Bluetongue virus belongs to the Orbivirus genus from the Reoviridae family. It infects predominantly domestic and wild ruminants and is economically significant worldwide. Bluetongue virus VP7 forms the intercepting layer between the outer capsid (VP2 and VP5) and VP3 which surrounds the genomic material. BL21(DE3), NiCo21(DE3), C43(DE3) pLysS and KRX Escherichia coli cells were transformed with a pET28a plasmid with the cDNA sequence encoding Bluetongue virus VP7. Expression of Bluetongue virus VP7 was tested at post induction temperatures between 16˚C and 37 ˚C, at inducer concentrations between 0.1 mM and 1.0 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside in BL21(DE3), NiCo21(DE3) and C43(DE3) pLysS cells and 0.05 % and 0.15 % rhamnose for KRX cells, in two types of growth media (LB and 2xYT) and post-induction growth times between two and 16 hours. Under all conditions tested; Bluetongue virus VP7 expression was found to be predominantly in the insoluble fraction (pellet). BL21(DE3) and NiCo21(DE3) cells were chosen and grown for five hours post induction, induced with 0.1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside and grown at a post-induction temperature of 37 ˚C. Bluetongue virus VP7 in bacterial cell inclusion bodies was solubilised using urea and a freeze-thaw step. Solubilisation was tested with urea concentrations between 2 M and 8 M, with solubilisation efficiency not increasing past 5 M urea. Solubilized Bluetongue virus VP7 was purified using nickel-affinity chromatography. Purified Bluetongue virus VP7 was then probed with far-UV circular dichroism and intrinsic fluorescence in several buffer conditions including different urea and guanidinium chloride concentrations as well as in the presence of glycerol and sodium chloride. Guanidinium chloride was able to cause Bluetongue virus VP7 unfolding, and the unfolding transition had 94 % and 89 % reversibility at 218 nm and 222 nm respectively. Bluetongue virus VP7 was shown to contain a native-like structure in 20 % glycerol and in up to 8 M urea and was found to be stable till at least 55 ˚C, even in the presence of 5 M urea. Glycerol and sodium chloride influenced the conformation of the protein resulting in different unfolding transitions. Thermal unfolding of Bluetongue virus VP7 was found to be irreversible. / Life and Consumer Sciences / M. Sc. (Life Sciences)

La Fièvre Catarrhale Ovine est une arbovirose due à un Orbivirus touchant les ruminants. Récemment, une épizootie majeure, notamment due au sérotype 8 du virus (BTV-8), a touché les ruminants Européens. Ce sérotype a présenté plusieurs particularités telles que le spectre d’hôte original, et la transmission transplacentaire. L’impact de l’infection par le BTV-8 chez le caprin a été étudiée dans ce travail d’un point de vue clinique, virologique, hématologique et sérologique, et notamment pour ce dernier aspect à travers le développement de deux outils sérologiques. L’impact d’une infection maternelle sur le fœtus a également été étudié.Ces travaux ont confirmé que l’impact de l’infection par le BTV-8 chez les caprins est modéré, tant d’un point de vue clinique que d’un point de vue hématologique. Ce travail a également permis de faire ressortir plusieurs connaissances nouvelles: un impact modéré sur les comptages leucocytaires ; une transmission transplacentaire du virus lors d’infection en milieu de gestation ; une détection du virus dans la semence ; une possible transmission « directe », non vectorielle.Ces 3 dernières constatations n’avaient jusqu’alors pas été rapportées dans la littérature chez les caprins, mais avaient été observées chez les ovins et les bovins. Ceci confirme que, même si les caprins sont des animaux sensibles mais que l’impact clinique est limité, la plupart des caractéristiques faisant la spécificité de l’infection par la souche européenne du BTV-8 peuvent également être retrouvées dans cette espèce. Néanmoins, l’absence de description de ces particularités dans des conditions d’infection naturelle ne permet pas de conclure quant à leur impact sur le terrain.Des outils sérologiques ont été également développés afin d’étudier les propriétés antigéniques des protéines virales chez le caprin. La production des protéines recombinantes NS1, NS3, VP7 et VP2 en système baculovirus, et de la protéine NS2 en système E. coli, ont permis l’obtention de protéines recombinantes. Ces 5 protéines recombinantes ont permis le développement de tests sérologiques permettant d’étudier leurs propriétés antigéniques et la cinétique d’apparition des anticorps après vaccination ou/et infection par le BTV-8 chez le caprin.Dans un premier temps, des tests ELISA indirect NS1, NS2, NS3, VP7 et VP2 ont été développés, et la capacité des tests ELISA NS et VP7 à permettre une différenciation entre les animaux infectés et vaccinés a été évaluée. Cependant, des anticorps anti-NS2 et NS3 ont été détectés dans les sérums d’animaux vaccinés et une faible réponse obtenue en ELISA NS1 chez les animaux infectés rend difficile l’utilisation d’un test ELISA DIVA basé sur ces 3 protéines non structurales. Enfin, une réponse en anticorps anti-VP2 est détectée par le test ELISA VP2 après vaccination et après épreuve virulente, suggérant une détection d’anticorps spécifiques de type par ce test.Dans un second temps, un test Luminex multiplex, basé sur l’utilisation des protéines VP7 et VP2 a été développé. Le Luminex VP7 présente une très bonne corrélation avec l’ELISA VP7 lorsque les sérums d’animaux infectés sont testés, avec une aire sous la courbe de 0,987. Les performances de ce test paraissent cependant modérées lorsque des sérums issus d’animaux ayant reçu une unique injection vaccinale sont testés. Le Luminex VP2 présente des performances également excellentes, avec une aire sous la courbe de 0,978. Les VPP et VPN ont été calculées pour des prévalences très faibles (0,5%, correspondant à la prévalence devant être détectée par le screening sérologique d’animaux sentinelles) : la VPP est alors très faible mais la VPN est très élevée (99,99% pour VP7, 99,95% pour VP2). Le test Luminex multiplex développé, caractérisé par une VPN très élevée, permet d’exclure avec confiance la présence du BTV-8 dans une région indemne lors de résultat négatif, correspondant parfaitement aux objectifs assignés. / Bluetongue is an infectious non contagious arbovirosis caused by Bluetongue virus (BTV), belonging to the genus Orbivirus. Recently, a major epizooty, due to BTV-8, was encountered in European ruminants. This serotype presented several original features such as an original host spectrum and transplacental transmission. This work consisted in studying the impact of BTV-8 infection in goats from a clinical, virological, haematological and serological (after development of two new serological tests) point of view, because of the lack of knowledge in this specie. The impact on foetuses of infection during gestation was also studied.The different animal studies realised confirmed that the BTV-8 infection has a moderate impact in goats from a clinical and haematological point of view. These studies led to obtain new information about BTV-8 impact: moderate impact on leucocytes counts; transplacental transmission of the virus when infection occurs in mid-pregnancy; detection of BTV-8 in bucks’ semen; direct, non vectorial transmission. The last 3 results had never been described in goats with BTV-8 before but had been encountered in sheep and cattle: it proves that, even if goats are susceptible to the infection but are less affected by the virus, most of feature of BTV-8 North European strain can also be encountered in this specie. However, these features have not been described in natural conditions, making impossible to conclude on their impact in the field.In a second part of this thesis, serological tool have been developed in order to study antigenic properties of viral proteins in goats. Recombinant proteins NS1, NS3, VP7 and VP2 were produced in baculovirus system, while NS2 was produced in E. coli system. These recombinant proteins were used to develop serological test in order to study antigenic properties and the kinetic of antibodies response against this 5 proteins after vaccination against and infection by BTV-8 in goats.In a first part, indirect ELISA NS1, NS2, NS3, VP7 and VP2 were developed, and the opportunity to develop DIVA ELISA test using NS and VP ELISA was evaluated. However, detection of antibodies against NS2 and NS3 in vaccinated animals, and the difficulties to detect antibodies against NS1 in infected animals led us to conclude that a DIVA ELISA test using non-structural proteins was difficult. Finally, it was possible to detect antibodies against VP2 in infected and vaccinated animals using our VP2 ELISA, suggesting a detection of antibodies specific of serotype by this test.In a second part, a multiplex Luminex test, using VP7 and VP2, was developed. This test has, for VP7 detection, a strong correlation with cELISA VP7, with an area under the curve of 0.987. Luminex VP7 performance is moderate when sera from goats having only one vaccine administration were tested. Concerning Luminex VP2, test performance are also excellent with an area under the curve of 0.978. When a prevalence of 0.5% was applied (prevalence that should be detected by serological screening in Europe), de predictive negative value was very high (99.99% for Luminex VP7; 99.95% for Luminex VP2). The Luminex test developed, with a very high PNV, can exclude with a high level of confidence the presence of BTV-8 in a free-area.

La maladie épizootique hémorragique (EHD) est une arbovirose inscrite sur la liste de l'OIE (organisation mondiale de la santé), qui affecte aussi bien les ruminants sauvages (essentiellement les cervidés) que les ruminants domestiques (les bovins) par la morsure de petits moucherons hématophages, les Culicoïdes (Diptera: Ceratopogonidae). Au début du 21ème siècle, cette maladie a émergé au Maghreb et au Moyen Orient (Turquie, Israël et Jordanie), générant de lourdes pertes économiques pour les éleveurs.L'émergence inattendue de l'EHDV en Tunisie en 2006, simultanément avec l’observation de foyers d'EHDV-6 au Maroc et en Algérie, a suscité une vive inquiétude dans le monde agricole tunisien, qui avait déjà eu à faire face à la survenue d’épizooties d'autres orbivirus : la peste équine africaine en 1960 et de la fièvre catarrhale ovine en 1999 donnant l’exemple qu'une maladie, réputée exotique, puisse émerger et devenir endémique (cas pour la fièvre catarrhale ovine).Ce projet a donc été réalisé pour améliorer les connaissances sur le virus de l’EHDV responsable de l'infection en Tunisie, en 2006, qui entrainait l’apparition de signes cliniques semblables à ceux du BTV.Dans un premier temps, nous avons disposé d'un échantillonnage de différents prélèvements de bovins, Culicoïdes de type imicola collectés en 2006 et conservés à la sérothéque de l'IRVT. Nous y avons donc recherché le génome de l’EHDV par RT-PCR afin de le caractériser et d'isoler le virus. Les résultats ont démontré que l'EHDV-6 était bien le sérotype qui circulait en Tunisie en 2006. Cette partie du travail a fait l'objet d'une publication dans Acta Veterinaria Hungarica.Le deuxième travail exposé s'est intéressé à la recherche d'une présence éventuelle de l’EHDV-6 en Tunisie avant et après l'épidémie de 2006 dans deux espèces animales : les bovins et les dromadaires. Pour cela, nous avons recherché les anticorps ou le génome viral à partir de prélèvements de terrain réalisés de 2000 à 2014 sur des bovins et des dromadaires. A l'issue de cette étude, nous avons détecté une possible circulation à très bas bruit de l'EHDV-6 chez les bovins. Les résultats obtenus sont discutés et ont fait l'objet d'une publication en cours de publication dans le journal Véterinaria Italiana.Concernant l’étude réalisée chez le dromadaire, espèce sensible au BTV, nous voulions évaluer son rôle de réservoir potentiel pour le virus de l’EHD. L’ensemble des résultats sérologiques et virologiques de notre étude nous indique que cette espèce ne semble pas jouer un rôle dans l’épidémiologie de l’EHD.Enfin, parallèlement à ces recherches sur le virus de l’EHD, nous avons mené une enquête sur la présence du virus de la Bluetongue à partir des échantillons de dromadaires et de bovins tunisiens. Les résultats ont été discutés. L'ensemble de ces études contribue à une meilleure connaissance de l'EHDV-6 présent en Tunisie, et permet de rendre compte des espèces potentiellement réservoirs. Certains travaux présentés pourraient être poursuivis pour évaluer le rôle du dromadaire comme réservoir d’Orbivirus et mieux déterminer les espèces de l'inventaire faunique des Culicoïdes impliquées dans la transmission des Orbivirus. / The epizootic hemorrhagic disease (EHD) is an arthropod-borne virus that is on the OIE’s list (World Animal Health Organisation, formerly Office international des épizooties), this disease is mainly transmitted to wild (mainly deer) as well as domestic (primarily cattle) ruminants, by the bites of minute size midges, the culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) also known as biting midges. In the beginning of the 21st century, EHD was emerged in Maghreb (North Africa) and in the Middle East (Turkey, Israel, Jordan), causing severe losses for the farmers and ranchers.The unexpected emergency of EHDV in Tunisia in 2006, simultaneously with the observation of EHDV-6 cases in Morocco and Algeria, has aroused great concern in the Tunisian agricultural sector, which had already to face the occurrence of other animal diseases orbivirus: African horse sickness in 1966 and bluetongue in 1999 giving examples of the possibility that deemed exotic disease could emerge and become endemic (case bluetongue).This project was carried out to raise the knowledge on the EHDV virus causing the infection in Tunisia in 2006, which led to the appearance of clinical signs similar to those of BTV.First, we prepared a sampling of various samples of cattle, Culicoides type imicola collected in 2006 and stored at the serum bank of IRVT. So, we searched therefore the genome of the EHDV by RT-PCR in order to characterize and isolate the virus. Results showed that EHDV-6 was actually the serotype circulating in Tunisia in 2006. This part of the job was published in Acta Veterinaria Hungarica.The second working paper concerned the potential presence of the EHDV-6 in Tunisia before and after the epidemic of 2006 in two animal species: cattle and camels. For this we looked for antibodies or viral genome from field samples collected from 2000 to 2014 cattle and camels. Following this study, we detected a possible circulation of EHDV-6 at a very low level of intensity among the cattle. The found results were discussed and made the subject of a publication to be in the newspaper Veterinaria iItaliana.Regarding the study on the dromedary species sensitive to BTV, we wanted to examine its potential role as a reservoir species for EHD virus. All serological and virological results of our study indicate that this species does not seem to play a role in the epidemiology of EHD.Finally, alongside these researches on EHD virus, we have investigated the presence of Bluetongue Virus in Tunisian samples from camels and cattle. The results were discussed.All these studies contribute to a better knowledge of EHDV-6 present in Tunisia and allows taking into account some species that are potentially reservoir. Some presented researches could be pursued to assess the role of the camel as a reservoir for Orbivirus and better identify species of the faunal inventory of Culicoides involved in transmission of orbivirus.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-04-25T12:36:56Z No. of bitstreams: 1 Antonio Fernando Barbosa Batista Filho.pdf: 1655868 bytes, checksum: 0e3328c020c4764ab7ac6b596bf0a9b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T12:36:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio Fernando Barbosa Batista Filho.pdf: 1655868 bytes, checksum: 0e3328c020c4764ab7ac6b596bf0a9b9 (MD5) Previous issue date: 2015-07-21 / This study aimed at analyzing the epidemiological aspects of Bluetongue Virus (BTV) infection on dairy cattle in Garanhuns micro-region, Pernambuco state, Brazil. 384 blood samples were collected from female cattle in reproductive age from 20 properties of 19 municipalities that compose the region. These samples were subject to immunodiffusion assay (AGID) to detect the presence of anti-BTV antibodies. There was a prevalence of 71.3% (274/384; CI – 66.5% - 75.7%) of positive animals. Regarding the foci numbers, 100% (20/20) of properties had at least one positive animal in the serum test. The risk factors identified were not performing intercropping breeding (OR = 3.2; p – 0.012), wetlands presence in the property (OR =2.1; p = 0.001); artificial insemination using (OR = 8.8; p = 0.003). This is the first report of BTV infection on cattle in Pernambuco state and from the results suggest it is widespread. Thus, the suggested control measures based on hygienic-sanitary management and biosecurity are intended to prevent/to avoid virus spreading. Moreover, epidemiological studies should be performed in order to identify the serotypes circulating in ruminant population. / Objetivou-se com este trabalho analisar os aspectos epidemiológicos da infecção pelo Vírus da Língua Azul (VLA) em bovinos leiteiros na microrregião Garanhuns do Estado de Pernambuco, Brasil. Foram coletadas 384 amostras sanguíneas de bovinos fêmeas em idade reprodutiva, procedentes de 20 propriedades dos 19 municípios que compõem a região. As amostras foram submetidas ao teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA) para pesquisa de anticorpos Anti-VLA. Observou-se uma prevalência de 71,3% (274/384; IC – 66,5% - 75,7%) de animais positivos. Em relação ao número de focos, 100% (20/20) das propriedades apresentaram ao menos um animal positivo no teste sorológico. Os fatores de risco identificados foram: não realizar criação consorciada (OR = 3,2; p = 0,012); presença de áreas alagadas na propriedade (OR = 11,8; p = 0,001); não realizar controle de insetos (OR = 2,1; p = 0,033); rebanho aberto (OR = 2,1; p = 0,001); utilização de inseminação artificial (OR = 8,8; p = 0,003). Este é o primeiro registro da infecção pelo Vírus da Língua Azul em bovinos no estado de Pernambuco e a partir dos resultados obtidos conclui-se que a infecção encontra-se distribuída na região e sugere-se que medidas de controle baseadas no manejo higiênico-sanitário e biosseguridade sejam implementadas para evitar a propagação do vírus, assim como estudos epidemiológicos devem ser realizados com o objetivo de identificar os sorotipos que circulam na população de ruminantes.

La découverte du rôle des insectes en tant que vecteurs de pathogènes, établi depuis plus d'un siècle, a été l'élément moteur de la discipline « entomologie médicale et vétérinaire ». Malgré le succès de nombreuses campagnes de prévention et de programmes de lutte, nous assistons depuis une trentaine d'années à l'émergence et à la recrudescence de maladies à transmission vectorielle. Le virus de la fièvre catarrhale ovine (FCO) (Reoviridae : Orbivirus) est un très bon exemple de virus émergent en Europe dont les mécanismes de transmission sont encore peu connus dans cette région. Ce virus est transmis par des moucherons hématophages du genre Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae) aux ruminants sauvages et domestiques. En Europe, la FCO a été pendant longtemps considérée comme une maladie exotique. À partir de 1998, plusieurs incursions apparaissent dans l'ouest du bassin méditerranéen en lien avec la remontée vers le nord de populations de Culicoides imicola, le principal vecteur afrotropical. À partir d'août 2006, l'apparition et la transmission du sérotype 8 dans le nord de l'Europe, dans des zones où C. imicola est absent, révèle l'importance des espèces autochtones et la nécessité de comprendre leur rôle vecteur. Ce travail s'intéresse aux mécanismes de transmission du virus de la FCO en Europe non méditerranéenne, en i) présentant un état de l'art de la biologie et l'écologie des Culicoides adultes, ii) en évaluant les conditions possibles d'utilisation de pièges pour estimer le taux de piqûre et iii) en décrivant les comportements trophiques pour les espèces d'intérêt vétérinaire. / The discovery of insects as pathogens vectors was established for over a century and was the driving force behind the discipline “medical and veterinary entomology”. Despite the success of some prevention and control program campaigns, the emergence and spread of vector-borne diseases occurred dramatically during this last thirty years. Bluetongue virus (BTV) (Reoviridae: Orbivirus) is a good example of emerging virus in Europe, with a little understanding of the epidemiology of this disease. This virus is transmitted by blood-sucking midges of the genus Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) to wild and domestic ruminants. In Europe, BT was considered an exotic disease. In 1998, several incursions appeared in the western Mediterranean Basin in line with the northward progression of C. imicola populations, the main afrotropical vector. From August 2006, the emergence and transmission of serotype 8 in northern Europe, in areas where C. imicola is absent, revealed the importance of autochthonous species and the urgent need to understand their role as vector. This work gives new insights into the understanding of BTV transmission in northern Europe: i) presenting a state of the art review of the biology and ecology of Culicoides adults, ii) assessing different methods to study the biting rate and iii) highlighting trends in host-seeking behavior.

Abstract :Bluetongue (BT) is a vector-borne infectious disease primarily transmitted to even- toed ungulates by the bite of several Culicoides species. The global distribution of BT can be attributed to the ubiquity of its vectors and its rapid spread, likely to the enhancement of human activities (intensification of animal production, trans- port, changing habitat). During the last decades, BT established in Southern Europe and more recently emerged in Northern Europe, causing the death of millions of domestic ruminants. On the same time, a Belgian research project has been set up to develop remote-sensing tools to study the EPidemiology and Space-TIme dynamicS of infectious diseases (EPISTIS). In that general framework, this thesis aimed to study the space-time distribution of the main Culicoides vectors occurring in Italy and Belgium, at two different scales. Firstly, we aimed to clarify the role of several eco-climatic factors on the regional-scale distribution of C. imicola in time, based on weekly samplings achieved throughout Italy from 2001 to 2006 and to develop an easy-to-use and reproducible tool, which could be widely validated on the basis of former vector sampling and freely accessible remote-sensing data. Secondly, we aimed to investigate how Culicoides species were distributed in the fine-scale habitat encountered throughout the agro-ecological landscapes of Belgium, while recent studies have suggested that the landscapes configuration could explain the spatial distribution of BT. In the first part, we showed that an autoregressive model where the observed monthly growth rate is predicted by monthly temperature, allowed predicting >70% of the seasonal variability in C. imicola trap catches. The model predicted the seasonality, the altitudinal gradient, and the low populations’ activity taking place during the winter. Incorporating eco-climatic indices such as the Normalized Difference Vegetation Index into the model did not enhance its predictive power. In the second part, we quantified how Culicoides populations are spatially structured in the neighbourhood of farms, and demonstrated the unexpectedly high level of population found in forest. We also showed how four classes of land use could influence the relative abundances of Culicoides species in the agro-ecological landscapes of Belgium. Although in summer, BT vectors were abundant in each of the four classes investigated, their relative abundances varied strongly as a function of sex, species and environmental conditions, and we quantified these variations. Finally, we also presented a new method to quantify the interference between Onderstepoort light traps, and used it to measure their range of attraction for several of the most common BT vectors species in Northern Europe. The model developed on C. imicola in Italy provided enthusiastic perspectives regarding the regional-scale analyses of its distribution in time, although further improvements are nevertheless required in order to assess the broad scale ecology of BT vectors throughout Europe. Mapping the abundances of C. imicola in Sardinia high- lighted an important lack of reliability attributable to the many land use classes that are currently not sampled in the vector surveillance achieved across Europe. Together with the novelties presented in the second part and the recent findings establishing that BT could circulate among wild hosts in both epidemiological systems (i.e. in Southern and Northern Europe), we call for increasing epidemiological and entomo- logical studies at the interface between farms and the surrounding natural habitats. Last, depicting in time the landscape-scale findings for Northern Europe highlighted how dramatic could be the role played by intensive farming practices to maintain BT within the agro-ecological landscapes studied and to facilitate its circulation between them. Quantifying the amplitude of the risk of disease transmission linked to these practices would require a further complex modeling approach accounting simultaneously for the diel activity of hosts, mainly resulting from the farming activities, the diel activities of different vector species and the landscapes configuration found in contrasted agro-ecological systems.<p>Résumé :La fièvre catarrhale ovine (FCO), encore appelée maladie de la langue bleue, est une maladie infectieuse des ruminants transmise par la piqûre d’un vecteur de type moucheron appartenant au genre Culicoides (Diptera :Ceratopogonidae). L’ubiquité de ses vecteurs peut expliquer son succès d’installation à l’échelle globale. Par ailleurs, sa rapide expansion a été grandement facilitée par l’importante activité anthropique (élevage, transport, modification de l’habitat) et peut-être même par les changements climatiques globaux. La FCO a été récemment qualifiée de maladie infectieuse émergente en Europe du fait de (i) son récent établissement dans la région, bien au delà de son aire de répartition traditionnelle, (ii) de sa forte capacité de dispersion affectant chaque jour un nombre plus important d’hôtes et enfin (iii) de sa forte virulence. Après avoir détaillé les caractéristiques majeures des deux principaux foyers de FCO rencontrés en Europe depuis 1998, la présente thèse s’est plus particulièrement intéressée à l’étude de la distribution spatio-temporelle de ses principaux vecteurs dans le sud (partie 1) puis dans le nord (partie 2) de l’Europe, à différentes échelles. Dans la première partie, un modèle discret, spatialement et temporellement explicite, a été développé afin de mesurer l’influence de différents facteurs éco-climatiques sur la distribution de Culicoides imicola, principal vecteur de la FCO dans le Bassin Méditerranéen. Les profils mensuels de distribution rencontrés en Sardaigne durant 6 années consécutives ont ainsi pu être reconstitués, principalement sur base de la température. Une cartographie de l’abondance de C. imicola sur le territoire a permis de mettre à jour le manque d’information sur sa distribution en dehors des exploitations agricoles. Dans la deuxième partie du travail, nous nous sommes penchés sur la distribution spatiale des Culicoides tels qu’on peut les rencontrer au sein de différents paysages agro-écologiques de Belgique. Nous avons ainsi pu décrire la structure adoptée par les populations de Culicoides au voisinage des fermes ainsi que quantifier l’importante population présente dans les forêts avoisinantes. Nous avons par ailleurs montré l’influence de différentes catégories d’utilisation du sol sur l’abondance et la composition en espèces. Enfin, nous avons présenté une méthode permettant de quantifier l’interférence entre des pièges lumineux utilisés dans un même paysage pour échantillonner les populations, et l’avons utilisé afin de mesurer leur rayon d’attractivité sur les espèces vectrices les plus communément rencontrées dans le nord de l’Europe. En guise de conclusion générale et conjointement aux récentes découvertes de cas de FCO au sein de la faune sauvage européenne, nous appelons à réaliser un plus grand nombre d’études éco-épidémiologiques à l’interface entre exploitations agricoles et zones (semi-) naturelles avoisinantes. En outres, les résultats présentés dans la seconde partie ont été mis en relation avec le mode de fonctionnement journalier de nos exploitations agricoles. Nous avons ainsi pu déduire le rôle dramatique joué par les pratiques agricoles intensives dans le maintien du virus de la FCO au sein de nos paysages agro-écologiques, ainsi que dans sa circulation d’un paysage à l’autre. Un cadre de modélisation complexe permettant une analyse simultanée de l’activité nycthémérale des hôtes de la FCO et de ses vecteurs Culicoides en fonction de la configuration des paysages agro-écologiques est néanmoins requis afin de quantifier l’amplitude du risque de transmission de la FCO lié aux pratiques agricoles intensives. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Alpacas were first introduced into South Africa during the year 2000. They are valuable because of the fine quality wool they produce which has much better insulation properties than that of merino wool fibres. Alpacas are also used to act as guards of sheep herds against predators. During 2008, blood samples from an alpaca that died acutely with severe lung oedema, respiratory distress and froth exuding from the nose were received at Elsenburg Veterinary Laboratory. The alpaca was from a herd of 23 alpacas of a British veterinarian in the Montagu district in the western Cape. Virus isolation attempts on the blood produced infrequent embryo mortalities. Embryonated chicken egg (ECE) material was send to the Virology Department at the Onderstepoort Veterinary Institute (OVI). A bluetongue virus (BTV) PCR performed at the diagnostic PCR laboratory at OVI on the ECE material was positive. Further intra-venous (IV) inoculations in ECE produced embryo mortalities on two consecutive days, the 8th and 9th November. The dead embryos were harvested separately and named and treated as two separate virus samples, Alp8 and Alp9 which were further passaged on baby hamster kidney (BHK) cells. The BTV virus neutralisation tests (VNT) performed at the Office International des Epizooties (OIE) Laboratory on both Alp8 and Alp9 were negative. Because of the close serological relationship between BTV and epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV), an EHDV VNT was also performed and was also negative. In the light of the negative VNT and the positive BTV PCR results, more in-depth molecular analyses were performed. RNA was purified from tissue culture material and agarose gel electrophoresis (AGE) performed. Both Alp8 and Alp9 had a typical orbiviral electrophoretic profile, but their respective profiles were different. A sequence-independent reverse transcriptase PCR amplification method generated ample complementary DNA (cDNA) of both samples for sequencing. Sanger sequencing was used to partially sequence genome segments 5 (NS1) and 2 (VP2). BLAST analysis of the partial information of the genome segments 5 (NS1) of Alp8 confirmed it as being a BTV and Alp9 as being an EHDV. BLAST analysis of the deduced amino acid sequence generated of VP2 of both Alp8 and Alp9 established that these samples were possibly new serotypes of BTV and EHDV respectively. The complete genome of both Alp8 and Alp9 was sequenced with next generation 454 Pyrosequencing. This confirmed the partial sequencing results. BLAST analysis of the complete sequence of S2 (VP2) of Alp8 showed that it has 73 % nucleotide and 77 % deduced amino acid identity to BTV15. In contrast the nucleic acid sequence of genome segment S2 (VP2) of Alp9 had no nucleotide sequence identity to any virus, but its deduced amino acid sequence had 71 % amino acid identity to EHDV2. Hyper immune guinea pig (GP) serum prepared against the putative new BT (Alp8) and EHD (Alp9) virus serotypes were tested for serological cross-reactivity against the 24 OIE reference antigen strains of BTV and the 8 OIE reference antigen strains of EHDV. Alp8 had a neutralising antibody (NAb) titre of > 32 against BTV15. Alp9 did not cross react with any of the OIE BTV and EHDV strains. Six out of the remaining 22 alpacas on the farm had NAbs to a greater or lesser extend against Alp8 (BTV) and Alp9 (EHDV) viruses, which confirmed that the viruses were also present in other alpacas in the herd. Very few cases of EHDV in alpacas have ever been reported in literature. A small scale pilot vector susceptibility study showed that vector competence of C. imicola for both Alp8 and Alp9 was low, below 2 %. The fact that neutralising antibodies to Alp8 and Alp9 were detected in other alpacas in the herd raises the question as to whether there are other Culicoides species circulating in the area that could vector the viruses. In conclusion, the results from the serological and virological analyses as well as the nucleic acid sequence data of the genomes of two virus samples, Alp8 and Alp9, from an alpaca that died in the Montagu district in the western Cape identified Alp9 as a definite new serotype of EHDV and Alp8 as a possible new serotype of BTV most closely related to BTV15. / MSc (Biochemistry), North-West University, Potchefstroom Campus, 2014

La Fièvre catarrhale ovine (FCO) est une arbovirose émergente en Europe depuis la fin desannées 90. Elle affecte principalement les ruminants par la piqûre de petits moucheronshématophages, les Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae). Pendant l’été 2006, l’introductiondu sérotype 8 de la FCO, dans la région de Maastricht (Pays-Bas) a rapidement diffusé dansles Ardennes, générant de lourdes pertes pour les éleveurs de bovins et d’ovins. Cesévènements interrogent sur la capacité des Culicoides de la région paléarctique à transmettrela FCO. Ils révèlent la nécessité de mieux connaître la biologie de ces diptères.Nous avons développé successivement dans ce travail, trois axes de recherche qui se sontappuyés sur un travail de terrain réalisé principalement au sein de deux élevages situés dansles Ardennes françaises.Dans un premier temps, nous avons réalisé une expérimentation de gorgement de Culicoidesde captures et d’émergences, provenant des Ardennes, sur petits ruminants virémiques pour leBTV8. A l’issue des expérimentations, une femelle gorgée de l’espèce Culicoides obsoletus apondu et a été retrouvée faiblement positive lors de la recherche du génome du virus de laFCO. Les résultats obtenus ainsi que les difficultés rencontrées lors de la réalisation de cetype d’expérimentation sont discutés.Le deuxième travail exposé s’est intéressé au comportement trophique des Culicoides parl’étude de l’origine du repas sanguin de femelles de Culicoides piégées dans des biotopesvariés. A cette fin, nous avons utilisé des marqueurs moléculaires pour amplifier l’ADN devertébré présent dans les estomacs de femelles gorgées. Ces analyses ont permis de mettre enévidence que des espèces appartenant aux complexes Obsoletus, Pulicaris, ou encore,Culicoides dewulfi, avaient un spectre d’hôte large. Certaines d’entre elles peuvent se gorger àla fois sur les ruminants domestiques et sur la faune sauvage. De plus, ce type d’étuderenseigne sur l’écologie des différentes espèces de Culicoides.Enfin, nous présentons les résultats d’une étude faunistique fondée sur des captures avec despièges lumineux, mais aussi, des prélèvements de boue pour la recherche des gîtes larvaires.Les résultats de piégeages entre les deux exploitations ont été comparés, notamment en termesde biodiversité, et sont discutés en regard des différences de pratiques d’élevage entre lesdeux exploitations choisies d’une part, et la mise en évidence des gîtes larvaires d’autre part.De nombreuses espèces de Culicoides ont émergé au laboratoire à partir des prélèvements deboues, qui ont été caractérisés macroscopiquement. Les gîtes larvaires de C. obsoletus, peuconnus jusqu’alors, ont été mis en évidence dans les deux fermes. Ils ont fait l’objet d’un suivisur plusieurs mois.L’ensemble de ces études contribue à la meilleure connaissance des Culicoides présents dansles Ardennes et de leur biologie, elles permettent de rendre compte des espèces qui semblenttrès inféodées à l’élevage de bovins, et celles qui sont plus ubiquistes. Certains travauxprésentés pourraient être poursuivis pour mettre en évidence les espèces ou populations deCulicoides plutôt sylvatiques, et pour mettre en place de nouvelles expérimentations sur lacompétence et la capacité vectorielle des Culicoides. / Since the late 90’s, Bluetongue disease (BT) can be considered as an emerging arbovirose inEurope. This disease is mainly transmitted to ruminants by the bites of minute size midges,the Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae), also known as biting midges. An outbreak of BTserotype 8 occurred during summer 2006, in the region of Maastricht (Netherlands) andspread quickly to the Ardennes region. The epizooty lead to severe losses in cattle and sheepholdings. These events highlighted the lack of knowledge on the vectorial capacity ofpaleartic Culicoides species, and more generally on their biology.Three approaches are successively treated in this document. They are all based on field workconducted mainly in two holdings located in the Ardennes region.First, an experiment to assess oral susceptibility of Culicoides to Bluetongue virus (BTV) 8was undertaken. Field collected and emerging Culicoides coming from the Ardennes wereengorged on viremic small ruminants. At the end of the experiments, one Culicoides obsoletusfemale was found bloodfed and laid eggs. She was tested for BTV and was found weaklypositive for BTV genome. This result and the difficulties met during the experiment havebeen discussed.The second study focused on the bloodmeal origin of engorged females of Culicoides. Thesewere collected by light traps set in different kinds of environment. Molecular markers wereused in order to amplify the DNA of vertebrates present in the stomach of bloodfed females.Some of the species processed belonging to the Obsoletus or the Pulicaris complex, andCulicoides dewulfi fed on a wide variety of hosts, including domestic ruminants and wildanimals. Moreover, this kind of study brings information on the ecology of different speciesof Culicoides.Finally, a faunistic survey is presented. It was achieved through light trap collections ofmidges and also thanks to the sampling of potential breeding sites. Biodiversity in thecollection of midges captured by light traps between the two holdings were compared.Differences observed are discussed taking into account the differences in breeding practicesbetween the two holdings and the breeding sites investigations. Numerous species ofCulicoides emerged in the laboratory from soil samples which were macroscopicallydescribed. Breeding sites of C. obsoletus, which were not well documentated in the literature,were found in both farms. These were monitored over some months.This work contributes to a better knowledge of the Culicoides present in the Ardennes andtheir biology. It highlights the species which are closely related to the cattle holdingenvironment, and those which are ubiquist. Some of these studies could be continued in orderto highlight the species more related to the forested areas, and to set new experiments onvectorial competence and capacity.

Le virus de la fièvre catarrhale ovine (Bluetongue virus, BTV) est l’agent étiologique de la maladie du même nom, une arbovirose non contagieuse transmise aux ruminants domestiques et sauvages par l’intermédiaire de morsures de moucherons hématophages du genre Culicoides. Il existe actuellement 27 sérotypes décrits de BTV à travers le monde qui se distinguent par les pathologies qu’ils induisent et leur capacité à infecter et se propager chez leur(s) hôte(s) mammifère(s). Le premier objectif de mon projet de thèse visait à identifier les interactions cellulaires spécifiques des sérotypes 8 et 27 pour identifier des facteurs de pathogénicité/virulence et/ou de franchissement de barrière d’espèces. Pour atteindre cet objectif, l’ensemble des protéines virales du BTV a été criblé par la méthode du double-hybride en levure contre deux banques d’ADN complémentaires, l’une d’origine bovine et l’autre d’origine culicoïde. A l’issue de 70 cribles, une centaine de nouvelles interactions virus-hôtes a été mise en évidence et révèle un enrichissement pour quatre processus cellulaires : l’épissage des ARNm, les ribosomes, la SUMOylation et l’apoptose. Cette étude nous a ainsi permis de réaliser le premier interactome pour le BTV qui se poursuit au travers de multiples validations biochimiques et fonctionnelles des interactions identifiées. En parallèle de ce travail de protéomique, le second objectif de mon projet de thèse a été de déterminer l’impact du BTV sur la voie MAPK/ERK, une voie cellulaire essentielle à la prolifération et différenciation cellulaire et classiquement modulée lors d’infections virales. En plus de son rôle antagoniste sur la voie des interférons de type I, nous avons démontré la capacité de la protéine NS3 de BTV à activer la voie MAPK/ERK. En effet, nous avons démontré que NS3 a la capacité d’augmenter le niveau de phosphorylation des protéines kinases ERK1/2 mais également du facteur de traduction eIF4E. Cette fonction, qui semble être spécifique au BTV par rapport aux autres orbivirus, implique l’interaction de NS3 avec la protéine cellulaire BRAF, une protéine MAP3 kinase jouant un rôle majeur dans l’activation de la voie MAPK/ERK. L’activation cette voie par NS3 pourrait être un mécanisme de détournement de la traduction cellulaire au profit de celle du virus mais aussi constituer un élément de réponse pour expliquer l’hyper-inflammation observée dans le cas d’une infection par ce virus / Bluetongue virus (BTV) is the etiological agent of the bluetongue (BT) disease, a non-contagious arbovirus that affects a wide range of wild and domestic ruminants. It is transmitted by blood-feeding midges of the genus Culicoides. There are currently 27 serotypes described of BTV in the world that are distinguished by their differences in term of pathology/virulence and their capacity to infect and disseminate in their mammalian host(s). The first objective of my thesis project was to identify specific cellular interactions of serotype 8 and 27 to reveal new factors of pathogenicity/virulence and/or cross species barrier. To reach this goal, all the proteins encoded by BTV were used as baits to screen, by a high-throughput yeast two-hybrid (Y2H) approach, two complementary DNA libraries originating from hosts naturally infected by BTV : Culicoides and cattle. Therefore, 70 screens were performed to identify a hundred of new virus-host interactions and reveal an enrichment for four cellular processes : mRNA splicing, ribosomes, SUMOylation and apoptosis. This study allowed us to build the first interactome of BTV which continues through multiple biochemical and functional validations of the identified interactions. In parallel to this proteomics work, my second objective was to determine the impact of BTV on the MAPK/ERK pathway, a cellular pathway essential for cell proliferation and differentiation usually modulated during viral infections. In addition to its antagonist role on the type I interferon pathway, we have demonstrated the ability of BTV-NS3 to activate the MAPK/ERK pathway. Indeed, we have demonstrated that NS3 has the ability to increase the level of phosphorylation of ERK1/2 protein and the eIF4E translation factor. This function, which seems to be specific to BTV compared to other orbiviruses, involves the interaction of NS3 with BRAF cellular protein, a MAP3 kinase protein that plays a major role in the regulation of the MAPK/ERK pathway. These results could provide a better understanding of the molecular basis underlying the hijacking of the translation machinery to support virus replication but also constitute a hypothesis to explain the hyperinflammation observed in the BTV infection context

Língua Azul (LA) é uma doença causada pelo Vírus da Língua Azul (VLA) e transmitida por vetores do gênero Culicoides. Estudos sorológicos tem demonstrado a ampla presença do vírus no Brasil, entretanto, informações clínicas da LA na América do Sul são limitadas. Este trabalho descreve alterações clínico-patológicas em ovinos acometidos pela LA no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Em dois surtos, em propriedades distintas, 15 ovinos apresentaram como principais sinais clínicos hipertermia, apatia, aumento de volume da face e região submandibular, dificuldade de deglutição com regurgitação, secreção nasal mucopurulenta esverdeada, alterações respiratórias, além de acentuada perda de peso e erosões na mucosa oral. Seis ovinos que morreram, apresentaram à necropsia edema subcutâneo na face e região ventral do tórax, secreção nasal de coloração esverdeada, esôfago dilatado e preenchido por grande quantidade de conteúdo alimentar, pulmões não colabados, com áreas de consolidação anteroventrais, e luz da traquéia e brônquios com conteúdo espumoso misturado a conteúdo alimentar. No coração e base da artéria pulmonar observaram-se focos de hemorragia. Histologicamente as principais alterações observadas foram no tecido muscular cardíaco e esquelético, em especial no esôfago, com degeneração hialina e flocular, necrose bifásica e micro-mineralização de miofibras associadas a infiltrado inflamatório mononuclear. Pneumonia aspirativa associada à presença de material vegetal e bactérias na luz de brônquios também foi observada e foi considerada a responsável pela gravidade das manifestações clínicas e pelas mortes. O diagnóstico de LA foi confirmado pelo duplex RT-PCR com a identificação do VLA, sorotipo 12. / Bluetongue (BT) is a disease caused by bluetongue virus (BTV) and transmitted by vectors of the genus Culicoides. Serological studies have demonstrated the widespread distribution of the virus in Brazil, however, clinical information of BT in South America are limited. This paper describes clinical and pathological changes in sheep affected by BTV in southern Brazil. In two outbreaks on different farms, 15 sheep showed clinical signs as severe hyperthermia, apathy, swelling of the face and submandibular area, difficulty in swallowing with regurgitation, greenish mucopurulent nasal secretion, severe weight loss and erosions in the oral mucosa. Six sheep that eventually died, shall necropsy showed subcutaneous edema in the face and ventral region of the chest, runny nose of green color, and dilated esophagus filled with adundant food content, lungs collapsed, with areas of antero ventral consolidation and trachea and bronchi containing foamy contents mixed with food. Heart and base of the pulmonary artery showing foci of hemorrhage. Histologically, the main changes were in cardiac and skeletal muscles and consisted of biphasic lesions characterized by hyaline and floccular degeneration/necrosis of myofibers associated with micro-mineralization and mononuclear cell infiltration. Pneumonia associated with the presence of organic matter and bacteria in the lumen of the bronchi was also observed. The diagnosis of BT was confirmed by duplex RT-PCR to the identification of the BTV, serotype 12.