Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. / Fenotiazinas (FTZ) sao farmacos psicotropicos utilizados no tratamento de esquizofrenia. Foram relatadas diversas propriedades biologicas interessantes das FTZ, dentre elas, efeitos na prevencao do cancer, atividade pro-apoptotica e reversao da resistencia a multiplas a drogas (MDR) por inibicao da glicoproteina P (Pgp). Neste trabalho, nos avaliamos os efeitos citotoxicos das FTZ sobre celulas leucemicas humanas que expressam ou nao o fenotipo MDR Lucena-1 e K562, respectivamente e os mecanismos de morte celular envolvidos. Nossos resultados demonstraram que as FTZ apresentaram atividade citotoxica nas linhagens K562 e Lucena-1 de maneira concentracao-dependente. Nos observamos que apesar da efetividade das FTZ ser praticamente a mesma nas celulas K562 e Lucena-1 os mecanismos envolvidos no processo de morte celular sao bastante distintos. A morte celular induzida por FTZ em celulas K562 parece ocorrer por apoptose e e disparada por aumento subito de Ca2+ citosolico, geracao de especies reativas de oxigenio (EROs) acompanhada da oxidacao de grupos tiolicos e dissipacao do ¿¢¿µ. Em paralelo foi observado que a morte celular induzida por FTZ em celulas K562 envolve a participacao de permeabilizacao de membrana lisossomal (PML) e da autofagia. Em contrapartida, a morte celular induzida pelas FTZ em celulas Lucena-1 parece ocorrer por necrose e nao ha participacao de calcio. Entretanto a geracao de EROs e a oxidacao de grupos tiolicos parecem ter participacao importante no processo, uma vez que o agente redutor, DTT preveniu completamente a morte celular induzida pelas FTZ em celulas Lucena-1. Nos sugerimos que as FTZ utilizam a necrose como mecanismo alternativo de morte de celulas Lucena-1, uma vez que este modelo celular apresenta alteracoes que bloqueiam a maquinaria apoptotica. Estes dados sugerem um potencial farmacologico destes compostos na quimioterapia antitumoral, como possivel estrategia em caso de resistencia a quimioterapia classica. / Phenothiazines (PTZ) are psychotropic drugs used in schizophrenia treatment. It were reported several interesting biological properties of PTZ,among then, effects in cancer prevention, pro-apoptotic activity and reversal of multidrug-resistant (MDR) by P-glycoprotein inhibition. We evaluate in this study the PTZ effects over the human leukemic viability that express or not the phenotype MDR Lucena-1 and K562, respectively and the cell death mechanisms involved. Our results demonstrated that PTZ showed cytotoxic activity in K562 and Lucena-1 cell lines in a concentrationdependent way. We could observe that besides the PTZ effectiveness being practically the same in the K562 and Lucena-1 the mechanisms involved in the cell death process are very distinct. Cell death induced by PTZ in K562 cells seems to occurs by apoptosis and is triggered by a sudden cytosolic Ca2+increase, ROS generation together with thiol groups oxidation and ÄØ dissipation. In parallel it was noticed that the PTZ-induced cell death in K562 cells involves the participation of lysosomal membrane permeabilization (LMP) and autophagy. In contrast, cell death induced by PTZ in Lucena-1 cells seems to occur by necrosis and there is no calcium participation. Therefore the ROS generation and the thiol groups oxidation seems to have important participation in the process, once that a reduction agent, the DTT completely prevented the cell death induced by PTZ in Lucena-1 cell. We suggest that PTZ used the necrosis as an alternative mechanism for Lucena-1 cell death, once that this cell model shows alterations that block the apoptotic machinery. These data suggest a pharmacological potential of this compounds in antitumor chemotherapy and possible strategy in case of classic chemotherapy resistance.

Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Among the main problem faced during the treatment of cancer patients is resistance to chemotherapy. Among the multiple drug resistance mechanisms (MDR), the best characterized involves the activity of P-glycoprotein (Pgp), the product of the MDR1 gene expression. The reversal of MDR due to Pgp inhibition has been observed by several drugs, including phenothiazines, which has currently been the focus of studies suggesting their use in antitumor therapy. Studies with copolymers of ethylene oxide and propylene oxide, termed poloxamers, demonstrated the ability to inhibit Pgp on MDR cells suggesting their use in antitumor formulations. Thus, this work aims to study cell death induced by phenothiazines inserted in nanostructured systems (liposomes, gold nanoparticles and polymeric micelles) in human myeloblastic leukemia cells K562 and Lucena 1, only the last one overexpressing the MDR1 gene. The results showed that the polymeric micellar systems consisting of poloxamers are more suitable for potentiation of the effect of phenothiazines. The characterization of micellar systems assays indicated that the structures are organized in a lamellar shape and the particle size is about 60 nm at 25°C and 25 nm at 37°C. The in vitro release assays showed that formulations were able to decrease the releasing by 80% when compared to phenothiazines in the free form. Formulations containing PL407/L81 (poloxamer 407 and Pluronic®L81) showed higher capacity to enhance the cytotoxic effect of phenothiazines. The formulation containing trifluoperazine (TFP) inserted in PL407/L81 system caused a significant decrease in the EC50 when compared to the free form only after 48 hours of incubation in K562 lines and Lucena 1. The formulation containing thioridazine (TR) significantly alter the EC50 for 24 hours in the cell line K562 and the both strains after 48 hours of incubation. For formulation containing chlorpromazine (CPZ) was significantly decreased upon incubation for 24 to 48 hours in both cell lines. The death induction profile was similar for all phenothiazines suggesting predominantly apoptosis and late apoptosis. The PL407 / L81 system was able to inhibit the activity of Pgp in resistant strain Lucena 1, this effect was also observed for TR and TFP which had the effect potentiated after insertion in the system containing PL407/L81. However, CPZ has not been capable of inhibiting Pgp in the absence of system PL407/L81 indicating that this system is essential for the enhancement of the cytotoxic effect of CPZ in the line Lucena 1. The tests on non-tumor cell line showed that the mononuclear PL407 / L81 system does not have cytotoxicity, and also is able to decrease the cytotoxic effects of phenothiazines. These data indicate that system containing PL407 and L81 has the greatest potential for application in anti-tumor therapy with the additional benefit of reduced cytotoxic effect on normal cells. / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Um dos principais problemas enfrentados no tratamento de pacientes com câncer é a resistência a quimioterápicos. Entre os mecanismos de resistência a múltiplas drogas (MDR), o melhor caracterizado envolve a atividade da glicoproteína P (Pgp), produto da expressão do gene MDR1. A reversão da MDR por inibição da Pgp foi observada por diversos fármacos, entre eles as fenotiazinas que atualmente tem sido alvo de estudos que sugerem sua utilização na terapia antitumoral. Estudos com co-polímeros constituídos por óxido de etileno e óxido de propileno, denominados poloxamers, demonstraram a capacidade de inibição da Pgp em células MDR sugerindo sua aplicação em formulações contendo antitumorais. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo estudar a morte celular induzida por fenotiazinas inseridas em sistemas nanoestruturados (lipossomas, nanopartículas de ouro e micelas poliméricas) em células leucêmicas mieloblásticas humanas K562 e Lucena 1, sendo que apenas a última apresenta superexpressão do gene MDR1. Os resultados indicaram os sistemas micelares poliméricos constituídos de poloxamers são mais adequados para potencialização do efeito das fenotiazinas. Os ensaios de caracterização dos sistemas micelares indicaram que as estruturas se organizam de forma lamelar e possuem tamanho de partícula de aproximadamente 60 nm, a 25°C, e de 25 nm, a 37°C. Nos ensaios de liberação in vitro, as formulações diminuíram 80% da liberação quando comparadas a liberação das fenotiazinas na forma livre. As formulações contendo PL407/L81 (poloxamer 407 e Pluronic®L81) apresentaram maior capacidade de potencialização do efeito citotóxico das fenotiazinas. A formulação contendo trifluoperazina (TFP) inserida no sistema PL407/L81 promoveu diminuição significativa do EC50 em relação à forma livre apenas após 48 horas de incubação nas linhas K562 e Lucena 1. A formulação contendo tioridazina (TR) alterou significativamente o EC50 em 24 horas na linhagem K562 e em ambas a linhagens após 48 horas de incubação. Para a formulação contendo clorpromazina (CPZ) a diminuição foi significativa na incubação por 24 e 48 horas, em ambas as linhagens. O perfil de indução de morte foi semelhante para todas as fenotiazinas sugerindo, predominantemente, apoptose tardia e apoptose. O sistema PL407/L81 foi capaz de inibir a atividade da Pgp na linhagem resistente Lucena 1, este efeito também foi observado para TR e TFP que tiveram o efeito potencializado após a inserção no sistema contendo PL407/L81. Contudo, CPZ não foi capaz de inibir a Pgp na ausência do sistema PL407/L81 indicando que este sistema é essencial para a potencialização do efeito citotóxico da CPZ na linhagem Lucena 1. A avaliação na linhagem mononuclear normal mostrou que o sistema PL407/L81 não apresenta citotoxidade e, ainda, é capaz de diminuir o efeito citotóxico das fenotiazinas. Estes dados indicam que sistema contendo PL407 14,5% e L81 0,5%, possui maior potencial para aplicação na terapia antitumoral com o benefício adicional de diminuição do efeito citotóxico em células normais.

Orientadora: Profa. Dra. Giselle Cerchiaro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / A proteina Cu,Zn Superoxido Dismutase, uma metalo proteina que atua na dismutacao do ion superoxido em agua e peroxido de hidrogenio, esta presente em todas as celulas do organismo e tambem esta relacionada com doencas neurodegenerativas como Esclerose Lateral Amiotrofica Familia, que acomete neuronios motor. Buscamos contribuir para a elucidacao do papel bioquimico e fisiologico da proteina Cu,Zn-SOD em cultura primaria de celulas da medula espinhal obtidas de neonatos (0-2 dias) de ratos da linhagem Wistar. Para isso, foi avaliado in vitro o papel do estresse oxidativo induzido por 100 ¿ÊM de H2O2 nos tempos de 3 e 6 horas. Os resultados mostraram que celulas de cultura primaria de medula espinhal, quando expostas a estresse oxidativo, levam a ativacao de caspases, portanto encontra-se populacoes em apoptose precoce e tardia, em ambos tempos, comparado ao controle negativo. Tambem foi observado a relocalizacao da proteina SOD1 nas condicoes de estresse oxidativo e controle, estando mais expressa na porcao nuclear e com atividade dismutasica integra. Na porcao citoplasmatica, ha a presenca de Cu,Zn-SOD, no entanto nao mostra atividade. / The protein Cu,Zn-Superoxide Dismutase is a metaloprotein that convert superoxide radicals to molecular oxygen and hydrogen peroxide. This protein is present in all cells of the body and also is related to neurodegenerative diseases as ALS, which affects motor neurons. The objective of this study was contribute to the elucidation of the biochemical and physiological role of the protein Cu,Zn-SOD in primary cultures of spinal cord cells from newborns (0-2 days) of Wistar rats. So we evaluated in vitro the role of oxidative stress induced by 100uM of H2O2 in 3 and 6 hours. The results showed that these cells when exposed to oxidative stress leading to caspase activation in early and late apoptosis in both times, as compared to the negative control. It was also observed relocation of SOD1 protein in conditions of oxidative stress and control, being more expressed in the nuclear portion with integrates activity. However, the cytoplasmic portion of Cu, Zn-SOD was not activated.

Orientadora: Profa. Dra. Daniele Ribeiro de Araujo / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / It is expected the improvement of BUD physicochemical properties through complexation with CD and the incorporation of BUD:HP-â-CD inclusion complex into PL-based hydrogels, contributing to a longer duration of anti-inflammatory effect associated with high bioadhesion in the treatment of ulcerative colitis. In this work, we propose the study of the system BUD:HP-â-CD inclusion complex incorporated into PL407 and PL407-PL403, since the micelles assembling to the thermoreversible hydrogels considering structural and thermodynamics parameters related to inclusion complex formation, micellization and sol-gel transition phase, as well as the interaction between BUD:HP-â-CD complex and PL. Complexation between BUD and HP-â-CD was confirmed by phase solubility studies (1:1 stoichiometry, Kc = 8662.8 M-1), DSC and microscopy analyzes. BUD solubility on upper and lower simulated colon fluids was improved in a dependence of both carriers association (HP-â-CD and PL407 or PL407-PL403). Micellar hydrodynamic diameter determination showed the interaction between HP-â-CD and PL blocks, as well as the reorganization of the micellar system in the presence of BUD. Micellization temperature (Tm) was not shifted, but in the presence of BUD or HP-â-CD, an increase on ÄH° values was observed for all formulations. Sol-gel phase transition studies showed that in the presence of BUD, HP-â-CD or BUD:HP-â-CD complex, the association PL407-PL403 favored the gel formation close to the physiological temperature. 1H-NMR studies revealed the interaction between PL407 and HP-â-CD and FTIR confirmed the effective incorporation of the drug and the inclusion complex in PL system. The in vitro drug release was sustained and the release rate was slowed by the addition of inclusion complex (under 38% of the BUD released after 2 days), suggesting a prolonged anti-inflammatory effect. Drug release of PL407 was best explained by Higuchi and Korsmeyer-Peppas (n < 0.5), indicating the Fickian diffusion mechanism. In the binary system with inclusion complex, drug release follows Hixson-Crowell cube root law, specially in lower colon fluid, indicating the erosion of polymer matrix as a mechanism that influences the BUD release profile. Sol/gel phase transition, solubility, turbidity, FTIR and in vitro release tests revealed no competitive displacement of BUD from the hydrophobic HP-â-CD cavity evoked by PL407 or PL407-PL403 addition. These promising findings point out the BUD-HP-â-CD in 20 % or 18/2 PL-based hydrogels as strategies for future in vivo investigations and also the development of new pharmaceutical formulations looking forward the treatment of ulcerative colitis. / O presente trabalho propoe a otimizacao das propriedades fisico-quimicas do glicocorticosteroide budesonida (BUD) para o tratamento da colite ulcerativa (COL), por meio da complexacao com ciclodextrinas (CD), bem como a incorporacao do complexo de inclusao farmaco:CD em hidrogeis a base de Poloxamer (PL), contribuindo para uma maior duracao do efeito antiinflamatorio associado a permanencia no local de aplicacao. Desta forma, para o complexo de inclusao BUD:HP-¿À-CD, como tambem para os hidrogeis termorreversiveis de PL407 e de PL407/PL403, foram realizados diferentes ensaios de caracterizacao fisico-quimica, abrangendo desde uma analise estrutural e morfologica ate ensaios de liberacao in vitro. A complexacao entre BUD e HP-¿À-CD foi confirmada por meio dos ensaios de solubilidade de fase (estequiometria 1:1), Calorimetria Diferencial Exploratoria (DSC), Microscopia Eleronica de Varredura (MEV), Ressonancia Magnetica Nuclear (RMN) e Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), destacando a elevada afinidades entre a molecula do farmaco e a cavidade hidrofobica da HP- ¿À-CD (Kc = 8.662,8 M-1). A solubilidade da BUD em fluidos simulados do colon superior (FSCS) e inferior (FSCI) foi melhorada de forma dependente a ambos os carreadores (HP-¿À- CD e PL), sugerindo o efeito aditivo dos sistemas polimericos na solubilizacao do farmaco. Na presenca de BUD ou de BUD:HP-¿À-CD, a associacao PL407/PL403 favoreceu a formacao da estrutura gel proximo a temperatura fisiologica, otimizando a viscosidade da formulacao em relacao a forma comercial (enema). A analise termodinamica mostrou ocorrencia de um processo endotermico espontaneo, embora tenha sido observado um aumento nos valores de AH¿ para todas as formulacoes. Estudos de RMN-H1 revelaram a interacao entre PL407 e HP-¿À-CD, nao sendo o mesmo identificado para o PL403. Os resultados de FTIR comprovaram a efetiva incorporacao do farmaco e do complexo de inclusao nos sistemas PL, que sofreram uma desorganizacao na cadeia polimerica e a formacao de um novo arranjo como consequencia da interacao entre os aditivos e o PL. Ensaios de liberacao in vitro atestaram a efetividade dos sistemas polimericos associados ao complexo de inclusao BUD:HP-¿À-CD, diminuindo significativamente o fluxo e prolongando a liberacao, que alcancou menos de 38% de farmaco liberado apos 2 dias de experimentacao, nas formulacoes 18/2% PL407/PL403 e 20% PL407. O perfil cinetico dos sistemas isolados de PL407 foi melhor descrito por Higuchi e Korsmeyer-Peppas, com expoente de liberacao inferior a 0,5, indicando a difusao Fickiana como mecanismo predominante. A incorporacao do complexo de inclusao no sistema binario conferiu ao perfil de liberacao uma aderencia ao modelo de Hixson-Crowell, indicando a erosao da matriz polimerica como mecanismo que influencia a liberacao do farmaco. Esses resultados promissores atestam a efetividade dos sistemas hibridos propostos no presente trabalho, apontando o complexo de inclusao BUD:HP-¿À-CD em hidrogeis de 20% PL e 18/2% PL407/PL403 como estrategia para investigacoes futuras in vivo, visando otimizar o tratamento da COL.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / A família Bunyaviridae agrupa virus de RNA trissegmentados de cadeia negativa e inclui mais de 350 isolados classificados em cinco gêneros, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus. Juntos, esses bunyavirus infectam uma grande variedade de animais e plantas, e determinados vírus têm a capacidade de causar doenças graves em seus respectivos hospedeiros. Depois da febre da Dengue, a doença viral transmitida por artrópodes com maior prevalência no Brasil corresponde à febre do Oropouche (FO), cujo agente etiológico é o arbovírus Oropouche (OROV) da família Bunyarviridae, gênero Orthobunyavírus, grupo sorológico Simbu. Nos últimos anos, OROV tem sido responsável por mais de 500.000 casos humanos em extensas e explosivas epidemias na Região Amazônica e no Planalto Central. Com o intuito de buscar novas ferramentas para o diagnóstico específico e tratamento da febre do Oropouche, este projeto teve por objetivo investigar a forma recombinante da proteína do Nucleocapsídeo (N) por meio de estudos estruturais. A proteína N dos bunyavirus é essencial para o processo de replicação, apresentando mecanismo específico de encapsidação do genoma de RNA. O gene que codifica a proteína N de OROV foi subclonada no vetor de expressão bacteriano pET28a (+), com subseqüente expressão em bactéria E. coli da linhagem BL21 (DE3), em diferentes condições de temperatura. Desenvolveram-se estudos estruturais com a análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS), Dicroísmo circular (CD), e de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS). Os resultados indicaram que o monômero da proteína N de OROV produzida em bactérias apresenta 28kDa com cauda de histidina, e após purificação em condições nativas, apresentou alta massa molecular com tamanho entre 400-660 kDa, sugerindo a formação de multímero associado inespecificamente à molécula de RNA com tamanho menor de 100 bases. / The Bunyaviridae family groups trissegmented RNA virus of negative strand and includes more than 350 isolates classified into five genders, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus and Tospovirus. Together, these bunyavirus infect a variety of animals and plants, and certain viruses have the ability to cause severe disease in their hosts. After Dengue fever, the viral disease transmitted by arthropods with a higher prevalence in Brazil corresponds to Oropouche fever (OF), whose etiologic agent is the Oropouche virus (OROV) of Bunyarviridae family, Orthobunyavirus genus, and serologic group Simbu. In recent years, OROV has been responsible for more than 500,000 human cases in extensive and explosive epidemics in the Amazon region and in the Central Highlands. In order to search for new tools for specific diagnosis and treatment of OF, this project aimed to investigate the recombinant form of the nucleocapsid (N) protein by means of structural studies. The N protein of bunyavirus is essential for the replication process, and present a specific mechanism for encapsidation of the virus RNA genome. The gene encoding the OROV N protein was subcloned into the bacterial expression vector pET28a (+) with subsequent expression in E. coli strain BL21 (DE3) under different temperature conditions. Structural studies have been developed with the dynamic light scattering analysis (DLS), circular dichroism (CD), and X-ray scattering at low angles (SAXS). The results indicated that the monomer OROV N protein with six histidine tag, produced in bacteria, has 28kDa, and after purification under native conditions, showed high molecular mass size between 400-660 kDa, suggesting multimer formation associated nonspecifically to RNA molecules with a length less than 100 bases.

Orientadora: Profa. Dra. Daniele Ribeiro de Araújo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O naproxeno (NPX) é um anti-inflamatório não-esteroidal utilizado no tratamento da artrite reumatóide, osteoartrites e artroses, tanto como terapia única ou em associações farmacoterapêuticas. No entanto, sua administração por via oral está relacionada a efeitos adversos importantes (como toxicidade para o trato gastrintestinal). Nesse contexto, o desenvolvimento de novas formulações para liberação modificada de NPX possibilitaria a redução do número de injeções, aumentando a adesão ao tratamento. A incorporação de nanopartículas constituídas por quitosana-tripolifosfato (QT-TPP) em hidrogéis a base de poloxamers (PL) com diferentes valores de balanço hidrofílicolipofílico, favorece a formação de um sistema duplo de liberação com propriedades termoreversíveis, temperatura de gelificação (transição sol-gel) e razão de liberação do fármaco diferenciadas. Este trabalho visa o desenvolvimento (preparação e caracterização), a avaliação dos perfis de liberação in vitro e da citotoxicidade de novas formulações para liberação controlada de NPX incorporado em nanopartículas QT-TPP dispersas em hidrogéis termorreversíveis, visando a administração por via intra-articular, para o tratamento da artrite. Os diferentes hidrogéis foram preparados a base de poloxamer 407, (18 e 20 %), isolados ou associados ao poloxamer 403 (2 %). Nanopartículas constituídas de QT e TPP foram preparadas, caracterizadas e, posteriormente, dispersas nos hidrogéis termorreversíveis. Para isso, foram realizados estudos da interação fármaco-micelas e fármaconanopartículas (diâmetro hidrodinâmico, índices de polidispersão, eficiência de encapsulação e potencial zeta), para verificar a compatibilidade entre os componentes das formulações, bem como inferir sobre a estabilidade coloidal das mesmas; ii) a determinação da temperatura e da variação de entalpia relacionadas à micelização dos copolímeros isolados e de seus sistemas binários, antes e após a dispersão das nanopartículas, por calorimetria diferencial exploratória; iii) determinação da temperatura de transição sol-gel; iv) avaliação dos perfis de liberação in vitro do fármaco aplicandose diferentes modelos matemáticos. A dispersão das nanopartículas CS/TPP nos hidrogéis alterou as transições de fases e a termoreversibilidade das formulações, especialmente para aquelas com menor concentração de polímero. Por outro lado, a adição de nanopartículas contendo NPX, aos hidrogéis, aumentou as temperaturas relativas à micelização e a variação de entalpia. As análises reológicas mostraram perfis viscoelásticos e os resultados dos ensaios de liberação in vitro de NPX sugerem a contribuição de mecanismos como difusão e relaxamento das cadeias poliméricas. Por fim, com os ensaios de viabilidade celular observou-se a baixa citotoxicidade das formulações, apontando-as como sistemas híbridos promissores para liberação modificada de naproxeno. / Naproxen (NPX) is a non-steroidal anti-inflammatory used in the treatment of rheumatoid arthritis, osteoarthritis and arthrosis, either as sole therapy or pharmacotherapeutic associations. However, the oral administration is related to significant adverse effects (how toxicity to the gastrointestinal tract). Thus, in order to reduce the systemic side effects, intraarticular (IA) injection has been proposed as alternative. In this context, the development of new formulations for modified release NPX brings the possibility to reduce the number of injections, increasing the treatment adherence. The incorporation of nanoparticles of QT-TPP in poloxamers (PL) with different hydrophilic-lipophilic balance values, favors the formation of a dual release system of thermosensitive properties, gelation temperature (Tsol-gel) and due to the different drug release. This work aims the development, evaluation of the release profile in vitro and cytotoxicity of new formulations for controlled release of NPX-QT-TPP nanoparticles dispersed in thermosensitives hydrogels, aiming the injection intraarticular for treatment of arthritis. The different hydrogels were prepared based on poloxamer 407 (18 and 20%), isolated or associated with the poloxamer 403 (2%). Nanoparticles made of QT and TPP were prepared, characterized, and dispersed in the thermosensitives hydrogels. Therefore, studies of drug-micelle interaction and drug-nanoparticles were performed (hydrodynamic diameter, polydispersity, encapsulation efficiency and zeta potential), to verify the compatibility between the components of the formulations, as well as inferences about the colloidal stability of such; ii) determining the temperature and enthalpy change related to micellization of the isolated copolymers and their binary systems before and after dispersion of nanoparticles, by differential scanning calorimetry; iii) determination of the sol-gel transition temperature; iv) evaluation of the release profiles in vitro of the drug by applying different mathematical models. The dispersion of NanoQT/TPP nanoparticles in hydrogels changed phase transitions and thermosensitive formulations, especially those with lower concentrations of polymer. Moreover, the incorporation of NanoQT/TPP containing NPX to the hydrogels increased the micellization temperatures and enthalpy variation. Rheological analyzes showed viscoelastic rprofile and NPX in vitro release assays showed the contribution of mechanisms such as diffusion and relaxation of the polymer chains. Finally, cell viability assays showed low toxicity, indicating the hydrogels as promising hybrid systems for NPX modified release.

Orientadora: Profª Drª Helena Beatriz de Carvalho Ruthner Batista / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / Apesar de ser uma das doenças mais antigas que se tem registro a raiva ainda é um desafio para a Saúde Pública. Esta zoonose acomete o sistema nervoso central (SNC) de todos os mamíferos sendo considerada fatal, porém foram registrados casos de cura no mundo que impulsionaram pesquisas na busca por potenciais mecanismos antivirais que atuem contra o vírus da raiva (RABV). O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antiviral do extrato vegetal hidroetanólico derivado de Dalbergia variabilis contra diferentes linhagens do RABV. Inicialmente, foi determinada a concentração máxima tolerada (CMT) do extrato vegetal em células de neuroblastoma de murino (N2a), sendo 1,56 mg/ml identificada como CMT. A atividade antiviral do extrato vegetal derivado da Dalbergia variabilis foi avaliada pela diferença no título viral infeccioso expresso em doses infectantes em 50% do cultivo celular (DICC50), na presença e na ausência do extrato frente a quatro amostras de RABV (IP4005 - amostra de RABV com linhagem genética característica de morcego hematófago Desmodus rotundus, IP964 - amostra de RABV com linhagem genética característica de morcego insetívoro Eptesicus furinalis, IP4871 - amostra de RABV com linhagem genética característica de cachorro do mato Cerdocyon thous e amostra padrão do vírus da raiva "Pasteur vírus" - PV). Uma vez que houve diferença no título viral infeccioso entre as amostras de RABV analisadas na presença e na ausência do extrato vegetal, foram realizados experimentos subsequentes a fim de compreender melhor a forma de atuação deste extrato vegetal frente ao RABV. Foi possível identificar ação antiviral do extrato vegetal derivado de Dalbergia variabilis frente a amostras de RABV analisadas, através dos resultados obtidos, sendo que a interferência na replicação viral foi mais significativa frente a amostras de RABV com linhagem genética de morcegos. / Despite its status as one of the oldest registered diseases, rabies remains a public health challenge. This zoonosis affects the central nervous system (CNS) of all mammals and is usually considered fatal. However, some cases in which the disease was reportedly cured have been registered worldwide, leading to renewed interest in researching potential antiviral mechanisms against the rabies virus (RABV). The aim of this work was to evaluate the antiviral activity of the hydroethanolic plant extract Dalbergia variabilis against different genetic lineages of RABV. In the first step, the maximum tolerated concentration (MTC) of plant extract in murine neuroblastoma cells (N2a) was determined to be 1.56 mg/ml. The antiviral activity of plant extract Dalbergia variabilis was evaluated to determine the difference presence and absence of the plant extract in four samples of RABV (IP4005- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of haematophagous bat, Desmodus rotundus; IP964- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of insectivorous bat, Eptesicus furinalis; IP4871- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of wild dog, Cerdocyon thous; and a standard sample of RABV, "Pasteur vírus" - PV). Since there was a difference in the infectious viral titer between the RABV samples analysed in the presence of the plant extract, subsequent experiments were carried out to better understand the performance of this plant extract against RABV. The antiviral activity of plant extract Dalbergia variabilis against samples of RABV was analysed, and the interference in viral replication was more significant against samples of RABV with genetic lineage characteristic of bats.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / Myxobacterias sao bacterias Gram-negativas com uma peculiaridade no ciclo de vida em comparacao a outros procariotos. Em resposta a periodos de baixa disponibilidade de nutrientes, inicia-se um processo de morfogenese cooperativa que culmina na formacao de corpos de frutificacao, um agregado de celulas que contem estruturas de resistencia caracteristicas. Subtilisinas sao serino proteases da familia S8A, inicialmente encontrada no Bacillus subtilis e atualmente identificada em uma ampla variedade de organismos procarioticos e eucarioticos. Essas enzimas apresentam um grande mercado de aplicacoes biotecnologicas e industriais. O objetivo deste trabalho foi clonar aqualisina, uma subtilisina extracelular da Myxococcus xanthus, uma especie de myxobacterias que preda outros microrganismos, e submete-la a um sistema de expressao heterologa em celulas E. coli BL2 (DE3). A proteina permaneceu na fase insoluvel apos as lises; portanto, foi necessario otimizar protocolos de solubilizacao e purificacao da aqualisina dos corpos de inclusao da celula, para que fosse possivel a caracterizacao cinetica. A solubilizacao utilizando tampao 0,1M de tris e pH 12 mostrou-se a mais eficiente em solubilizar os corpos de inclusao, o que permitiu obter os valores cineticos Km de 0,6 e 1,3 ¿ÊM, para aqualisina purificada (AQN) e para nao retida pela coluna (FT), respectivamente, que demonstram uma alta afinidade pelo substrato utilizado. No entanto, valores obtidos de kcat, e kcat/Km apontam a presenca de duas populacoes de proteinas, nas quais a populacao inativa esta presente em maior quantidade. Embora o sistema de expressao da aqualisina tenha ocorrido com sucesso, a solubilizacao dos corpos de inclusao sem utilizacao de agentes desnaturantes, e posterior purificacao ainda necessitam ser otimizadas, a fim de aumentar a recuperacao de enzima ativa, possibilitando que sua caracterizacao cinetica seja realizada sem a influencia desta populacao de enzima inativa. / Despite its status as one of the oldest registered diseases, rabies remains a public health challenge. This zoonosis affects the central nervous system (CNS) of all mammals and is usually considered fatal. However, some cases in which the disease was reportedly cured have been registered worldwide, leading to renewed interest in researching potential antiviral mechanisms against the rabies virus (RABV). The aim of this work was to evaluate the antiviral activity of the hydroethanolic plant extract Dalbergia variabilis against different genetic lineages of RABV. In the first step, the maximum tolerated concentration (MTC) of plant extract in murine neuroblastoma cells (N2a) was determined to be 1.56 mg/ml. The antiviral activity of plant extract Dalbergia variabilis was evaluated to determine the difference presence and absence of the plant extract in four samples of RABV (IP4005- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of haematophagous bat, Desmodus rotundus; IP964- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of insectivorous bat, Eptesicus furinalis; IP4871- sample of RABV with the genetic lineage characteristic of wild dog, Cerdocyon thous; and a standard sample of RABV, "Pasteur vírus" - PV). Since there was a difference in the infectious viral titer between the RABV samples analysed in the presence of the plant extract, subsequent experiments were carried out to better understand the performance of this plant extract against RABV. The antiviral activity of plant extract Dalbergia variabilis against samples of RABV was analysed, and the interference in viral replication was more significant against samples of RABV with genetic lineage characteristic of bats.

Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / O melanoma e uma doenca causada pela proliferacao exacerbada dos melanocitos caracterizada por alta capacidade metastatica e alta mortalidade. Apesar de existirem drogas disponiveis para seu tratamento, existe uma busca por tratamentos alternativos, devido a toxicidade e resistencia tumoral. Com os avancos no campo da nanotecnologia, surgiram novas tecnicas e possibilidades para o desenvolvimento de drogas. O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade de nanoparticulas de quitosana doadoras de oxido nitrico (¿PNO) em celulas de melanoma (B16-F10) e melanocitos (Melan-A), e investigar os mecanismos envolvidos neste processo. Os resultados obtidos mostram potentes efeitos citotoxicos das nanoparticulas de quitosana contendo S-nitroso-mercaptossuccinico (S-nitroso-MSA-CS) contra a linhagem tumoral B16-F10 em um modo concentracao dependente (EC50= 6,7 ¡Ó 0,7 £gg/mL), enquanto que as nanoparticulas de acido mercaptossuccinico (MSA-CS) apresentaram um EC50 seis vezes maior (> 40 £gg/mL). Em contraste, as nanoparticulas de S nitroso-MSA-CS nao foram significativamente citotoxicas nos melanocitos nao tumorais (Melan-A) com EC50 quatro vezes maior (32,0 ¡Ó 7,5 £gg/mL). De acordo com os resultados obtidos por citometria de fluxo (dupla marcacao com anexina V-FITC/PI e caspase-3 na forma ativa) pode-se associar a morte celular induzida pelas nanoparticulas de S-nitroso-MSA-CS a um perfil de apoptose tardia (com marcacao positiva para anexina V e PI), ativacao de caspase-3 sem liberacao de LDH. Observou-se tambem um aumento na producao de especies reativas de oxigenio e nitrogenio, aumento da geracao de superoxido mitocondrial e oxidacao de grupamentos tiolicos de proteinas celulares, o que mostra que o estresse oxidativo e um evento importante no processo de morte celular induzido pelas nanoparticulas de S-nitroso-MSA-CS nas celulas B16-F10. Alem disso, observou-se por imunofluorescencia indireta o aumento da nitracao dos residuos de tirosina e nitrosacao de cisteina das proteinas celulares. Nossos resultados apontam para o potencial uso destas nanoparticulas para a terapia antitumoral. / The cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) is a legume of important economic and nutritional representativeness, especially in Brazil. Serine protease inhibitors, such as trypsin, have been described in many species, as well as in other plants. In this specie an inhibitor with activity on human neutrophil elastase (HNE) has not yet been identified. This protease is involved in many pathological processes, such as the onset and progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). We purified and characterized an inhibitor from the protein extract of Vigna unguiculata presenting activity towards HNE. Firstly, we performed the alkaline extraction procedure for proteins followed by three different chromatographic steps using Hitrap Q (ion exchange), Source15RPC (Reversed-Phase) and ACE18 (Reversed Phase) columns. These steps were followed by the inhibitory activity tests using fluorogenic substrates, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (elastase) and Z-Phe-Arg-MCA (trypsin), and quantitation assays of protein concentration. To determinate the size of the molecule, we used MALDI-TOF mass spectrometry and SDS-PAGE. The molecular mass of the inhibitor was 10,99 kDa. The dissociation constant (Ki) toward HNE was 9 pM. HNE inhibitor showed no inhibitory activities toward trypsin and thrombin. However, the inhibitor presented activity toward subtilisin and chymotrypsin. These datas indicate that this molecule is a novel inhibitor to HNE and we named it Vigna unguiculata Elastase Inhibitor (VuEI).

Orientador: Prof. Dr. Daniel Carneiro Carrettiero / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / A estreptozotocina (STZ) e uma toxina derivada da bacteria Streptomyces acromogenes. A administracao cerebral de STZ promove alteracoes metabolicas que mimetizam as encontradas em pacientes com doenca de Alzheimer (DA) esporadica. Por este motivo, a STZ vem, sendo utilizada intracerebroventricularmente na criacao de modelos animais para o estudo de DA. A DA possui duas importantes caracteristicas histopatologicas, o acumulo de peptideo ¿À amiloide, levando a formacao das placas senis, e o aumento da fosforilacao da proteina tau, que culmina com a formacao dos emaranhados neurofibrilares, que possuem papel eminente no processo neurodegenerativo da DA. Alguns fatores estao relacionados com o surgimento dessas caracteristicas no paciente, como por exemplo, a geracao de estresse oxidativo, ativacao de Caspase e morte neuronal. A co chaperona BAG2 e fundamental para degradacao da proteina Tau fosforilada inibindo sua ubiquitinacao e favorecendo sua degradacao pela via proteossomica independente de ubiquitina. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da STZ nos parametros relacionadas a citotoxicidade (MTT, Senescencia, Caspasee potencial mitocondrial), na geracao de estresse oxidativo (Diclorofluorisceina e citometria), dosagem de oxido nitrico (Griess), bem como estudar sua acao nos niveis das proteinas oxido nitrico sintase (nNOS e iNOS), Tau fosforilada e BAG2. Para o estudo, foram utilizadas cultura primaria de celulas do hipocampo. As celulas foram tratadas com STZ (0,05; 0,5 e 5 mM) pelos periodos de 6, 12 e 24 horas. A STZ apresentou citotoxicidade na concentracao de 5 mM por 24 horas, no ensaio de MTT e pelo teste de Senescencia celular nas concentracoes de 0,05 e 5 mM em 12 e 24 horas, promovendo aumento na morte celular e niveis de caspase total ativa em celulas tratadas 0,05; 0,5 e 5 mM por 12 e 24 horas. Apesar disso, nao houve alteracao no potencial mitocondrial em nenhuma das concentracoes e tratamentos com STZ. O tratamento promoveu aumento tanto na quantidade de especies reativas de oxigenio avaliado pela Diclorofluorisceina e estresse oxidativo por citometria de fluxo em celulas submetidas as concentracoes de 0,5 e 5 mM por 12 e 24 horas. Os niveis de Nitrito apresentaram uma diminuicao nas concentracoes de 0,5 e 5 mM em 12 horas de tratamento e um aumento em celulas tratadas com 5 mM por 24 horas. Em relacao aos niveis de nNOS houve uma reducao em seus niveis em celulas tratadas na concentracao de 5 mM por 24 horas. Ja a iNOS nao teve seus niveis alterados em nenhum dos tratamentos. Apos o tratamento com STZ foi observado a diminuicao nas formas fosforiladas de proteina Tau, nas concentracoes de 0,05; 0,5 e 5 mM por 12 e 24 horas. O tratamento com STZ 14 promoveu uma reducao nos niveis de Tau total nas concentracoes de 0,5 e 5 mM em 12 horas e 0,05; 0,5 e 5 mM por 24 horas. A razao entre a proteina Tau fosforilada e total nao apresentou alteracao significativa. A proteina BAG2 apresentou diminuicao em seus niveis em celulas tratadas com 0,5 e 5 mM por 12 horas de STZ e 5 mM por 24 horas. Desse modo, conclui-se que a STZ, em celulas de cultura primaria de hipocampo, mostrou ser uma ferramenta interessante de estresse oxidativo, caracteristica da DA, alem de apresentar morte celular tambem um fator envolvido com a doenca. / Cancer is the leading cause of death worldwide and it is considered a public health problem. Tumor cells exhibit a variety of features that enable tumor growth and dissemination, like resistance to cell death mechanisms. Phenothiazines is a group of drugs that have been used in the treatment of psychiatric disorders for a long time. Literature data demonstrate that these compounds exhibit relevant biological effects including antitumor activity. Publications from our group have evidenced extremely important effects of phenotiazines and analogues on mitochondria related to the increase of calcium cytosolic concentration promoted by this drug. In our earlier work with isolated mitochondria, it was demonstrated that these drugs promote the mitochondrial membrane permeability due to the opening of permeability transition pore complex with consequent dissipation of mitochondrial transmembrane potential, calcium efflux and cytochrome c release. Additionally, in our latest publication, we demonstrated the cytotoxicity of phenothiazines in hepatoma cells, accompanied by cellular morphological alterations, plasma membrane permeability and immediate dissipation of mitochondrial transmembrane potential. Among the studied phenothiazines, the most potent was thioridazine, which was chosen for the present work. The goal of this work was to underlie the molecular mechanisms of thioridazine-­induced cell death in leukemic cells, evaluating the role of BCL-­2 family proteins, as well as changes in signaling pathways associated to cell death, including endoplasmic reticulum (ER) stress. This compound was able to induce apoptosis in a concentration and time-­dependent manner, and also inhibit the cell cycle progression in K562 cells. Furthermore, tioridazine-­induced cell death was accompanied by dissipation of mitochondrial transmembrane potential, alterations in BCL-­2 proteins expression as well as activation of the kinases JNK, ERK1/2 and p38. Our results also demonstrated that thioridazine was able to activate the pro ­apoptotic protein BAX and the release of the mitochondrial protein Omi, resulting in mitochondrial outer membrane permeabilization. In addition, we observed that thioridazine was able to induce a severe ER stress, promoting an increase in the expression of the major sensor proteins in this signaling pathway, leading to cell death. We can conclude that both mitochondrial and ER stress contributes to thioridazine-­induced cell death in K562 cells. Besides the importance of our results to the elucidation of phenothiazines-­induced tumor cells death, it also confirms the promising therapeutic potential of this class of drugs as antitumor agents.