hipertensao arterial em individuos obesos e presenca de hipertrofia cardiaca, que e a maior condicao de morbimortalidade cardiovascular. Trata-se de uma doenca cronica relacionada a eventos pro-inflamatorios com acao de diversas citocinas e quimiocinas alem de hormonios envolvidos na resposta imunologica inata. Os receptores Toll-Like fazem parte da Resposta Imunologica Inata e estao presentes em diversos tecidos, incluindo o coracao. Quando ativados desencadeiam uma resposta intracelular, ativando fatores transcricionais, como NF-kB, que leva a transcricao genica de citocinas inflamatorias: IL-6, TNF-¿¿, INF-gama, IL-1. Algumas doencas cardiovasculares sao antecedidas por inflamacoes sistemicas ou locais, demonstrando que as citocinas sao responsaveis por modular o trofismo cardiaco. Diante do exposto, uma analise mais completa envolvendo obesidade e processos inflamatorios com o risco cardiovascular se faz necessaria para a compreensao de moleculas e vias de sinalizacao, reguladas nessa patologia. O presente estudo tem como objetivo avaliar a contribuicao dos fatores inflamatorios na hipertrofia cardiaca induzida por modelo experimental de obesidade. Para tanto, foram utilizados camundongos C57Bl/6 e camundongos FVB/NJ submetidos ao tratamento com dieta rica em gordura contendo 23% proteina, 35,5% carboidrato e 35,9% gordura e foram comparados aos grupos chow (controle) submetidos a dieta composta por 19% de proteina, 56% de carboidrato, 3,5% de gordura por 68 dias de tratamento. Os animais C57Bl/6 apresentaram maior ganho de peso em relacao aos FVB/NJ ao final dos 68 dias de dieta High Fat. O aumento de colesterol serico, insulina, glicemia, epiWAT (epididymal white adipose tissue) foi maior nos animais C57Bl/6. As duas linhagens apresentaram Heart Weight/Body Lenght e Heart Weight/Tibia Lenght maior em relacao ao grupo Chow, ou seja, grupo controle. Atraves da tecnica de Q-PCR os niveis de mRNA dos marcadores moleculares de hipertrofia cardiaca foram avaliados, e o marcador alfa-actina mostrou-se aumentado na linhagem C57Bl/6 enquanto o marcador ANF (atrial natriuretic factor) mostrou-se aumentado na linhagem FVB/NJ, quando comparados aos seus respectivos grupos chow. Os genes TLR2, TLR4, TNF-¿¿, IL-6, MyD88 e NF-kB tambem foram avaliados. A expressao genica de TLR2, MyD88 e NF-kB mostrou-se diminuida nos animais FVB/NJ submetidos a dieta rica em gordura quando comparados aos animais controle. Na linhagem C57Bl/6, observou-se aumento na expressao genica de TNF-¿¿ e NF-kB. A inducao da obesidade promoveu maior ganho de peso na linhagem C57Bl/6 acompanhado de maior adiposidade abdominal e no tecido epididimal, essa linhagem apresentou maior sensibilidade a insulina e maiores niveis de colesterol na dieta High Fat em relacao a linhagem FVB/JN. Houve remodelamento cardiaco em ambas linhagens e a expressao genica de citocinas inflamatorias foi mais evidente na linhagem C57Bl/6, tambem apresentando maior expressao genica de NF-kB. A linhagem FVB/NJ apresentou diminuicao na expressao de MyD88 e NF-kB na dieta High Fat. Com base nos resultados obtidos verificamos que os camundongos C57Bl/6 mostraram-se mais suscetiveis a dieta enquanto a linhagem FVB/JN mostrou-se mais resistente. / Cardiovascular diseases correspond to an increased risk of worldwide sudden death, the world population has become increasingly sedentary and with cardiovascular diseases other public health problems increase such as obesity and diabetes mellitus. Expenditures on public health increase greatly due to a higher incidence of diseases associated with sedentarism, obesity, smoking, stress, hypertension among others. Obesity specifically is considered a worldwide epidemic, which is associated with eating habits and sedentary lifestyle, and is largely related to cardiovascular risk such as hypertension, insulin resistance, dyslipidemia and diabetes mellitus, which favor the atherosclerotic process and occurrence of cardiovascular events. There is a higher prevalence of hypertension in obese and presence of cardiac hypertrophy, which is a higher cardiovascular morbidity and mortality condition. It is a chronic disease related to pro-inflammatory events with the action of various cytokines and chemokines in addition to hormones involved in the innate immune response. Toll-like receptors are part of the innate immune response and are present in several tissues including the heart. When activated trigger an intracellular response, activating transcriptional factors such as NF-kB, which leads to the genetic transcription of inflammatory cytokines: IL-6, TNF- á, IFN-gamma, IL-1. Some cardiovascular diseases are antecedents of systemic or local inflammations, demonstrating that cytokines are responsible for modulating cardiac trophism. In summary, a more complete analysis involving obesity and inflammatory processes with cardiovascular risk to understand molecules and signaling pathways regulated in this pathology are needed. The present study aims to evaluate the contribution of inflammatory factors in cardiac hypertrophy induced by the experimental model of obesity. For this, C57Bl/6 mice and FVB/NJ mice submitted to a high fat diet containing 23% protein, 35.5% carbohydrate and 35.9% fat were compared to the Chow (control) groups submitted to a chow diet containing 19% protein, 56% carbohydrate, 3.5% fat for 68 days of treatment. The C57Bl/6 animals presented greater weight gain in relation to FVB/NJ at the end of 68 days of high fat diet. Serum cholesterol, insulin, glycemia, epiWAT (epididymal white adipose tissue) increased in C57B1/6 animals. Both strains presented Heart Weight/Body Lenght and Heart Weight/Tibia Lenght higher than the Chow group. mRNA levels of cardiac hypertrophy molecular markers were evaluated through Q-PCR technique, and the alpha-actin marker was shown to be increased in the C57B1/6 lineage while the ANF (atrial natriuretic factor) marker was shown to be increased in the FVB/NJ lineage, when compared to their respective chow groups. TLR2, TLR4, TNF-á, IL-6, MyD88 and NF-kB genes were also evaluated. Gene expression of TLR2, MyD88 and NF-kB were decreased in FVB / NJ animals submitted to a high fat diet when compared to control animals. There was an increase in the gene expression of TNF-á and NF-kB in C57Bl/6 lineage. The induction of obesity promoted greater weight gain in the C57Bl/6 mice followed by a greater abdominal and epididymal adiposity, this lineage presented higher insulin sensitivity and higher cholesterol levels in the High Fat diet when compared to the FVB/JN lineage. There was cardiac remodeling in both lineages and inflammatory cytokines gene expression were more evident in the C57Bl/6 mice, also presenting a greater gene expression of NF-kB. The FVB/NJ mice showed decreased expression of MyD88 and NF-kB on the High Fat diet. Based on the results, we found that the C57Bl/6 mice were more susceptible to the High Fat diet than the FVB/JN strain.

Orientadora: Profa. Dra. Marcela Sorelli Carneiro Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / hipertrofia cardiaca pode ser considerada uma adaptacao fisiologica que se desenvolve quando ha uma sobrecarga cronica imposta ao miocardio. A lesao renal e definida como uma diminuicao abrupta da funcao renal e pode ser considerada uma doenca inflamatoria que pode atingir outros orgaos como, por exemplo, pulmoes, figado e coracao. Evidencias sugerem um papel importante para interleucina-6 (IL-6) nas vias moleculares que iniciam a hipertrofia. O sistema nervoso simpatico (SNS) esta relacionado com a funcao imunologica inervando os orgaos imunes sendo responsavel pela liberacao de catecolaminas. Por sua vez, as catecolaminas quando liberadas no coracao modificam o debito cardiaco por alterarem a forca de contracao nas fibras miocardicas e a frequencia cardiaca. Alem de influenciar funcionalmente a circulacao, o aumento na atividade do SNS, pode exercer um efeito trofico sobre as celulas musculares lisas e miocardicas, podendo assim, contribuir para o trofismo do sistema cardiovascular. O presente estudo buscou avaliar a participacao do Sistema Nervoso Simpatico, no desenvolvimento da hipertrofia cardiaca induzida por lesao renal isquemica. Para tanto, foram utilizados camundongos machos C57BL/6 submetidos a oclusao do pediculo renal esquerdo, por 60 min, seguido de reperfusao por 12 dias, e submetidos ou nao ao tratamento com o ¿À-bloqueador atenolol. Os resultados demostraram que o modelo experimental de isquemia/reperfusao (I/R), foi capaz de gerar um quadro de falencia renal e induzir hipertrofia cardiaca, devido ao processo inflamatorio causado pela lesao. Alem disso, o tratamento com atenolol foi capaz de prevenir o crescimento hipertrofico observado apos a I/R, avaliado pelas relacoes Peso coracao/Peso Corporeo, pelos niveis de RNAm de ANF e BNP (marcadores moleculares de hipertrofia cardiaca) e pelos niveis das citocinas inflamatorias. Da mesma forma, o tratamento reduziu os niveis de expressao genica e proteica do receptor ¿À adrenergico assim como dos demais componentes da via, e tambem a atividade enzimatica de PKA. Os niveis de noradrenalina tambem se mostraram elevados apos isquemia e reperfusao, apresentando uma relacao com a hipertrofia observada, sugerindo um papel importante do SNS na regulacao do quadro hipertrofico. Diante do exposto, os dados apresentados demonstram uma sensibilidade do tecido cardiaco para as acoes do SNS, o qual pode estar presente na regulacao de mecanismos que levam a patogenese da hipertrofia cardiaca neste modelo. / Cardiac hypertrophy is a physiological adaptation that develops when a chronic overload is imposed on the myocardium. Kidney damage is defined as an abrupt decrease in kidney function and can be considered an inflammatory disease that can target other organs such as the lungs, the liver and the heart. Evidence suggests an important role for interleukin-6 (IL-6) in the molecular pathways that initiate hypertrophy. The sympathetic nervous system is related to the immune function by innervating the immune organs and also being responsible for the release of catecholamines. On the other hand, the catecholamines released in the heart modify the cardiac output because they change the contraction force of the myocardial fibers and the heart rate. An increase in the activity of the SNS, which functionality influencescirculation, can exert a trophic effect on the smooth and over myocardial muscle cells, thus contributing to the trophism of the cardiovascular system. The present study aimed to evaluate the participation of the Sympathetic Nervous System in thedevelopment of cardiac hypertrophy induced ischemia/reperfusion animal model. Therefore, C57BL / 6 mice were submitted to left renal pedicle occlusion for 60 min, followed by reperfusion for 12 days, with or without treatment with the â-blocker atenolol. The results demonstrated that the experimental model of ischemia / reperfusion (I / R) was able to generate renal failure and induce cardiac hypertrophy due to the inflammatory process caused by the lesion. In addition, atenolol treatment was able to prevent the hypertrophic development observed after I / R, performed by heart weight/ bodyweight ratios, ANF and BNP mRNA levels (molecular markers of cardiac hypertrophy), and cytokine levels. Similarly, the treatment reduced the levels of gene and protein expression of the â-adrenergic receptor as well as of the other components of the pathway and enzymatic activity of PKA. Noradrenaline levels were also elevated after ischemia / reperfusion, showing a relationship with the hypertrophy phenomenon and therefore suggesting an important role of SNS in the regulation of hypertrophic conditions. In conclusion, this data indicates a sensitivity of the cardiac tissue to the actions of the SNS, which may be present in the regulation of mechanisms that lead to the pathogenesis of cardiac hypertrophy in this model.

Orientadora: Profa. Dra. Helena Beatriz de Carvalho Ruthner Batista / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / A raiva é uma zoonose que atinge todos os mamíferos e ocasiona encefalite fatal. O agente etiológico da infecção é o vírus da raiva (RABV), um vírus RNA membro da família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus. Morcegos e cães são os principais reservatórios do vírus na América Latina e são responsáveis pela manutenção de diferentes ciclos da infecção, denominados ciclos "aéreo, silvestre e rural", onde os morcegos são os maiores protagonistas, e o ciclo urbano, onde os cães domésticos são os principais reservatórios. Nos estados do Rio Grande do Sul (RS) e Santa Catarina (SC), sul do Brasil, a raiva em cães domésticos tem sido controlada por mais de 20 anos. A raiva rural, porém, ainda é endêmica e os bovinos têm sido acometidos de forma frequente com oscilações periódicas em ambos estados. Apesar do aumento nos estudos sobre análises genéticas de isolados brasileiros do RABV, vírus do sul do Brasil têm sido pouco estudados. Este trabalho foi realizado para identificar linhagens genéticas de RABV que circulam nos estados do RS e SC, a fim de contribuir no entendimento das razões para perpetuação da raiva rural na região. Foram selecionadas 50 amostras isoladas de bovinos no RS e 9 em SC e submetidas a Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia pela Polimerase (RT-PCR) e sequenciamento genético da nucleoproteína do RABV. Foi possível identificar, no RS, a circulação de duas sublinhagens (1A e 1B) de RABV, ambas com características semelhantes a linhagem genética de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. Em SC foi identificada apenas uma sublinhagem de RABV (1B). Não foram identificados marcadores genéticos específicos que possam ser relacionados com a distribuição geográfica dos vírus. / Rabies is a zoonosis that affects all mammals and causes fatal encephalitis. The etiological agent of the infection is rabies vírus (RABV), a RNA virus member of the family Rhabdoviridae, genus Lyssavirus. Bats and dogs are the main reservoirs of the virus in Latin America and are responsible for the maintenance of the different cycles of infection, namely the "aerial, sylvatic and rural" cycles, where bats are major protagonists, and the urban cycle, where domestic dogs are main reservoirs. In the states of Rio Grande do Sul (RS), and Santa Catarina (SC), Southern Brazil, rabies in domestic dogs has been successfully controlled for more than 20 years. However, rural rabies is still endemic; in cattle has been prone to periodic oscillations in frequency in both states. Despite the plethora of studies on genetic analyses of Brazilian RABV isolates, viruses from Southern Brazil have only scarcely been investigated. This work was performed to identify genetic lineages of RABV circulating in states of RS and SC, in attempting to contribute to the understanding of the reasons for perpetuation of rabies in the region. Fifty RABV cattle isolates from RS and 9 from SC were selected and submitted to Reverse Transcriptase and Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) and genetic sequencing of nucleoprotein of RABV. In RS, the circulation of two sublineages (1A and 1B) of RABV could be identified, both with characteristics of genetic lineages of viruses usually detected in haematophagous bats of the species Desmodus rotundus. In SC, only one sublineages of RABV (1B) was identified. No specific genetic markers that could be related to the viruses¿ geographical distribution were identified.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / A dengue, causada por quatro diferentes sorotipos do vírus (DENV1-4), é a arbovirose de maior prevalência em humanos no mundo. Estudos moleculares são necessários para melhor entendimento de doenças causadas por diferentes sorotipos e variantes genéticas. Em relação á sua origem e história evolucionária, análises filogenéticas e epidemiológicas sugerem que genótipos mais virulentos estão substituindo os de menor virulência. Este trabalho teve como objetivo a caracterização da dinâmica de transmissão e epidemiologia molecular dos DENV circulantes na cidade de médio porte do Estado de São Paulo, Marília, com 233.639 habitantes, durante uma epidemia de dengue ocorrida no ano de 2007. Para tanto foram obtidas amostras de pacientes com diagnóstico clínico e epidemiológico (sem confirmação laboratorial) durante ocorrência de epidemia de dengue. O estudo comparativo de características hematológicas e demográficas dos pacientes com a presença de antígeno NS1 de DENV nas amostras revelou associação significante com leucopenia e plaquetopenia (medianas: DENV+= 3.715 células/mL e DENV- = 6.760 células/mL; e medianas: DENV+ = 134.896 células/mL e DENV- = 223.872 células/mL, respectivamente), e aumento de linfócitos atípicos. Esse padrão hematológico foi mantido durante o longo período da epidemia, permitindo que, com a determinação do padrão conservado nas primeiras fases de uma epidemia, este possa ser usado para implementar medidas de diagnóstico de novos casos, bem como no controle e tratamento dos doentes em todo o restante do período. A detecção e identificação do sorotipo viral, por PCR e Nested-PCR, respectivamente, utilizando como alvo o gene que codifica a junção das proteínas estruturais do capsídeo e pré-membrana (C/prM), confirmou a co-circulação de DENV1 (33%) e DENV3 (67%) em 2007. A partir das sequências obtidas da junção C/prM dos DENV1 e DENV3 dessas amostras, foi feita a reconstrução filogenética. Os resultados indicaram que a população de DENV1 provavelmente se originou da região norte do Brasil, por apresentar pouca variabilidade genética e alta similaridade com amostras de DENV1 de pacientes de Belém do Pará isoladas no mesmo ano. A população de DENV3 apresentou variabilidade genética, provavelmente, devido à microevolução na própria região, visto que as amostras de Marília-SP apresentaram alta similaridade com amostras de vírus isoladas de pacientes da Venezuela, em 2001. Os dois sorotipos mostraram padrões hematológicos distintos, nos quais, com o aumento de linfócitos atípicos houve uma significante maior leucopenia na população de DENV3 e uma tendência a maior diminuição de plaquetas em DENV1. Os estudos realizados demonstram que a dengue é uma doença com características regionais específicas. Portanto, a implementação das atividades de manejo das epidemias dependem da caracterização das variantes genéticas dos DENV e sua relação com a população acometida. / Dengue, caused by four different serotypes of the virus (DENV1-4), is the most prevalent arbovirose in humans in the world. Molecular studies are needed to better understand diseases caused by different serotypes and genetic variants. In relation to its origin and evolutionary history, phylogenetic and epidemiological analyzes suggest that more virulent genotypes are replacing those of less virulence. This work aimed to characterize the transmission dynamics and molecular epidemiology of DENV circulating in the medium-sized city of the State of São Paulo, Marília, with 233,639 inhabitants, during a dengue epidemic occurred in 2007. For this purpose, samples were obtained of patients with clinical and epidemiological diagnosis (without laboratory confirmation) during the occurrence of a dengue epidemic. The comparative study of the hematological and demographic characteristics of patients with the presence of DENV NS1 antigen in the samples revealed a significant association with leukopenia and thrombocytopenia (median: DENV + = 3,715 cells / mL and DENV- = 6,760 cells / mL; 134,896 cells / mL and DENV- = 223,872 cells / mL, respectively), and increase of atypical lymphocytes. This hematological pattern was maintained during the long period of the epidemic, allowing the determination of the pattern preserved in the first stages of an epidemic, to be used to implement measures for the diagnosis of new cases, as well as for the control and treatment of patients in the remainder of the period. Detection and identification of the viral serotype by PCR and Nested-PCR, respectively, targeting the gene coding for the junction of the capsid and premembrane (C / prM) structural proteins, confirmed the co-circulation of DENV1 (33 %) and DENV3 (67%) in 2007. From the sequences obtained from the C / prM junction of the DENV1 and DENV3 of these samples, the phylogenetic reconstruction was performed. The results indicated that the DENV1 population probably originated from the northern region of Brazil, as it presents little genetic variability and high similarity with DENV1 samples from patients from Belém do Pará isolated in the same year. The DENV3 population showed genetic variability, probably due to the microevolution in the region itself, since the Marília-SP samples presented high similarity with virus samples isolated from patients from Venezuela in 2001. The two serotypes showed different hematological patterns in the which, with the increase of atypical lymphocytes, there was a significant greater leucopenia in the DENV3 population and a tendency to a greater decrease of platelets in DENV1. Preliminary data from another epidemic were obtained in 2015, from which we tested 100 positive samples to date, with 87% belonging to serotype 1 by means of molecular typing using the gene coding for the C / prM junction. Studies show that dengue is a disease with specific regional characteristics. Therefore, the the implementation of epidemic management activities depend on the characterization of genetic variants of DENV and its relationship with the affected population.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / As calicreinas teciduais humanas (KLKs) compreendem uma familia de quinze serino proteases encontradas em uma diversidade de fluidos e tecidos biologicos. Estas enzimas sao identificadas como possuindo papel em diferentes doencas como Alzheimer, cancer, dermatite atopica, esclerose multipla, Parkinson, psoriase e outras. Existe, portanto, uma crescente demanda por inibidores especificos para cada uma das calicreinas e este e o objetivo do nosso grupo de pesquisa na UFABC. Neste trabalho pretendemos gerar inibidores para as calicreinas teciduais humanas 3, 5 e 7, utilizando bibliotecas baseadas em duas serpinas diferentes: uma expressando a forma Pittsburgh do inibidor de proteinase-¿¿1 (IP-¿¿1 M358R), randomizada nos residuos 352-356 (P7-P3); e outra expressando a serpina bacteriana vioserpina, randomizada nos residuos 343-347 (P3-P2f). A abordagem do phage display foi eficaz para gerar as bibliotecas e o protocolo de bioselecao utilizado adequado para enriquecer diversas variantes reativas. Na selecao da biblioteca do IP-¿¿1 M358R, consensos PSEAL e PSRIL foram observados, para KLK5 e KLK7, respectivamente, e varias das sequencias selecionadas exibiram maiores taxas de inibicao para ambas as calicreinas, quando comparadas a molecula molde (IP-¿¿1 M358R). A variante HDVIL e o consenso PSRIL foram identificados como sendo altamente seletivos para a KLK7, com constantes de segunda ordem 14 e 33 vezes maiores que as para KLK5. Pudemos realizar uma selecao efetiva da biblioteca de vioserpina contra a KLK7, cujas variantes enriquecidos demonstraram uma preferencia geral pelo aminoacido Serina ocupando as posicoes P3, P1f, P2f e P1, seguido por uma Tirosina, tambem preferida em P2. A tecnica de phage display foi, portanto, eficiente como base para um estudo de especificidade, e para o desenvolvimento de melhores e mais especificos inibidores para as Calicreinas Teciduais Humanas, e pode ser utilizada para o desenvolvimento de novas bibliotecas, com outras regioes da RCL randomizadas, ou mesmo baseadas em outras serpinas. / The human tissue kallikreins (KLKs) comprise a family of fifteen serine proteases found in a diversity of biological fluids and tissues. These enzymes are identified as having a role in different diseases such as Alzheimer's, cancer, atopic dermatitis, multiple sclerosis, Parkinson's, psoriasis, and others. Thus there is a growing demand for specific inhibitors for each of these kallikreins, and this is the aim of our group at UFABC. In this work we intended to generate inhibitors for the human tissue kallikreins 3, 5 and 7, using libraries based on two different serpins: one expressing the Pittsburgh form of the human serpin á1-proteinase inhibitor (á1-PI M358R), randomized at residues 352-356 (P7-P3); and another one expressing the bacterial vioserpin, randomized at residues 343-347 (P3-P2¿). The phage display approach was effective to generate the libraries and the biopanning protocol used suitable to enrich numerous reactive variants. On the á1-PI M358R selection, loose consensus of PSEAL and PSRIL were observed, for KLK5 and KLK7, respectively, and several of the selected sequences exhibited higher inhibition rates when compared to the template molecule for both kallikreins. The variant HDVIL and consensus PSRIL were found to be highly selective for the KLK7, with second order constants 14- and 33-fold higher than the ones for KLK5. We could only perform an effective selection with the vioserpin library for the KLK7, whose enriched variants demonstrated a general preference for the amino acid Serine occupying the positions P3, P1¿, P2¿ and P1, followed by a Tyrosine, also preferred on the P2. The phage display approach was therefore effective as basis for a specificity study, and for the development of improved, more specific inhibitors for the Human Tissue Kallikreins, and can be used to develop new libraries, with other randomized RCL regions, or even based on other serpins.

O presente projeto de pesquisa foi desenvolvido no ano de 2015 in loco em 109 nascentes da Sub Bacia de Posses no município de Extrema, MG que está inserida na Bacia Hidrográfica do Rio Jaguari. Entendeu-se que o Biossistema da Nascente é composto por um conjunto de funções biológicas, ecológicas e geológicas que se interagem entre si e se completam com a ação antrópica e o ciclo hidrológico. Objetivou-se neste trabalho apresentar uma ferramenta prática de gestão, que seja objetiva e eficiente para análise da qualidade do Biossistema das Nascentes, baseado no estudo e análise dos indicadores que envolvem a sua dinâmica, valorizando as interações entre as dimensões ecológica, social e antrópica, organizando os aspectos de forma quantitativa e qualitativa com o objetivo de identificar o nível de conservação em que se encontra o Biossistema da Nascente de forma que esta ferramenta de análise denominada Protocolo de Campo venha a ser utilizada por gestores da qualidade das águas das bacias hidrográficas. Para isso foi utilizado o Protocolo de Campo composto por 11 indicadores, também foi feito uma análise exploratória dos parâmetros de qualidade dos Biossistemas das nascentes da Sub Bacia de Posses em Extrema - MG, para isso foram coletadas amostra de águas das nascentes, medição da vazão e análise do número mais provável de coliformes. Os dados obtidos pelo Protocolo de Campo demonstraram que dos 109 Biossistemas de Nascentes analisados, 64 se enquadraram como Perturbado, 41 como Conservados e apenas 4 atingiram a pontuação para se enquadrar como Preservado, sendo que nenhum dos Biossistemas das Nascentes estudados se enquadraram na categoria Degradada, porém notou-se que o entorno das nascentes é ocupado em sua grande maioria por pastagem sendo 92,66%, seguido por Eucalipto com 7,34%, apresentaram fisionomia herbácea 43,12%, fisionomia arbustiva entre 1 a 5 metros 43,12% e 13,76% fisionomia arbustiva acima de 5 metros, contudo mais de 90% dos Biossistemas das Nascentes analisados apresentaram ausência de lixo, ausência de fogo e ausência de assoreamento. / This research was developed in 2015 at 109 water springs of the sub basin from Posses, Extrema, MG, that are inserted at Jaguari\'s River basin. The result is that the water spring\'s biosystem is composed by a group of biological, ecological and geological functions, and they interact with each one and they are completed with antropic action and the hydrological cycle. The objective of this research was to present a practical tool of management, and that must be objective and efficient to analyze the quality of water spring\'s biosystem, based on studies and analysis of the indicators that involves it\'s dynamic, doing the interaction between ecological, social and anthropical dimensions very important, organizing the aspects in a quantitative and qualitative form and the objective must be identify in each level of conservation is the water spring\'s biosystem analized, after that the analyzis tool named by \"Protocolo de Campo\" will be used by water quality managers. To get this, the \"Protocolo de Campo\" was composed by 11 indicators and a research of the quality parameters of the water spring\'s biosystems from Posses in Extrema - MG was made too, for this were collected water samples at the water springs, flow measurement and analysis of the most probable number of coliforms. The data obtained in the field by the \"Protocolo de Campo\" revealed that of the 109 water spring\'s biosystems analized, 64 are in the \"disturbed group\", 41 are in the \"conserved group\" and only 4 are in the \"preserved group\". None of them is in the \"degraded group\", but the research has noticed that the surroundings of the water springs is ocuppied in the most by pasture, being 92,66%, eucalyptus, being 7,34%, they represent 43,12% of herbaceous physiognomy, 43,12% represent shrub physiognomy between 1 and 5 meters and 13,76% represent shrub physiognomy above 5 meters, even more than 90% of the water spring\'s biosystem analized presented absence of rubbish, absence of fire and absence of silting.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2018. / Serpinas sao proteinas inibidoras de serino-proteases, responsaveis pelo controle dos mais diversos processos fisiologicos e que cujo mecanismo de inibicao consite em formar um complexo covalente com a enzima alvo, em um processo de inibicao irreversivel. A alca de centro reativo (RCL) e responsavel por interagir com a protease, mimetizando um substrato, e quando clivada se insere como uma ¿À-fita no interior da serpina, trazendo a protease e causando uma distorcao no seu sitio ativo. Como as serpinas forma ligacoes covalentes com seus alvos durante a inibicao, essas proteinas tem sido utilizadas para o estudo do mecanismo de hidrolise das serino-proteases. No entanto, elas tambem oferecem a possibilidade do desenvolvimento de novas drogas contra enzimas relacionadas com patologias, como pode ser o caso da Vioserpina, uma serpina bacteriana capaz de inibir serino-proteases do tipo tripsina-like como a calicreina tecidual humana 5. Encontrar uma maneira de produzir uma Vioserpina fluorescente pode resultar no desenvolvimento de uma poderosa ferramenta para moniotramento e controle dessa e outras enzimas envolvidas com processos patologicos, como o antigeno prostatico especifico (PSA). Dessa maneira, realizamos mutacoes pontuais no gene da Vioserpina para a incorporacao do aminoacido cumarinico via par ortogonal tRNA/aaRS por supressao do codon ambar de parada. O aminoacido cumarinico e um aminoacido nao-canonico capaz de emitir fluorescencia na comprimento de onda de 450 nm quando excitado a 363 nm, permitindo o facil monitoramento e deteccao de uma proteina. Tres residuo distintos da Vioserpina foram escolhidos para a incorporacao do aminoacido cumarinico: Trp 208, Ile 342 (P4 da RCL) e Val 343 (P3 da RCL). A incorporacao nas posicoes Trp 208 e Ile 342 resultou em proteina fluorescentes, mas truncadas apos a insercao do aminoacido. Foi possivel obter uma Vioserpina completa com o aminoacido cumarinico na posicao Ile 342, embora com rendimento muito baixo. Tal mutante apresentou capacidade de inibicao e especificidade diferentes da Vioserpina wild type, em ensaios de inibicao enzimatica contra Tripsina e Quimotripsina, indicando que o aminoacido cumarinico em P4 parece causar diferentes interacoes no momento de inibicao da serpina. Para averiguar as melhores sequencias resultantes da incorporacao do aminoacido cumarinico, foi gerada uma biblioteca de genes da Vioserpina variando aleatoriamente as posicoes P4, P2, P1 e P1f da RCL, com incosporacao do aminoacido cumarinico na posicao P3 (Val 343). A biblioteca de Vioserpina foi apresentada por Phage Display no capsideo do fago M13 fusionada a proteina PIII, utilizando Biopanning para selecao das melhores sequencias com incorporacao do aminoacido nao-canonico, contra a serino-protease quimotripsina. A biblioteca de fagos gerou cinco sequencias com melhor inibicao que da Vioserpina, e mostrou que a insercao do aminoacido cumarinico parece acontecer com maior frequencia quando flanqueado por aminoacidos hidrofobicos ou sem cargas. A incorporacao do aminoacido cumarinico em sequencias da Vioserpina foi bem sucedida, sendo possivel avaliar a insercao de tal aminoacido na capacidade inibitoria dessa serpina. A investigacao da insercao de aminoacido nao-canonicos por Phage Display e Biopanning representa um grande passo para entender melhor como ocorre a incorporacao de tais aminoacidos, e quais residuos podem ocupar com maior naturalidade suas posicoes laterais. / Serpins are serine protease inhibitor proteins, responsible for the control of the most diverse physiological processes and whose mechanism of inhibition consists in forming a covalent complex with the target enzyme, in an irreversible inhibition process. The reactive center loop (RCL) acts as a bait for the protease, and when cleaved it inserts as a â-strand inside the molecule, distorting the protease active site. As serpins form covalent bonds with their targets, these proteins have been used to study the hydrolysis mechanism of serine proteases. However, they also offer the possibility of developing new drugs against disease-related enzymes, as is the case of Vioserpin, a bacterial serpin capable of inhibiting trypsin-like serine proteases such as human tissue kallikrein. Finding a way of producing fluorescent Vioserpin may result in the development of a powerful tool for monitoring and controlling this and other enzymes involved in pathological processes, such as prostate specific antigen (PSA). Thus, we performed point mutations in the Vioserpin gene for incorporation of the coumarin amino acid through tRNA/aaRS orthogonal pair by suppression of the amber stop codon. The coumarin amino acid is a non-canonical amino acid capable of emitting fluorescence at 450 nm when excited at 363 nm, allowing for easy detection of a protein. Three different residues of Vioserpin were chosen for incorporation of the coumarin amino acid: Trp 208, Ile 342 (P4 in RCL) and Val 343 (P3 in RCL). Incorporation at positions Trp 208 and Ile 342 resulted in fluorescent but truncated proteins following amino acid insertion. A complete Vioserpin bearing the coumarin amino acid at the Ile 342 position was possible, although at very low yield. Such a mutant exhibited different inhibition and specificity compared to Vioserpin wild type in enzymatic inhibition assays against trypsin and chymotrypsin, indicating that the coumarin amino acid at P4 appears to cause different interactions during serpin inhibition. To ascertain the best sequences resulting from coumarin amino acid incorporation, a Vioserpin gene library was generated by randomly varying the P4, P2, P1 and P1' positions in RCL, with coumarin amino acid incorporated at the P3 (Val 343) position. The Vioserpin library was exhibited by Phage Display in the M13 phage capsid fused to the PIII protein, using Biopanning against chymotrypsin to select the best sequences with incorporation of the non-canonical amino acid. The phage library generated five sequences with better inhibition than Vioserpin, and pointed to coumarin amino acid insertion appearing to occur more frequently when flanked by hydrophobic or uncharged amino acids. The incorporation of the coumarin amino acid into Vioserpin sequences was successful, and it is possible to evaluate the insertion of such amino acid in the inhibitory capacity of this serpin. The investigation of non-canonical amino acid insertion by Phage Display and Biopanning represents a great step to better understand how the incorporation of such amino acids occurs, and which residues may more naturally occupy their lateral positions

Orientadora: Profa. Dra. Maria Cristina Carlan da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2018. / A relação entre a presença do Citomegalovírus Humano (HCMV) e diversos tipos de tumores tem sido alvo de investigação por décadas, e em especial, em Glioblastoma Multiforme (GBM). O GBM é o mais maligno tumor do Sistema Nervoso Central (SNC), com baixa sobrevida mesmo após o tratamento. Nosso grupo e outros demonstraram a presença do HCMV neste tipo de tumor restrita a uma pequena quantidade de células, além disso, vários mecanismos de aumento de malignidade tumoral mediados pelo HCMV já foram demonstrados in vitro e in vivo. As principais drogas utilizadas durante o tratamento quimioterápico, Temozolamida (TMZ) e Carmustina (BCNU), levam a adição de adutos no DNA, criando erros durante a replicação celular. Estudos demonstram que o HCMV pode modular vias de reparo de DNA em fibroblastos, entretanto, o possível efeito durante a quimioterapia não é conhecido. Com isto, neste trabalho avaliou-se a infecção viral de linhagens celulares de GBM bem como a resposta das mesmas ao tratamento com TMZ e BCNU. Demonstrou-se que linhagens de GBM U87MG, A172, U251MG e TP365MG são suscetíveis a infecção por HCMV, mas não igualmente permissíveis as linhagens virais laboratoriais (AD169) e clínica (TB40), provavelmente refletindo a infectividade do vírus nos tumores. Observou-se também uma diminuição na viabilidade celular nas linhagens TP365MG e U251MG infectadas com HCMV, de maneira dependente da multiplicidade de infecção (MOI). Na presença concomitante de drogas e vírus também ocorre a diminuição de viabilidade MOI dependente, especificamente em TP365MG tratada com BCNU. Em suma, os resultados indicam que a permissibilidade do HCMV em células de GBM é determinada por fatores celulares/hospedeiro e não por fatores virais. Por fim, o vírus também não aumenta a resistência ao tratamento por TMZ e BCNU em linhagens U251MG e TP365MG, entretanto, devido a heterogeneidade tumoral mais estudos são necessários em outros tipos celulares, especialmente em células tronco tumorais, levando a um melhor entendimento do possível efeito do vírus durante o tratamento quimioterápico / The relationship between the Human Cytomegalovirus (HCMV) and different types of tumors has been investigated for many decades, especially in Glioblastoma Multiforme (GBM). GBM is the most malignant tumor of the Nervous Central System (SNC), with a low overall survival even after treatment. We and others demonstrated the presence of HCMV in this type of tumor, restricted to a small number of cells, and various studies showed that the virus can increase cell malignancy both in vitro and in vivo. The chemotherapeutic agents Temozolomide (TMZ) and Carmustine (BCNU) used in GBM treatment lead to insertion of adducts in the DNA, creating errors during replication. It is well known that HCMV can modulate DNA repair pathways in fibroblasts, however, the possible effect of the virus during chemotherapy is not known. In this work we analyzed viral infection in GBM cell lines and their response to the TMZ and BCNU. We demonstrated that A172, U251MG and TP365MG GBM cell lines are susceptible to HCMV infection, but not equally permissive to both laboratory (AD169) and clinical strains (TB40), likely reflecting infection in the tumor. Additionally, we show a decrease in cell viability in TP365MG and U251MG infected with HCMV, in a MOI dependent manner. In infected and treated with chemotherapeutic drugs cells, there is also a reduction in cell viability MOI dependent in TP365MG treated with BCNU. Overall our results indicate that HCMV permissiveness in GBM cells is determined by host/cellular rather than viral factors and that the virus does not increase cell resistance to chemotherapeutic drugs in U251MG and TP365MG. Due to the tumor heterogeneity, more studies need to be performed in other tumor cells, especially in cancer stem cells, to lead to a better understanding of the possible effect of the virus during chemotherapy.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina Santos de Souza Galvão / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2018. / O hepatorcarcinoma é um dos tipos tumorais mais comuns e está entre as três malignidades que mais causam óbito. Embora grandes avanços terapêuticos tenham sido realizados nos últimos anos, ainda se faz grande a necessidade de desenvolvimento de novas terapias mais efetivas na eliminação desta doença e menos severas quanto aos efeitos adversos resultantes. Diante deste cenário, neste trabalho a metformina foi avaliada quanto à sua capacidade citotóxica, antiproliferativa e antimetastática sobre células de carcinoma hepático humano - HepG2. Desta forma, objetivou-se no presente trabalho avaliar as alterações na viabilidade, proliferação e potencial metastático de HepG2 após o tratamento com metformina, A viabilidade celular foi verificada através do teste de redução do MTT e incorporação do vermelho neutro. A progressão do ciclo celular foi avaliada por citometria de fluxo e a análise de marcadores de morte celular foi realizada por meio de avaliação de expressão/atividade das moléculas sinalizadoras caspase 3, PARP e PARP clivada através de Western blotting. Variações no potencial metastático foram verificadas através de estudo das atividades de adesão, via teste de redução do MTT, migração celular, por Scratch Assay, migração e invasão por ensaios em placas do tipo transwell e determinação da atividade das metaloproteinases MMP2 e MMP9, por Zimografia em gelatina. Os resultados indicam que a metformina atua de forma citotóxica e citostática sobre HepG2 de modo concentração e tempo-dependente, e sugerem também a ocorrência de morte celular envolvendo ativação da caspase 3. Adicionalmente, o tratamento com metformina reduziu as atividades de migração e invasão celular, redução esta provavelmente associada à diminuição nas atividades de MMP2 e MMP9, ao mesmo tempo em que aumentou a atividade de adesão celular. Conclui-se, assim, que a ação antitumoral da metformina está associada com a indução de efeito citotóxico e citostático em HepG2, e que o euglicemiante parece reduzir o potencial metastático dessas células. Estes achados indicam que, futuramente, a metformina poderá embasar uma nova estratégia terapêutica e preventiva contra o hepatocarcinoma humano. / Hepatocellular carcinoma is one of the most common types of tumor and represents the third leading cause of cancer-related death. In despite to the major progresses made in recent years, there is still a great needed for the development of new therapies. More efficient treatments should eliminate the disease while triggers few smoother adverse effects as possible. Metformin is a traditional hypoglycemic prescribed for the treatment of type II diabetes. It has received considerable attention in the past years due to its potential anti-tumor activity. Indeed, previous studies involving this drug showed interesting results not only for the treatment itself, but also in preventing the cancer development. In this project, effects of metformin over human hepatic carcinoma cells (HepG2 lineage) were evaluated, assessing changes on cell proliferation, viability and metastatic potential. HepG2 cells were exposed to different metformin concentrations for 24 and 48 hours, and the cell viability/proliferation was determined by MTT assay. The metastatic potential analysis, adhesive and migratory abilities of HepG2 cells were evaluated by the determination of metalloproteinases (MMP-2 and -9) activities by zymography, cell motility by scratch assay and cell adhesion by MTT, respectively. Analysis of cell death markers was performed by the evaluation of caspase 3, PARP and cleaved-PARP expression by Western blotting. Results suggested that metformin promotes the reduction of cell viability in a concentration and time-dependent manner. HepG2 cells had their viability reduced through the cytotoxic and cystostatic action of metformin. Regulation over caspase 3 activation and cleavage of its substrate, PARP, indicated occurrence of programmed cell death by apoptosis. Metformin increased the adhesion simultaneously to the reduction of HepG2 migration and invasion abilities. Finally, it seems that the drug was able to modulate MMP-2 and -9 activities. Thus, confirming literature data, metformin seems able to decrease the metastatic potential of HepG2 cells. These findings indicate that, in the future, metformin may support a new therapeutic and preventive strategy against human hepatocarcinoma.

O tratamento de efluentes por digestão anaeróbia tem sido amplamente modelado via ADM1 (Anaerobic Digestion Model No. 1) desenvolvido pela IWA (International Water Association). Tal modelo é dinâmico de modo que concentrações das espécies químicas no interior do reator variam com o tempo, sendo matematicamente regidas por equações diferenciais ordinárias ou algébricas conforme a respectiva cinética química. Este trabalho teve como objetivo adaptar o modelo ADM1 para tratamento e posterior aproveitamento de efluentes agroindustriais, com interesse futuro ao tratamento anaeróbio da vinhaça de cana de açúcar. O presente trabalho considerou biorreatores contínuos de mistura perfeita (CSTR - Continuously Stirred Tank Reactor) e a solução numérica das equações governantes foi programada em linguagem Python. O modelo computacional implementado se mostrou aplicável e pode ser utilizado em demais pesquisas que se baseiam no modelo ADM1 de digestão anaeróbia para tratamento de efluentes agroindustriais, considerando possíveis adaptações devido à especificidade de cada tipo de efluente. / The wastewater treatment by anaerobic digestion has been extensively modelled by ADM1 (Anaerobic Digestion Model No. 1) developed by IWA (International Water Association). This model is dynamic so that chemical species concentrations within the reactor vary over time, being mathematically governed by either ordinary differential equations or algebraic equations according to their chemical kinetics. This research aimed at adapting the ADM1 model for treatment and subsequent use of agroindustrial effluents, with future interest in the anaerobic treatment of sugarcane vinasse. The present research considered Continuously Stirred Tank Reactor (CSTR) and the numerical solution of the governing equations was programmed in Python language. The computational model implemented was applicable and can be used in other studies that are based on the ADM1 model of anaerobic digestion for the treatment of agroindustrial effluents, considering possible adaptations due to the specificity of each type of efluente.