Le présent travail avait pour but principal de déterminer si l'enrichissement de la l'alimentation avec des acides gras oméga-3 (AGPI n-3), présents en quantités importantes dans les huiles de poisson, modifie le profil lipidique du sang et des spermatozoïdes tout en améliorant les performances de production des verrats, la qualité du sperme et ses propriétés de conservation; ces effets dépendraient aussi du statut en biotine, une vitamine impliquée dans l'élongation des acides gras. Un autre aspect de ce travail a été d'établir si un apport important d'acides gras n-3 pendant une longue période pouvait modifier le métabolisme post-prandial de l'insuline. Au cours d'une première expérience, 64 verrats ont reçu pendant 28 semaines une alimentation de base supplémentée avec l'un des 4 traitements suivants: 1) 62 g de gras animal hydrogéné (AF); 2) 60 g d'huile de menhaden (MO); 3) 60 g d'huile de thon (TO); 4) 60 g d'huile de menhaden et 2 ppm de biotine (MO+B). Outre les données quantitatives et qualitatives, des échantillons de sang et de semence ont été récoltés afin d'évaluer la composition en acides gras et en certaines vitamines. Une seconde expérience visait à évaluer, dans des conditions dites « commerciales », les performances de production de 222 verrats recevant pendant six mois l'un des traitements alimentaires suivants : AF, MO ou TO. À l'issue de ces expériences, une évaluation de la qualité de la semence, après conservation à 17°C pendant plusieurs jours et congélation en paillettes de 0,5 ml, a été effectuée, ainsi qu'un test oral de tolérance au glucose. L'ajout d'huiles de poisson à la ration alimentaire des animaux a modifié efficacement la composition en acides gras du plasma sanguin et des spermatozoïdes, ceci indépendamment du type d'huile de poisson utilisée (MO ou TO) ou du statut en biotine. En revanche, cet apport alimentaire en AGPI n-3 n'a donné aucun effet sur la libido, les caractéristiques quantitatives ou qualitatives de l'éjaculat, la résistance des spermatozoïdes à la conservation ou le métabolisme de l'insuline. / The aim of the present work was to determine if a dietary supplementation of fish oils (rich in long chain omega-3 fatty acids, n-3 PUFA) alters the profile of fatty acids in blood plasma and spermatozoa and improves reproductive performances of boar, semen quality and its properties for conservation. Those effects are dependent upon biotin status, this vitamin being a critical factor in the elongation of long-chain fatty acids. Another aspect of this study was to evaluate the influence of n-3 PUFA on post-prandial insulin metabolism. For Experiment 1, 64 boars were fed a basal diet at 2.5 kg/day top dressed with 0.3 kg/day of one of the following treatment mixtures: 1) 62 g of hydrogenated animal fat (AF); 2) 60 g of menhaden oil (MO); 60 g of tuna oil (TO); 4) 60 g of menhaden oil and with 2 ppm of biotin (MO+B). All diets were isoenergetics. For this experiment, semen production and quality were measured. Blood and spermatozoa samples were also collected to measure composition of fatty acid and of some vitamins. In Experiment 2, 222 animals raised in "commercial conditions" were fed one of the 3 treatments (AF, MO or TO) during six months. Furthermore, an evaluation of sperm quality during storage at 17°C and cryopreservation was also performed. The addition of fish oils to boar diet had an effect on the composition of fatty acid in blood plasma and sperm. This effect was affected by the fish oil type (MO or TO) and the biotin status (MO or MO+B). Dietary supplementation with n-3 PUFA did not have any effect on sexual behaviour, quantitative and qualitative characteristics of the boar semen, and sperm capacity to conservation as well as insulin secretion/sensitivity.

Les liquides ioniques connaissent depuis quelques décennies un essor particulier en raison de leurs nombreuses propriétés physico-chimiques intéressantes, telles qu’une faible pression de vapeur saturante, une viscosité limitée, une faible miscibilité avec la plupart des solvants communs, ou encore des propriétés d’agencement supramoléculaire, qui en font des outils puissants dans de nombreux domaines de la chimie. Les sels d’imidazolium représentent la plus grande famille de liquides ioniques à ce jour. Leur modulabilité leur permet d’être dérivés pour de nombreuses applications spécifiques, notamment en synthèse organique, où ils sont utilisés majoritairement comme solvants, et plus récemment comme catalyseurs. Les travaux présentés dans cette thèse se concentrent sur leur utilisation en synthèse organique, à la fois comme solvants et principalement comme catalyseurs chiraux, catalyseurs pour lesquels l’anion du sel est l’espèce catalytique, permettant d’ajouter de la flexibilité et de la mobilité au système. En tirant parti de la tolérance des liquides ioniques envers la majorité des macromolécules naturelles, l’objectif principal des travaux présentés dans cette thèse est le développement d’un nouveau type de catalyseur bio-hybride reposant sur l’encapsulation d’un sel d’imidazolium dans une protéine. Par le biais de la technologie biotine-avidine, l’inclusion supramoléculaire de sels d’imidazolium biotinylés portant des contre-anions catalytiques dans l’avidine a été réalisée et exploitée en catalyse. Dans un premier temps, le développement et l’étude de deux sels de 1-butyl-3-méthylimidazolium possédant des anions chiraux dérivés de la trans-4-hydroxy-L-proline sont rapportés, ainsi que leur comportement dans des réactions énantiosélectives d’aldol et d’addition de Michael. Ces types de composés se sont révélés actifs et performants en milieu liquide ionique. Dans un second temps, la préparation de sels d’imidazolium dont le cation est biotinylé et portant un contre-anion achiral, a été réalisée. Le comportement de l’avidine en milieu liquide ionique et son apport en termes de chiralité sur le système bio-hybride ont été étudiés. Les résultats montrent le rôle crucial des liquides ioniques sur la conformation de la protéine et l’efficacité du catalyseur pour des réactions d’aldol. Dans un dernier temps, l’influence de la structure du cation et de l’anion sur le système a été étudiée. Différents espaceurs ont été introduits successivement dans les squelettes cationiques et anioniques des sels d’imidazolium biotinylés. Dans le cas du cation, les résultats ne révèlent aucune influence majeure sur l’efficacité du catalyseur. La structure de l’anion se montre cependant beaucoup plus importante : la préparation de différents catalyseurs bio-hybrides possédant des anions aux propriétés physico-chimiques différentes a permis d’obtenir de plus amples informations sur le mode de fonctionnement du système bio-hybride et de la coopérativité entre l’avidine et l’anion du sel d’imidazolium.La nature ionique de la liaison cation-anion offrant une liberté de mouvement accrue à l’anion dans la protéine, la tolérance à différents substrats a également été abordée après optimisation du système. / Ionic liquids have gained a growing interest due to many interesting properties, such as low vapor pressure, reasonably low viscosity, poor miscibility with common organic solvents, and also exhibit supramolecular organization in solution, which make them interesting tools for several fields of applications in chemistry. As of today, imidazolium salts make up the largest family of ionic liquids. Their modulability allows them to be used for a wide range of applications, notably in organic chemistry, where they are mainly used as solvents, but also more recently as actual catalysts. The work presented in this thesis focuses on their use as solvents and chiral catalysts, in which the catalytic species is the anion of the imidazolium salts, adding more flexibility and mobility to the whole system. Taking advantage from the tolerance of ionic liquids toward biological macromolecules, the main goal of this work is the design and development of a new type of bio-hybrid catalyst based on the encapsulation of an imidazolium salt inside the cavity of a host protein. Based on the biotin-avidin technology, the supramolecular ligation of biotinylated imidazolium salts inside avidin, bearing catalytic counter-anion, is discussed. As a first step, the development and studies of two 1-butyl-3-methylimidazolium-based salts, bearing trans-4-hydroxy-L-proline-derived anions are reported. Their use for asymmetric catalysis in ionic liquids media is disclosed, both for the aldol and Michael additions. Results show that these compounds are viable and efficient organocatalysts in ionic liquids. Subsequently, the preparation of biotinylated imidazolium salts, bearing a racemic pyrrolidine-based counter-anion is reported. Avidin behaviour in ionic liquid media, as well as its contribution for the stereocontrol for the whole bio-hybrid system, is assessed. Results highlight the critical role of the ionic liquid reaction medium on the protein’s conformation, and thus the efficiency of the bio-hybrid catalyst towards aldol reactions. Finally, the influence of the structure of the cation and anion on the catalytic properties of the biohybrid system were investigated. Several spacers were inserted successively both in the cation and anion structures of the biotinylated imidazolium salts. Regarding the cation modifications, results show no major influence on the bio-hybrid catalyst behaviour. However, modifying the anion structure revealed the much more important role of the anion towards catalysis. Preparation of different anions, each bearing a different spacer, granting them different physico-chemical properties, gives rise to further information regarding the behaviour of the bio-hybrid catalyst, and possible cooperativity between avidin and the imidazolium salt. The ionic character of the interaction between the anion and the cation, allowing a greater freedom of movement of the anion inside the avidin’s cavity, and the tolerance of the bio-hybrid system to different substrates were studied.

Une importante avancée dans la compréhension des mécanismes gouvernant le processus de transport des ions iodures à l’intérieur des cellules thyroïdiennes a été le clonage en 1996 de la protéine responsable de ce transport : le symporteur Na/I (ou NIS). De nombreuses recherches ont été conduites depuis afin de caractériser cette protéine ainsi que les mécanismes qui régulent son expression et son activité. Les mécanismes cellulaires de régulation du transport et les protéines impliquées dans la régulation post-traductionnelle du symporteur restent toutefois largement inconnus. La compréhension de l’ensemble de ces mécanismes permettrait pourtant d’améliorer le traitement d’un grand nombre de patients. Le transport d’iode est en effet non seulement impliqué dans différentes pathologies de la thyroïde, mais aussi dans les contaminations à l’iode radioactif consécutives aux accidents nucléaires et dans de prometteuses stratégies de thérapie génique anticancéreuses. La chémogénomique, aussi appelée génétique chimique, est une approche multidisciplinaire dont le but est d’explorer les systèmes vivants au moyen de petites molécules organiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes qui gouvernent le transport d’iode, notre laboratoire a mis en place une stratégie de génétique chimique qui a permis dans un premier temps de découvrir 10 molécules capables d’inhiber le transport d’iode. L’objectif de cette thèse était d’identifier les cibles protéiques de deux de ces molécules : ITB5 et ITB2. Des études d’électrophysiologie et de flux isotopique ayant montré que ces deux molécules ont un mode d’action différent, leur étude devait permettre d’identifier au moins deux protéines impliquées dans le transport des ions iodures.Afin d’identifier les protéines cibles d’ITB5 et d’ITB2, des sondes ont été synthétisées. Ces sondes sont constituées du composé d’intérêt, d’un groupement photoactivable permettant de créer, sous irradiation lumineuse, une liaison covalente avec la ou les protéine(s) cible(s) et d’une molécule de Biotine ou de Desthiobiotine afin d’extraire les protéines marquées des lysats cellulaires. Une fois marquées et capturées sur des billes d’agarose Streptavidine, les protéines d’intérêt ont été séparées sur des gels SDS-PAGE colorés au nitrate d’argent ou au bleu de Coomassie. Les bandes correspondantes ont été excisées, digérées à la trypsine et les peptides obtenus analysés par spectrométrie de masse. L’interrogation de la base de données Swissprot avec les données issues des expériences menées avec la sonde ITB5-P2 a permis d’identifier 3 protéines interagissant visiblement avec ce composé. Les expériences basées sur le composé ITB2 ont du être suspendues par manque de temps mais des résultats encourageants ont déjà été obtenus. Une bande pouvant correspondre à une protéine marquée spécifiquement par la sonde ITB2-P1 a en effet pu être observée en Western-blot suite à une première expérience de capture sur billes. Elle n’a toutefois pas pu être visualisée sur gel du fait d’une présence trop importante de protéines captées non spécifiquement par les billes. Les conditions expérimentales de capture ayant été optimisées avec le composé ITB5, leur application au composé ITB2 devrait maintenant permettre d’obtenir des gels plus propres à partir desquels la bande d’intérêt pourra être excisée pour être, elle aussi, analysée par spectrométrie de masse. / An important breakthrough in the understanding of the mechanisms governing the process of iodide transport inside thyroid cells has been the cloning in 1996 of the protein responsible for this transport : the Na/I symporter (NIS). Different studies have been conducted ever since in order characterize this protein as well as the mechanisms which regulate its expression and its activity. Nevertheless, the cellular mechanisms of transport regulation and the proteins implied in the posttranslational regulation of the symporter remain largely unknown. The full understanding of these mechanisms would allow the treatment improvement of a lot of patients. Iodide transport is indeed involved not only in different thyroid pathologies, but also in radioactive iodide contaminations following nuclear accidents and in promising anticancer strategies by gene transfer. Chemogenomics, also called chemical genetics, is a multidisciplinary approach which goal is to explore the living systems thanks to small organic molecules. To better understand the mechanisms which govern iodide transport, our laboratory has set up a direct chemical genetic strategy which allowed us first to discover 10 molecules able to inhibit iodide transport. The objective of this thesis was to identify the protein targets of two molecules : ITB5 and ITB2. Electrophysiological and isotopic flux studies showed that these two molecules have a different mechanism of action. Their study should then allow the identification of at least two proteins involved in iodide transport.To identify the protein targets of ITB5 and ITB2, different probes were synthesized. These probes are made from the compound of interest, a photoactivable group allowing the creation, under light irradiation, of a covalent bound with the protein target(s) and a Biotin or Desthiobiotine molecule to extract the labeled proteins from cellular lysates. Once labeled and captured on agarose-Streptavidin beads, the proteins of interest were separated on SDS-PAGE gels stained either with silver nitrate or Coomassie blue. The corresponding bands were excised, digested by trypsin and the obtained peptides analyzed by mass spectrometry. A query made in the data bank Swissprot with the data obtained after the experiments conducted with the probe ITB5-P2 allowed us to identify 3 proteins apparently interacting with the compound ITB5. The experiments based on ITB2 had to be suspended because of a lack of time but encouraging results have been obtained. A band which may correspond to a protein specifically labeled by the probe ITB2-P1 has indeed been observed on a Western-blot after a first on-bead capture experiment. However, we couldn’t visualize it on a gel because of the important presence of proteins captured non specifically by the beads. The capture experimental conditions were optimized with the compound ITB5. These conditions will now be applied to the compound ITB2 and this should allow us to obtain cleaner gels on which the band of interest will be excised for an analyze by mass spectrometry.

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Les protéines Binder of Sperm (BSP) appartiennent à une superfamille de protéines exprimées dans le système reproducteur masculin, plus particulièrement dans les vésicules séminales chez les ongulés, et dans l’épididyme chez l’humain et la souris. Jusqu'à présent, des rôles variés chez différentes espèces ont été démontrés pour les protéines BSP, tels que dans la motilité et la capacitation chez le bovin. Cependant, leur rôle demeure élusif chez d’autres mammifères comme la souris et l’humain. Des études in vivo récentes ont démontré que la délétion des gènes Bsph1 et Bsph2 chez la souris n’a aucune conséquence sur la fertilité, et n’induit aucune anomalie au niveau de l'appareil reproducteur masculin. Afin d'élucider le rôle spécifique de la protéine BSP chez l'humain (BSPH1), nous avons d’abord développé une méthode de purification efficace permettant d’obtenir la protéine BSPH1 fonctionnelle car ces protéines ne sont présentes qu'en quantité infime dans l’épididyme humain. Suite, a la purification de BSPH1, j’ai réalisé des expériences in vitro et cherché à identifier son réseau d'interaction protéique. Il a été démontré que les protéines BSP interagissent avec des groupes pseudo-choline tels que le diéthylaminométhyle par affinité plutôt que par des interactions ioniques. Le diéthylaminoéthyle est chargé positivement et par conséquence, est un échangeur d'anions faible, mais les BSP interagissent avec affinité à la résine. Cette étude présente également une nouvelle méthode de purification rapide et peu coûteuse, qui fournit des protéines BSP recombinantes de grande pureté qui peuvent être utilisées pour étudier leurs rôles dans la fécondation chez les mammifères. Nous avons montré que la pré-incubation des ovocytes avec la protéine BSPH1 recombinante peut diminuer le taux de fécondation de manière dose-dépendante. Les spermatozoïdes ont également été pré-incubés avec un anticorps anti-BSPH1 et ont montré une diminution du taux de fécondation. Pour identifier le réseau d’interaction protéique de BSPH1, j'ai utilisé la méthode « Proximity-dependent biotin identification » (BioID) couplée à la spectrométrie de masse. Les résultats de la spectrométrie de masse ont démontré une interaction entre BSPH1 et toutes les sous-unités du complexe CCT / TRIC (Chaperonin containing tailless complex polypeptide 1 (CCT) ou tailless complex polypeptide 1 ring complex (TRiC)). Ce complexe interagit avec un autre complexe appelé BBSome (Bardet–Bied syndrome complex), qui joue un rôle important dans le transport de protéines à travers les cils primaires. BSPH1 a également interagi avec un grand nombre de protéines de la famille CEP (centrosome-associated proteins), importantes dans la formation des cils primaires par les microtubules et de la maturation du centrosome, qui soutiennent le rôle de BSPH1 dans les cils primaires. Dans l’ensemble, cette étude démontre que BSPH1 pourrait avoir un nouveau rôle en tant que chaperonne, à travers les cils primaires dans les cellules qui l’expriment dans l’appareil reproducteur masculin. / Binder of SPerm (BSP) proteins belong to a superfamily of proteins expressed in the male reproductive tract, particularly in seminal vesicles of ungulates (e.g., bovine, ram) and in the epididymis of humans and mice. So far, BSP proteins have been shown to play different roles in different species such as in motility and capacitation in bovine; however, their role remains unclear in other mammals. For instance, depletion of Bsph1/Bsph2 in mice had no effect on fertility. In order to elucidate the specific role of BSP protein in humans (BSPH1), I sought to investigate a purification method to produce functional human BSP protein, as these proteins are only present in minute amounts in the human epididymis. Following purification of BSPH1, I carried out in vitro experiments and sought to identify its protein interaction network. BSP proteins have been shown to interact with pseudo-choline groups such as diethylaminomethyl through affinity rather than ionic interactions. Diethylaminoethyl is positively charged and therefore is a weak anion exchanger, but BSPs interact through affinity to this resin. This study presents a new, rapid and cost-effective purification method that provides recombinant BSP proteins of a high purity level, which can be used to study their roles in mammalian fertilization. We showed that pre-incubation of oocytes with recombinant BSPH1 can decrease fertilization rate in a dose-dependant manner. Sperm were also preincubated with anti-BSPH1 antibody and showed a decrease in fertilization rate. Secondly, I used BioID (proximity-dependent biotin identification), coupled with mass spectrometry to identify the protein-protein interaction network of BSPH1 by proximity labeling. Mass spectrometry results showed an interaction between BSPH1 and all subunits of the CCT/TRIC complex (Chaperonin containing tailless complex polypeptide 1 (CCT) or tailless complex polypeptide 1 ring complex (TRiC). This complex interacts with another complex called BBSome (Bardet–Biedl syndrome complex), which plays a role in protein trafficking through primary cilium. I also identified BBS proteins, as well as other proteins, that interact with the BBSome complex and regulate protein trafficking in the cilia. BSPH1 also interacted with a large number of CEP (centrosome-associated proteins) family proteins, important in the formation of primary cilium through microtubules and centrosome maturation, which further support the potential implication of BSPH1 with the primary cilia. Overall, this study demonstrates that BSPH1 may have a new role as a chaperone involved in protein trafficking through the primary cilia in cells that express it in the male reproductive system

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Caractériser la fonction des protéines est crucial pour notre compréhension des mécanismes moléculaires de la vie, des maladies, et aussi pour inspirer de nouvelles applications en bionanotechnologie. Pour y arriver, il est nécessaire de caractériser la structure et la dynamique de chaque état occupé par la protéine durant sa fonction. La caractérisation expérimentale des états transitoires des protéines représente encore un défi majeur parce que les techniques à haute résolution structurelle, telles que la spectroscopie RMN et la cristallographie aux rayons X, peuvent difficilement être appliquées à l’étude des états de courte durée. De plus, les techniques à haute résolution temporelle, telles que la spectroscopie de fluorescence, nécessitent généralement une chimie complexe pour introduire des fluorophores à des endroits spécifiques dans la protéine. Dans cette thèse nous introduisons l’utilisation des nanoantennes fluorescentes en tant que nouvelle stratégie pour détecter et signaler les changements de conformation des protéines via des interactions non covalentes entre des fluorophores spécifiques et la surface de la protéine. En utilisant des expériences et des simulations moléculaires, nous démontrons que des fluorophores chimiquement divers peuvent se lier et être utilisés pour sonder différentes régions d’une enzyme modèle, la phosphatase alcaline (PA). Ces nanoantennes peuvent être fixées directement aux protéines ou utilisées à l'aide du système de fixation simple et modulaire, le complexe biotine-streptavidine (SA), qui permet un criblage rapide et efficace de la nanoantenne optimale tant dans sa composition que sa longueur. Dans le cas de la PA, nous montrons que nos nanoantennes permettent la détection et la caractérisation des conformations distinctes incluant les changements conformationnels nanoscopiques produisant durant la catalyse du substrat. Nous démontrons également que les signaux fluorescents émis par la nanoantenne peuvent également permettre de caractériser la cinétique enzymatique d’une protéine en une seule expérience tout en incluant la détermination des paramètres « Michaelis-Menten » de ses substrats et inhibiteurs. Nous avons également exploré l'universalité de la stratégie ces nanoantennes fluorescentes en utilisant une autre protéine modèle, la Protéine G et son interaction avec les anticorps, et avons démontré son utilité pour mettre au point un essai permettant de détecter les anticorps. Ces nanoantennes simples et faciles à utiliser peuvent être appliquées pour détecter et analyser les changements conformationnels de toutes tailles et nos résultats suggèrent qu'elles pourraient être utilisées pour caractériser n’importe quel type de fonction. / The characterisation of protein function is crucial to understanding the molecular mechanisms of life and disease, and inspires new applications in bionanotechnology. To do so, it is necessary to characterise the structure and dynamics of each state that proteins adopt during their function. Experimental study of protein transient states, however, remains a major challenge because high-structural-resolution techniques, including NMR spectroscopy and X-ray crystallography, can often not be directly applied to study short-lived protein states. On the other hand, high-temporal-resolution techniques, such as fluorescence spectroscopy, typically require complicated site-specific labelling chemistry. This thesis introduces the use of fluorescent nanoantennas as a new strategy for sensing and reporting on protein conformational changes through noncovalent dye-protein interactions driven by a high local concentration. Using experiments and molecular simulations, we first demonstrate that chemically diverse dyes can bind and be used to probe different regions of a model enzyme, intestinal alkaline phosphatase (AP). These nanoantennas can be attached directly to proteins or employed using the simple and modular biotin-streptavidin (SA) attachment system, which enables rapid and efficient screening for high sensitivity by tuning their length and composition. We show that these nanoantennas enable the detection and characterisation of distinct conformational changes of AP, including nanoscale conformational changes that occur during substrate catalysis. We also show that the fluorescent signal emitted by the nanoantenna enables complete characterisation of enzyme kinetics in one experiment, including determination of Michaelis-Menten parameters of substrates and inhibitors of AP. We then explored the universality of the nanoantenna strategy by using a different model protein system. Protein G was shown to interact with antibodies, using a rapid screening strategy for antibody detection. These effective and easy-to-use nanoantennas could potentially be employed to monitor various conformational changes, and our results offer potential for characterising various protein functions.