HSP25 ist ein Vertreter der ubiquitär verbreiteten kleinen Hitzeschockproteine, einer Familie innerhalb der großen Klasse der Streßproteine. Es ist an der Vermittlung von zellulärer Streßtoleranz beteiligt, besitzt Chaperoneigenschaften, hemmt die Actinpolymerisation in vitro und ist in der Lage, supramolekulare Komplexe auszubilden. Die hier vorgelegte Arbeit befaßte sich mit der Isolierung, der strukturellen und funktionellen Charakterisierung des Proteins und seinem Vorkommen in verschiedenen Geweben von Ratten mit pathologisch erhöhtem Blutdruck: · Es wurde eine Methode zur schonenden Isolierung von HSP25 aus Ehrlich-Ascites-Tumor (EAT) etabliert. Daraus konnte niedrig- und hochmolekulares Material gewonnen werden. · Unter Anwendung elektronenmikroskopischer und hydrodynamischer Methoden konnte für die hochmolekularen Komplexe des nativen HSP25 ein Strukturmodell abgeleitet wer-den. Es ist durch eine zylinderförmige Struktur aus vier gestapelten Ringen mit je acht HSP25-Monomeren charakterisiert. · Hochmolekulare Komplexe des rekombinanten HSP25 liegen demgegenüber als kom-pakte globuläre Strukturen vor. Elektronenmikroskopische Analysen verschiedener Mutanten und von phosphoryliertem HSP25 zeigen, daß die HSP25-Komplexe mit zu-nehmender Phosphorylierung kleiner werden. Dies belegt einen Zusammenhang zwischen dem Phosphorylierungszustand des Proteins und seiner supramolekularen Organisation. · Mittels Elektronenmikroskopie und Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß nur natives HSP25 aus EAT, aber nicht rekombinantes HSP25 oder HSP25-Mutanten die Actinpolymerisation hemmen. Dies bestätigt den Befund, daß nur unphosphorylierte nati-ve HSP25-Monomere für die Inhibierung der Actinpolymerisation verantwortlich sind. · Es konnten zwei HSP25-Peptide identifiziert werden, die eine Hemmung der Actinpoly-merisation auslösen. Damit konnte erstmals experimentell nachgewiesen werden, daß be-stimmte Sequenzabschnitte von HSP25 eine spezifische Wechselwirkung mit Actin ein-gehen. Mit Hilfe phosphorylierter HSP25-Peptide konnte die Abhängigkeit dieser Reaktion vom Phosphorylierungszustand bestätigt werden. · Vorläufige Ergebnisse mit Zellulose-gebundenen Peptid-Bibliotheken deuten auf eine Wechselwirkung von HSP25 mit einem exponierten Loop in Actin-Domäne IV hin, einem Bereich, der an Actin-Actin-Wechselwirkungen beteiligt ist. · HSP25 hat aufgrund seiner verstärkten Synthese bei vielen pathologischen Prozessen eine medizinische Relevanz. Untersuchungen an verschiedenen Tiermodellen zeigen, daß es bei Hypertonie-belasteten Herzen verstärkt im rechten Ventrikel akkumuliert wird. · Es wird ein Modell vorgestellt, in dem die Struktur-Funktions-Beziehungen für HSP25 zusammengefaßt sind. / HSP25 is a member of the ubiquitous family of small heat shock proteins belonging to the big class of stress proteins. It is related to acquiring of cellular thermotolerance, can act as molecular chaperone, is able to inhibit polymerization of actin in vitro and can form high molecular weight complexes. In this thesis the isolation, structural and functional characteri-zation of this protein as well as its abundance in different tissues of rats suffering on patho-logical forms of hypertension is analyzed: · A method for rapid isolation of HSP25 out of Ehrlich-ascites-tumor (EAT) was estab-lished. From isolated HSP25 low and high molecular weight material could be obtained. · Analysis of high molecular weight complexes by means of electron microscopy and ana-lytical ultracentrifugation results in a structural model characterized by a cylindrical structure composed of four stacked rings each containing eight HSP25 monomers. · High-molecular weight complexes of recombinant HSP25 are organized as compact globular structures. Electron microscopic investigations of different mutants and of in vi-tro phosphorylated HSP25 show a connection between phosphorylational status and su-pramolecular organization of the protein: the higher the degree of phosphorylation the smaller are the HSP35-complexes. · By means of electron microscopy and fluorescence spectroscopy it could be shown that only native HSP25 from EAT but not recombinant HSP25 nor HSP25 mutants inhibit polymerization of actin. This is in agreement with recent results showing that only un-phosphorylated native HSP25 monomers are active inhibitors of actin polymerization. · Two HSP25 derived peptides could be identified as competent inhibitors of actin polym-erization. This is the first experimental evidence for a specific interaction of HSP25 se-quences with actin. This interaction is dependent on the phosphorylational status as con-firmed by phosphorylated HSP25 peptides. · Preliminary results with cellulose bound peptide libraries indicate an interaction of HSP25 with an exposed loop in actin domain IV, an area involved in actin-actin interactions. · HSP25 is of medical relevance because of its increased synthesis in a bright variety of pathological processes. Investigations on different animal models of hypertension show an enhanced accumulation of HSP25 in the right ventricle. · A model is presented summing up the structure-function relationships of HSP25.

Diese Arbeit befasst sich mit der Kinetik der Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen. Anhand dreier Beispiele, der Phosphoglyceratkinase (PGK) aus Hefe, einer Variante von Barstar und des Prion-Proteins des Syrischen Hamsters (SHaPrP(90-232)) wurde insbesondere die Kinetik der Bildung von Amyloidfibrillen und deren kinetischer Vorläuferstrukturen mittels dynamischer und statischer Lichtstreuung, Circulardichroismus, Infrarotspektroskopie, Elektronenmikroskopie und teilweise analytischer Chromatographie untersucht. Die Kinetiken wurden mit Konzepten der Aggregationstheorie von Kolloiden und der chemischen Kinetik beschrieben. Die Modellierung der Kinetiken weist ausgehend von der monomeren PGK bei pH 2 und 190 mM NaCl auf eine zweistufige Reaktionskaskade, bestehend aus irreversiblen, bimolekularen Elementarschritten hin. Während der ersten Stufe wird ein engverteiltes Ensemble von Oligomeren mit einer mittleren Masse von 10 Monomeren und wesentlichen Anteilen an beta-Faltblattstrukturen gebildet. Die Protofibrillen entstehen durch die Vereinigung der strukturell polaren Oligomere, die durch die erste Reaktionsstufe bereitgestellt werden und als kritische Oligomere bezeichnet werden. Die gefundene Kopplung des Wachstums der intermediären Zustände und die Zunahme der beta-Faltblattstruktur kann innerhalb eines verallgemeinerten Diffusions-Kollisions-Modells interpretiert werden, bei dem die beta-Stränge durch intermolekulare Wechselwirkungen stabilisiert werden. Die Fehlfaltung und Aggregation des SHaPrP(90-232) bei pH 4.2 und 1 M GuHCl und geeigneten Zusätzen an Salz zeigt einen augenscheinlichen Zweizustandsübergang mit hoher Reaktionsordnung ( >2.5) zwischen dem monomeren, alpha-helikalen Ausgangszustand und einem beta-faltblattreichen, ringförmigen Oktamer. Die Progresskurven der Umwandlung der Sekundärstruktur lassen sich mit dem Zeitverlauf einer bimolekularen Reaktion anpassen. Das Oktamer bildet bei hohen eingesetzten Proteinkonzentrationen Multimere. Auf sehr langen Zeitskalen setzt die Bildung von Protofibrillen ein. Das kritische Oktamer stellt die Vorstufe der nachgeschalteten Wachstumsphänomene dar. Unter geeigneten Umgebungsbedingungen kann der nicht-nativ, partiell gefaltete Zustand von Barstar bei niedrigem pH (A-Zustand) in einem zweistufigen Prozess erst in Protofibrillen und anschlie"send in reife Amyloidfibrillen konvertiert werden. Zur Aktivierung der Konversion des oligomeren A-Zustandes (mittlere Masse von 16 Monomeren) sind moderate Ionenstärken ([NaCl]>0) und erhöhte Temperaturen (T>50°C) notwendig. Die Bildung der Protofibrillen ist unabhängig von der eingesetzten Proteinkonzentration. Bei Raumtemperatur und entsprechender Ionenstärke bilden sich amorphe Aggregate. Dagegen führt die Erhöhung der Temperatur in Abwesenheit von Salz zur Dissoziation des oligomeren A-Zustandes. Alle drei Proteine müssen zur Ausbildung protofibrillärer Strukturen und gegebenenfalls reifer Fibrillen oligomere Zustände mit partiell gefalteter Konformation einnehmen. Diese kritischen Oligomere sind langlebige Intermediate, die den Dreh- und Angelpunkt für die Bildung nachgeordneter Strukturen darstellen. Die Bildung von Amyloidfibrillen ist somit ein mehrstufiger hierarchischer Strukturbildungsprozess. Die in der Literatur bekannten Modelle der nukleierten Polymerisierung und der nukleierten Konformationskonversion werden dem höchstens in gewissen Teilaspekten gerecht. Die Annahme einer universellen Kinetik der Amyloidbildung kann im Lichte der Ergebnisse dieser Arbeit nicht aufrechterhalten werden. Dagegen scheinen die Zustände des kritischen Oligomers und der Protofibrille als Hierarchiestufen der Amyloidbildung generische Bestandteile des Prozesses zu sein. Die Kinetik der Bildung der verschiedenen Hierarchiestufen weist keine nennenswerten Gemeinsamkeiten zwischen den drei untersuchten Proteinen auf. / This thesis deals with the kinetics of misfolding and aggregation of proteins. The kinetics of amyloid formation and precursors of three proteins, phosphoglcerate kinase (PGK), a barstar variante and the Syrian hamster Prion protein (SHaPrP(90-232)) were investigated by the use of dynamic and static light scattering, infrared spectroscopy, circular dichroism, electron microscopy and in part by analytical chromatography. The kinetics were described with concepts from the theory of colloidal aggregation and chemical kinetics. The modelling of the kinetics starting from the monomeric PGK at pH 2 and 190 mM NaCl points to a two stage reaction cascade built up by irreversible, bimolecuar elementary reaction steps. During the first stage a narrow distributed ensemble of oligomeric states with an average mass of ten monomers and essentially ordered amounts of beta-sheet structure is built up. Protofibrils are formed by coalescence of the structural polar oligomers provided by the first stage which are termed critical oligomers. The found coupling between growth and acquisition of beta-sheet structure is interpreted in terms of a generalized diffusion-collision model, where stabilization takes place by intermolecular interactions. The misfolding and aggregation of SHaPrP(90-232) shows an apparent two-state transition between the initial monomeric, alpha-helical state and an beta-sheet rich, annular octamer with high reaction order (>2.5) at pH 4.2 and 1 M GuHCl with appropriate amounts of salt added. Progress curves monitoring the secondary structure transition can be fitted by the time-course of bimolecular reactions. The octamer forms multimers at high protein concentrations. Formation of protofibrils sets up on very long time-scales. The critical octamer is a precursor for all subsequent growth processes. The non-native, partially folded state of barstar at low pH (A-state) can be converted in a two-stage process first to protofibrils and then to mature amyloid fibrils under appropriate environmental conditions. Conversion of the oligomeric A-state (average mass of 16 monomers) can be activated by elevated temperatures (T>50°C) in the presence of moderate amounts of salt ([NaCl]>0). Formation of protofibrils is independent of protein concentration. Amorphous aggregates are formed at room temperature with sufficient amounts of salt added. In contrast elevated temperatures in absence of salt lead to dissociation of the oligomeric A-state. All three proteins have to populate an oligomeric, partially folded state to form protofibrils and eventually mature fibrils. These critical oligomers are long-lived intermediates which are the pivotal point from which all other structures arise. Formation of amyloid fibrils is a hierarchical assembly process where structures are built up by several stages. Models known from the literature, in particular nucleation polymerization and nucleated conformational conversion, only master partial aspects of amyloid formation. The wide-spread assumption of a universal kinetics of amyloid formation turns out to be unjustified. In contrast, the states of critical oligomer and protofibril seem to be generic parts of the hierarchical assembly process. Comparison of the kinetics of each hierarchical level amoung the three investigated proteins shows no considerable similarities.

Im Mittelpunkt der Arbeit stehen Betrachtungen zur Mobilität von epikutan applizierten ESR-Spinsonden, sowie noch weitgehend ungeklärte Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen Liposomen und Haut. Dazu gehört vor allem die Frage nach der Integrität von epikutan applizierten Liposomen. Weiterhin wurden die Auswirkungen von Liposomen auf die Flexibilität der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen, die Penetration von ESR-Spinsonden unterschiedlicher Hydro-/Lipophilie, sowie die Mobilität von ESR-Spinsonden in der Haut und die Polarität ihrer Mikroumgebung untersucht. Als wichtigste Ergebnisse der Arbeit sind folgende Punkte zu nennen. Liposomen verlieren nach epikutaner Applikation ihre Integrität und bilden auf dem Stratum corneum einen Lipidfilm aus. Dabei nimmt nicht nur der Dispersitätsgrad der Liposomen sondern auch die Flexibilität ihrer Membranen ab. Entgegen der Erwartung führt die epikutane Applikation von liposomalen Zubereitungen nicht zu einer stärkeren Fluidisierung der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen als Phosphatpuffer, wohingegen durch Ölsäure eine deutlich stärkere Fluidisierung erreicht wird. Liposomen mit rigiden Membranen führen zu höheren Spinsondenkonzentrationen in der Haut als Liposomen mit fluiden Membranen, und solche aus partialsynthetischen Lipiden führen zu höheren Konzentrationen als Liposomen aus Sojabohnenphospholipiden. Der Vergleich der Penetration von ESR-Spinsonden in die Haut nach epikutaner Applikation von Liposomen mit der Penetration der Spinsonden aus anderen topischen Zubereitungen zeigt, dass eine generelle Aussage zur Penetrationsförderung durch die Anwendung von Liposomen problematisch ist. Es konnte ein Polaritätsprofil der Mikroumgebung von Spinsonden in der Haut erstellt werden, das belegt, dass die Polarität in der Epidermis geringer ist als in der Dermis. Mit zunehmender Inkubationsdauer konnte ein Anstieg der Polartiät in den Hautproben nachgewiesen werden. Die Anwendung eines durch Freed et al. entwickelten Computerprogramms zur Bestimmung von Rotationskorrelationszeiten sich langsam bewegender Moleküle aus Spektren, die mittels spektral-räumlich aufgelöster ESR-Tomografie erhalten wurden, erlaubt die Erstellung von Viskositätsprofilen der oberen Hautschichten in Abhängigkeit von den epikutan applizierten Zubereitungen. Die Bandbreite der ortsabhängig berechneten Rotationskorrelationszeiten von CAT-1 und TEMPOL in der Haut nach epikutaner Applikation der Spinsonden in Liposomen reicht von 5,94 ns bis 1,97 ns. Dies entspricht einer Viskosität der Mikroumgebung von 118 bis 26 mPas. / The present thesis was focused on the mobility of epicutaneously applied ESR spinprobes and open questions concerning the interactions between liposomes and skin e.g. the integrity of liposomes after epicutaneous application. Additionally the effect of liposomes on the flexibility of lipid membranes in the stratum corneum, the penetration of ESR spinprobes with different hydrophilic / lipophilic properties as well as the mobility and polarity of the microsurrounding of ESR spinprobes in the skin were investigated. The main results of the investigations are mentioned in the following. There will be a loss of integrity of epicutaneously applied liposomes and a lipid film will be formed on the stratum corneum. At the same time the degree of dispersity and the flexibility of their membranes decreases. Contrary to the expectation the application of liposomal formulations does not lead to a stronger fluidity of the lipid membranes of the stratum corneum than the incubation of the samples with phosphate buffer, whereas the incubation with oleic acid results in a substantial increase of the fluidity. The application of ESR spinprobes in liposomes with rigid membranes leads to higher spinprobe concentrations in the skin than with liposomes having fluid membranes. At the same time the application of liposomes made from semi-synthetic lipids leads to higher concentrations of the spinprobe in the skin, than the application of liposomes made from soybean phospholipids. The penetration of spin probes into the skin out of liposomes compared to other topical preparations shows, that a general statement concerning the penetration enhancing effect of liposomes is difficult. On using the ESR tomography a polarity profile of the skin was obtained, showing that the polarity in the epidermis is lower than in the dermis. With increasing incubation time of the skin samples the polarity increases. The application of a computer program, developed by Freed et al. in order to determine rotational correlation times for slowly tumbling molecules, to spectra, obtained from spectral-spatially resolved ESR tomography, allowed the establishment of viscosity profiles for the upper skin layers in dependency on the applied formulations. The range of the calculated rotational correlation times of CAT-1 and TEMPOL in the skin reaches from 5.94 ns to 1.97 ns. This corresponds to a viscosity of the spinprobes microsurrounding from 118 to 26 mPas.

In der vorliegenden Arbeit werden Wachstum und Entwicklung von 10 Schilfklonen (Phragmites australis) verglichen, um die genotypische Determinierung verschiedener Eigenschaften sowie den Einfluss der Standortfaktoren auf diese Eigenschaften zu untersuchen. Dabei sollen Aussagen zum Bestehen unterschiedlicher Ökotypen beim Schilf abgeleitet werden. Die Untersuchungen erfolgten auf sechs Pflanzfeldern, die im Rahmen von Renaturierungsmaßnahmen an den Ufern der Berliner Gewässer Seddinsee, Langer See und Havel im Frühjahr 1995 angelegt wurden. Die Anpflanzung erfolgt am Land, das Schilf wuchs in das Wasser vor. Die Herkunftsorte der Schilfklone unterschieden sich in der Nährstoffversorgung, der Substratqualität und der Exposition. Die Ergebnisse ließen deutliche Unterschiede in der Morphometrie der Halme (Halmlänge, Halmdurchmesser, Blattfläche pro Halm), der Halmbiomasse und der Balance zwischen Halmdichten und Halmlängen (bzw. Trockenmassen) zwischen den einzelnen Schilfklonen erkennen. Da dies beim Wachstum unter vergleichbaren Standortbedingungen gefunden wurde, kann eine genotypische Determinierung dieser Eigenschaften vermutet werden. Es konnte ebenfalls ein starker Einfluss der Umwelt auf das Wachstum des Schilfs festgestellt werden. Allgemein waren die Wachstumsbedingungen im Wasser deutlich besser als am Land. Die höchsten Halmbiomassen der einzelnen Schilfklone wurden daher im Wasser erreicht (zwischen 0,7 und 2,1 kg Trockenmasse pro m²), während die Werte am Land geringer waren (zwischen 0,6 und 1,0 kg/m²). Obwohl sich die Schilfklone an ihren ursprünglichen Standorten deutlich in den Stickstoffgehalten der Halme unterschieden, ergaben sich auf den Pflanzungen keine Unterschiede zwischen ihnen. Im Gegensatz dazu lagen die N-Werte bei jedem Schilfklon im Wasser erheblich höher als am Land. Dies lässt folgern, dass die Stickstoffgehalte der Halme in erster Linie vom Stickstoff-Angebot am jeweiligen Standort abhängen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Schilfklone genotypische Unterschiede in verschiedenen Merkmalen aufweisen können. Eine mögliche Nutzung zu einer Verbesserung des Erfolges von Pflanzmaßnahmen wird diskutiert. / In this study, growth and development of 10 reed clones (Phragmites australis) were compared to investigate genetically determined differences in various characteristics as well as the influence of site conditions on these characteristics. In addition, conclusions on the existence of different ecotypes were to be drawn. The study was performed on six experimental fields, established for shore renaturation on the lakes Seddinsee, Langer See and on the river Havel in Berlin in spring 1995. The plantations were established ashore, the reed expanded into the water. The sites of origin of the clones differed in nutrient supply, substrate quality and shore exposition. The results showed distinct differences between the individual reed clones regarding the morphometrics of the shoots (shoot length, culm diameter, leaf area per shoot), standing crop and the trade-off between shoot length (or dry matter) and shoot density. The fact that these results were found with clones that had grown under comparable site conditions seems to suggest a genotypic determination of these characteristics. A strong influence of the environment on the growth of the reed could also be deserved. In general, the conditions for growth were better in water than ashore. The highest standing crops of the individual reed clones were reached in water (between 0.7 and 2.1 kg drymatter pro m²), while the values ashore were lower (between 0.6 and 1.0 kg/m²). Although the reed clones at their original sites were clearly different in the nitrogen content of shoots, no differences were observed on the experimental fields. In contrast, the N-values of each clone were higher in water than ashore. This suggests that the nitrogen content of the shoots depends primarily on the nitrogen availability at the specific site. The results overall suggest that reed clones could exhibit genetically determined differences in various characteristics. A possible practical use to increase the efficiency of further reed plantations is discussed.

Wichtige Marker in der klinischen Routine für die Risikoabschätzung von kardiovaskulären Erkrankungen (CVD) sind Blutcholesterinwerte auf Basis von Lipoproteinklassen wie ''schlechtes'' LDL oder ''gutes'' HDL. Dies vernachlässigt, dass jede Lipoproteinklasse eine nicht-homogene Population von Lipoproteinpartikeln unterschiedlicher Zusammensetzung aus Lipiden und Proteinen bildet. Studien zeigen zudem, dass solche Sub-populationen von Lipoproteinen im Stoffwechsel als auch im Beitrag zu CVD unterschiedlich sind. Mehrwert und routinemäßiger Einsatz einer detaillierteren Auftrennung von Lipoproteinen sind jedoch umstritten, da die experimentelle Fraktionierung und Analyse aufwendig, zeit- und kostenintensiv sind. Die vorliegende Arbeit ''Computational Lipidology'' präsentiert einen neuartigen Modellierungsansatz für die Berechnung von Lipoproteinverteilungen (Lipoproteinprofil) im Blutplasma, wobei erstmals individuelle Lipoproteinpartikel anstelle von Lipoproteinklassen betrachtet werden. Das Modell berücksichtigt elementare Bestandteile (Lipide, Proteine) und Prozesse des Stoffwechsel von Lipoproteinen. Stochastische wie deterministische Simulationen errechnen auf Basis aller Lipoproteinpartikel im System deren Dichteverteilung. Die Modellberechnungen reproduzieren erfolgreich klinisch gemessene Lipoproteinprofile von gesunden Patienten und zeigen Hauptmerkmale von pathologischen Situationen, die durch Störung eines der zugrundeliegenden molekularen Prozesse verursacht werden. Hochaufgelöste Lipoproteinprofile zeigen die Verteilung von sogenannten ''high-resolution density sub-fractions'' (hrDS) innerhalb von Hauptlipoproteinklassen. Die Ergebnisse stimmen mit klinischen Beobachtungen sehr gut überein, was die Arbeit als einen signifikanten Schritt in Richtung Analyse von individuellen Unterschieden, patienten-orientierte Diagnose von Fettstoffwechselstörungen und Identifikation neuer Sub-populationen von potentiell klinischer Relevanz qualifiziert. / Monitoring the major lipoprotein classes, particularly low-density lipoproteins (''bad'' LDL) and high-density lipoproteins (''good'' HDL) for characterizing risk of cardiovascular disease (CVD) is well-accepted and routine in clinical practice. However, it is only one-half of the truth as lipoprotein classes comprise non-homogeneous populations of lipoprotein particles varying significantly in their composition of lipids and apolipoproteins. Various studies have shown differing metabolic behavior and contribution to CVD of individual lipoprotein sub-populations. Nevertheless, the superiority of more detailed lipoprotein fractionation is still a matter of debate because experimental separation and analysis is an elaborate, time-consuming and expensive venture and not yet worthwhile for routine measurements. The present work ''Computational Lipidology'' aims at establishing a novel modeling approach to calculate the distribution of lipoproteins (lipoprotein profile) in blood plasma being the first that settles on individual lipoprotein complexes instead of common lipoprotein classes. Essential lipoprotein constituents and processes involved in the lipoprotein metabolism are taken into account. Stochastic as well as deterministic simulations yield the distribution of lipoproteins over density based on the set of individual lipoprotein complexes in the system. The model calculations successfully reproduce lipoprotein profiles measured in healthy subjects and show main characteristics of pathological situations elicited by disorder in one of the underlying molecular processes. Moreover, the model reveals the distribution of high-resolution lipoprotein sub-fractions (hrDS) within major density classes. The results show satisfactory agreement with clinical observations which qualifies the work as a significant step towards analyzing inter-individual variability, patient-oriented diagnosis of lipid disorders and identifying new sub-fractions of potential clinical relevance.

Die Modifizierung von Proteinsequenzen unter anderem durch den Austausch von Aminosäuren ist ein zentraler Aspekt in evolutionären Prozessen. Solche Prozesse ereignen sich nicht nur innerhalb großer Zeiträume und resultieren in der Vielfalt des Lebens, das uns umgibt, sondern sind auch täglich beobachtbar. Diese mikroevolutionären Prozesse bilden eine Grundlage zur Immunabwehr höherer Wirbeltiere und werden durch das humorale Immunsystem organisiert. Im Zuge einer Immunantwort werden Antikörper wiederholt der Diversifizierung durch somatische Hypermutation unterworfen. Ziele dieser Arbeit waren, neue Kenntnisse über die Mikroevolution von Antikörpern während der Immunantwort zu gewinnen und die Beziehung zwischen Aminosäureaustauschen und Affinitätsänderungen zu verstehen. Zu diesem Zweck wurde zunächst gezeigt, dass die SPOT Synthese eine präzise Methode ist, um Signalintensitäten drei verschiedenen Bindungsaffinitätsklassen zuzuordnen. Antikörper-Peptid Bindungsdaten, die aus SPOT Synthese Experimenten generiert wurden, bildeten die Grundlage zur Konstruktion der Substitutionsmatrix AFFI - der ersten Substitutionsmatrix, die ausschließlich auf Bindungsaffinitätsdaten beruht. Diese bildete die Grundlage für die Gewinnung eines reduzierten Aminosäuresatzes. Durch einen theoretischen Ansatz konnte gezeigt werden, dass der reduzierte Aminosäuresatz eine optimale Basis für die Epitopsuche darstellt. Für den Prozess der somatischen Hypermutation und Selektion wurde ein neuer Ansatz präsentiert, um für die Affinitätsreifung relevante Mutationen zu identifizieren. Die Analyse zeigte, dass das Spektrum der selektierten Mutationen viel umfangreicher ist als bisher angenommen wurde. Die Tatsache, dass auch einige stille Mutationen stark bevorzugt werden, deutet darauf hin, dass entweder die intrinsische Mutabilität stark unterschätzt wurde oder, dass Selektion nicht nur auf Affinitätsreifung von Antikörpern basiert sondern auch auf ihrer Expressionsrate. / A central task of the evolutionary process is the alteration of amino acid sequences, such as the substitution of one amino acid by another. Not only do these amino acid changes occur gradually over large time scales and result in the variety of life surrounding us, but they also happen daily within an organism. Such alterations take place rapidly for the purposes of defense, which in higher vertebrates, is managed by the humoral immune system. For an effective immune response, antibodies are subjected to a micro-evolutionary process that includes multiple rounds of diversification by somatic hypermutation resulting in increased binding affinity to a particular pathogen. The goal of this work was to provide insights into the microevolution of antibodies during the immune response, including the relationship between amino acid substitutions and binding affinity changes. A preliminary step in this work was to determine the accuracy of the SPOT synthesis technique, which could be shown to be an accurate method for assigning measured signal intensities to three different binding affinity classes. A substitution matrix based on data produced with these binding experiments was constructed and named AFFI. AFFI is the first substitution matrix that is based solely on binding affinity. A theoretical approach has additionally revealed that an AFFI-derived reduced set of amino acids constitutes an optimal basis for epitope searching. For the process of somatic hypermutation and selection, a novel approach to identify mutations relevant to affinity maturation was presented. The analysis revealed that the spectrum of mutations favored by the selection process is much broader than previously thought. The fact that particular silent mutations are strongly favored indicates either that intrinsic mutability has been grossly underestimated, or that selection acts not only on antibody affinity but also on their expression rates.

Fehlerhafte sekretorische Proteine werden über einen speziellen Abbauweg, die ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD), mit Lysin48-verknüpften Ubiquitinketten polyubiquitiniert und dem proteolytischen Abbau am 26S Proteasom zugeführt. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae bilden die beiden ER-membranständigen RING-Ubiquitinligasen Hrd1 und Doa10 zentrale Komponenten im Ubiquitinierungsprozess. Das lösliche zytosolische Ubiquitin-konjugierende Enzym Ubc7, welches mit beiden Ligasen bei der Polyubiquitinierung von Substratproteinen zusammenwirkt, wird über den membranverankerten Co-Faktor Cue1 an die ER-Membran rekrutiert. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse belegen zwei weitere Funktionen für Cue1 im Ubiquitinierungsprozess: Die Bindung von Ubc7 an einen carboxyterminalen Bereich in Cue1 führt zur Stimulation der Ubiquitinierungsaktivität von Ubc7 mit den RING-Ligasen. Darüber hinaus bewirkt die Ubiquitin-bindende CUE-Domäne in Cue1 eine Steigerung der Länge der Ubiquitinketten und deren Syntheserate, was zum effektiven Abbau einiger ER-membrangebundener Substratproteine beiträgt. Die durch Ubc7 synthetisierten Lysin48-verknüpften Ubiquitinketten werden in Abhängigkeit eines schleifenförmigen sauren Bereichs in Ubc7 gebildet. Entfernen dieses Bereichs resultiert im Abbruch der Ubiquitinierung nach Konjugation eines Monoubiquitins auf dem Substrat. An der Hrd1-Ligase werden durch Ubc7 polyubiquitinierte Proteine umgehend zum Proteasom transferiert. Für den Doa10-abhängigen Substratabbau ist die Funktion eines weiteren Ubiquitin-konjugierenden Enzyms, Ubc6, notwendig. Die hier gezeigten Daten weisen auf eine Ubc6-abhängige Verknüpfung von Ubiquitinmolekülen in einer Lysin11-abhängigen Weise hin. Eine Inhibition der Synthese Lysin11-verknüpfter Ubiquitinketten hatte jedoch keinen Effekt auf den Abbau von Substratproteinen. Stattdessen wurde der Abbau von Ubc6 selbst durch Unterbindung der Bildung Lysin27-verknüpfter Ubiquitinketten verhindert. / Aberrant secretory proteins are removed from the cell in a process termed „endoplasmic reticulum-associated protein degradation" (ERAD), as it screens the endoplasmic reticulum for unwanted polypeptides and triggers their elimination via the 26S proteasome. To this end, client proteins of the ERAD pathway are polyubiquitinated with lysine48-linked ubiquitin chains at the ER membrane. Two ER membrane-integrated RING ubiquitin ligases, Hrd1 and Doa10, constitute central components of the ubiquitination machinery in Saccharomyces cerevisiae. To polyubiquitinate substrate proteins, both ligases interact with the ubiquitin-conjugating enzyme Ubc7. Since Ubc7 itself is a soluble cytosolic protein, it is recruited to the ER-membrane by is anchoring factor Cue1. Results in this study reveal two additional functions of Cue1 in the ubiquitination reaction: First, binding of Ubc7 to the Cue1-carboxyterminus stimulates the ubiquitin chain formation by Ubc7 and the ligases. Second, the CUE domain within Cue1 increases the chain length and accelerates the synthesis of the polyubiquitin chain, which results in efficient degradation of certain substrate proteins. Formation of lysine48-linked ubiquitin chains by Ubc7 depends on an acidic loop within Ubc7. Deletion of this structure leads to inhibition of ubiquitin chain elongation after the initial substrate monoubiquitination. Client proteins, ubiquitinated by Ubc7 and Hrd1, are immediately transferred to the proteasome. For Doa10-dependent substrate degradation, the activity of another ubiquitin-conjugating enzyme, Ubc6, is required. Data shown here indicate a function of Ubc6 in the formation of lysine11-linked polyubiquitin, since mutation of this lysine residue resulted in the prevention of ubiquitin chain synthesis. However, expression of this ubiquitin mutant had no effect on substrate degradation. Moreover, the proteolysis of Ubc6 itself is inhibited by prevention of lysin27-linked polyubiquitin chain formation.

Helminthen besitzen effektive Strategien um das Immunsytem ihrer Wirte zu modulieren. Sie sekretieren Moleküle mit deren Hilfe Immunzellen unterdrückt werden und verhindern dadurch Immunantworten, die ihnen schaden. AvCystatin ist ein Cystein-Protease-Inhibitor der Filarie Acanthocheilonema viteae. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass dieses Molekül in Makrophagen MAPK (p38, ERK) sowie Transkriptionsfaktoren (CREB, STAT3) anspricht und zur Expression von spezifischen Markergenen führt, die eine M2a/M2b Makrophagen-Aktivierung repräsentieren. Ein intravenöser Transfer solcher Zellen 18-20 Stunden nach Stimulation mit AvCystatin führte in Mäusen zu einer signifikanten Reduktion von wichtigen Merkmalen der Ovalbumin-induzierten Atemwegshyperreaktivität wie Schleimproduktion, Th2 Zytokinen, IgE und Eosinophilen. Die Linderung von Krankheitsparametern war mit einem lokalen und systemischen Anstieg von IL-10 assoziiert. Unter Verwendung eines in vitro Systems zeigte sich, dass AvCystatin induzierte Makrophagen einen löslichen Faktor sekretieren, der eine IL-10-Produktion durch CD4+ T-Zellen induziert und parallel die Produktion von IL-13, IL-2 und IFN-gamma unterdrückt. Um zu untersuchen, ob die suppressive Aktivität der AvCystatin-Makrophagen auf Entzündungsprozesse der Atemwege beschränkt ist, wurde ein Makrophagen-Transfer in Tiere durchgeführt, die unter DSS-induzierter Kolitis litten. Eine einmalige Gabe von Zellen verhinderte den Verlust von Körpergewicht, eine Verkürzung des Kolons und verminderte die Migration entzündungsvermittelnder Zellen in die Lamina Propria. Im Gegensatz zum Krankheitsmodell der Ovalbumin-induzierten Atemwegshyperaktivität korrelierten die Effekte nicht mit erhöhten Mengen an IL-10. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass AvCystatin Makrophagen adressiert und eine immunsuppressive Population generiert, welche Mäuse im Kontext von Atemwegsentzündung und Kolitis gegen überschießende Immunantworten schützen kann. / Helminth parasites possess effective strategies to modulate the immune system of their hosts. They release molecules which target immune cells and prevent reactions directed against them. AvCystatin is a cysteine protease inhibitor secreted by the nematode Acanthocheilonema viteae. The present thesis shows that this molecule modulates signaling pathways in murine macrophages through activation of MAPK (p38, ERK) and transcription factors (CREB, STAT3). Such macrophages express specific marker genes reflecting M2a/M2b activation. A single intravenious transfer of macrophages 18-20 hours after treatment with AvCystatin significantly reduced major parameters of ovalbumin-induced airway hyperreactivity in mice such as mucus production, Th2 cytokines, IgE and recruitment of eosinophils to the airways. The amelioration of inflammation was associated with significantly increased levels of local and systemic IL-10. By using an in vitro co-culture assay AvCystatin-induced macrophages were shown to secrete a soluble factor which induces IL-10 in CD4+ T cells and in parallel to suppress production of IL-13, IL-2 and IFN-gamma. To evaluate whether the suppressive potential of AvCystatin-macrophages is restricted to airway inflammation, macrophages were administered to animals suffering from DSS-induced colitis. A single application of cells into the tail vein sufficiently prevented body weight loss, colon shortening and suppressed the influx of inflammatory cells to the lamina propria. In contrast to the model of ovalbumin-induced airway inflammation the effects were not associated with increased levels of IL-10. On the whole these findings show that the helminth immunomodulator AvCystatin targets macrophages thereby inducing a distinct immunosuppressive population which protects mice against overshooting immune responses in disease models for airway and intestinal inflammation.

Um die Rolle von Bx42 in der Regulation des Zellzyklus von Drosophila zu verstehen, habe ich die Auswirkungen der Expression von dominant negativen Bx42 Allel in Drosophila Augenimaginalscheiben untersucht, sowie die Auswirkungen der Bx42 Protein Abbau in Drosophila S2-Zellen mit Hilfe der RNA-Interferenz-Methode. In meiner Studie fand ich, dass die Expression von Bx42-SNW, einer abgeschnittenen dominant negative Version von Bx42, in den Augenimaginalscheiben zu kleinen und groben Augen führte. Analyse des Zellzyklus in den betroffenen Scheiben zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der S-Phase-Zellen, aber eine starke Reduktion der mitotischen Zellen und die Herunterregulation von Cyc A und B Cyc in dem normalen mitotischen aktiven SMW Bereich des Augenimaginalscheibes. Ziel dieser Studie war auch Faktoren zu finden, die den kleinen Augenphänotyp von Überexpression der negativen Form Bx42-SNW modifizieren können. Die definierten Modifikatoren waren E2F / Dp, Rb, Tribbles, Cdk1, Cyclin B3, EGFR, Dpp und Armadillo. Um weitere Einblicke in der Rolle des Bx42 in Proliferation, dsRNA-vermittelte Knockdown der Expression von Bx42 in S2-Zellen verwendet wurde. Zellen, die mit dsRNA behandelt wurden, zeigten eine signifikante Abnahme der Proliferationsraten im Vergleich zu kontrol dsRNA-OFP-Zellen. Zellzyklusanalyse zeigte, dass die Herunterregulation von Bx42 Zellpopulationen in der G1 und G2 Phasen verringerte, gleichzeitig S-Phasen-Zellen durch Zyklusarrest vermehrete, was führte zu einem Zustand, die Zellen unfähig die zellteilung zu vervollständigen. Semi q-RT-PCR ergab, dass die Herunterregulation von Bx42 die Transkription von E2F, Dap, Cyc A und Cyc B beeinflusst. Eine Reduktion von Cyc A und Cyc B auf Proteinebene wurde auch nachgewiesen. / In order to understand the role of Bx42 in cell cycle regulation of Drosophila, I have investigated the effects of the expression of dominant negative Bx42 allele in Drosophila eye imaginal discs, as well as the effects of depleting the Bx42 protein in Drosophila S2 cells by RNAi. In my study, I found that the expression of Bx42-SNW, a truncated dominant negative version of Bx42, in eye imaginal discs resulted in small and rough eyes. Analyzing the cell cycle in the affected discs showed no significant differences in the number of S-phase cells, but a strong reduction of mitotic cells and the downregulation of Cyc A and Cyc B in the normally mitotic active SMW region of the eye disc. This study aimed also at finding factors that modify the small eye phenotype resulting from overexpression of Bx42-SNW in the eye. The defined modifiers were E2F/Dp, Rb, Tribbles, Cdk1, Cyclin B3, EGFR, Dpp and Armadillo. To gain further insight into the role of Bx42 in proliferation, dsRNA-mediated knockdown the expression of Bx42 was employed in S2 cells. Cells treated with dsRNA exhibited a significant decrease in proliferation rates compared to control dsRNA-OFP cells. Cell cycle analysis demonstrated that down-regulation of Bx42 decreased cell populations in the G1& G2 phases simultaneously augmenting S-phase cells by cycle arrest, leading to a state unable to complete cell division. Semi q-RT PCR, revealed that downregulation of Bx42 affects the transcription of E2F, Dap, Cyc A and Cyc B. A reduction of Cyc A and Cyc B was also demonstrated at the protein level.

Die Eigenschaften einzelner Nervenzellen sind von grundlegender Bedeutung für die Verarbeitung von Informationen im Nervensystem. Neuronen antworten auf Eingangsreize durch Veränderung der elektrischen Spannung über die Zellmembran. Die Spannungsantwort wird dabei durch die Dynamik der Ionenkanäle in der Zellmembran bestimmt. In dieser Arbeit untersuche ich anhand von leitfähigkeits-basierten Modellneuronen den Einfluss von Ionenkanälen auf zwei Aspekte der Signalverarbeitung: die Frequenz-Selektivität sowie die Zuverlässigkeit und zeitliche Präzision von Aktionspotentialen. Zunächst werden die zell-intrinsischen Mechanismen identifiziert, welche the Frequenz-Selektivität und die Zuverlässigkeit bestimmen. Weiterhin wird untersucht, wie Ionenkanäle diese Mechanismen modulieren können, um die Integration von Signalen zu optimieren. Im ersten Teil der Arbeit wird demonstriert, dass der Mechanismus der unterschwelligen Resonanz, so wie er bisher für periodische Signale beobachtet wurde, auch auf nicht-periodische Signale anwendbar ist und sich ebenfalls in den Feuerraten niederschlägt. Im zweiten Teil wird gezeigt, dass zeitliche Präzision und Zuverlässigkeit von Aktionspotentialen mit der Stimulusfrequenz variieren und dass, in Abhängigkeit davon, ob das Stimulusmittel über- oder unterhalb der Feuerschwelle liegt, zwei Stimulusregime unterschieden werden müssen. In beiden Regimen existiert eine bevorzugte Stimulusfrequenz, welche durch die Gesamtleitfähigkeit und die Dynamik spezifischer Ionenkanäle moduliert werden kann. Im dritten Teil wird belegt, dass Ionenkanäle die Zuverlässigkeit auch direkt über eine Veränderung der Sensitivität einer Zelle gegenüber neuronalem Rauschen bestimmen können. Die Ergebnisse der Arbeit lassen auf eine wichtige Rolle der dynamischen Regulierung der Ionenkanäle für die Frequenz-Selektivität und die zeitliche Präzision und Zuverlässigkeit der Spannungsantworten schließen. / The properties of individual neurons are of fundamental importance for the processing of information in the nervous system. The generation of voltage responses to input signals, in particular, depends on the properties of ion channels in the cell membrane. Within this thesis, I employ conductance-based model neurons to investigate the effect of ionic conductances and their dynamics on two aspects of signal processing: frequency-selectivity and temporal precision and reliability of spikes. First, the cell-intrinsic mechanisms that determine frequency selectivity and spike timing reliability are identified on the basis of conductance-based model neurons. Second, it is analyzed how ionic conductances can serve to modulate these mechanisms in order to optimize signal integration. In the first part, the frequency selectivity of subthreshold response amplitudes previously observed for periodic stimuli is proven to extend to nonperiodic stimuli and to translate into firing rates. In the second part, it is demonstrated that spike timing reliability is frequency-selective and that two different stimulus regimes have to be distinguished, depending on whether the stimulus mean is below or above threshold. In both cases, resonance effects determine the most reliable stimulus frequency. It is shown that this frequency preference can be modulated by the peak conductance and dynamics of specific ion channels. In the third part, evidence is provided that ionic conductances determine spike timing reliability beyond changes in the preferred frequency. It is demonstrated that ionic conductances also exert a direct influence on the sensitivity of the timing of spikes to neuronal noise. The findings suggest an important role for dynamic neuromodulation of ion channels with regard to frequency selectivity and spike timing reliability.