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Calreticulina de trypanosoma cruzi : un factor de virulencia que unido exógenamente a epimastigotes, promueve su penetración a células hospederasSosoniuk Roche, Eduardo Rodrigo January 2013 (has links)
Memoria para la obtención del Título de Químico Farmacéutico / La enfermedad de Chagas es una patología endémica en América Latina y sin un tratamiento eficaz, causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Es un problema mayor de salud identificándose actualmente entre 8 a 9 millones de infectados, de los cuales aproximadamente un 30% desarrolla sintomatología. Sin embargo, la infección se ha globalizado durante los últimos años, confirmándose sobre 300.000 sero-positivos en Estados Unidos y varias decenas de miles en Europa, Asia y Oceanía. Esto se debe a que, aunque T. cruzi es normalmente transmitido por insectos triatominios infectados, se ha descrito la transmisión por transfusión sanguínea, trasplante de órganos, infección congénita y consumo de alimentos contaminados con el parásito. En el ciclo de vida de T. cruzi se pueden identificar 3 etapas principales: amastigote y epimastigote, que cumplen funciones replicativas en el hospedero mamífero y en el insecto vector respectivamente, y la forma tripomastigote, encargada de infectar células eucariontes. Calreticulina de T. cruzi (TcCRT), es una proteína de 45 kDa, aislada, clonada y caracterizada en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), de la Facultad de Medicina de nuestra Universidad. Se ha demostrado que TcCRT es translocada a la zona de emergencia flagelar de los tripomastigotes, donde captura C1, primer componente de la vía clásica del sistema del complemento. En el humano, esta señal es característica de células apoptóticas. Es por esto que al capturar C1, se reclutan macrófagos para fagocitar a los tripomastigotes. Una vez dentro de estas células, el parásito escapa de la vacuola parasitófora, y comienza a diferenciarse, iniciando el proceso de infección del huésped. Junto a esto, la interacción entre TcCRT y C1 impide la activación del sistema del complemento del hospedero, disminuyendo la lisis del parásito por este medio. Resultados obtenidos previamente en LIAM muestran que TcCRT se expresa marginalmente en la membrana plasmática de la forma epimastigote del clon Dm28c. En base a esto, se propuso como Hipótesis de Trabajo de esta Memoria de Título, que, al incubar epimastigotes con rTcCRT, se promueve su penetración a las células hospederas mamíferas. Los principales resultados obtenidos señalan que: i) epimastigotes unen rTcCRT en su membrana, posiblemente mediante alguna proteína que sirva de anclaje, ii) el tratamiento con rTcCRT en presencia o ausencia de C1q conlleva a un aumento en la penetración del parásito en fibroblastos que expresan CRT, iii) la ausencia de CRT en la membrana de la célula hospedera lleva a una disminución en la penetración de los parásitos. En el contexto del epimastigote, puede que la falta de translocación de TcCRT sea el factor principal para que esta forma presente menor resistencia a lisis por el complemento y falle en desarrollar el ciclo infectivo en el mamífero / Chagas’ disease is an endemic pathology in Latin America, caused by the hemoflagelated protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), and still with no available effective treatment. It has become a major health problem, with 8 - 9 million seropositive people, with 30% of them developing symptoms. In the last few years, the infection has globalized, with 300.000 people infected just in the USA, and tens of thousands in Europe, Asia and Oceania. Although T. cruzi is usually transmitted through the bite of Triatominae insects, blood transfusion, organ transplants or congenital infection have also been described. In the parasites life cycle, 3 principal different stages are identified: Replicative amastigotes and epimastigotes, present in the mammal host and Triatominae vector respectively, and trypomastigotes, which infect eukaryotic cells. T. cruzi Calreticulin (TcCRT) is a 45 kDa protein, isolated, cloned and characterized in the Immunology of Microbial Aggression Laboratory (LIAM), Faculty of Medicine, University of Chile. Later, it was demonstrated that TcCRT is translocated from the ER to the flagella emergence zone where it captures C1, the first component of the classical pathway of the complement system. In humans, this interaction is characteristic of apoptotic cells. Once C1 is captured, macrophages are recruited and phagocytose the trypomastigotes. Once inside the cell, the parasites escape the parasitophorous vacuole and start dedifferentiation, leading to the amastigote stages, which will finally differentiate into infective trypomastigotes. Upon TcCRT binding to C1, inhibition of the complement system activation occurs, with a decrease in parasite lysis. According to previous observations in our laboratory, TcCRT is expressed marginally on the plasmatic membrane of the studied epimastigote form. Taken all together, these facts allow us to propose the following Working Hypothesis: Incorporation of exogenously added rTcCRT onto epimastigotes will promote their penetration into mammal hosts cells. The main results obtained show that: i) epimastigotes bind rTcCRT to their cellular membrane, by a still unidentified membrane protein that works as an anchor, ii) rTcCRT-treated epimastigotes, in the presence or absence of C1q, promote an increase in parasite penetration into CRT expressing fibroblasts and iii) the absence of CRT in the host cell correlates with a decrease in parasite penetration. In the epimastigote context, it could be proposed that the lack of TcCRT translocation is an important reason why this form is more easily destroyed by the complement system, and for their incapacity to infect host cells / Fondecyt
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Estimación del número de copias del gen calreticulina, en el genoma de Trypanosoma cruziMaldonado Fuentes, Ismael January 2009 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina es una proteína con múltiples funciones presente en todas las células de organismos superiores, salvo eritrocitos. En protozoos parásitos, hemos demostrado que calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe el sistema del complemento humano y la angiogénesis y promueve la infectividad parasitaria. Esta proteína se expresa en la superficie del parásito y en organelos citoplásmicos. Su gen posee una localización cromosómica variable, sugiriendo que TcCRT estaría codificada por múltiples copias génicas organizadas en “tandem” con posibles implicancias funcionales. Obtuvimos ADN cromosomal de cultivos in vitro de epimastigotes. Mediante Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE), seguido por hibridación con sonda radiactiva (correspondiente al dominio C-terminal de TcCRT) localizamos el gen TcCRT en las cepas Y, MF y Tulahuén y los clones DM28c y Cl Brener. Para evaluar el número de copias del gen TcCRT se realizó una cinética de digestiones parciales con la enzima BamH1 para generar fragmentos de ADN que contengan desde una a múltiples copias del gen. Los productos de digestión fueron separados por PFGE y el gen fue detectado con la sonda anterior. Nuestros resultados corroboran que TcCRT se encuentra en varios cromosomas de diferente tamaño, probablemente correspondan a pares homólogos donde TcCRT está presente en una sola copia. Estos datos concuerdan con la secuencia publicada del genoma de T. cruzi, Cl Brener, y sugieren que las múltiples funciones de TcCRT estarían controladas a nivel postranscripcional.
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Trypanosoma cruzi calreticulin expression in parasites infecting murine macrophagesGonzález Zúñiga, Andrea Elizabeth 03 1900 (has links)
Doctor en Bioquímica / La calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), una chaperona pleiotrópica de
47 kDa, se transloca desde el retículo endoplásmico (RE) a la zona de emergencia
flagelar, donde actúa como un factor de virulencia principal, además de sus roles
funcionales intracelulares. La TcCRT extracelular media la infectividad del parásito en
virtud de su capacidad para interactuar con los componentes del complemento C1 y
MBL. La inhibición de las vías del complemento clásica y de las lectinas también son
consecuencias de estas interacciones. No se ha reportado respecto a la localización y
funciones de TcCRT una vez que el parásito se encuentra en el interior de la célula
hospedera. Aquí proponemos que, durante la infección por T. cruzi, y mediante el uso
de anticuerpos específicos, es posible detectar TcCRT, una vez que el parásito se
encuentra el interior de la célula hospedera de mamífero. También proponemos que la
expresión de TcCRT en la célula hospedera se correlaciona inversamente con la
expresión de antígenos MHC-I. Al abordar experimentalmente estos temas queremos
contribuir al conocimiento de los términos moleculares que regulan la interacción células
hospederas-T.cruzi, centrándose en el papel de TcCRT en particular, dentro de la célula
hospedera infectada. Para alcanzar este objetivo apuntamos a la validación de la
especificidad de los anticuerpos para ser utilizados como sondas detectoras de TcCRT,
con ello identificar TcCRT interior de los macrófagos murinos infectados y, por último,
evaluar las variaciones en la superficie de las moléculas de MHC- I en los macrófagos
murinos infectados. Por lo tanto, específica y topográficamente se monitoreó la
presencia de TcCRT en los parásitos que infectan a una línea celular de macrófagos
murinos, en comparación con tripomastigotes libres y epimastigotes no infecciosos.
Para ello, se probaron tres anticuerpos diferentes como sondas detectoras para
procedimientos inmunocitoquímicos. Anticuerpos anti-TcCRT policlonales y
monoclonales se validaron como sondas detectoras, ya que mostraron poca o nula
reactividad cruzada. En inmunocitoquímica, el anticuerpo policlonal de conejo, y los
anticuerpos monoclonales murinos anti-TcCRT, detectan TcCRT con diferentes
sensibilidades y especificidades, cuando son revelados con inmunosondas conjugadas
con oro coloidal, seguido por microscopía electrónica de transmisión. Con los
anticuerpos policlonales de conejo, se observaron partículas de CRT, tanto en parásitos
libres como en aquellos que se encuentran dentro del interior de células hospederas
infectadas, principalmente en el núcleo y kinetoplasto del parásito. Con un anticuerpo
monoclonal murino anti-TcCRT, y el uso de partículas de oro de tamaño más grande, se obtuvo una mejora drástica en la sensibilidad y especificidad para la detección TcCRT.
Se detectaron moléculas de TcCRT principalmente en el kinetoplasto del tripomastigote.
Proponemos que este organelo puede representar una escala para TcCRT, generada
en el RE, previo a su translocación a la zona de emergencia flagelar. Esta movilización
puede estar influenciada por las nuevas condiciones ambientales con las que el parásito
se encuentra en el interior de la célula hospedera. Queda por determinar las
consecuencias funcionales de la presencia acumulada de TcCRT en el kinetoplasto. La
posibilidad de que TcCRT regule la transcripción en el ADN del kinetoplasto, según lo
propuesto anteriormente para la CRT de mamífero en el núcleo, podría ser considerada,
aunque la organización de ADN en el kinetoplasto es diferente. Además, TcCRT podría
regular vías de transducción de señales dependientes de Ca+2. Finalmente, por
mecanismos desconocidos, la infección por T. cruzi disminuye el número de células
positivas MHC de clase I, tan temprano como 2 horas después de la infección. Queda
por determinar si TcCRT accede al RE de la célula huésped e interfiere en el proceso de
plegamiento de moléculas MHC clase I / Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT), a 47 kDa pleiotropic chaperone,
besides its intracellular functional roles, is translocated from the endoplasmic
reticulum (ER) to the area of flagellum emergence where it acts as a main
virulence factor. Extracellular TcCRT mediates parasite infectivity by virtue of its
capacity to interact with complement components C1 and MBL. Both inhibitions of the
classical and lectin complement pathways are also consequences of these
interactions. The localization and functions of TcCRT once the parasite is inside the
host cell has not been reported. Herein we hypothesize that, during T. cruzi infection,
and using specific antibodies, it is possible to detect TcCRT, once the parasite is
inside the mammalian host cell. We also propose that TcCRT expression in the host
cell inversely correlates with the MHC-I antigen expression. By experimentally
addressing these issues we expect to contribute to the knowledge of the molecular
terms governing the T. cruzi-host cell interplay, focusing on the role of TcCRT in
particular inside the infected host cell. To reach this goal we will aim at validating the
specificity of the antibodies to be used as TcCRT detector probes to identify TcCRT
inside infected murine macrophages and, finally, to evaluate variations in surface
MHC-I molecules on infected murine macrophages. Thus, we specifically and
topographically monitor the TcCRT presence in parasites infecting a murine
macrophage cell line, as compared to free trypomastigotes and non-infective
epimastigotes. For that purpose, three different antibodies were tested as detector
probes for immunocytochemical procedures. Polyclonal and monoclonal anti-TcCRT
antibodies were validated as detector probes, as they showed minimal or null cross
reactivity. In immunocytochemistry, polyclonal rabbit, and monoclonal murine anti-
TcCRT antibodies, detected TcCRT with different sensitivities and specificities,
when revealed with immune probes conjugated to colloidal gold, followed by
transmission electron microscopy. With the rabbit polyclonal antibodies, CRT
particles were observed, both in free parasites and infected host cells, mainly in the
parasite nucleus and kinetoplast. With a murine monoclonal anti-TcCRT antibody,
and using larger size gold particles, a drastic improvement in sensitivity and
specificity for TcCRT detection, was obtained. TcCRT molecules were detected
mainly in the trypomastigotes kinetoplast. We propose that t his organelle may
represent a stopover for TcCRT, generated in the ER, previous its translocation to the
area of flagellum emergence. This mobilization may be influenced by the new environmental conditions that the parasite meets inside the host cell. It remains to be
determined the functional consequences of TcCRT cumulative presence in the
kinetoplast. The possibility that TcCRT regulates transcription in kinetoplast DNA, as
previously proposed for mammalian CRT in the nucleus, could be considered,
although the DNA organization in the kinetoplast is different. Also, TcCRT may
regulate Ca+2-dependent transduction signalling pathways. Finally, by unknown
mechanisms, T. cruzi infection seems to decrease the number of MHC class I positive
cells, as early as 2h post-infection. It remains to be determined whether TcCRT
accesses to the host cell ER and interferes in the MHC class I molecule-folding
process / Conicyt
Fondecyt
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Evaluación de calreticulina recombinante humana versus parasitaria de Trypanosoma cruzi sobre la regeneración ósea en conejosBravo Reyes, Patricia January 2013 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En cirugía ortopédica, el uso de factores tróficos que favorezcan la formación de tejido de granulación y eviten o retrasen la formación de nuevo hueso es deseable en resoluciones quirúrgicas de ciertas patologías en pequeños animales. Calreticulina (CRT) es una proteína chaperona que asegura el correcto plegamiento de proteínas y actúa en la regulación del metabolismo del calcio dentro del retículo endoplásmico (RE). Esta proteína ha sido localizada además fuera de la célula donde cumple variadas funciones, entre ellas, favorece la formación de tejido de granulación en piel y además, inhibe la formación de hueso. Es así como, en este estudio se evaluó y se comparó el efecto de CRT recombinante humana (rHuCRT) y parasitaria proveniente de Trypanosoma cruzi (rTcCRT) sobre la regeneración ósea, mediante liberación controlada desde una esponja de quitosano al interior de una lesión circular en hueso cortical de conejo. rHuCRT y rTcCRT demostraron inhibir la regeneración ósea in vivo, sin embrago, rTcCRT demostró ser más eficaz en esta función que su contraparte humana / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 3100021
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Rol de la sobreexpresión de Calreticulina de Trypanosoma cruzi en la infectividad parasitaria mediada por la interacción de calreticulina de Trypanosoma cruzi y C1qNieto Muñoz, Vanesa Denise January 2015 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina de Trypanosoma cruzi, (TcCRT) es una proteína presente en el retículo endoplásmico (RE) y traslocada desde este organelo al área de emergencia flagelar, donde captura al componente C1q del sistema del complemento (SC), en una estrategia similar a la utilizada por las células apoptóticas. En consecuencia, la interacción TcCRT/C1q, además de inhibir la activación de la vía clásica del SC, promueve infectividad. Esta Memoria de Título propone estudiar el rol de la sobreexpresión de TcCRT en la infectividad parasitaria mediada por la interacción TcCRT/C1q. Para esto utilizamos una línea parasitaria que sobreexpresa calreticulina (TcCRT+) en un 13% y un clon nativo (wild type, wt), derivados de la cepa Tulahuén de T. cruzi. Nuestros resultados mostraron que tripomastigotes pretratados con C1q aumentan la infectividad en células VERO, en ambas variantes. Por otro lado, tripomastigotes pretratados con C1q y fragmentos F(ab’)2 de inmunoglobulinas anti-TcCRT que carecen de la porción Fc, capaces de inhibir esta interacción, interfieren significativamente con la infectividad dependiente de C1q, reduciendo la internalización de parásitos en células VERO para ambas variantes. Sin embargo, no se evidenció diferencias en cuanto a infección celular entre los tripomastigotes TcCRT+ y wt, por lo cual se concluye que un 13% de sobreexpresión de TcCRT no producen mayor infectividad. Es probable, que esta sobreexpresión no se exprese en la superficie parasitaria y por lo tanto, no participe en el proceso infectivo. Por otra parte, TcCRT es un factor de virulencia sobre la superficie celular, pero probablemente asociada a una gran cantidad de proteínas participando en este complejo proceso
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Estudio del rol de calreticulina de Trypanosoma cruzi en la respuesta inmune celular inhibitoria del crecimiento tumoral mamarioGallardo Aguilera, Haydeé Gabriela Paulette January 2016 (has links)
El cáncer es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo, y año a año aumentan las cifras de nuevos casos. Es un proceso complejo de proliferación celular no regulada, favorecido por la angiogénesis, que le brinda al tumor oxígeno, nutrientes y la posibilidad de eliminar productos catabólicos, lo que le permite crecer y eventualmente metastizar. Hace aproximadamente ocho décadas, se describió la inhibición de tumores malignos implantados en ratones, concomitantemente infectados con Trypanosoma cruzi y, en humanos, se observó el efecto antitumoral de la inoculación de extractos de este parásito. Sin embargo, no se identificó moléculas parasitarias responsables. Estudios más recientes mostraron el efecto antitumoral de Calreticulina de T.cruzi (TcCRT). Esta proteína es translocada desde el retículo endoplásmico a la zona de emergencia flagelar del parásito, donde inhibe al sistema del complemento, sirve de señal profagocítica, y media efectos antiangiogénicos que protegen al hospedero de agresiones neoplásicas. Calreticulina (CRT) de mamíferos tiene varias funciones intracelulares; como reguladora de la homeostasis del calcio, de la expresión de genes y del plegamiento de proteínas. Aunque, dependiendo del tipo tumoral, su sobreexpresión se ha asociado a mayor capacidad metastásica, su localización superficial, en general, es señal de daño, conduciendo a la fagocitosis de la célula y, en el caso de las células tumorales conduciría, además, a la activación de una respuesta inmune. Este proyecto propone que, al inhibir la angiogénesis, TcCRT recombinante (rTcCRT) genera un microambiente estresante para células tumorales. En respuesta, éstas translocan CRT murina (MmCRT) a la superficie celular. Por otra parte, rTcCRT inoculada podría unirse a la superficie de la células del tumor, generando señales profagocíticas, lo que mediaría una respuesta inmune, resultante en una mayor infiltración linfocitaria en el tejido tumoral, contribuyendo a un menor desarrollo de la neoplasia. Para abordar esta posibilidad se utilizó un modelo in vivo de adenocarcinoma mamario murino resistente a metotrexato (TA3-MTXR). Se obtuvo tejido tumoral de ratones, tratados o no con rTcCRT, se analizó la expresión del mRNA de MmCRT mediante qPCR y, por citometría de flujo, se analizó la cantidad de CRT en superficie y la infiltración linfocitaria. Se detectó una mayor cantidad de CRT en la superficie de las células del tejido tumoral de animales que recibieron rTcCRT, y una mayor infiltración de LTCD4+ y LTCD8+ en los mismos. Por otra parte, el tratamiento con rTcCRT no afectó los niveles de expresión del mRNA de MmCRT en el tejido tumoral. En síntesis, rTcCRT, modula la respuesta inmune, aumentando señales profagocíticas, la infiltración linfocitaria, conduciendo a la inhibición del crecimiento tumoral. / Cancer is a major cause of morbidity and mortality worldwide, and the number of new cases increases yearly. Cancer is a complex process of unregulated cell proliferation, favored by angiogenesis, which provides tumors with oxygen, nutrients and eliminates accumulation of catabolic products, allowing the tumor to grow and eventually metastasize. Eight decades ago, inhibition of malignant tumors implanted in mice concomitantly infected with Trypanosoma cruzi, was described and, on the other hand, antitumor effects of inoculated parasite extracts was observed in humans. However, it was not possible to identify the responsible parasite molecules. Recent studies showed the antitumor effect of T. cruzi calreticulin (TcCRT). This protein is translocated from the endoplasmic reticulum to the area of flagellum emergence in this parasite. There, it inhibits the complement system, serves as pro phagocytosis signal, and has antiangiogenic properties that protect the host from neoplastic aggressions. Calreticulin (CRT) from mammals has several intracellular functions; as a regulator of calcium homeostasis, gene expression and protein folding. Although, depending on tumor type, its overexpression has been associated with increased metastatic ability, in general, CRT surface location, is a sign of damage, leading to the phagocytosis of the cell by macrophages. In tumor cells, surface CRT would lead also, to activation of an immune response. In this project it is proposed that, by inhibiting angiogenesis, recombinant TcCRT (rTcCRT) generates a stressful microenvironment for tumor cells. In response, they translocate murine CRT (MmCRT) to the cell surface, as a sign of damage, or rTcCRT upon binding surface tumor cells, generates “eat me signals”, thus mediating an immune response, resulting in increased infiltration of lymphocytes in the tumor tissue, contributing to impaired development. To address this possibility, an in vivo murine methotrexate resistant (TA3-MTXR) mammary adenocarcinoma model was used. Tumor tissue was obtained from mice treated or untreated with rTcCRT, to analyze the mRNA expression of MmCRT by qPCR and, by flow cytometry, the expression of CRT surface and infiltrating lymphocytes was analyzed. The results show increased expression of CRT on the surface of tumor cells of animals receiving rTcCRT, and increased CD4+ and CD8+ T lymphocyte infiltration in these treated tumors. Moreover, rTcCRT did not affect the levels of expression of messenger RNA of murine CRT in tumor tissues. In short, rTcCRT modulates the immune response, inducing “eat-me signals”, increased infiltrating lymphocytes, resulting inhibition of tumor growth.
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La terapia experimental conjunta con calreticulina de Trypanosoma cruzi y la inmunización con survivina inhibe el crecimiento in vivo de un melanoma experimental murinoAguilar Guzmán, Lorena Andrea January 2012 (has links)
Doctor en Bioquímica / El cáncer, una de las causas más frecuentes de muerte en el mundo, es un gran desafío para el desarrollo de terapias específicas anti-tumores o de sus metástasis. Ya sea la inmunoterapia anti-tumoral ó la terapia anti-angiogénica, son estrategias con un muy buen potencial en la lucha contra el cáncer. La primera busca activar la respuesta de linfocitos T tumor-específicos, mientras que la segunda bloquea o retarda el crecimiento del tumor al interferir con el abastecimiento adecuado de nutrientes y oxígeno y con la remoción de productos catabólicos tóxicos. La inmunoterapia requiere de la identificación de Antígenos Asociados Tumores (TAA) que se expresen preferencialmente en tejidos con alto nivel proliferativo, como los tumores. Un TAA adecuado para este tipo de terapia debe ser esencial para la mantención de la viabilidad del tumor y ser blanco de linfocitos T citotóxicos. Survivina (Surv), cumple con estos requisitos. Por otra parte, en vertebrados, Calreticulina (CRT), proteína altamente pleiotrópica, además de su participación en procesos de presentación antigénica en células presentadoras de antígeno (APCs), puede translocarse a la membrana externa e interactuar con C1 del complemento. A pesar de la enorme distancia evolutiva entre el Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, y los mamíferos, CRT del parásito (TcCRT) comparte una gran cantidad de características estructurales y funcionales con sus homólogos vertebrados. Recientemente, hemos propuesto que el efecto anti-neoplásico asociado a la infección por T. cruzi, se debería, al menos parcialmente, a la capacidad anti-angiogénica de TcCRT, al interactuar con células endoteliales, interfiriendo con su multiplicación, movilidad y capacidad morfogénica capilar. En estas actividades, la proteína parasitaria es más efectiva que su contraparte humana. Por estas razones, nuestra Hipótesis de Trabajo propuso que, la inmunización genética con Surv y la administración concomitante de TcCRT, genera una actividad anti-tumoral mayor que con solo uno de estos productos. Los principales resultados obtenidos señalan que: i) De acuerdo a lo esperado, rTcCRT no afecta la proliferación in vitro de células de un melanoma murino B16-F10, ii) la inmunización genética con pSurv, en conjunto con rTcCRT (ó su dominio R), retrasa el crecimiento del tumor, iii) aumentando la sobrevida de los animales tratados. iv) El tratamiento combinado pSurv-rTcCRT inhibe la angiogénesis tumoral. v) rTcCRT se une a los melanocitos, promueve la incorporación de C1q humano y la fagocitosis macrofágica y, vi) La combinación de la inmunización con pSurv y pSec-Surv, más la inoculación i.v. con rTcCRT, inhibe sinérgicamente la metástasis pulmonar. Es probable que una secuencia de eventos se desencadene primariamente por la actividad anti-angiogénica de TcCRT, en el tumor, generando una respuesta al estrés derivado, siendo translocada CRT de la célula tumoral a la membrana externa, donde captura C1, evento que promueve la fagocitosis de la célula tumoral, por parte de las APCs. La presentación de péptidos derivados de antígenos TAA debiera ocurrir (Surv incluida), con la consiguiente inducción de actividad inmune anti-tumor. Independientemente, Surv podría también mediar actividad inmune anti-células endoteliales. En consecuencia, el retardo en el crecimiento tumoral y aumento en la sobrevida de los animales tratados con pSurv-rTcCRT se debería a la combinación de efectos sobre distintos blancos moleculares, colaborando y potenciando el efecto final. / Cancer, the most frequent cause of death worldwide, is a great challenge for the development of specific anti-tumor and metastasis treatment. Either immune anti-tumor or anti-angiogenic therapies, are potentially promising in the struggle against cancer. Immune therapy seeks to activate the response of antigen-specific T lymphocytes, thus allowing selective elimination of tumor cells, while anti-angiogenesis blocks or delays tumor growth by interfering with nutrient or oxygen supply and with the removal of catabolic toxic products. Immune therapy for cancer treatment requires the identification of Tumor Associated Antigens (TAA), specifically expressed in tissues with high proliferative levels, such as tumors. A TAA useful for this therapy must be essential for tumor liability and also serve as a target for cytotoxic T lymphocytes. Survivin (Surv), fulfills these requirements. On the other hand, in vertebrates, Calreticulin (CRT), a highly pleiotropic protein, besides its participation in antigen presenting cells (APCs), can translocate to the external membrane and interact with complement C1. In spite of the great evolutionary distance between Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas´ disease, and mammals, parasite CRT (TcCRT) shares many structural and functional properties with its vertebrate counterparts. Recently, we have proposed that the anti-tumor effect associated to T. cruzi infection is at least partially due to the TcCRT anti-angiogenic capacity. Thus, upon interacting with endothelial cells, TcCRT interferes with their multiplication, mobility and capacity to generate capillaries. In all these activities, the parasite protein is more effective than its human counterpart. For these reasons, the Working Hypothesis proposes that genetic immunization with Surv and concomitant TcCRT administration, generates a greater anti-tumor activity than each of these products, administered separately. The principal results obtained indicate that: i) As expected, while rTcCRT does not affect the in vitro proliferation of B16-F10 tumor cells, ii) genetic immunization with pSurv, together with rTcCRT (or its R domain), slows the growth of the B16-F10 murine melanoma iii) increasing survival of treated animal. iv) pSurv-rTcCRT treatment inhibits tumor angiogenesis. v) rTcCRT binds to B16-F10 melanocytes, promotes the incorporation of human C1q and consequent macrophage phagocytosis and, vi) The combination of immunization with pSurv and pSecSurv plus rTcCRT i.v. inoculation, synergistically inhibits lung metastasis. Perhaps, a sequence of events is primarily unleashed by the TcCRT anti-angiogenic activity in the tumor. As a response to derived stress, tumor cell CRT is translocated to the external membrane, where it captures C1, an event that promotes tumor phagocytosis by APCs. TAA-derived antigen presentation (Surv included) should follow, with the induction of anti-tumor immune activity. Independently, Surv could also mediate anti-endothelial cell immune activity. Consequently, the slower tumor growth and increased survival of the animals treated with pSurv-rTcCRT is due to the combined effects on different molecular targets, collaborating and enhancing the overall effect. / Fondap
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Caracterização da calreticulina recombinante de Acanthamoeba castellanii e avaliação de seu potencial imunodiagnóstico / Characterization of Acanthamoeba castellanii recombinant calreticulin and evaluation as a potential immunodiagnosticSanchez, Alemao Gustavo Carpinteyro January 2015 (has links)
Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.
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Calreticulina (CRT) en el líquido sinovial de la articulación radio carpal clínicamente sana de equinosDörner Santa María, Cristóbal Antonio January 2016 (has links)
Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / El objetivo planteado para esta tesis fue investigar la presencia de la proteína Calreticulina en el líquido sinovial de la articulación radio carpal de
equinos Fina Sangre Inglés, mediante métodos moleculares y de esta manera
describir una proteína que hasta la fecha no se ha identificado en la especie
equina.
Para lo anterior, se utilizaron 5 equinos clínicamente sanos, desde los
cuales se obtuvo una muestra de líquido sinovial para su posterior estudio. Se
realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida que se analizó mediante
inmuno electro transferencia (IWB) utilizando anticuerpos anti Calreticulina
humana (HuCRT) y anti Calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT),
permitiendo un reconocimiento antigénico de la proteína. Se utilizó HuCRT y
TcCRT como control (+). Adicionalmente, se estudió la capacidad in vitro de la
Calreticulina presente en el líquido sinovial para unirse a C1q del sistema de
complemento, lo cual fue estudiado mediante inmuno electro transferencia.
También, se efectuaron ensayos con el objetivo de modificar el patrón
electroforético de las proteínas del líquido sinovial equino para disminuir la
concentración de las proteínas más abundantes, y con ello aumentar
relativamente las proteínas que se encuentran en menor concentración.
Finalmente, se realizó una espectrometría de masas (MALDI-TOF) y una
espectroscopia de Raman con el objeto de identificar y confirmar que la proteína
inmuno reactiva fuese CRT.
En la IWB se evidenció una reacción positiva por la aparición de una banda
de aproximadamente 50 kDa la cual fue evidenciada con el anticuerpo anti
HuCRT. El desafío a C1q no generó una reacción positiva, no pudiendo evidenciarse la unión de CRT del líquido sinovial equino al componente C1q del
complemento. La presencia de la proteína CRT en el líquido sinovial equino,
utilizando el diseño experimental planteado, no pudo ser confirmada por
espectrometría de masas como por espectroscopía de Raman, necesitándose
diseñar otros experimentos para separar y aislar más específicamente la proteína
en estudio.
La Calreticulina equina (EqCRT) fue reconocida principalmente por el
anticuerpo anti HuCRT y no así por el anticuerpo anti TcCRT, lo que se debe
probablemente a una mayor homología entre ambas proteínas a diferencia de la
proteína del equino con la proteína de Trypanosoma cruzi. Por otro lado, el que
no hubiese reacción al realizar el desafío frente a C1q, no quiere decir que la
“EqCRT” no se una a C1q y puede haber sido más que nada un problema de
diseño experimental en donde se utilizaron concentraciones muy bajas de
proteína, no logrando producir una reacción identificable mediante el IWB. Para
lograr una correcta identificación de la CRT mediante espectrometría de masas,
se requiere obtener una muestra más purificada y de esta manera evitar el
reconocimiento de otras proteínas contaminantes. Por otro lado, la
espectroscopía de Raman, con la longitud de onda utilizada (785 nm), no fue
posible identificar un espectro específico que pudiese confirmar la presencia de
CRT en el líquido sinovial equino de animales clínicamente sanos. Con la
información obtenida en este estudio, es posible suponer que la CRT puede estar
cumpliendo algún rol en la homeostasis articular, sin embargo, otros
experimentos son necesarios para lograr su completa identificación. / The goal for this research was to investigate the presence of Calreticulin in
the equine synovial fluid obtained from the radio carpal joint of Thoroughbred
horses and thus describe a protein that has not been identified in this specie so
far.
Five clinically healthy horses were selected and a synovial fluid sample
was obtained from each one. Synovial fluid samples obtained were analyzed by
a polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting using anti
Trypanosoma cruzi Calreticulin (TcCRT) and anti Human Calreticulin (HuCRT)
antibodies, allowing an antigenic recognition of the protein. TcCRT and HuCRT
served as positive controls. Additionally, challenge between the equine synovial
fluid and C1q of the human complement system was studied by western blot. Also,
a combinatorial peptide ligand library technology assay was performed to deplete
high concentration proteins, like albumin, which can mask and difficult the access
to low concentration proteins. The aforementioned assay changed the synovial
fluid electrophoretic pattern. Finally, the immunoreactive protein was studied by
MALDI-TOF mass spectrometry and Raman spectroscopy.
The western blot demonstrated a positive reaction that allowed detection
of a band of 50 kDa when anti HuCRT antibody was used. The challenge to C1q
did not generate a positive reaction evidencing a failed binding between EqCRT
from synovial fluid with human C1q. The presence of CRT in the equine synovial
fluid could not be confirmed by both mass spectrometry and Raman spectroscopy
using the experimental design proposed for this study thus further investigation is
required to fully identify the protein in the equine synovial fluid.
The EqCRT was only recognized by anti HuCRT antibody, which was probably
due to higher homology between the human and equine proteins.
On the other hand, no reaction was evidenced when the EqCRT was
challenged against C1q, nevertheless, that is attributable to an experimental
design problem in which very low concentrations of protein were used so the
western blot was not able to generate a detectable signal.
Due to experimental design, it was not possible to fully confirm the presence
of the protein in the equine synovial fluid from clinically healthy animals using
Mass spectrometry and Raman spectroscopy. However, the information gathered
in this study imply that CRT may be present in the synovial fluid of horses and it
might be a protein involved in the homeostasis of joints but further investigation is
required.
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Clonagem, caracterização e expressão de cDNAs similares a calreticulina e paramiosina isolados de glândula salivar do carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887)Ferreira, Carlos Alexandre Sanchez January 2002 (has links)
O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.
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