Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-15T15:30:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese VALE RIA versão digital - 13-04-2015.pdf: 1990902 bytes, checksum: 9eeb1d5ff93da209400b4799b7ddd5f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-15T15:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese VALE RIA versão digital - 13-04-2015.pdf: 1990902 bytes, checksum: 9eeb1d5ff93da209400b4799b7ddd5f0 (MD5) Previous issue date: 2014-08-28 / A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) compromete progressivamente o sistema imunológico, levando a depleção das células T CD4+ e suas funções, caracterizando a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). A resposta inata é determinante para estabelecer um estado antiviral, que mantém o equilíbrio entre o vírus e o hospedeiro. Os interferons tipo III também chamados de interferons lambda (IFN-λ1 ou IL-29; IFN-λ2 ou IL-28a; IFN-λ3 ou IL-28b), assim como, as Células Natural Killer (NK), são componentes da imunidade inata que desenvolvem papéis importantes no controle da replicação viral. O polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) no gene IFNL3 que codifica o IFN-λ3 mostrou uma forte associação com cura espontânea e sucesso na resposta ao tratamento na infecção pelo HCV. Entretanto, a influência do polimorfismo no IFNL3 na resposta ao tratamento para HIV é controversa. Visando investigar associação entre SNP no IFNL3 com a resposta ao tratamento para HIV, assim como seu efeito nos marcadores de superfície de células NK foram realizados respectivamente dois estudos resultando em dois artigos intitulados: ―Genótipos CC/CT do IFNL3 rs12979860 como marcadores genéticos na resposta imunológica e virológica à TARV em pacientes brasileiros infectados com HIV”, realizado em uma amostra constituída por 266 pessoas vivendo com HIV/AIDS, submetidas à TARV por 12 meses e atendidas no Hospital Correia Picanço (HCP), sendo 30 não respondedores a TARV, e 236 respondedores imunológico e/ou virológico apresentando aumento de T CD4+ e carga viral indetectável. Em um modelo de regressão logística multivariada os genótipos CC/CT rs12979860 do IFNL3 (p= 0,027 OR 2,52 IC 1,02-6,21) e níveis baixos de T CD4+ (p= 0,002 OR 0,997 IC 0,995-0,999, respectivamente) antes da terapia foram independentemente associados à resposta virológica e imunológica a TARV. Dessa maneira, a presença dos genótipos CC/CT rs12979860 no IFNL3 foram associados a um efeito positivo para a resposta imunológica e virológica a TARV, o que pode ser explorado como um possível marcador genético de resposta considerando o período de 12 meses. No segundo artigo, Associação do polimorfismo do gene do IFNL3 e aumento da expressão de CD69 em células NK de pessoas vivendo com HIV sem TARV, foi explorada a hipótese de que os genótipos CC/CT estariam relacionados com uma maior ativação das células NK. Desta forma, o estudo foi constituído por 25 pessoas vivendo com HIV (PVHA) sem TARV, atendidas no HCP, e por 25 indivíduos sem HIV (controle), atendidas no Centro de Testagem e Aconselhamento (CTA), localizado na cidade do Cabo, PE, onde foi comparada a diferença do número da população de células NK e marcadores de ativação entre esses grupos. Os resultados mostraram um aumento da subpopulação NK CD56+CD16- e diminuição de NK CD56+CD16+ (p < 0.001), assim como aumento dos marcadores HLA-DR e CD38 em ambas subpopulações em PVHA quando comparados com o controle. Quanto ao polimorfismo do IFNL3 e a ativação de NK, foi observada uma relação entre a expressão de CD69 e os genótipos CC/CT, porém os marcadores HLA-DR e CD38 não mostraram diferenças de expressão em relação a essa SNP. Em conclusão, o presente estudo mostra evidências que apoiam a influência do polimorfismo do IFNL3 na resposta ao tratamento do HIV e na ativação de células NK em PVHA.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12379_Tese - COVRE L.P. 2018.pdf: 30345373 bytes, checksum: ec3dc8e879b3ba71ae62497eaf04c63e (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / As células natural killer (NK) são fundamentais na resposta imune inata. As funções dessas células são reguladas pela sinalização de receptores de ativação ou inibição. Durante seu desenvolvimento, as células NK podem sofrer uma diferenciação terminal progressiva, que está associada a modificações fenotípicas e deficiências funcionais. Neste trabalho, descrevemos aspectos relacionados a estas características decorrentes do envelhecimento ou induzidas durante a leishmaniose cutânea localizada causada por Leishmania braziliensis. Demonstramos que indivíduos idosos apresentaram um aumento na população de células NK expressando alta frequência do receptor inibitório KLRG1. Essas células possuem perfil de diferenciação terminal e ativam espontaneamente o sensor metabólico denominado proteína quinase ativada por AMP (AMPK). O estímulo através do receptor KLRG1 foi capaz de aumentar a fosforilação de AMPK, impedindo a desfosforilação dessa quinase mediada por PP2C. Além disso, a ativação de AMPK suprimiu a citotoxicidade, a produção de granzima B e de IFN-&#947; nas células NK. Células com a via KLRG1-AMPK ativa apresentaram reduções da capacidade proliferativa, da expressão da subunidade catalítica da telomerase (TERT) e no comprimento dos telômeros, bem como aumento do dano ao DNA. Todos esses fatores são associados a redução no crescimento celular e ao fenótipo de imunosenescência adquirido durante o envelhecimento. Da mesma forma, pacientes com leishmaniose cutânea localizada demonstraram um aumento do fenótipo maduro de células NK, com expansão da subpopulação CD56dim. Além disso, foram observados a diminuição dos marcadores imaturos NKG2A, CD161 e CD27, seguidos pelo aumento na expressão dos receptores NKG2C, KIR (CD158a) e acúmulo de células terminalmente diferenciadas caracterizadas como KLRG1bright e CD57bright. Células NK de pacientes com LCL apresentaram aumento da citotoxicidade, produção de granzima B e de citocinas inflamatórias quando comparadas com controles saudáveis. No entanto, também apresentaram uma baixa capacidade proliferativa, associada à presença de células KLRG1bright e CD57bright e encurtamento significativo dos telômeros quando comparado aos controles saudáveis. Juntos, nossos dados demonstram que o envelhecimento e a infecção causada por Leishmania podem afetar o fenótipo e a função de células NK, levando ao acúmulo de células terminalmente diferenciadas. Assim, a elucidação dos mecanismos que levam a esse comprometimento, como a via KLRG1 / AMPK, podem ser futuramente explorados como forma de retardar ou mesmo reverter as deficiências observadas nestas populações. Além disso, a identificação desses fatores pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, que irão auxiliar no processo de maturação funcional de células NK e aprimorar a resposta imunológica durante infecções e câncer.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12379_Tese - COVRE L.P. 2018.pdf: 30345373 bytes, checksum: ec3dc8e879b3ba71ae62497eaf04c63e (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / As células natural killer (NK) são fundamentais na resposta imune inata. As funções dessas células são reguladas pela sinalização de receptores de ativação ou inibição. Durante seu desenvolvimento, as células NK podem sofrer uma diferenciação terminal progressiva, que está associada a modificações fenotípicas e deficiências funcionais. Neste trabalho, descrevemos aspectos relacionados a estas características decorrentes do envelhecimento ou induzidas durante a leishmaniose cutânea localizada causada por Leishmania braziliensis. Demonstramos que indivíduos idosos apresentaram um aumento na população de células NK expressando alta frequência do receptor inibitório KLRG1. Essas células possuem perfil de diferenciação terminal e ativam espontaneamente o sensor metabólico denominado proteína quinase ativada por AMP (AMPK). O estímulo através do receptor KLRG1 foi capaz de aumentar a fosforilação de AMPK, impedindo a desfosforilação dessa quinase mediada por PP2C. Além disso, a ativação de AMPK suprimiu a citotoxicidade, a produção de granzima B e de IFN-γ nas células NK. Células com a via KLRG1-AMPK ativa apresentaram reduções da capacidade proliferativa, da expressão da subunidade catalítica da telomerase (TERT) e no comprimento dos telômeros, bem como aumento do dano ao DNA. Todos esses fatores são associados a redução no crescimento celular e ao fenótipo de imunosenescência adquirido durante o envelhecimento. Da mesma forma, pacientes com leishmaniose cutânea localizada demonstraram um aumento do fenótipo maduro de células NK, com expansão da subpopulação CD56dim. Além disso, foram observados a diminuição dos marcadores imaturos NKG2A, CD161 e CD27, seguidos pelo aumento na expressão dos receptores NKG2C, KIR (CD158a) e acúmulo de células terminalmente diferenciadas caracterizadas como KLRG1bright e CD57bright. Células NK de pacientes com LCL apresentaram aumento da citotoxicidade, produção de granzima B e de citocinas inflamatórias quando comparadas com controles saudáveis. No entanto, também apresentaram uma baixa capacidade proliferativa, associada à presença de células KLRG1bright e CD57bright e encurtamento significativo dos telômeros quando comparado aos controles saudáveis. Juntos, nossos dados demonstram que o envelhecimento e a infecção causada por Leishmania podem afetar o fenótipo e a função de células NK, levando ao acúmulo de células terminalmente diferenciadas. Assim, a elucidação dos mecanismos que levam a esse comprometimento, como a via KLRG1 / AMPK, podem ser futuramente explorados como forma de retardar ou mesmo reverter as deficiências observadas nestas populações. Além disso, a identificação desses fatores pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, que irão auxiliar no processo de maturação funcional de células NK e aprimorar a resposta imunológica durante infecções e câncer.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-03-10T14:19:47Z No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Taís Campos.PDF: 1941952 bytes, checksum: c97f06b80eaaa998c41ad42a9d48dfc7 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-28T12:16:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Taís Campos.PDF: 1941952 bytes, checksum: c97f06b80eaaa998c41ad42a9d48dfc7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T12:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Taís Campos.PDF: 1941952 bytes, checksum: c97f06b80eaaa998c41ad42a9d48dfc7 (MD5) / Introdução: Leishmaniose cutânea (LC) devido à infecção por L. braziliensis é caracterizada pelo desenvolvimento de lesões cutâneas ulcerativas. Recentemente, atenção tem sido dada à participação das células T CD8+ para a resposta inflamatória deletéria observada em pacientes com LC. Foi demonstrado que estas células contribuem para a imunopatologia através da produção de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina. Em adição às células T CD8+ , células NK e NKT são também importantes fontes de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina, e o papel destas células na infecção por L. braziliensis ainda não foi investigado. Objetivo: Avaliar o papel das células NK na infecção por L. braziliensis. Métodos: As células mononucleares de sangue periférico foram obtidas a partir de indivíduos saudáveis e de pacientes com LC para a marcação ex-vivo com CD56, CD8, CD3, e marcação intracelular para granzima e perforina. As células derivadas de biópsias foram obtidas para munofenotipagem por citometria de fluxo e imunohistoqímica. Resultados: Identificamos quatro sub-populações de células citotóxicas: células NK (CD8- CD3- ), células NK (CD8dimCD3- ), células NKT-like (CD8brigth CD3+ ) e células T CD8+ . Observamos que as frequências de sub-populações de células NK (CD8- e CD8+ ) estavam aumentadas no sangue periférico de pacientes com LC quando comparadas com IS, e estas duas populações expressam mais granzima e perforina do que as células T CD8+ em pacientes com LC. Observamos ainda que as células NK derivadas de lesões de pacientes com LC expressam mais CD107a, marcador de degranulação, do que as células T CD8+ . E que as células NK contribuem para destruição de parasitos na infecção por L. braziliensis Conclusão: Os nossos dados sugerem uma dicotomia funcional das células NK na leishmaniose cutânea, participando tanto na patogênese da doença quanto na destruição de parasitos. Palavras-chave: leishmaniose cutânea, células NK, infócitos citotóxicos, citotoxicidade.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-05-24T18:47:40Z No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Taís Menezes Cerqueira Campos de Brito.pdf: 1736787 bytes, checksum: 003a13a8467c51581b7ceeef54973d9e (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-03T14:43:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Taís Menezes Cerqueira Campos de Brito.pdf: 1736787 bytes, checksum: 003a13a8467c51581b7ceeef54973d9e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T14:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Taís Menezes Cerqueira Campos de Brito.pdf: 1736787 bytes, checksum: 003a13a8467c51581b7ceeef54973d9e (MD5) / CNPq;NIH;INCT-DT / Introdução: Leishmaniose cutânea (LC) devido à infecção por L. braziliensis é caracterizada pelo desenvolvimento de lesões cutâneas ulcerativas. Recentemente, atenção tem sido dada à participação das células T CD8+ para a resposta inflamatória deletéria observada em pacientes com LC. Foi demonstrado que estas células contribuem para a imunopatologia através da produção de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina. Em adição às células T CD8+, células NK e NKT são também importantes fontes de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina, e o papel destas células na infecção por L. braziliensis ainda não foi investigado. Objetivo: Avaliar o papel das células NK na infecção por L. braziliensis. Métodos: As células mononucleares de sangue periférico foram obtidas a partir de indivíduos saudáveis e de pacientes com LC para a marcação ex-vivo com CD56, CD8, CD3, e marcação intracelular para granzima e perforina. As células derivadas de biópsias foram obtidas para imunofenotipagem por citometria de fluxo e imunohistoqímica. Resultados: Identificamos quatro sub-populações de células citotóxicas: células NK (CD8-CD3-), células NK (CD8dimCD3-), células NKT-like (CD8brigthCD3+) e células T CD8+. Observamos que as frequências de sub-populações de células NK (CD8- e CD8+) estavam aumentadas no sangue periférico de pacientes com LC quando comparadas com IS, e estas duas populações expressam mais granzima e perforina do que as células T CD8+ em pacientes com LC. Observamos ainda que as células NK derivadas de lesões de pacientes com LC expressam mais CD107a, marcador de degranulação, do que as células T CD8+. E que as células NK contribuem para destruição de parasitos na infecção por L. braziliensis Conclusão: Os nossos dados sugerem uma dicotomia funcional das células NK na leishmaniose cutânea, participando tanto na patogênese da doença quanto na destruição de parasitos.

A leptospirose é a zoonose mais comum, distribuída em todas as regiões do mundo e causada por bactérias virulentas do gênero Leptospira spp. A apresentação clínica da leptospirose varia de uma doença febril inespecífica a quadros graves com insuficiência renal aguda, icterícia, hemorragias graves, choque cardiovascular e falência de múltiplos órgãos. Pouco se sabe sobre a resposta imune do hospedeiro e os mecanismos patogênicos associados com a leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. O baço tem sido estudado e considerado nos últimos anos como um órgão essencial na fisiopatologia da sepse/choque séptico, uma vez que nele ocorre perda de células da imunidade, secundária à apoptose. Objetivos: descrever os achados histológicos e a resposta imune in situ do baço de pacientes falecidos por leptospirose com hemorragia pulmonar e choque refratário, comparando-os com dois grupos controles, um formado por pacientes falecidos por choque séptico causado por bactérias Gram-positivas/-negativas e um segundo, formado por vítimas de trauma. Metodologia: retrospectivamente, 11 baços de pacientes com leptospirose grave e 10 baços de pacientes com choque séptico foram obtidos por necrópsia e comparados com 12 baços de vítimas de trauma abdominal fechado (controles normais), obtidos por esplenectomia. Os achados histológicos da polpa vermelha e da polpa branca esplênica foram analisados por meio de escore semi-quantitativo. A reação de imunohistoquímica (IH) foi empregada para a marcação de células NK, S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+ e CD20+, bem como para células expressando caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL-10, IL-4 e TGF. A contagem de células marcadas foi realizada utilizando-se gratículo sobre 10 campos da polpa vermelha e 10 campos da polpa branca, escolhidos aleatoriamente. IH também foi realizada nos baços dos casos de leptospirose para a detecção de antígenos de Leptospira spp. Resultados: os baços de pacientes do grupo leptospirose e do grupo choque séptico demonstraram similaridades na análise histológica, divergindo do grupo trauma, com as seguintes alterações: congestão difusa da polpa vermelha com infiltração moderada a intensa de plasmócitos e polimorfonucleares e folículos da polpa branca com atrofia. A IH para antígenos de Leptospira foi positiva em oito (72,7%) amostras de baços do grupo leptospirose. Pela análise quantitativa das células marcadas pela IH, os seguintes resultados foram estatisticamente significantes: alta contagem de células S100+ no grupo leptospirose; alta densidade de células CD68+ no grupo choque séptico; baixa quantidade de células NK e TCD4+ nos grupos leptospirose e choque séptico; baixa quantidade de células TCD8+ nos casos de choque séptico e alta contagem de células CD20+ nos grupos leptospirose e choque séptico. Quanto às células expressando citocinas, encontrou-se alta quantidade de TNF nos pacientes do grupo leptospirose e grande número de células positivas para IL-10 nos grupos leptospirose e choque séptico. A expressão de IL-6, IFN, IL-1 e IL-2r foi insignificante nos baços dos três grupos estudados. Células expressando IL-12 foram encontradas apenas na polpa vermelha de casos de leptospirose. Conclusões: Semelhantes clinicamente aos casos de choque séptico, pacientes com leptospirose grave com choque apresentam disfunção endotelial difusa no baço, esplenite aguda e sinais de comprometimento da imunidade inata e adaptativa in situ no baço, caracterizado por uma baixa densidade de células NK, de células TCD4+ e baixa expressão de IL-6, IL-1, IL-2r, IFN e IL-12, com alta expressão de IL-10. Estes resultados sugerem que um estado de imunossupressão pontua a resposta imune do hospedeiro no estágio terminal da leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. A presença de antígenos de Leptospira nos baços de casos de leptospirose sugere que o agente etiológico contribui diretamente para a patogênese das lesões / Leptospirosis is the most common worldwide zoonosis caused by virulent bacteria from the genus Leptospira spp. The clinical presentation of leptospirosis ranges from unspecific febrile illness to severe forms with acute renal failure, jaundice, hemorrhages, shock and multi organ failure. Little is known about the hosts immune response and the pathogenic mechanisms involved in severe leptospirosis. In recent years the spleen has been considered a pivotal organ in the patophysiology of the sepsis/septic shock because immune cells are lost due to apoptosis in this organ Objectives: describe and compare the splenic histological features and the immune response in situ in patients who died of pulmonary hemorrhage and shock caused by leptospirosis, with spleens from patients who suffered from Grampositive/- negative septic shock and abdominal trauma. Methodology: in retrospect, 11 spleen tissue samples from patients with leptospirosis and 10 spleens from patients with septic shock were obtained by necropsy, and compared with 12 spleens obtained by splenectomy from patients with abdominal trauma. The histological features in the red pulp and white pulp were analyzed by a semi quantitative score. Immunohistochemistry (IH) methods for NK , S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+, CD20+ cells, caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL- 10, IL-4 and TGF were carried out and the stained cells were counted using a grid scale in ten fields of red pulp and white pulp chosen randomly. Also, IH was performed for Leptospira antigens in the leptospirosis patients. Results: the trauma group was totally different from the leptospirosis and septic shock patients which demonstrated strong similarities in the histological analysis: diffuse congestion in the red pulp with a moderate to intense infiltration of plasma cells, and polymorph nuclear cells, and follicles with marked atrophy. The Leptospira antigen was positive in eight (72,7%) spleen tissue samples from the leptospirosis group. By the IH methods and quantitative analysis, the following results reached statistical significance: high account of S100+ cells in the leptospirosis group; high density of CD68+ cells in the septic group; low density of NK and TCD4+ cells in the leptospirosis and septic groups; low quantities of TCD8+ cells in the septic group; high density of CD20+ cells in the leptospirosis and septic groups; high expression of TNF in the leptospirosis group and a strong expression of IL-10 in the leptospirosis and sepsis groups. The expression of IL-6, IFN, IL-1 and IL-2r was insignificant in all groups. IL-12 was only expressed in the red pulp of leptospirosis cases. Conclusion: similar to patients with septic shock, cases of severe leptospirosis (with pulmonary hemorrhage and shock) are associated with a splenic diffuse endothelial dysfunction, splenitis and signs of splenic disturbance in the innate and adaptative immunity in situ, characterized by an low density of NK cells, TCD4+ cells and low expression of IL-6, IL-1, IL-2r, IFN and IL-12 with a high expression of IL-10. These results suggest that an immunosuppressive state develops in the hosts immune response at the terminal stage of severe leptospirosis with pulmonary hemorrhage and shock. Also, the presence of leptospiral antigens in the spleen of the leptospirosis patients suggests the ethyological agent contributes directly to the pathogenesis of the lesions

A leptospirose é a zoonose mais comum, distribuída em todas as regiões do mundo e causada por bactérias virulentas do gênero Leptospira spp. A apresentação clínica da leptospirose varia de uma doença febril inespecífica a quadros graves com insuficiência renal aguda, icterícia, hemorragias graves, choque cardiovascular e falência de múltiplos órgãos. Pouco se sabe sobre a resposta imune do hospedeiro e os mecanismos patogênicos associados com a leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. O baço tem sido estudado e considerado nos últimos anos como um órgão essencial na fisiopatologia da sepse/choque séptico, uma vez que nele ocorre perda de células da imunidade, secundária à apoptose. Objetivos: descrever os achados histológicos e a resposta imune in situ do baço de pacientes falecidos por leptospirose com hemorragia pulmonar e choque refratário, comparando-os com dois grupos controles, um formado por pacientes falecidos por choque séptico causado por bactérias Gram-positivas/-negativas e um segundo, formado por vítimas de trauma. Metodologia: retrospectivamente, 11 baços de pacientes com leptospirose grave e 10 baços de pacientes com choque séptico foram obtidos por necrópsia e comparados com 12 baços de vítimas de trauma abdominal fechado (controles normais), obtidos por esplenectomia. Os achados histológicos da polpa vermelha e da polpa branca esplênica foram analisados por meio de escore semi-quantitativo. A reação de imunohistoquímica (IH) foi empregada para a marcação de células NK, S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+ e CD20+, bem como para células expressando caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL-10, IL-4 e TGF. A contagem de células marcadas foi realizada utilizando-se gratículo sobre 10 campos da polpa vermelha e 10 campos da polpa branca, escolhidos aleatoriamente. IH também foi realizada nos baços dos casos de leptospirose para a detecção de antígenos de Leptospira spp. Resultados: os baços de pacientes do grupo leptospirose e do grupo choque séptico demonstraram similaridades na análise histológica, divergindo do grupo trauma, com as seguintes alterações: congestão difusa da polpa vermelha com infiltração moderada a intensa de plasmócitos e polimorfonucleares e folículos da polpa branca com atrofia. A IH para antígenos de Leptospira foi positiva em oito (72,7%) amostras de baços do grupo leptospirose. Pela análise quantitativa das células marcadas pela IH, os seguintes resultados foram estatisticamente significantes: alta contagem de células S100+ no grupo leptospirose; alta densidade de células CD68+ no grupo choque séptico; baixa quantidade de células NK e TCD4+ nos grupos leptospirose e choque séptico; baixa quantidade de células TCD8+ nos casos de choque séptico e alta contagem de células CD20+ nos grupos leptospirose e choque séptico. Quanto às células expressando citocinas, encontrou-se alta quantidade de TNF nos pacientes do grupo leptospirose e grande número de células positivas para IL-10 nos grupos leptospirose e choque séptico. A expressão de IL-6, IFN, IL-1 e IL-2r foi insignificante nos baços dos três grupos estudados. Células expressando IL-12 foram encontradas apenas na polpa vermelha de casos de leptospirose. Conclusões: Semelhantes clinicamente aos casos de choque séptico, pacientes com leptospirose grave com choque apresentam disfunção endotelial difusa no baço, esplenite aguda e sinais de comprometimento da imunidade inata e adaptativa in situ no baço, caracterizado por uma baixa densidade de células NK, de células TCD4+ e baixa expressão de IL-6, IL-1, IL-2r, IFN e IL-12, com alta expressão de IL-10. Estes resultados sugerem que um estado de imunossupressão pontua a resposta imune do hospedeiro no estágio terminal da leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. A presença de antígenos de Leptospira nos baços de casos de leptospirose sugere que o agente etiológico contribui diretamente para a patogênese das lesões / Leptospirosis is the most common worldwide zoonosis caused by virulent bacteria from the genus Leptospira spp. The clinical presentation of leptospirosis ranges from unspecific febrile illness to severe forms with acute renal failure, jaundice, hemorrhages, shock and multi organ failure. Little is known about the hosts immune response and the pathogenic mechanisms involved in severe leptospirosis. In recent years the spleen has been considered a pivotal organ in the patophysiology of the sepsis/septic shock because immune cells are lost due to apoptosis in this organ Objectives: describe and compare the splenic histological features and the immune response in situ in patients who died of pulmonary hemorrhage and shock caused by leptospirosis, with spleens from patients who suffered from Grampositive/- negative septic shock and abdominal trauma. Methodology: in retrospect, 11 spleen tissue samples from patients with leptospirosis and 10 spleens from patients with septic shock were obtained by necropsy, and compared with 12 spleens obtained by splenectomy from patients with abdominal trauma. The histological features in the red pulp and white pulp were analyzed by a semi quantitative score. Immunohistochemistry (IH) methods for NK , S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+, CD20+ cells, caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL- 10, IL-4 and TGF were carried out and the stained cells were counted using a grid scale in ten fields of red pulp and white pulp chosen randomly. Also, IH was performed for Leptospira antigens in the leptospirosis patients. Results: the trauma group was totally different from the leptospirosis and septic shock patients which demonstrated strong similarities in the histological analysis: diffuse congestion in the red pulp with a moderate to intense infiltration of plasma cells, and polymorph nuclear cells, and follicles with marked atrophy. The Leptospira antigen was positive in eight (72,7%) spleen tissue samples from the leptospirosis group. By the IH methods and quantitative analysis, the following results reached statistical significance: high account of S100+ cells in the leptospirosis group; high density of CD68+ cells in the septic group; low density of NK and TCD4+ cells in the leptospirosis and septic groups; low quantities of TCD8+ cells in the septic group; high density of CD20+ cells in the leptospirosis and septic groups; high expression of TNF in the leptospirosis group and a strong expression of IL-10 in the leptospirosis and sepsis groups. The expression of IL-6, IFN, IL-1 and IL-2r was insignificant in all groups. IL-12 was only expressed in the red pulp of leptospirosis cases. Conclusion: similar to patients with septic shock, cases of severe leptospirosis (with pulmonary hemorrhage and shock) are associated with a splenic diffuse endothelial dysfunction, splenitis and signs of splenic disturbance in the innate and adaptative immunity in situ, characterized by an low density of NK cells, TCD4+ cells and low expression of IL-6, IL-1, IL-2r, IFN and IL-12 with a high expression of IL-10. These results suggest that an immunosuppressive state develops in the hosts immune response at the terminal stage of severe leptospirosis with pulmonary hemorrhage and shock. Also, the presence of leptospiral antigens in the spleen of the leptospirosis patients suggests the ethyological agent contributes directly to the pathogenesis of the lesions

Los objetivos de este trabajo han sido estudiar la expresión de receptores de células NK (NKR), en particular CD94/NKG2C, en relación con la infección por citomegalovirus humano (HCMV). Los resultados descritos constituyen la primera evidencia de que la infección por HCMV modifica el repertorio de NKR. El incremento en la proporción de células CD94/NKG2C+ en donantes seropositivos para HCMV sugiere que participan en la respuesta al patógeno. El receptor CD94/NKG2C no sólo estimula las funciones efectoras y la proliferación de las células NK, sino que también activa a una subpoblación minoritaria de células T CD8+. El estudio de la expansión in vitro de la subpoblación NK CD94/NKG2C+ tras la interacción con fibroblastos infectados por el HCMV, sugiere que el propio receptor está implicado en la proliferación. / The main goals of this work have been to study the influence of human cytomegalovirus (HCMV) infection on the NK cell receptor (NKR) repertoire, mainly on the CD94/NKG2C receptor. Our observations provide a first evidence indicating that human cytomegalovirus (HCMV) may selectively shape the NKR repertoire. The increased proportions of NKG2C+ cells in HCMV-seropositive donors suggest a role in the response against the virus. The CD94/NKG2C receptor triggers the effector functions and proliferation not only in NK cells but also in a subset of CD8+ T lymphocytes. The stimulation of PBL from HCMV+ donors with virus-infected fibroblasts elicited a preferential expansion of CD94/NKG2C+ NK cells; studies carried out in this experimental system suggest that the receptor is involved in driving the proliferation.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-17T18:25:36Z No. of bitstreams: 1 Tese Isabela.pdf: 1865877 bytes, checksum: cbd1986b7bda4dc09057f53feeaa35b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-05-02T12:43:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Isabela.pdf: 1865877 bytes, checksum: cbd1986b7bda4dc09057f53feeaa35b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T12:43:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Isabela.pdf: 1865877 bytes, checksum: cbd1986b7bda4dc09057f53feeaa35b2 (MD5) / A hepatite C crônica (HCC) é um problema de saúde mundial, sendo uma das principais causas de transplantes de fígado. A maioria dos indivíduos infectados desenvolve a infecção crônica. Muitos trabalhos têm relatado a ocorrência de desregulação na resposta imune durante a infecção pelo HCV, o que implica na persistência viral. Alguns mecanismos de escape foram sugeridos, como: mascaramento de epítopos, interferência viral nas vias de sinalização de IFN e da resposta imune inata, exaustão e anergia de células T, supressão de resposta imune por ação das células T regulatórias ou ação de citocinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imune celular em portadores de hepatite C crônica antes e na 12ª semana de tratamento com interferon-α mais ribavirina. Este trabalho foi dividido em dois artigos. No primeiro artigo foi investigada a frequência de subpopulações de linfócitos no sangue periférico de portadores de HCC não tratados e após 12 semanas de tratamento antiviral com IFN-α e ribavirina. Uma elevada frequência de células B e frequências baixas de células T CD8+ e células NK foram encontrados nos indivíduos não tratados, mas não houve alteração nas frequências de células T CD4+ e células Tregs. Porém, portadores de HCC que tiveram positividade para crioglobulinas possuíam baixa frequência de células Treg CD4+CD25+FoxP3+ em comparação aos pacientes sem essas manifestações extra-hepáticas. Não houve diferença na frequência das subpopulações de linfócitos entre os portadores de HCC antes e na 12ª semana do tratamento duplo, mas houve aumento da frequência de células NK em pacientes com resposta virológica precoce. No segundo trabalho foi avaliada a produção das citocinas imunorregulatórias (IL-10 e TGF-β) e as relacionadas à resposta antiviral (IL-2 e IFN-γ) por células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de portadores de HCC estimuladas com fitohemaglutinina e antígenos do HCV (core, NS3, NS4 e NS5), antes e na 12ª semana de tratamento antiviral com interferon e ribavirina. Foi demonstrado que o estímulo das CMSP desses pacientes com antígeno HCV-core causou um aumento na produção de IL-2, redução na produção de IFN-γ e produção aumentada de IL-10. Antígenos HCV-NS3 e HCV-NS5 estimularam apenas a produção de IL-10. Os antígenos do HCV não estimularam a produção de TGF-β pelas CMSP, e houve uma relação entre os níveis desta citocina e a carga viral do HCV dos pacientes antes do tratamento. Conclui-se que a resposta imune nos portadores de HCC está alterada, demonstrado pela diminuição na frequência de células CD8+ e NK, e pela aumentada produção de IL-10, baixa produção de IL-2 e IFN-γ provocada pelos antígenos virais. / Chronic hepatitis C (HCC) is a global health problem and a cause of liver transplants. Most infected individuals develop chronic infection. Altered immune response to hepatitis C virus (HCV) infection can be demonstrated in patients with chronic hepatitis C (CHC), which implies the viral persistence. Some escape mechanisms have been suggested, such as: masking epitopes, viral interference in the IFN signaling pathway and innate immune response, exhaustion and anergy of T cells response, suppression of immune response by action of regulatory T cells or action of cytokines. The aim of this study was to evaluate the cellular immune response in patients with chronic hepatitis C before and after 12 weeks of treatment with interferon-α plus ribavirin. This study has been divided into two papers. The first paper investigated the frequency of blood lymphocyte subsets in untreated HCV patients and after 12 weeks of antiviral treatment with IFN-α plus ribavirin. A high frequency of B cells and low frequencies of both CD8+ T cells and NK cells were found in untreated patients, but there was no change in the frequency of CD4 + T cells and Treg cells. However, patients with cryoglobulinemia had a lower frequency of CD4+CD25+FoxP3+ Treg cells compared to patients without these extrahepatic manifestations. There was no difference in the frequency of blood lymphocyte subsets among patients with HCC before and after 12 weeks of antiviral treatment, but there was an increase in the frequency of NK cells in patients with early virological response. The second study evaluated the production of immunoregulatory cytokines (IL-10 and TGF-β) and associated antiviral response (IL-2 and IFN-γ) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from CHC patients stimulated with Phytohemagglutinin (PHA) and HCV antigens (core, NS3, NS4 e NS5), before and at 12 weeks of antiviral treatment with interferon plus ribavirin. It has been shown that stimulation of the PBMC of patients with HCV core antigen caused an increase in IL-2 production, reduction in IFN-γ and increased in IL-10 production. HCV-NS3 e HCV-NS5 antigens only stimulated IL-10 production. The HCV antigens did not stimulate TGF-β production. There was a relationship between the levels of this cytokine and the HCV viremia of the patients before treatment. In conclusion, the immune response in patients with HCC is disrupted, demonstrated by decrease in the frequency of CD8 +T cells and NK cells, and the increased production of IL-10, low IL-2 and IFN-γ production induced by the viral antigens.

Grado de magíster en ciencias biológicas, mención inmunología / La endometriosis es una enfermedad inflamatoria benigna que se caracteriza por la presencia y crecimiento de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina (ectópico), cuya etiología y fisiopatología permanece aún sin aclarar. Se ha demostrado que el endometrio eutópico de mujeres con endometriosis exhibe alteraciones moleculares, indicando que el defecto primario se encontraría en este tejido. Por otro lado, la desregulación del sistema inmune permite que las células endometriales que han llegado a la cavidad pélvica escapen de la vigilancia inmune, se implanten y proliferen, lo que favorece la formación de las lesiones ectópicas endometriales. Las células Natural Killer (NK) son linfocitos que participan en la inmunovigilancia y poseen un receptor de activación denominado NKG2D, el cual interactúa con diferentes ligandos (NKG2DL) expresados por células bajo estrés celular. Las interleuquinas (IL)-10 e IL-12 juegan un rol importante en la función inmunoreguladora, la cual involucra a macrófagos, linfocitos T y NK. Los niveles de NKG2DL, IL-10 e IL-12 en células endometriales del endometrio eutópico de mujeres con endometriosis no han sido estudiados hasta la fecha. Por lo tanto, en este trabajo, propusimos la siguiente hipótesis: “Durante el ciclo menstrual, en el endometrio eutópico de mujeres con endometriosis, los niveles de los ligandos del receptor NKG2D, activadores de las células Natural Killer (NK), se encuentran disminuidos, así como las citoquinas IL-10 e IL-12, lo que contribuye a la alterada respuesta inmunológica descrita en esta patología”. Para ello, se caracterizaron los niveles transcripcionales y la presencia de los ligandos MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 y ULBP-3 y de IL-10 e IL-12 en el endometrio eutópico de mujeres con y sin endometriosis durante el V ciclo menstrual, así como se evaluó el efecto del estradiol y prostaglandina E2 en células endometriales aisladas de pacientes y controles, simulando el microambiente estrogénico e inflamatorio descrito en el endometrio de las pacientes con endometriosis. Se evaluaron los niveles de mRNA por RT-PCR y los niveles proteicos por inmunohistoquímica (IHQ) y citometría de flujo. Se detectó la expresión de todos los NKG2DL estudiados, tanto al nivel de mRNA como proteico, en ambos grupos de endometrios durante el ciclo menstrual, encontrándose que los niveles de MICA aumentaron en la fase secretora media y tardía en el grupo control, pero su expresión no presentó diferencia significativa durante el ciclo menstrual de las pacientes. En contraste, la expresión de MICB aumentó en la fase secretora inicial, disminuyendo fuertemente al final del ciclo en las mujeres con endometriosis. Los niveles de mRNA de ULBP-3 fueron significativamente mayores en el endometrio eutópico de las pacientes comparado al grupo control durante la fase secretora media, mientras que los niveles de ULBP-2 aumentaron gradualmente hacia las etapas finales del ciclo menstrual en ambos grupos, y los niveles de ULBP-1 no se modificaron durante el ciclo menstrual. Muy bajos niveles de mRNA de IL-12p40 fueron detectados en el endometrio control durante el ciclo menstrual, a diferencia del endometrio de fase secretora media de endometriosis, cuyos niveles fueron significativamente mayores que el grupo control. Por el contrario, la proteína IL-12 fue localizada en forma focal, aumentando su presencia solamente en el endometrio control secretor tardío. En forma similar, los niveles de la proteína IL-10 aumentaron significativamente en el compartimiento estromal control de la fase secretora tardía, y disminuyó en endometriosis en comparación al grupo control. En células VI epiteliales aisladas de ambos grupos, se detectaron, al nivel proteico y transcripcional, los NKG2DL estudiados, encontrándose disminuidos en endometriosis comparados al grupo control. La presencia de estradiol y/o prostaglandina no modificó el nivel de mRNA de ningún ligando estudiado. En síntesis, hemos caracterizado, por primera vez, la expresión de los NKG2DL MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 y ULBP-3 en el endometrio normal y patológico durante el ciclo menstrual. El aumento sostenido de los niveles de MICA y ULBP-2 hacia la fase secretora tardía sugiere una mayor activación de células NK en el tejido pre-menstrual normal que coincide con una reducida expresión de MICB en endometriosis. Por otro lado, la expresión diferencial de ULBP-3 e IL-12 en los endometrios secretores de endometriosis, además de la fuerte disminución en la expresión de IL-10 en la fase secretora tardía, podrían estar favoreciendo la implantación ectópica de los debris endometriales que arriban a la cavidad pélvica. Estos resultados sugieren que los ligandos del receptor NKG2D, principalmente MICA y ULBP-2, como también IL-10 e IL-12, jugarían un papel importante en las etapas finales del ciclo menstrual, período en que el endometrio experimenta una exhaustiva remodelación, preparándose para la acogida embrionaria o, en su defecto, para su eliminación a través de la menstruación. Las diferencias observadas en el endometrio de mujeres con endometriosis podrían explicar, al menos en parte, la infertilidad, como también la capacidad del tejido menstrual de escapar a la inmunovigilancia, como ha sido descrito en estas pacientes. / Endometriosis is a benign inflammatory disease characterized by the presence and growth of endometrial tissue outside the uterus (ectopic), whose etiology and pathophysiology still remains unclear. It has been shown that the eutopic endometrium of women with endometriosis exhibits molecular alterations, indicating that the primary defect would be present in this tissue. On the other hand, deregulation of the immune system allows the endometrial cells that have reached the pelvic cavity to escape immune surveillance, which favors their implantation and proliferation, resulting in ectopic endometrial lesions. Natural Killer (NK) cells are innate lymphocytes that participate in immune surveillance. They express the activating receptor NKG2D, which interacts with different ligands (NKG2DL) on nucleated cells under cell stress. Interleukin (IL)-10 and IL-12 play a role in the immune regulatory function involving macrophages, T lymphocytes and NK cells. To date, the levels of NKG2DL, IL-10 and IL-12 on endometrial cells of the eutopic endometrium of women with endometriosis have not been described. Therefore, here we proposed the following hypothesis: "During the menstrual cycle, in the eutopic endometrium of women with endometriosis, the ligands of the NKG2D receptor, which activate natural killer (NK) cells, are decreased, as well as the cytokines IL-12 and IL-10, which contribute to the altered immune response described in this pathology". For this purpose, the transcriptional levels and the presence of MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 and ULBP-3 ligands and IL-10 and IL-12 were characterized in the eutopic endometrium of women with and without endometriosis during the menstrual cycle. We also evaluated the effect of estradiol and prostaglandin E2 in isolated endometrial cells from patients and controls, simulating the estrogenic and inflammatory microenvironment described in the endometrium of patients with endometriosis. The mRNA levels were evaluated by RT-PCR and the presence of proteins was assessed by immunohistochemistry (IHC) and flow cytometry. Both, mRNA and protein of all NKG2DL studied were detected in both groups of endometria during the menstrual cycle. MICA levels increased in the mid and the late secretory phases only in the endometrium of control individuals, although its expression did not show significant difference during all phases of the menstrual cycle in patients with endometriosis. In contrast, MICB expression increased in the early secretory phase and fell sharply in the late secretory phase only in the endometrium of women with endometriosis. The mRNA levels of ULBP-3 were significantly higher in the eutopic endometrium from patients compared to controls during the mid-secretory phase. In addition the mRNA levels of ULBP-2 gradually increased towards the end of the menstrual cycle, while ULBP-1 did not change during the menstrual cycle in both groups of individuals. Very low levels of IL-12p40 mRNA were detected in the control endometrium during the menstrual cycle, which differed from the mid secretory phase in the endometrium of women with endometriosis, which presented significantly higher IL-12p40 messenger levels than the control group. In contrast, IL-12 protein levels were focally localized in the endometrial tissue, and its expression increased significantly only in the late secretory control endometrium. Similarly, the IL-10 protein increased significantly in the late secretory phase in the control stromal and epithelial compartments, whereas its levels reduced significantly in endometriosis compared to the control group in the same menstrual cycle phase and tissue compartments. IL-10 mRNA levels were not detected in any endometrium. We detected the expression of all NKG2DL studied both, at the mRNA and protein levels, in epithelial cells isolated from the endometrium of both groups However, the transcripts and protein levels of these ligands were decreased in endometriosis compared to the control group. The presence of estradiol and/or prostaglandin did not affect the level of mRNA of any ligand studied. In summary, we have characterized, for the first time, the expression of the NKG2DL MICA, MICB, ULBP-1, ULBP-2 and ULBP-3 in normal and pathological endometrium during the menstrual cycle. The sustained increase in MICA and ULBP-2 expression towards the late secretory phase suggests a greater activation of NK cells in the healthy premenstrual tissue, which coincides with a reduced expression of MICB in endometriosis. On the other hand, the differential expression of ULBP-3 and IL-12 observed in the secretory endometrium of women with endometriosis, in addition to the sharp decline in IL-10 expression observed in the late secretory phase in these patients, may favor the ectopic implantation of endometrial debris that reach the pelvic cavity. These results suggest that NKG2D receptor ligands, mainly MICA and ULBP-2, as well as IL-10 and IL-12 play an important role in the final stages of the menstrual cycle, during which the endometrium undergoes extensive remodeling preparing for embryo implantation or otherwise for disposal through menstruation. The results obtained herein in relation to the endometrium of women with endometriosis may partially explain infertility, as well as the ability of the menstrual tissue to escape immune surveillance, as described in these patients.