O saco vitelino é o único anexo embrionário presente em todas as espécies dos embriões vertebrados, répteis, aves e mamíferos. Em mamíferos domésticos o saco vitelino é inicialmente grande, pois nestas espécies ele é transitório. Após a implantação, surge no mesênquima lateral à notocorda agrupamentos de células, denominados ilhotas sanguíneas, que representam os progenitores dos sistemas vascular e hematopoético: os hemangioblastos. Os hemangioblastos centrais das ilhas sanguíneas formam as primeiras células-tronco hematopoéticas, enquanto os hemangioblastos periféricos se diferenciam em angioblastos, os precursores dos vasos sanguíneos. O desenvolvimento inicial da atividade hematopoética no saco vitelino conduz a hipótese de que esse tecido é o local primário de desenvolvimento hematopoético e que as células-tronco derivadas dele semeiam os outros sítios intraembriônicos. Foi possível observar nas análises microscópicas que realmente existe uma relação entre ambas linhagens. Nas análises de expressão gênica, alguns genes expressos pelo hemangioblasto apresentaram alta expressão nas análises D+0 e outros genes também específicos do hemangioblasto, porém em estágios secundários de diferenciação como os encontrados na região aórtica, a nível de endotélio hemogênico apresentaram altos níveis de expressão após 3 dias em cultivo. Concluímos portanto, que o saco vitelino por ser o local primário de formação das células sanguíneas e endoteliais nos estágios iniciais da embriogênese, por serem primitivas e, portanto não expressarem marcadores de células maduras na sua superfície, tornam estas células uma importante fonte de células-tronco relevante para a Terapia Celular para hemofilia e muitas outras doenças humanas. / The yolk sac is the single attachment embryo present in all species of vertebrate embryos, reptiles, birds and mammals. In domestic mammals the yolk sac is initially large, since these species it is transient. After implantation, appears in the lateral mesenchyme to the notochord cell clusters, called \"blood islands\" that represent the progenitors of vascular and hematopoietic systems: the hemangioblasts. The central islands hemangioblasts form the first blood hematopoietic stem cells, while peripheral hemangioblasts, the angioblastic differentiate into the precursors of blood vessels. The initial development of the yolk sac hematopoietic activity leads to the hypothesis that this tissue is the primary site of development and that hematopoietic stem cells derived from them sow other intraembryos sites. It was observed in the microscopic analysis that there is indeed a relationship between the two lineages. In the analysis of gene expression, some genes expressed by hemangioblasts showed high expression in D+0 and other specific genes also hemangioblasts, but in secondary stages of differentiation as found in the aortic region, the level of hemogenic endothelium showed high levels of expression after 3 days in culture. We therefore conclude that the yolk sac to be the primary site of formation of blood and endothelial cells in the early stages of embryogenesis, for its cells be primitive and therefore do not express markers of mature cells on the surface, these cells become an important source of cells relevant to stem cell therapy for hemophilia and many other human diseases.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-09-25T12:22:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Brunno Câmara Lopes Costa - 2018.pdf: 3761382 bytes, checksum: 9df697870cea1a53a75ea6dad69c9e91 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-09-26T11:34:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Brunno Câmara Lopes Costa - 2018.pdf: 3761382 bytes, checksum: 9df697870cea1a53a75ea6dad69c9e91 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-26T11:34:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Brunno Câmara Lopes Costa - 2018.pdf: 3761382 bytes, checksum: 9df697870cea1a53a75ea6dad69c9e91 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Human Bocavirus (HBoVs) are classified in the Parvoviridae family and are associated with respiratory and gastrointestinal symptoms. Viral infections are an important cause of morbimortality in immunocompromised patients such as allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) recipients. The aim of the present study was to evaluate the positivity rate and loads of HBoVs in clinical samples (feces and sera) of patients who were subjected to allo-HSCT at a reference center for bone marrow transplantation in Goiânia, Goiás. A total of 105 fecal samples and 145 sera samples were collected from 21 consecutive patients, during October 2012 to October 2014. Samples were screened by qPCR TaqMan assay, with specific probe and primers targeting all HBoVs genotypes (HBoV-1 to -4), and viral loads were determined using serial dilutions of a recombinant plasmid, targeting the NP1 gene. The results showed that 53.4% (11/21) of the patients were male, aged between four and 61 years-old (mean 35 years). The most observed hematologic malignancy was myeloid leukemia (acute or chronic), accounting for 57.1% (12/21) of the cases. The HBoVs were detected in 42.9% (9/21) of the patients and 77.7% (7/9) were positive in both fecal and serum samples. The viral load in fecal samples were higher than in the sera samples and a prolonged fecal shedding were observed, with two patterns: one intermittent and another continuous. Of all HBoV positive patients, six (66.6%) had the first positive sample before the transplantation, and a rise of the viral loads after the allo-HSCT occurred when comparing to the loads before the allo-HSCT. Furthermore, on most cases the highest viral loads were detected during the first 100 days after the allo-HSCT. Considering the symptoms presented by the patients, 66.6% (6/9) had diarrhea at the same period of the viral genome detection in feces, but no statistical significance was observed. Three fecal samples were characterized as being HBoV-1, with more than 99% of nucleotide identity among them. The present data shows a high occurrence and loads of HBoVs in allo-HSCT recipients, with first positivity in fecal samples and later viral detection in sera. These results suggest that fecal samples could be the sample of choice in HBoV monitoring of these patients both before and after the transplant. / Os Bocavírus humanos (HBoVs) pertencem à família Parvoviridae e têm sido associados a sintomas respiratórios e gastroentéricos. As infecções virais são uma importante causa de morbimortalidade em pacientes imunocomprometidos, como os pacientes submetidos a transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas (TACPH). Dados sobre a ocorrência de HBoV nesses pacientes ainda são escassos. Os objetivos deste estudo foram avaliar a frequência e a carga de HBoVs em amostras clínicas (fezes e soro) de pacientes submetidos a TACPH e avaliar as características gerais e sintomas apresentados, e caracterizar as amostras positivas. Foram incluídos no estudo 21 pacientes consecutivos, dos quais foram coletadas 105 amostras fecais e 145 amostras de soro, em um centro de transplante de medula óssea em Goiânia, Goiás, durante o período de outubro de 2012 a outubro de 2014. As amostras foram testadas por qPCR TaqMan®, com sonda e iniciadores específicos para todos os genótipos de HBoVs (HBoV-1 a -4), e a carga viral nas amostras foi determinada pela construção de uma curva padrão de diluições seriadas de um plasmídeo recombinante, contendo como inserto a região NP1. Os resultados mostraram que 53,4% (11/21) dos pacientes eram do sexo masculino, com idade entre quatro e 61 anos de idade (mediana 35 anos). A neoplasia hematológica mais observada foi a leucemia mieloide (aguda e crônica), totalizando 57,1% (12/21) dos casos. Os HBoVs foram detectados em 42,9% (9/21) dos pacientes, sendo que em 77,7% (7/9) desses houve positividade em ambas amostras de soro e fezes. A carga de HBoV nas amostras fecais foi significativamente maior do que nas amostras séricas, sendo observado dois padrões principais de excreção nas fezes, um intermitente e outro contínuo. Dos nove pacientes, seis (66,6%) tiveram a primeira amostra positiva antes de serem submetidos ao transplante, sendo observado aumento nas cargas de HBoV pós-TACPH em comparação às cargas pré-TACPH e, na maioria dos casos, os picos da carga viral foram detectados durante os 100 primeiros dias após o TACPH. Considerando os sintomas apresentados pelos pacientes, 66,6% (6/9) desses apresentavam diarreia no mesmo período da detecção de HBoV nas amostras fecais, porém não houve significância estatística entre a positividade e os sintomas gastroentéricos. Três amostras fecais foram caracterizadas como sendo o genótipo HBoV-1, com mais de 99% de identidade nucleotídica entre elas. Os dados apresentados mostram uma alta ocorrência e elevada carga de HBoVs nos pacientes submetidos ao TACPH, além de detecção inicial nas fezes com posterior positividade no soro. Esses resultados sugerem que as fezes poderiam ser a amostra clínica de escolha para o monitoramento desses pacientes, tanto antes quanto após o transplante.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-29T11:10:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Hugo César Pereira Santos - 2015.pdf: 3535564 bytes, checksum: 4fc7d88b1da6008bc42c01f46e4f8d7a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-29T11:20:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Hugo César Pereira Santos - 2015.pdf: 3535564 bytes, checksum: 4fc7d88b1da6008bc42c01f46e4f8d7a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T11:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Hugo César Pereira Santos - 2015.pdf: 3535564 bytes, checksum: 4fc7d88b1da6008bc42c01f46e4f8d7a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The human adenoviruses (HAdV) infect people of all ages worldwide, causing a wide range of clinical syndromes, depending on the viral type. In immunocompromised hosts, as transplanted patients, HAdV infection can result in a bad prognosis. Some aspects of viral pathogenesis, such as the association between viremia and/or viral load with disseminated disease and the optimal moment to start the therapy, are still not well established in adult patients that have undergone allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (ASCT). Therefore, the main objective of this study was to monitor ASCT recipients for HAdV occurrence, and also correlate viral positivity, viral load and molecular variant with clinical symptoms and patients’ prognosis. For this, stool and serum from 21 patients were monitored in a 2 years period (from October/2012 to October/2014). Serum and fecal samples were screened by Nested-PCR, using primers targeting a partial region of the hexon gene (143bp). Fecal samples were further screened by a commercial enzyme immunoassay (EIA). In total, 57% of the patients had at least one positive sample (serum or stool) for HAdV. Patients presented high viral load (varying from 7,7x103 to 2x108 copies/mL), with a higher viral load in stool when compared to serum. Positive samples were submitted to genomic sequencing, revealing the occurrence of HAdV from C, D and F species. The main clinical symptom presented by infected patients was diarrhea, and graft-versus-host disease was the main intercurrence; however it was not possible to directly associate viral positivity to cause of death. We hope to contribute for a better understanding of the HAdV infection pattern in patients submitted to ASCT. Our data highlights the importance of the inclusion of HAdV testing in the routine laboratory exams of this group of patients. / Os adenovírus humanos (HAdV) podem infectar pessoas de todas as idades, causando uma ampla gama de quadros clínicos. Em pacientes imunocomprometidos, como os indivíduos que receberam transplante, a infecção por esses vírus pode resultar em pior prognóstico para o paciente. Determinados aspectos da patogenia viral, como a associação entre viremia e/ou carga viral com a doença disseminada, bem como o melhor momento para o início da terapia, não estão ainda bem esclarecidos em pacientes que foram submetidos ao transplante de células progenitoras hematopoiéticas (TACPH), principalmente em indivíduos adultos. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi realizar o monitoramento da infecção por HAdV e a caracterização molecular das variantes virais em pacientes submetidos ao TACPH, bem como determinar a carga viral e correlacionar a infecção com o quadro clínico e prognóstico dos pacientes. Foram analisadas amostras de soro e fezes de 21 pacientes submetidos ao TACPH no período de dois anos (de outubro/2012 a outubro/2014). As amostras de fezes foram triadas por ensaio imunoenzimático e por Nested-PCR, enquanto as amostras de soro foram triadas somente por Nested-PCR de uma região parcial do gene hexon (produto esperado de 143 pb). Foram detectadas amostras positivas de soro e/ou fezes de 57% dos pacientes. De forma geral, os pacientes do presente estudo apresentaram elevadas cargas virais (variando de 7,7x103 à 2x108 CG/mL), que foram mais elevadas nas fezes. As amostras positivas foram submetidas ao sequenciamento genômico e resultados revelaram a ocorrência de adenovírus das espécies C, D e F. O principal quadro clínico apresentado pelos pacientes foi a diarreia e a principal intercorrência observada, a doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Dez pacientes foram a óbito durante o período de estudo, entretanto, não foi possível associar a infecção por HAdV diretamente à causa mortis. Esperamos que os dados obtidos possam auxiliar no melhor entendimento do padrão da infecção dos HAdVs em pacientes submetidos ao TACPH, de forma a contribuir para que a pesquisa de adenovírus seja incluída na rotina de exames desses pacientes.

O saco vitelino é o único anexo embrionário presente em todas as espécies dos embriões vertebrados, répteis, aves e mamíferos. Em mamíferos domésticos o saco vitelino é inicialmente grande, pois nestas espécies ele é transitório. Após a implantação, surge no mesênquima lateral à notocorda agrupamentos de células, denominados ilhotas sanguíneas, que representam os progenitores dos sistemas vascular e hematopoético: os hemangioblastos. Os hemangioblastos centrais das ilhas sanguíneas formam as primeiras células-tronco hematopoéticas, enquanto os hemangioblastos periféricos se diferenciam em angioblastos, os precursores dos vasos sanguíneos. O desenvolvimento inicial da atividade hematopoética no saco vitelino conduz a hipótese de que esse tecido é o local primário de desenvolvimento hematopoético e que as células-tronco derivadas dele semeiam os outros sítios intraembriônicos. Foi possível observar nas análises microscópicas que realmente existe uma relação entre ambas linhagens. Nas análises de expressão gênica, alguns genes expressos pelo hemangioblasto apresentaram alta expressão nas análises D+0 e outros genes também específicos do hemangioblasto, porém em estágios secundários de diferenciação como os encontrados na região aórtica, a nível de endotélio hemogênico apresentaram altos níveis de expressão após 3 dias em cultivo. Concluímos portanto, que o saco vitelino por ser o local primário de formação das células sanguíneas e endoteliais nos estágios iniciais da embriogênese, por serem primitivas e, portanto não expressarem marcadores de células maduras na sua superfície, tornam estas células uma importante fonte de células-tronco relevante para a Terapia Celular para hemofilia e muitas outras doenças humanas. / The yolk sac is the single attachment embryo present in all species of vertebrate embryos, reptiles, birds and mammals. In domestic mammals the yolk sac is initially large, since these species it is transient. After implantation, appears in the lateral mesenchyme to the notochord cell clusters, called \"blood islands\" that represent the progenitors of vascular and hematopoietic systems: the hemangioblasts. The central islands hemangioblasts form the first blood hematopoietic stem cells, while peripheral hemangioblasts, the angioblastic differentiate into the precursors of blood vessels. The initial development of the yolk sac hematopoietic activity leads to the hypothesis that this tissue is the primary site of development and that hematopoietic stem cells derived from them sow other intraembryos sites. It was observed in the microscopic analysis that there is indeed a relationship between the two lineages. In the analysis of gene expression, some genes expressed by hemangioblasts showed high expression in D+0 and other specific genes also hemangioblasts, but in secondary stages of differentiation as found in the aortic region, the level of hemogenic endothelium showed high levels of expression after 3 days in culture. We therefore conclude that the yolk sac to be the primary site of formation of blood and endothelial cells in the early stages of embryogenesis, for its cells be primitive and therefore do not express markers of mature cells on the surface, these cells become an important source of cells relevant to stem cell therapy for hemophilia and many other human diseases.

Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). Desde o surgimento desta tecnologia diversos modelos animais foram gerados, ampliando as possibilidades de seu uso na pesquisa, como por exemplo, na criação de modelos para doenças genéticas humanas como esclerose lateral amiotrófica, autismo, esquizofrenia, doença de Parkinson e Alzheimer, além do aprimoramento de características relevantes para produção animal. O modelo suíno é considerado vantajoso sobre os outros modelos animais principalmente pela criação já bem estabelecida e similaridades fisiológicas com os humanos. O intuito deste projeto foi reprogramar fibroblastos embrionários suínos através do sistema integrativo à iPSCs, para então diferenciá-las em células progenitoras neurais (neural progenitor cells, NPCs). Para isso, os fibroblastos foram transduzidos com vetores contendo sequencias humanas ou murinas dos genes OCT4, SOX2, c-Myc e KLF4 (hOSKM ou mOSKM) para formação das iPSCs. Estas foram caracterizadas quanto a morfologia, presença de fosfatase alcalina, a expressão dos genes exógenos e endógenos (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) através de imunofluorescência e RT-qPCR e formação de corpos embrióides. Então foram submetidas durante 14 dias ao meio de indução neural sob matriz extracelular comercial, gerando células potencialmente similares às NPCs. Estas foram caracterizadas morfologicamente, por imunofluorescência das proteínas NESTINA, BETA TUBULINA III e VIMENTINA, além da expressão de NESTINA e GFAP por RT-qPCR. Foram produzidas com sucesso 3 linhagens de iPSC em diferentes estágios de reprogramação e células positivas para todos os marcadores neurais testados. Os resultados apresentados deverão contribuir para a utilização do modelo suíno em futuros estudos voltados à medicina regenerativa e translacional. / In 2006, Takahashi and collaborators reported the induction into pluripotency of somatic cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs). Since then, this technique has much been developed; many animal models have been created opening a new series of opportunities in research. They enable the creation of models for human genetic diseases, for example, amyotrophic lateral sclerosis, autism, schizophrenia, Parkinson´s disease, Alzheimer´s disease and the enhancement of relevant characteristics in agriculture. The swine model is considered to present many advantages over others, including the well-known production and maintenance and physiological similarities to humans. The aim of this project was to reprogram porcine embryonic fibroblasts (pEF) into iPSCs using the lentiviral integrative system, followed by its differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The cells were reprogrammed using vector containing either the human sequences (hOSKM) or the mouse sequences (mOSKM) for the OCT4, SOX2, c-Myc and KLF4 genes to form the iPSCs. They were characterized regarding the presence of the Alkaline Phosphatase enzyme, expression of exogenous and endogenous genes (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) through immunofluorescence and RT-qPCR, and embryoid body formation. Then, the cells were cultured with neural induction media for 14 days in commercial extracellular matrix, generating cells potentially like NPCs. Those were characterized regarding their morphology, immunofluorescence for NESTINA, BETA TUBULIN III and VIMENTINA and gene expression of NESTINA and GFAP. iPSCs were successfully reprogramed, generating 3 cell lines at different stages of reprograming and cells positive for all the neural markers tested were produced. The results shown will contribute to the use of the porcine model in future regenerative and translational medicine research.

O treinamento físico aeróbio (TF) tem sido utilizado como um importante tratamento não farmacológico da hipertensão arterial (HA), uma vez que ele corrige a rarefação microvascular e reduz a pressão arterial; entretanto, os mecanismos envolvidos são pouco conhecidos. Investigamos se o número e a capacidade funcional das células progenitoras endoteliais (CPE) derivadas da medula óssea, sabidamente diminuídas na HA, melhoram pós TF, potencialmente contribuindo para a neovascularização e regressão da doença. O efeito do TF sobre a pressão arterial, freqüência cardíaca, tolerância ao esforço, consumo de oxigênio (VO2), morfologia e bioquímica da musculatura esquelética foram estudados em ratos espontaneamente hipertensos (SHR, n=28) e Wistar Kyoto (WKY, n=28) com 12 semanas de vida e divididos em 4 grupos: SHR, SHR treinado (SHR-T), WKY e WKY Treinado (WKY-T). O TF promoveu redução da pressão arterial em SHR e bradicardia de repouso acompanhado por um aumento da atividade da citrato sintase muscular, tolerância ao esforço e VO2 nos grupos de animais treinados. Concomitantemente, o TF corrigiu a alteração na distribuição dos tipos de fibra muscular e a rarefação capilar em SHR, mediado em grande parte por um aumento nos níveis protéicos periféricos de VEGF, VEGFR2, eNOS e a desativação das vias de apoptose. O número de CPE (CD34+/Flk1+) no sangue periférico (SP) analisadas por FACS foram aumentadas 115% no grupo WKY-T em comparação ao grupo controle. Em contraste, o grupo SHR reduziu 39% o número de CPE, entretanto o TF normalizou os níveis no grupo SHR-T. Resultado similar foi encontrado na quantificação das CPE na medula óssea (MO) avaliadas por células duplamente positivas para Di-acLDL e Lectina-FITC. A senescência das CPE na MO foi aumentada 126% no grupo SHR vs. WKY, e o TF foi eficiente em reduzir 72% este processo no grupo SHR-T. Além disso, os ensaios funcionais avaliados pelo número de unidades formadoras de colônia mostraram um aumento de 40% na MO e 70% no SP de WKY-T vs. WKY. Em contraste, a HA reduziu 35% na MO e 45% no SP este número de colônias vs. WKY, porém o TF corrigiu esta disfunção das CPE na HA. De fato, o TF recuperou a falha na formação de tubos como capilares sobre matrigel na HA. Os resultados demonstram que o remodelamento vascular acompanhado pela redução da pressão arterial induzido pelo TF na HA ocorreram em sinergia com a recuperação do número e das propriedades funcionais das CPE da MO e SP, bem como de seus fatores mobilizadores e angiogênicos. Estes resultados sugerem que o TF pode participar do reparo vascular por meio da ação das CPE, promovendo a revascularização periférica. Assim, há perspectiva do potencial terapêutico das CPE no tratamento da HA pós TF. / Aerobic exercise training (ET) has been established as an important non-pharmacological treatment for hypertension, since it counteracts microvascular rarefaction and decreased blood pressure; however, underlying mechanisms remain to be further determined. We investigated for the first time if the endothelial progenitor cells (EPC) number and the functional capacity, impaired in hypertension; are improved after ET potentially contributing to neovascularization and disease regression. The effect of ET on blood pressure, heart rate, exercise tolerance, peak VO2 and skeletal muscle morphology and biochemistry was studied in twelve-week old male Spontaneously Hypertensive Rats (SHR, n=28) and Wistar Kyoto (WKY, n=28) assigned into 4 groups: SHR, trained SHR (SHR-T), WKY and trained WKY (WKY-T). The ET promoted a decrease in blood pressure in SHR and resting bradycardia, an increase in exercise tolerance, peak VO2 and citrate synthase activity in trained groups. In parallel, the ET repaired the skeletal muscle fiber type shift and capillary rarefaction in SHR, at least partly, by enhancing protein levels of VEGF, VEGFR-2, eNOS and deactivated apoptosis pathway. Numbers of EPC (CD34+/Flk1+) in the peripheral blood (PB) quantified by FACS analysis were enhanced 115% in WKY-T of control levels. In contrast, the SHR group decreased 39%, but ET normalized in the SHR-T. Similar results were found in the EPC quantification of the bone marrow (BM) by double positive cells to Di-acLDL and Lectin-FITC. BM-EPC senescence was increased 126% in SHR and this process was reduced 72% by ET. Moreover, EPC functional assay by colony-forming units showed an increase of 40% to BM and 70% to PB in WKY-T of control levels. In contrast, the SHR group reduced 35% to BM and 45% to PB; however the ET repaired EPC dysfunction in hypertension. In fact, the ET corrected failure in the capillary-like tube formation on matrigel. The present findings reveal that the vascular remodeling accompanied by reduction of blood pressure induced by ET occurs in synergy with the restoration of the BM and PB- EPC number and functional properties, as well as of their mobilizing and angiogenic factors. These results suggest that the ET can participate in the vascular repair by means of the EPC, promoting the peripheral revascularization in hypertension. In this way, there is perspective of therapeutic potential of the EPC in treatment of hypertension after ET.

A utilização das células progenitoras hematopoéticas (CPH) obtidas do sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) apresenta vários benefícios para o transplante de CPH em comparação às células provenientes de outras fontes. Dentre eles, a maior disponibilidade e a maior imaturidade imunológica das CPH, o que permite certa flexibilidade nos critérios de compatibilidade entre doador e receptor e uma menor taxa de reação do enxerto-versus-hospedeiro. A legislação brasileira e órgãos internacionais exigem a realização de vários testes para garantir a qualidade do produto hemoterápico contendo CPH a ser transplantado. O objetivo deste estudo foi confirmar que o teste para quantificação de CPH com elevada atividade da enzima ALDH1(ALDHbr) pode ser considerado um teste de adequado ou seja, é capaz de predizer quais produtos tem melhor capacidade de repopular a medula óssea do recipiente após o transplante. Para isso, foram utilizadas 40 unidades de SCUP coletadas e processadas pelo Banco de Sangue de Cordão Umbilical e Placentário do Cetebio / Fundação Hemominas. As unidades foram processadas por método automatizado e amostras do creme leucocitário (buffy coat) foram coletadas para a realização da quantificação de células ALDHbr, quantificação de células CD34+, ensaio clonogênico (CFU), hemograma e cálculo do total de células nucleadas (TCN). A citometria de fluxo foi utilizada para a quantificação das CPH ALDHbr e CD34+ e das subpopulações CD45dim e CD38+. Outras informações como idade materna, idade gestacional e sexo do recém-nascido também foram coletadas para descrição das unidades. Para verificar a viabilidade da utilização do teste de ALDH pelos BSCUP foi realizado o levantamento do seu custo. A capacidade funcional das CPH em proliferar e se diferenciar em tecido hematopoético foi avaliada por meio do ensaio clonogênico. Detectou-se correlação entre a quantidade de células ALDHbr e o número de colônias no ensaio clonogênico (p<0,001), entre o número de células ALDHbr e de células CD34+ (p=0,001) e entre o número de colônias no ensaio clonogênico e o número de células CD34+ (p<0,001). A imunofenotipagem mostrou que 46,25% das células ALDHbr eram CD45dimCD38+CD34+. Os dados sugerem que a quantificação de células ALDHbr em unidades de SCUP pode ser considerada teste adequado, de baixo custo, de execução simples, rápida e menos dependente do operador em relação ao ensaio clonogênico. / The use of the umbilical cord blood cells presents numberless benefits when compared to the cells from different sources. Among them, the ease of availability, the bigger immunological immaturity, which allows some flexibility in the compatibility between donor and receptor and less induction of reaction of graft-versus-host. The Brazilian legislation and international organizations demand the practice of various tests to guarantee the quality of the product to be transplanted. The aim of this research was to confirm that the test used to quantify ALDHbr cells can be considered a power test, meaning that it tests the ability to repopulate the bone marrow after transplant. For this study, it has been used 40 units of SCUP collected and processed by the Cetebio Umbilical Cord Blood Bank - Fundação Hemominas. The units were processed by the automatized method and the samples of the final product (buffy coat) were collected for the quantification of ALDHbr cells, quantification of CD34+ cells, clonogenic essay (CFU), hemogram and the total number of nucleated cells (TNC). It was used the flow cytometry to perform ALDH and CD34+ tests. Besides that, it was also performed the association of antibodies anti-CD34, anti-CD45 and anti-CD38 for the immunophenotyping of the units. Other information such as maternal age, fertilization age and the newborn gender were also collected for description of the units. In order to verify the viability of the use of the ALDH test by BSCUP its costs were calculated, as well as of the clonogenic essay. The results showed a significant correlation between ALDHbr cells and the clonogenic essay (p<0.001), between ALDHbr and CD34+ cells (p=0,001) and between the clonogenic essay and the quantification of CD34+ cells (p<0,001). The immunophenotyping revealed that 46,25% of ALDHbr cells were CD45dimCD38+CD34+. The data indicated that the quantification of ALDHbr cells in the SCUP units can be considered a powerful and low cost procedure, of easier and quicker execution and less operator dependent.

Introdução. As células progenitoras hematopoéticas (CPH) têm sido utilizadas no tratamento de algumas doenças malignas hematológicas e de desordens hematopoéticas. Dentre estas células estão as CPHs provenientes de cordão umbilical e placentário (SCUP). Para coleta e armazenamento destas células foram criados os Bancos de Sangue de Cordão Umbilical e Placentário (BSCUP). No Brasil existe a rede BrasilCord e o BSCUP do Hemocentro de Ribeirão Preto é um dos que compõem esta rede. Objetivo. Avaliar a viabilidade financeira de um banco de sangue de cordão umbilical e placentário público comparando os custos de seus procedimentos com os valores ressarcidos definidos pela tabela SUS. Metodologia: Este estudo utilizou a metodologia de Custeio Baseado em Atividades (Activity-Based Costing - ABC), que procura reduzir as distorções provocadas pelo rateio arbitrário dos custos indiretos utilizando direcionadores de custos. Foram avaliados os custos diretos e indiretos da coleta, transporte, processamento, testagem e criopreservação de CPH proveniente de SCUP no primeiro semestre de 2015. Para os custos indiretos foram definidos os direcionadores de custo. Resultados Os resultados mostram que o BSCUP do Hemocentro de Ribeirão Preto foi deficitário no primeiro semestre de 2015. O déficit apurado por unidade foi de R$1.155,69 para o processamento semiautomatizado e R$1.703,78 para o processamento automatizado. O déficit total no período foi de R$ 100.376,50 quando 50 unidades foram processadas utilizando o método semiautomatizado e 25 pelo método automatizado. Conclusão. O valor ressarcido pelo SUS não cobre os gastos do BSCUP do Hemocentro de Ribeirão Preto. Isso pode ser atribuído a várias causas como: sistemática de pagamento pelo SUS apenas pelo produto criopreservado, elevados índices de rejeição das doadoras na maternidade e de descarte das unidades coletadas, embora este último seja menor que o descrito na literatura, e o custo do armazenamento em longo prazo. Os custos do BSCUP são menores que os descritos na literatura e poderiam ser reduzidos com melhorias de processos de gestão e aumento do número de unidades criopreservadas, bem como, por meio de descentralização de coletas para processamento centralizado. / Introduction. Hematopoietic progenitor cells (HPC) are being used in some hematologic malignancies and hematopoietic disorders treatment. Among these cells are the HPCs from umbilical blood cord (UCB). Umbilical cord blood banks were created to collect and store these cells. In Brazil there is a net called Brasilcord and the umbilical cord blood bank (UCBB)of the Hemocentro de Ribeirão Preto belongs to this net. Objective. To evaluate the financial viability of a public umbilical cord blood bank and compare the costs from its procedure with the values reimbursed defined by the SUS table. Methodology.This study used the ActivityBased Costing, which tries to reduce distortions caused by arbitrary apportionment of indirect costs using cost drivers. Direct and indirect costs of collection, transport, processing, testing and cryopreservation of HPCs from umbilical cord blood were evaluated. Cost drivers were defined for indirect costs. Results. The results showed that there was a deficit in the UCBB of the Hemocentro de Ribeirão Preto in the first semester of 2015. The deficit was R$1.155,69 when the unit was processed by the semi-automated method and R$1.703,78 when it was processed by an automated method. The total deficit in the period was R$100.376,50 as 50 units were processed by a semi-automated method and 25 by an automated method. Conclusion. The amount reimbursed by SUS does not cover the UCBB of Hemocentro de Ribeirão Preto expenses. This can be attributed to several causes such as: systematic of reimbursement used by SUS that only cryopreserved units are payed, high percentage of deferral in the maternity and of discard of collected units, although this latter is smaller than that described in the literature and the cost of storage of the units for long periods. The costs of UCBB are lower than that described in the literature and could be reduced with improvements in managing process and increase the number of cryopreserved units as well as decentralization of collections for centralizes processing.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-25T17:34:38Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Lucianna G. N. Lemes.pdf: 2661301 bytes, checksum: c0238e41dfbe2adbd10e5ddcff7a139e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-26T11:31:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação_Lucianna G. N. Lemes.pdf: 2661301 bytes, checksum: c0238e41dfbe2adbd10e5ddcff7a139e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-26T11:31:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Lucianna G. N. Lemes.pdf: 2661301 bytes, checksum: c0238e41dfbe2adbd10e5ddcff7a139e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-12-20 / The calicivirus (norovirus and sapovirus) are important etiologic agents of acute gastroenteritis. Recent studies show that in immunocompromised patients such as those undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), norovirus infection can lead to worsening of symptoms and be confused with clinical symptoms of graft versus host disease (GVHD). However, calicivirus screening is not performed, routinely, as part of the patients’ follow-up laboratory exams. The main objective of this study was to evaluate the occurrence of norovirus (NoV) and sapovirus (SaV) in patients who underwent HSCT, and to conduct the molecular characterization of the samples positive for these viruses. Fecal samples were collected weekly, and serum samples were obtained every two weeks of ten patients who underwent HSCT, for a minimum period of five months and a maximum of one year. The secretor status was determined by an enzyme immunoassay and the detection of calicivirus was performed by RT-PCR using primers specific for a partial region of the gene encoding the NoV genogroup I and II (GI and GII) and SaV capsid protein. The genomic sequencing was performed for positive samples. The results showed that from ten patients participating in the study, eight had diarrhea. Among these, six (60%) had positive samples for NoV, and all of them had a secretor phenotype. The duration of NoV excretion in feces ranged from five to 143 days. Viral RNA was also detected in serum specimens, ranging from 29 to 36 days in the five patients infected with NoV. Three of the six patients had acute intestinal GVHD. Through genomic sequencing and phylogenetic analysis all NoV-positive samples were characterized as genotype GI.3, and because they had a high nucleotide identity, they were all characterized as a single haplotype. The data highlight the urgent need of the inclusion of calicivirus screening in the routine testing performed before transplantation and during follow-up of these patients. This is the first report of the occurrence of NoV in patients undergoing HSCT in Brazil. / Os calicivírus (norovírus e sapovírus) são importantes agentes etiológicos da gastroenterite aguda. Estudos recentes mostram que em pacientes imunocomprometidos, como os submetidos a transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas (TACPH), a infecção por norovírus pode levar ao agravamento dos sintomas e ser confundida com quadro clínico da doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Entretanto, a triagem para calicivírus não é realizada, rotineiramente, como parte dos exames laboratoriais de acompanhamento destes pacientes. O principal objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de norovírus (NoV) e sapovírus (SaV) em pacientes que foram submetidos ao TACPH e proceder à caracterização molecular das amostras positivas para estes vírus. Foram obtidas amostras de fezes, coletadas semanalmente, e de soro, a cada quinze dias, de dez pacientes que realizaram o TACPH, por um período mínimo de cinco meses e máximo de um ano. O fenótipo secretor dos pacientes foi determinado utilizando um teste imunoenzimático e a pesquisa de calicivírus foi realizada pela RT-PCR, utilizando-se iniciadores específicos para uma região parcial do gene codificante para a proteína dos capsídeos dos NoV do genogrupo I e II (GI e GII) e dos SaV. Os amplicons das amostras positivas foram submetidos ao sequenciamento genômico e análise filogenética. Os resultados obtidos revelaram que de dez pacientes participantes do estudo, oito apresentaram diarreia e vômito. Dentre esses, seis (60%) apresentaram amostras positivas para NoV, sendo que todos foram identificados como secretores. O período de excreção de NoV nas fezes variou de cinco a 143 dias. Foi também detectado RNA viral nas amostras de soro, variando de 29 a 36 dias, em cinco pacientes infectados por NoV. Três, dos seis pacientes, apresentaram DECH aguda intestinal. Através do sequenciamento genômico e análise filogenética, todas as amostras positivas para NoV, de todos os pacientes, foram caracterizadas como genótipo GI.3 dos NoV, e como foi comprovada elevada identidade nucleotídica entre elas, foram caracterizadas como um único haplótipo. Os dados obtidos ressaltam a urgente necessidade da inclusão da pesquisa de calicivírus na rotina de exames realizados antes do transplante, bem como durante o acompanhamento destes pacientes. Este é o primeiro relato da ocorrência de NoV em pacientes submetidos ao TACPH no Brasil.

A causa mais frequente de surdez de herança autossômica recessiva são as mutações no lócus DFNB1, onde estão os genes GJB2 e GJB6. Dentre os indivíduos com deficiência auditiva associada a esse lócus, 10% a 50% apresentam uma única mutação recessiva no gene GJB2, frequência muito superior à esperada em função da frequência de heterozigotos na população geral. Apesar de alguns desses casos terem sido elucidados após a identificação de grandes deleções no gene GJB6 ou nas suas proximidades, a existência de muitos indivíduos com uma única mutação patogênica no gene GJB2 sugere que a haplo-insuficiência nesse gene possa interagir com outras mutações no mesmo gene, no gene GJB6 vizinho, ou até em outros genes. O objetivo desse estudo foi identificar novos alelos patogênicos, novas proteínas e novos genes que interagem com o lócus DFNB1, do ponto de vista molecular e celular, e que possam ser responsáveis por surdez de herança autossômica recessiva. Desse modo, pretendemos contribuir para o esclarecimento da patogênese da surdez de herança autossômica recessiva. Nesse trabalho, três tipos de estudos foram realizados, com metodologias próprias. Na primeira parte, buscamos identificar novos alelos patogênicos no lócus DFNB1 que poderiam ser responsáveis por surdez quando presentes em heterozigose composta com outros alelos patogênicos nos genes GJB2 e GJB6. Foi realizada a análise do DNA de 16 pacientes surdos portadores de uma única mutação patogênica em um desses dois genes por meio: (i) do sequenciamento das regiões codificadora, promotora e doadora de splicing (intron 1) do gene GJB2, (ii) da triagem de uma deleção de 200 kb localizada a 130 kb da proximidade distal da região 5\' do gene GJB6 e (iii) da pesquisa de variações no número de cópias de um ou mais exons dos genes GJB2, GJB6, GJB3 e WFS1 por MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Detectamos uma segunda mutação provavelmente patogênica em dois dos 16 pacientes heterozigotos: em um deles, a mutação p.L76P (c.C227T) foi identificada na região de código do gene GJB2 e foi por nós descrita pela primeira vez; no segundo caso, uma duplicação (0,4-1,2Kb) que inclui a região de código do gene GJB2 foi detectada, também inédita na literatura. Na segunda parte, tivemos como objetivo obter um modelo experimental para estudos funcionais in vitro da proteína codificada pelo gene GJB2, a conexina 26, em seu local de expressão que são as células de suporte do órgão de Corti. Padronizamos o cultivo in vitro de células progenitoras do órgão de Corti de camundongos e de cobaias e conseguimos obter a diferenciação in vitro das otoesferas dos camundongos em células que expressam marcadores de células ciliadas (Miosina VIIa e Jagged2) e de células de suporte (p27kip e Jagged1). Por fim, na terceira parte, buscamos por proteínas que interagem com a conexina 26 por meio de ensaios de precipitação por afinidade. Para isso, produzimos clones recombinantes de uma proteína de fusão GST-Cx26 e de uma proteína controle (GST), e realizamos sua expressão in vitro em bactérias E.coli B21. Ensaios de precipitação por afinidade entre a proteína de fusão GST-Cx26 ou GST sozinha e proteínas extraídas de cérebro ou fígado de camundongos foram realizados em diferentes condições. A identificação e a análise das proteínas presentes em bandas de SDS-PAGE, obtidas no ensaio de precipitação com a proteína de fusão GST-Cx26 e ausentes no ensaio com a GST, foram realizadas por espectrometria de massas. Identificamos um total de 49 proteínas candidatas a interagirem com a região C-terminal da Cx26. Realizamos diversas análises in silico e em literatura específica e após exclusão de candidatas por: (i) redundância de representação no ensaio GST-Cx26, (ii) diferença entre a massa molecular esperada e a obtida, (iii) precipitação inespecífica e (iv) localização subcelular incompatível com a conexina 26, selecionamos um total de 22 proteínas candidatas a interagirem com a região C-terminal da conexina 26, para estudos futuros. A confimação da interação entre essas 22 proteínas e a conexina 26 é desejável por meio de estudos de co-localização e imuno-coprecipitação / The most frequent causes of nonsyndromic recessive hearing loss are mutations in locus DFNB1, in the GJB2 and GJB6 genes. Among the individuals with hearing loss with mutations in this locus, 10% to 50% present a single recessive mutation in the GJB2 gene, frequency much higher than expected taking into account the frequency of heterozygotes in the general population. Although some of these cases have been elucidated after the identification of large deletions in GJB6 or its surrounding regions, the existence of many individuals with a single pathogenic mutation in the GJB2 gene suggests that haplo-insufficiency of this gene may interact with other types of mutations in the same gene, in the neighbor gene GJB6, or even in other genes. The aim of this study was to identify new pathogenic alleles, proteins and genes that interact with the locus DFNB1, from the molecular and cellular perspective, and that may be responsible for autosomal recessive deafness. Thus, we aimed to contribute to the understanding of the pathogenesis of autosomal recessive deafness. In this work, three different types of studies were performed, each one with a particular methodology. In the first part, we searched for new pathogenic alleles in the locus DFNB1 that could be responsible for deafness, when present in compound heterozygosis with other pathogenic alleles in GJB2 and GJB6 genes. We performed DNA analysis in samples from 16 deaf patients, carriers of a single pathogenic mutation in one of these two genes by: (i) sequencing the coding, promoter and splice donor (intron 1) regions of the GJB2 gene, (ii) screening for a deletion of 200 kb located 130 kb upstream from GJB6 gene and (iii) investigating copy number variations in of one or more exons of the genes GJB2, GJB6, GJB3 and WFS1 by MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). We detected a second mutation, probably pathogenic, in two of the 16 heterozygous patients: in one case, the p.L76P (c.C227T) mutation was identified in the coding region of the GJB2 gene and was firstly described by us; in the second case, a novel duplication (0.4 - 1.2 Mb) that includes the coding region of the GJB2 gene was detected. In the second part, our objective was to obtain an experimental model for in vitro functional studies of the protein encoded by the GJB2 gene, connexin 26, in its site of expression, that is, in the supporting cells of the organ of Corti. We standardized the culturing of guinea pigs and mice progenitor cells of organ of Corti. We were also able to induce differentiation of mice\'s otospheres into cells that express markers of hair (myosin VIIa and Jagged2) and supporting cells (p27kip and Jagged1). Finally, we searched for connexin 26 interacting proteins by pull-down assays. Recombinant clones expressing a fusion protein GST-Cx26 and a control protein (GST) were produced, so that in vitro expression in E. coli B21 could be performed. Pull-down experiments, perfomed with fusion protein GST-Cx26 or GST alone, and with proteins from mice brain or liver extracts were done under several different conditions. The identification and analysis of proteins present in SDS-PAGE bands in experiments performed with the fusion protein GST-Cx26, and absent in the GST assay, were performed by mass spectrometry. We identified a total of 49 candidate proteins for interaction with the C-terminal region of Cx26. In silico analyses performed in several databases and search in the literature allowed exclusion of candidates by: (i) redundancy of representation in the GST-Cx26 experiments; (ii) discrepancy between the expected and the obtained molecular weight; (iii) nonspecific precipitation and (iv) subcellular localization incompatible with connexin 26 localization. Summing up, we selected a total of 22 candidate proteins to interact with the C-terminal region of connexin 26. Confirmation of the interaction between these proteins and connexin 26 is planned to be performed by co-localization studies and by immuno-coprecipitation