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Efecto de la calreticulina de Trypanosoma cruzi en la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de rataGuerrero Moncayo, Alejandra January 2017 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario.
Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / La calreticulina recombinante de Trypanosoma cruzi (rTcCRT) aplicada tóipicamente es más efectiva que su contraparte humana en inducir proliferación y migración fibroblástica in vitro, correlacionándose con los efectos in vivo de esta proteína, la cual estimula un cierre acelerado de heridas en piel de ratas.
Para estudiar una de las posibles vías por la cual podría ocurrir este proceso, se analizó la influencia directa de rTcCRT sobre la diferenciación a fibroblastos a partir de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) subcutáneo, adyacente a la herida. Para esto, se propuso detectar la expresión de genes fibrogénicos específicos en ADSC, en presencia de rTcCRT, in vitro.
Las ADSC de rata fueron aisladas y cultivadas para comprobar el potencial multilinaje a linaje osteogénico, adipogénico y fibrogénico. La diferenciación a cada linaje a través de tinción histoquímica y RT-PCR, a las cuatro semanas.
Por otro lado, se cultivaron ADSC en medio de cultivo suplementado con rTcCRT para observar el potencial efecto diferenciador a fibroblastos. Su detección se realizó a través tinción tricrómica de Mallory luego de cuatro semanas, revelando la presencia de fibras colágenas, con patrones similares a aquellos obtenidos en los controles positivos de fibroblastos dérmicos de rata. Se utilizó RT-PCR para identificar la expresión de genes fibrogénicos, mostrando una significativa expresión de genes fibrogénicos en las ADSC suplementadas con rTcCRT y una expresión no detectable en las ADSC control sin suplementar. / Recombinant Trypanosoma cruzi calreticulin (rTcCRT) topically applied is more efficient than its human counterpart on its capacity to increase fibroblastic proliferation and migration in vitro, and correlates with an accelerated rat skin wound healing process in vivo.
To study one of the possible pathways by which this process occurs, the direct influence of rTcCRT in the differentiation to fibroblasts of the subcutaneous population of rat adipose derived stem cells (ADSC) surrounding the wound, was analyzed. For this purpose, we detected the expression of specific fibrogenic genes in rTcCRT-supplemented ADSC, in vitro.
Rat ADSC were obtained and cultured to analyze their multilineage potential to osteogenic, adipogenic and fibrogenic lineages. The differentiation was detected through histological staining and RT-PCR, after four weeks of culture.
On the other hand, ADSC were cultured in supplemented growth medium supplemented with rTcCRT to observe the fibroblast differentiation-effect. The detection was accomplished by Mallory's trichrome staining direct histology after four weeks of culture, revealing the presence of collagen fibers with similar staining patterns to those obtained with rat skin fibroblasts primary cultures as positive controls. RT-PCR was also used to identify the expression of fibrogenic genes, showing significative expression of fibrogenic genes in the rTcCRT-supplemented ADSC and no detectable expression in ADSC negative control cultures. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1130257 y Proyecto U-INICIA 2036.
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Detección de calreticulina en saliva de caninos domésticos (Canis lupus familiaris) mediante criterios antigénicos y funcionalesCoddou Soto, María Francisca January 2011 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina (CRT) es una proteína filogenéticamente conservada y extremadamente pleiotrópica que, a pesar de residir en el retículo endoplásmico (RE), también se traslada al ambiente extracelular donde media efectos notables sobre los índices de aceleración y calidad de reparación tisular. Específicamente, CRT recluta la mayoría de las células involucradas en la cicatrización, estimula marcadamente la proliferación celular e incrementa la producción de proteínas extracelulares de la matriz, tales como colágeno y fibronectina, componentes indispensables en el proceso de remodelación de la herida.
Por otra parte, CRT ha sido detectada en saliva de humanos y de algunos géneros de artrópodos, como garrapatas y pulgas. Aunque el gen de calreticulina canina ha sido secuenciado, la proteína derivada no ha sido expresada, ni definida su presencia en saliva canina. El que CRT sea altamente conservada en cuanto a su estructura y funciones, permite proponer que también se encuentra en saliva de cánidos, en particular la especie doméstica (Canis lupus familiaris). Así, en caninos, el hecho conductual de lamer sus heridas podría generar un efecto pro cicatrizante, atribuible al menos en parte, a CRT. Por ello, se buscó CRT en saliva canina utilizando criterios antigénicos y funcionales.
El criterio antigénico utilizó un ensayo de electrotransferencia, donde anticuerpos policlonales dirigidos contra CRT humana (HuCRT), murina (MuCRT) y de Trypanosoma cruzi (TcCRT), junto con anticuerpos heterólogos monoclonales contra HuCRT y MuCRT, reconocieron una proteína de peso molecular aparente de 55 kDa. Entonces, derivado de su reconocimiento por cuatro anticuerpos, generados contra CRT de dos especies mamíferas y de una protozoaria, esta banda corresponde antigénicamente a CRT canina (CfCRT), molécula chaperona presente en la saliva de esta especie.
Los criterios funcionales se basan en que se ha descrito que TcCRT se une a C1 y C1q del sistema del complemento humano, brazo efector fundamental de la inmunidad adaptativa e innata, inhibiendo la ruta clásica de activación. Así, en saliva canina existe al menos un factor que se une a C1, en un ensayo de electrotransferencia de esta molécula, seguido de incubación con saliva canina y posterior visualización con anticuerpos anti CRT. Un segundo criterio funcional consideró que, dado que CRT de diversas especies interactúa con C1 del complemento, inactivando su ruta clásica, entonces CRT, en saliva canina, además de interactuar con C1 debiera inhibir la ruta clásica del sistema del complemento humano. Por ello, en un ELISA, donde la fase sólida se sensibilizó con C1 y luego se incubó con diluciones de saliva canina, se propone que la unión de CfCRT a C1, es responsable, al menos en parte, de la menor generación de C4b, lo que es indicativo de una interferencia de la molécula canina con la función de las serino proteasas asociadas al primer componente, en una situación similar previamente demostrada para TcCRT y confirmada para HuCRT
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Evaluación de calreticulina humana versus calreticulina recombinante de Trypanosoma cruzi en la inducción de tejido fibroso para la cicatrización de piel en ratasSepúlveda Núñez, Caroll January 2012 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina (CRT) es una proteína ubicua, altamente conservada, que se localiza principalmente en el retículo endoplásmico (RE), donde es elemental para el correcto plegamiento y transporte de proteínas. Se han descrito diversas funciones extracelulares para esta proteína, entre ellas, inducir la fagocitosis de células apoptóticas, y promover la migración concentración-dependiente de queratinocitos, fibroblastos, macrófagos y monocitos, estimulando la re-epitelización a través de la proliferación celular de queratinocitos y fibroblastos, procesos fundamentales para la cicatrización de heridas cutáneas. Es así como, se evaluaron diversos efectos de CRT recombinante humana (rHuCRT) y parasitaria proveniente del protozoo Trypanosoma cruzi (rTcCRT) administrada subcutáneamente en distintas concentraciones, en el proceso de cicatrización de heridas en la piel de ratas. Se comparó la efectividad de ambas proteínas en el porcentaje de re-epitelización, proliferación celular (medido como N° de células/cm2) y profundidad dérmica, tanto a los 5 como 10 días post-intervención. Los mejores resultados en la cicatrización de heridas de piel en ratas fueron obtenidos al administrar rTcCRT en menor concentración (2.500 veces menos concentrada que la dosis alta) y rHuCRT a mayor concentración. / Calreticulin (CRT) is a ubiquitous protein highly conserved mainly localized in the endoplasmic reticulum (ER), which is elementary for the proper folding and protein transport. Have been described various extracellular functions for this protein, including induction of phagocytosis of apoptotic cells and promote migration concentration-dependent keratinocytes, fibroblasts, macrophages and monocytes, stimulate re-epithelialization through cell proliferation of keratinocytes and fibroblasts, processes essential for cutaneous wound healing. Thus, we evaluated various effects of recombinant human (rHuCRT) and protozoan parasite Trypanosoma cruzi (rTcCRT) CRT administered subcutaneously at different concentrations, in the process of wound healing in the skin of rat. We compared effectiveness of both proteins in the percentage of re-epithelialization, cell proliferation (measured as numbers of cells), and dermal depth, both at 5 and 10 days post-intervention. The best results in healing of skin wounds in rats were obtained by administering rTcCRT in lower concentrations (2,500 times less concentrated than the high dose) and rHuCRT of higher concentration. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 3100021
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Estudio de regulación de ligandos de NKG2D por interleuquina 10 y su asociación con calreticulina, en trofoblasto y melanoma humanoSerrano Gómez, Antonio Enrique January 2009 (has links)
NKG2D (Natural Killer Group 2, type D) es un receptor de activación de las células
Natural Killer de sangre periférica (NK), uterinas (uNK) y TCD8+
humanos. Son ligandos de
NKG2D (NKG2DL), las proteínas relacionadas con la cadena alfa del complejo principal de
histocompatibilidad de clase I A y B (MICA y MICB) y las proteínas de unión a UL16
(ULBPs). Se han descrito variados mecanismos relacionados con la evasión tumoral y con la
tolerancia fetal que involucran el control de la síntesis de los NKG2DL, los cuales se expresan
principalmente en la superficie de células diana en situaciones de estrés, infección intracelular o
transformación maligna. Hay antecedentes que indican que la sobreexpresión de moléculas
chaperonas puede alterar el nivel de expresión en la superficie celular de proteínas de
membrana, como también algunas citoquinas pueden reducir la expresión de los NKG2DL. Se
postula que Calreticulina (CRT) se asocia con las moléculas MICA en células de trofoblasto y
en melanoma maligno y que la expresión de los ligandos MICA está influenciada por la
Interleuquina 10 (IL-10) en melanoma maligno. Mediante análisis histológicos y microscopía
confocal se determinó la superposición de MICA y MICB con calreticulina, calnexina y Erp57.
Además, se detectó co-inmunoprecipitación de CRT y MICA. Ambos estudios realizados en
cultivos celulares de trofoblasto humano de primer trimestre y en líneas de melanoma maligno
humano. Sin embargo no se detectó interacción directa entre CRT-MICA recombinantes
mediante análisis de afinidad por BIAcore. Se analizó la expresión de NKG2DL y la relevancia
funcional en líneas celulares humanas de melanoma en respuesta al estímulo con Interleuquina
10. Se utilizaron líneas de células malignas del melanoma tratadas con IL-10 para analizar
MICA/B mediante qRT-PCR y citometría de flujo. Se demostró que IL-10 disminuye la
expresión en la superficie de células de melanoma de MICA, pero no MICB. También se indicó
que la regulación de MICA se produce a nivel de mRNA, de forma dosis dependiente tanto de
citoquina humana recombinante como de la variante viral de la IL-10. Este estudio reveló
además que la disminución la MICA por IL-10 conduce a la reducción de la lisis mediada por
células citotóxicas in vitro. Esta tesis contribuye al conocimiento de las moléculas responsables
del plegamiento y retención intracelular de los NKG2DL, así como al papel de la IL-10 en la
expresión de NKG2DL, ambos mecanismos propios de la evasión inmune tumoral y de la
tolerancia fetal.
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Mecanismos antiangiogénicos de calreticulina de Trypanosoma cruziLópez Bartolucci, Nandy Carolina January 2008 (has links)
Doctor en Bioquímica / La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes. La utilización
de agentes capaces de inhibir este proceso podría ofrecer opciones terapéuticas para patologías
dependientes del abastecimiento de nutrientes a través de la sangre, como el cáncer, obesidad, o
desórdenes inflamatorios.
Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las
células nucleadas. Se ha reportado que calreticulina humana (HuCRT) y su dominio N-terminal,
vasostatina, interfieren con la angiogénesis inhibiendo la proliferación de células endoteliales y la
interacción de éstas con laminina, una proteína de la membrana basal. Previamente, hemos
descrito que CRT de T. cruzi (TcCRT), es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana
corioalantoídea de pollo. Este efecto se correlaciona con propiedades antineoplásicas reportadas
para la infección tripanosómica con varias cepas del parásito.
El objetivo de la presente Tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares que
median el efecto antitumoral de la infección chagásica, centrándose en el posible papel de TcCRT,
en virtud de posibles efectos antiangiogénicos expresados en modelos in vitro y ex vivo. Para ello
se propusieron tres Hipótesis: 1. TcCRT manifiesta efectos antiangiogénicos in vitro y ex vivo en
modelos de vertebrados, 2. El efecto antiangiogénico de TcCRT se explica, al menos en parte, por
su interacción directa con células endoteliales, inhibiendo su proliferación, y 3. La actividad
antiangiogénica de TcCRT se localiza en su dominio N-terminal (N-TcCRT), y su unión a laminina
inhibe la adhesividad de células endoteliales a ésta.
Los objetivos específicos propuestos para dar cuenta de estas hipótesis fueron: 1. Determinar si
TcCRT y su dominio N-terminal inhiben la angiogénesis en ensayos in vitro y ex vivo, a partir de
células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y de anillos de aorta de rata, 2.
Determinar si TcCRT se une a células endoteliales, 3. Estudiar el efecto comparativo equimolar de HuCRT, TcCRT y N-TcCRT sobre la proliferación de HUVECs, 4. Estudiar el efecto de TcCRT sobre la
quimiotaxis de células endoteliales, 5. Determinar si TcCRT se une a laminina 6. Determinar si la
interacción TcCRT/laminina inhibe la adhesión de HUVECs a esta última proteína y 7. Determinar el
efecto de TcCRT sobre la expresión de genes reguladores del proceso angiogénico en HUVECs.
Los ensayos ex vivo mostraron que TcCRT inhibe el crecimiento capilar en anillos aórticos de rata
en forma dosis-dependiente. N-TcCRT (aa 20-191) también inhibió completamente el crecimiento
capilar. TcCRT tuvo un efecto inhibitorio dosis-respuesta en experimentos de morfogénesis capilar
in vitro, utilizando HUVECs. Comparaciones equimolares de TcCRT con su contraparte humana,
mostraron que la molécula parasitaria y el dominio N-terminal, tienen un efecto inhibitorio
claramente superior. Los dominios R (R-TcCRT) y S (S-TcCRT) de la proteína parasitaria (aa 136-281
y 159-281 respectivamente) no afectaron la morfogénesis capilar de HUVECs. Mediante
experimentos de fluorescencia, demostramos que TcCRT se une y es internalizada por HUVECs y
células de la línea endotelial EAhy926. La internalización es inhibida por fucoidina. TcCRT inhibió la
proliferación de HUVECs en forma dosis y tiempo-dependiente. Este efecto es independiente de
apoptosis. Cuando comparamos la acción de la molécula parasitaria y de su dominio N-terminal
con la de la humana, sobre la proliferación de HUVECs, no encontramos diferencias significativas
en condiciones equimolares. R-TcCRT no tuvo efecto en la proliferación de HUVECs. Mediante
experimentos de migración, determinamos que TcCRT inhibe la migración de HUVECs y células
EAhy926 en forma dosis-dependiente. En ELISA TcCRT, R-TcCRT y S-TcCRT, se unen a laminina en
forma dosis-dependiente, pero en contraste con los resultados obtenidos con la molécula
humana, esta interacción no afecta la adhesión de las células endoteliales a esta proteína.
Finalmente, mediante experimentos de RT-PCR en tiempo real, determinamos que la incubación
de HUVECs con TcCRT por 24 h, no activa la expresión de genes antiangiogénicos.
En síntesis, en este trabajo demostramos un efecto antiangiogénico de TcCRT y su dominio Nterminal
en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies, Rattus rattus y Homo
sapiens, en ensayos ex vivo e in vitro. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la
morfogénesis capilar, proliferación y migración de las células endoteliales, y también con la
internalización de TcCRT en células endoteliales. Estas propiedades de TcCRT podrían explicar, al menos en parte, la resistencia relativa a ciertas agresiones por tumores sólidos inducida por
infecciones tripanosómicas / Angiogenesis is the growth of new blood vessels from the pre-existing ones. The use of agents
capable of inhibit this process would offer therapeutic options for pathologies dependent on blood
supplied nutrients, such as cancer, obesity and inflammatory disorders.
Calreticulin (CRT) is a multifunctional, highly conserved protein, expressed in every nucleated cell.
It has been reported that human calreticulin (HuCRT), and its N-terminal domain, vasostatin,
interferes with angiogenesis by inhibiting endothelial cell proliferation and their attachment to
laminin, a basement membrane protein, by binding to it. Previously, we have described that T.
cruzi calreticulin (TcCRT) is antiangiogenic in the in vivo chorioalantoid membrane chicken assay,
which correlates with the reported anti-neoplasic properties for trypanosomic infection with
several strains of the parasite.
The aim of the present Thesis was to contribute furthermore to the knowledge of the cellular
mechanisms that mediate the antitumoral effect of chagasic infection, focusing on the possible
role of TcCRT, expressed in in vitro and ex vivo models. We proposed three Hypotheses: 1. TcCRT
shows antiangiogenic effects in in vitro and ex vivo vertebrate models, 2. The TcCRT antiangiogenic
effect is explained, at least partly, by its direct interaction with endothelial cells, inhibiting their
proliferation, and 3. the antiangiogenic TcCRT activity is located on its N-terminal domain (NTcCRT),
and its binding to laminin inhibits endothelial cell attachment.
The proposed specific objectives were: 1. To determine if TcCRT and its N-terminal domain inhibits
angiogenesis in in vitro and ex vivo assays, on human vein endothelial cells (HUVECs) and rat aortic
rings, 2. To determine if TcCRT binds to endothelial cells, 3. To study the equimolar comparative
effect of HuCRT, TcCRT and N-TcCRT on HUVECs proliferation, 4. To study the TcCRT effect on
endothelial cell chemotaxis, 5. To determine if TcCRT binds to laminin, 6. To determine if
TcCRT/laminin interaction inhibits endothelial cell attachment to laminin and 7. To determine the
TcCRT effect on the expression of angiogenic genes in HUVECs. The ex vivo assays showed that TcCRT inhibits capillary growth on rat aortic rings, in a dosedependent
manner. Complete capillary growth abrogation was also observed with N-TcCRT (aa 20-
191) incubation. TcCRT had a dose-response inhibitory effect in in vitro capillary morphogenesis
experiments on HUVECs. When TcCRT and N-TcCRT were compared at equal molarities with
HuCRT, the effects of the parasite derived molecules were clearly stronger than those of the
human counterpart. The R (R-TcCRT) and S (S-TcCRT) domains of the parasite protein (aa 136-281
and 159-281 respectively) did not affect capillary morphogenesis. By fluorescence experiments we
demonstrated that TcCRT binds and is internalized by HUVECs and EAhy926 endothelial cell line.
The internalization was competed by fucoidan. TcCRT inhibited HUVECs proliferation in a dose and
time-dependent manner. This effect is apoptosis independent. Non significant differences were
observed in the proliferation inhibition capacity at TcCRT, N-TcCRT and HuCRT equimolar
concentrations. R-TcCRT had no significant effect on HUVECs proliferation. HUVECs and EAhy cells
migration was inhibited by TcCRT in a dose-response manner. TcCRT and its R and S domains bind
to laminin in ELISA assays, but in contrast to the observed effects of the human molecule, this
interaction does not impedes cell attachment to this protein. Finally by carrying out real time RTPCR
experiments, we determined that HUVECs incubation with TcCRT for 24 h, does not activate
the antiangiogenic gene expression.
In synthesis, in this work we demonstrated an antiangiogenic effect of TcCRT and N-TcCRT on
arterial and venous endothelial cells from two species, Rattus rattus and Homo sapiens, in ex vivo
and in vitro assays. This effect correlates to capillary morphogenesis, proliferation and migration
inhibition of endothelial cells, and also with TcCRT internalization to endothelial cells. These
properties could explain, at least partly, the relative resistance to certain solid tumor aggressions
induced by trypanosomic infections
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Expresión de calreticulina y su relación con el factor de crecimiento nervioso en cáncer ovárico epitelialVera Castillo, Carolina Andrea January 2011 (has links)
Magister en Bioquímica área de
especialización en Bioquímica Clínica y
Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En el cáncer ovárico epitelial (COEI), el ovario pierde el control normal de la angiogénesis.
El COE exhibe alta expresión del Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), un factor proangiogénico.
Por otro lado, la calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional con
propiedades anti-angiogénicas. Su exposición en la cara extracelular de la membrana plasmática
de células tumorales en proceso de muerte celular es necesaria para que éstas sean reconocidas y
fagocitadas por células dendríticas.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de CRT en muestras humanas: ovarios
normales inactivos, tumores benignos, tumores borderline y muestras de cáncer ovárico epitelial.
Además, evaluar si el NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales normales de la
superficie ovárica humana (células HOSE) y en una línea celular de cáncer ovárico epitelial
(A2780).
Los niveles de mRNA y proteicos de CRT fueron evaluados mediante RT-PCR, western-blot
e inmunohistoquímica en un total de 67 muestras ováricas humanas. La expresión de CRT
inducida por estimulación con NGF en líneas celulares fue evaluada por RT-PCR, western-blot e
inmunocitoquímica.
Los niveles de mRNA de CRT aumentaron en muestras de cáncer ovárico epitelial
comparado con ovarios normales inactivos, tumores benignos y tumores borderline. Los niveles
proteicos resultaron mayores en cáncer con respecto a tumores benignos y tumores borderline.
Al estimular las líneas celulares HOSE y A2780 con NGF (100 ng/ml) por 30 minutos, no se
observaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de mRNA. Sin embargo, a
través de inmunocitoquímica y western-blot se observó un aumento significativo en los niveles
proteicos de CRT al estimular con NGF comparado con la situación control. Este efecto fue
revertido por GW441756, un inhibidor específico del receptor de NGF, TRKA.
Estos resultados sugieren que NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales ováricas
mediante la activación de su receptor de alta afinidad TRKA / In epithelial ovarian cancer (EOC), the ovary loses the normal control of angiogenesis. EOC
exhibits high expression of Nerve Growth Factor (NGF), a proangiogenic protein. On the other
hand, calreticulin (CRT) is a multifunctional protein with anti-angiogenic properties. Its
exposure on the cell membrane of dying tumor cells is necessary to promote their recognition
and engulfment by dendritic cells.
The aim of this work was to evaluate CRT expression in human samples: normal inactive
ovaries, benign tumors, borderline tumors and epithelial ovarian cancer samples. Besides, to
evaluate whether NGF regulates CRT expression in human ovarian surface epithelium cells
(HOSE cells) and in an epithelial ovarian cancer cell line (A2780).
Calreticulin mRNA and protein levels were analyzed by RT-PCR, western-blot and
immunohistochemistry in 67 human ovarian samples. CRT expression induced by NGF
stimulation in cell lines was evaluated by RT-PCR, western-blot and immunocytochemistry.
CRT mRNA levels were elevated in epithelial ovarian cancer samples as compared to
inactive normal ovaries, benign tumors and borderline tumors. CRT protein levels, evaluated by
western-blot, were increased in epithelial ovarian cancer with respect to benign and to borderline
tumors. When HOSE and A2780 cell lines where stimulated with NGF (100 ng/ml) for 30
minutes, no significant increase in CRT mRNA levels, evaluated by RT-PCR, was found.
However, by immunocytochemistry and western-blot there was a significant increase in CRT
protein levels after NGF stimulation, as compared to controls. This effect was reverted by
GW441756, a TRKA specific inhibitor, receptor for NGF.
These results suggest that Nerve Growth Factor regulates CRT expression in epithelial
ovarian cells through TRKA activation, its high affinity receptor
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Estudio de la secreción de Tax, su interacción con Calreticulina y sSEMA-4D en linfocitos infectados con HTLV-I y su efecto sobre las actividades quinásicas y fosfatásicas en células PC12 durante su diferenciación a tipo neuronalQuintremil Fuentes, Sebastián Andrés 12 1900 (has links)
Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica de proteínas recombinantes y Memoria de título de bioquímico / El HTLV-I (Virus Linfotrópico humano Tipo I) puede causar dos enfermedades, la Mielopatía asociada al HTLV-I/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP), una axonopatía neurodegenerativa central donde existe falla en el transporte axonal y la Leucemia de células T del adulto (ATL), una neoplasia agresiva. El HTLV-I infecta principalmente linfocitos T CD4+. No se ha detectado infección por HTLV-I en neuronas, desconociéndose el mecanismo por medio del cual se produce la neurodegeneración en HAM/TSP. Algunos productos virales secretados por linfocitos infectados infiltrados en el sistema nervioso central podrían afectar vías intracelulares relacionadas con el citoesqueleto axonal, produciendo el daño evidenciado en pacientes HAM/TSP.
Los productos secretados por células MT2 (linfocitos infectados con HTLV-I) disminuyen la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12 durante su diferenciación a tipo neuronal. Entre las proteínas virales secretadas se encuentra Tax, que se ha asociado fuertemente al desarrollo de HAM/TSP. La disminución de la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12 podría estar mediada por Tax, o bien por otras proteínas secretadas por estos linfocitos como sSEMA-4D (Semaforina 4D soluble) la cual participa como guía axonal negativo pudiendo producir detención del crecimiento neurítico. Esta proteína soluble es generada por medio de proteólisis de SEMA-4D unida a la membrana plasmática por metaloproteinasas de matriz (MMPs). En linfocitos infectados con HTLV-I existe un desbalance entre las actividades de MMPs y sus inhibidores tisulares lo que podría provocar mayor cantidad de sSEMA-4D, causando así detención del crecimiento axonal. Además, Tax interacciona intracelularmente con la chaperona de retículo endoplásmico Calreticulina (CRT) en linfocitos infectados, pero se desconoce si esta interacción se mantiene una vez que Tax es secretada.
En esta tesis se propuso que “La proteína Tax secretada desde linfocitos infectados con HTLV-I, complejada con Calreticulina y/o SEMA-4D soluble, produce disminución del largo neurítico durante la diferenciación a tipo neuronal de células PC12 asociado al aumento de la actividad quinásica (CDK5 y GSK3ß) y disminución de la fosfatásica (PP2A)”. Los objetivos planteados incluyeron estudiar: a) el mecanismo de secreción de Tax y CRT; b) si había interacción extracelular entre Tax, CRT y sSEMA-4D; c) el efecto de Tax, CRT y sSEMA-4D sobre el proceso de diferenciación neuronal de la línea PC12 y d) si en células PC12 se producían cambios en las actividades quinásicas de GSK3ß y CDK5, y fosfatásica de PP2A por acción de productos secretados por linfocitos infectados con HTLV-I.
Los resultados mostraron que en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes HAM/TSP existe una correlación positiva entre las cantidades de Tax y CRT secretadas determinadas por Western-blot, siendo esta secreción dependiente de la vía retículo endoplásmico-aparato de Golgi.
Por otra parte, efectivamente se identificó la interacción de Tax tanto con sSEMA-4D como con CRT en medios de cultivo de PBMCs de pacientes HAM/TSP.
Mediante el bloqueo de Tax, sSEMA-4D y CRT con anticuerpos se demostró la participación extracelular de Tax y sSEMA-4D, probablemente actuando como un complejo, pero no de CRT en la disminución del largo neurítico en células PC12 cultivadas con medios condicionados de linfocitos infectados con HTLV-I (medio condicionado de células MT2).
Respecto a las actividades quinásicas y fosfatásicas, se encontró que en células PC12 cultivadas con medios condicionados de células MT2 la actividad de GSK3ß no se altera, en cambio la de CDK5 disminuye, observándose también una menor proporción de PP2A fosforilada en Y307 (fosforilación inactivante), lo que sugiere una mayor actividad fosfatásica. Esto concuerda con la menor fosforilación en el residuo T181 de Tau, sustrato tanto de CDK5 como de PP2A.
Aunque los resultados encontrados no apoyan la hipótesis planteada, la disminución de la actividad de CDK5 y la probable mayor actividad fosfatásica PP2A también pueden estar asociadas con la disminución en el largo neurítico en células PC12 producido por productos secretados por linfocitos infectados con HTLV-I. Este efecto podría ser mediado por sSEMA-4D y Tax que interaccionan, abriendo la posibilidad de que estén actuando como complejo sobre los receptores Plexinas (receptores de semaforinas) que están directamente relacionados con colapso del cono de crecimiento axonal, dando luces sobre cómo el HTLV-I podría producir paraparesia en pacientes infectados. / The HTLV-I (Human T-cell Lymphotropic Virus Type-I) may cause two diseases, the HTLV-I Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP), a neurodegenerative central axonopathy with axonal transport failure, and the Adult T-cell Leukemia (ATL), an aggressive neoplasia. HTLV-I infects mainly CD4+ T lymphocytes. No evidence of neuron infection with HTLV-I has been detected, therefore the molecular mechanisms associated with the neurodegeneration in HAM/TSP remain unclear. Viral products secreted from infected lymphocytes infiltrated in the central nervous system may affect intracellular pathways related with axonal cytoskeleton producing damage in HAM/TSP patients.
Secreted products from MT2 cells (lymphocytes infected with HTLV-I) decrease the rate of neurite growth of PC12 cells at the third day of differentiation to neuronal type. The viral protein Tax is strongly associated with HAM/TSP progression. The decrease in neuritic length of PC12 cells could be mediated either by Tax or by other proteins secreted from these lymphocytes, for example sSEMA-4D (soluble Semaphorin 4D) that serves as negative axonal guide being capable of producing detention of the axonal outgrowth. This soluble protein is generated by the proteolytic release of the membrane-bound SEMA-4D by Matrix Metaloproteinases (MMPs). In HTLV-I infected lymphocytes there is an imbalance in the activities of MMPs and their tissular inhibitors that could produce a large extent of sSEMA-4D, causing detention of the axonal outgrowth. Also, Tax interacts with the endoplasmic reticulum chaperone Calreticulin (CRT) in infected lymphocytes, although it is unknown if this interaction is maintained once Tax is secreted.
In this Thesis we proposed that “Secreted Tax protein from HTLV-I infected lymphocytes, complexed with Calreticulin and/or soluble SEMA-4D, reduces the neuritic length during PC12 differentiation to neuronal type, associated with an increase of kinase activities (CDK5, GSK3β) and a decrease in phosphatase activity (PP2A)”. The objectives include to study: a) the mechanism of Tax and CRT secretion; b) the existence of extracellular interaction between Tax, CRT and sSEMA-4D; c) the effect of Tax, CRT and sSEMA-4D on the neuronal differentiation process of PC12 cell line, and d) whether extracellular Tax produces in PC12 cells changes in activities of the kinases CDK5 and GSK3β, and the phosphatase PP2A.
The results showed a positive correlation between secreted Tax and CRT amounts determined by Western-blot in Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) of HAM/TSP patients. This secretion was dependent of the Endoplasmic Reticulum–Golgi Apparatus pathway.
We identified interaction of Tax with both sSEMA-4D and CRT in the culture medium of PBMCs from HAM/TSP patients.
Antibody-mediated blocking demonstrated the participation of both Tax and sSEMA-4D in neurite length decrease of PC12 cells cultured with conditioned media of HTLV-I infected lymphocytes (MT2 cells conditioned media).
Respect to kinase and phosphatase activity participation, we determined that in PC12 cells cultured with MT2 conditioned media, GSK3ß activity was not altered, while that of CDK5 was diminished, finding also a lower ratio of phosphorylated PP2A at Y307 (inactivating phosphorylation) that suggests an increase in its phosphatase activity. These results agree with the lower phosphorylation at T181 of Tau, substrate of both CDK5 and PP2A.
Although these results do not support the proposed hypothesis, the reduction on CDK5 activity and higher phosphatase activity also may be involved with the reduction of PC12 neuritic length in response to products secreted by HTLV-I infected lymphocytes. This effect could be mediated by the participation of sSEMA-4D and Tax. In consideration of the identified interaction between them, the results open the possibility that they are acting together as a complex on Plexin receptors (Semaphorin receptors) giving us new insights about the mechanism by which the HTLV-I produces HAM/TSP in infected patients. / Fondecyt
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Modificaciones postraduccionales e interacción con calreticulina de la proteína viral Tax en linfocitos infectados con HTLV-I y su relación con la evolución de la paraparesia espástica tropicalMedina Ferrer, Fernando Edmundo January 2010 (has links)
Tesis Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímico / El virus linfotrópico humano tipo I o HTLV-I es un retrovirus humano que infecta principalmente Linfocitos T CD4+ y es capaz de provocar dos patologías; la Leucemia de Células T en el Adulto (ATL), y la Mielopatía Asociada al HTLV-I/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP), una enfermedad neurodegenerativa progresiva que se caracteriza por ser una axonopatía de carácter central originada por un trastorno en el transporte axoplásmico. A pesar de conocerse bastante sobre las características del HTLV-I, aún no se conocen los mecanismos moleculares involucrados en la patogénesis de HAM/TSP y en la evolución de la infección durante la enfermedad.
En HAM/TSP, el daño está asociado a la presencia del HTLV-I en linfocitos infiltrantes en el sistema nervioso central, en donde la proteína viral Tax, principal transactivador de genes virales y celulares, jugaría un papel relevante en el trastorno funcional de estas células, y posiblemente sobre las neuronas afectadas en la patología. Se postula que Tax secretada desde linfocitos infectados altera el transporte axonal en las neuronas motoras y con ello podría dar cuenta de la patogénesis de HAM/TSP.
Se ha descrito recientemente una modulación de la actividad transactivadora de Tax mediada por modificaciones postraduccionales en ella, las cuales incluyen Ubiquitinación y Sumoilación. Principalmente estas modificaciones regulan la localización subcelular de Tax. Se postula hasta el momento que su ubiquitinación es señal de localización citoplasmática y su sumoilación, de localización nuclear. Esto último podría dar cuenta de la progresión en la ATL, pero aún no se han relacionado con la evolución de la infección viral en HAM/TSP. También se ha descrito recientemente la interacción de Tax con Calreticulina, lo que podría aumentar la exportación nuclear de la primera y su secreción al medio extracelular, pero hasta el momento no se ha relacionado directamente esta interacción con la secreción de Tax, lo que traería consecuencias directas sobre la etiología y progresión de HAM/TSP.
En este trabajo se identifican las modificaciones postraduccionales en la proteína viral Tax mediante western blot a partir de la línea linfocitaria MT-2, la cual contiene el genoma del HTLV-I en la forma de provirus, y de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) de individuos con HAM/TSP. Estos estudios tienen como objeto identificar las modificaciones postraduccionales de Tax en linfocitos infectados para poder relacionarlas con el nivel funcional de pacientes HAM/TSP. En células MT-2 se encontró una forma de 71 kDa de Tax, de peso molecular mayor al teórico de 40 kDa, la cual no se encuentra modificada por las proteínas pequeñas Ubiquitina y SUMO, pero si se encuentra N-glicosilada y probablemente corresponde a una proteína de fusión viral gp21-Tax. Al analizar Tax desde PBMC de pacientes infectados, sólo se pudo identificar la presencia de una banda de 58 kDa correspondiente a Tax presente en los medios de cultivos de las células. Esta proteína secretada se encuentra Ubiquitinada, pero no se encontraron diferencias significativas en los niveles de Tax modificada entre los distintos grupos de pacientes con diversa evolución de HAM/TSP estudiados.
Se cuantificaron también los niveles de Calreticulina en células MT-2 y PBMC de individuos infectados, y se estableció la interacción entre Tax y Calreticulina en células MT-2. En los medios de cultivo de PBMC se encontró un aumento significativo de los niveles de una especie de Calreticulina a 56 kDa de los individuos infectados con HTLV-I. Se estableció una relación directa entre las cantidades de Tax y Calreticulina de 56 kDa secretadas al medio de cultivo. Esto último puede tener especial relevancia en los mecanismos de secreción de ambas proteínas y en los efectos extracelulares de las mismas
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Estandarización de ensayos inmunométricos para determinar la reactividad de sueros humanos con calreticulina recombinante de Trypanosoma cruziWilliams Monreal, Pamela Elisa January 2005 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El protozoo flagelado Trypanosoma cruzi es el agente causal de una de las endemias de mayor relevancia para la Salud Pública en América Latina, la Enfermedad de Chagas. Es una patología zoonótica que afecta aproximadamente a 18 millones de individuos en Sudamérica y alrededor de 150.000 en Chile.
El diagnóstico de esta enfermedad es principalmente serológico, basándose en la detección inmunométrica de IgG contra antígenos parasitarios o el parásito completo. Esta metodología tiene la desventaja que, a pesar de tener un alta sensibilidad, la presencia de reacciones cruzadas con otros tripanosomátidos disminuye la especificidad del método. Este problema no es de mayor relevancia en Chile, ya que no existen datos acerca de la existencia de otros parásitos que pudieran producir resultados falsos positivos.
Con el objetivo de mejorar la calidad del diagnóstico, numerosos laboratorios han desarrollado ensayos que usan proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de T. cruzi. Se ha descrito que tanto sueros de ratones desafiados con tripomastigotes, como sueros humanos infectados con el parásito, presentan una respuesta humoral dirigida contra una proteína de 45 kDa de T. cruzi, descrita en el laboratorio donde se desarrolló esta Memoria, llamada en un comienzo Tc45, hoy día identificada como calreticulina de T. cruzi, TcCRT.
En esta Memoria de Título se propone estandarizar ensayos inmunoenzimáticos para determinar la reactividad de sueros humanos con calreticulina recombinante de T. cruzi (rTcCRT), con el fin de aportar datos con un posible potencial diagnóstico de la enfermedad.
Se utilizaron sueros humanos seropositivos y seronegativos a T. cruzi (según criterio del Centro de Referencia Nacional, ISP, Chile), y se desarrollaron ensayos inmunoenzimáticos utilizando extracto parasitario completo y calreticulina recombinante del parásito, para evaluar y comparar la reactividad de los sueros en estudio con estos reactivos. Además, se utilizaron inmunoglobulinas monoclonales y policlonales, dirigidas contra rTcCRT, para sensibilizar las placas de ELISA.
Los resultados demostraron que el ensayo inmunoenzimático directo, utilizando extracto parasitario completo, es un buen método diagnóstico que permite discriminar entre individuos infectados y no infectados, ya que la especificidad de este ensayo no estaría comprometida, en Chile, por la presencia de reacciones no deseadas con otros tripanosomátidos.
Aunque los resultados obtenidos en los ensayos indirectos no favorecen un valor diagnóstico para rTcCRT, indican que tanto en individuos infectados, como en individuos normales, la presencia de anticuerpos anti – TcCRT es un hecho frecuente. En los individuos seropositivos, este hecho se puede explicar por numerosos factores, tanto del hospedero como del parásito. En los individuos seronegativos, que no han estado en contacto con el parásito, al igual que en los seropositivos, se presume que la presencia de reactividad contra TcCRT podría tener un origen autoinmune, además de otros factores que se discuten en esta Memoria.
A pesar que el ensayo de captura de la proteína nativa desde extracto parasitario con inmunoglobulinas policlonales lapinas anti rTcCRT ofrecía una posibilidad atractiva para discriminar entre sueros positivos y negativos, experimentos posteriores sugieren que la inmunogenicidad de nTcCRT es sólo una parte menor de un conjunto de otras interacciones complejas (no necesariamente inmunológicas), participantes en el ensayo. Una contribución inesperada de estos ensayos, es la participación paradójica de la fase sólida (representada por el PVC de la placa de ELISA, sensibilizada con inmunoglobulinas lapinas, inmunes o no, y la proteína saturante inespecífica). Así, independientemente de la especificidad de los anticuerpos unidos al PVC, se unieron antígenos parasitarios, inmunogénicos en humanos y discriminatorios entre sueros positivos y negativos. Es obvia, entonces, la necesidad futura de identificar estos antígenos parasitarios / Financiamiento: Proyecto FONDECYT Nº 1010930
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Calreticulina de Trypanosoma cruzi: modulación, por fragmentos inmunoglobulínicos F(ab')2, de su capacidad inhibidora del sistema del complemento humanoRamírez Toloza, Galia Andrea January 2005 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas, producida por el protozoo Trypanosoma cruzi, afecta aproximadamente 18 millones de personas en Latinoamérica, existiendo alrededor 200.000 individuos infectados en Chile. En nuestros días, aún no existe vacuna y el tratamiento farmacológico de los casos crónicos es de escasa eficacia, constituyendo uno de los más importantes problemas de salud pública y socioeconómicos de nuestro continente. Aunque el agente causal infecta a todos los mamíferos, no existe información sobre el impacto patológico en animales con valor afectivo o productivo. Numerosos son los antígenos inmunodominantes que se han descrito relacionados con el agente. Uno de ellos es calreticulina, proteína multifuncional altamente conservada presente en el retículo endoplásmico de todas las células de los organismos superiores, con excepción de eritrocitos. Actualmente, el Laboratorio donde se realizó esta Memoria (Inmunología de la Agresión Microbiana, Programa de Inmunología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile) ha centrado su interés en tres funciones de calreticulina de T. cruzi (TcCRT), tales como: inhibición del sistema del complemento, capacidad ligante de calcio y propiedades anti-angiogénica. Los tripomastigotes infectantes de Trypanosoma cruzi, evaden la respuesta inmune. In vitro, el dominio S de TcCRT (TcS), une C1q del complemento humano, inhibiendo la activación de la ruta clásica. TcCRT induce inmunidad humoral (IgG) in vivo. Por ello, en un intento para generar un correlato in vitro de posibles situaciones inmunomoduladoras de la interacción in vivo entre TcCRT y C1q, se generaron fragmentos inmunoglobulínicos F(ab’)2 anti-TcS y anti-TcCRT recombinante (rTcCRT). Para esto, se inmunizaron conejas con ambos antígenos. Todas respondieron a las inmunizaciones produciendo sueros con alto título de inmunoglobulinas. Estas fueron purificadas por cromatografía de afinidad y se obtuvo la fracción IgG. Los anticuerpos policlonales se sometieron a una digestión enzimática, obteniendo sus fragmentos F(ab’)2, los cuales, fueron purificados y utilizados en un ensayo de ELISA para intentar bloquear la unión de rTcCRT a C1q del complemento humano.
En síntesis, tanto rTcCRT como su dominio funcional TcS fueron inmunogénicos, obteniéndose anticuerpos policlonales, de los que se generaron fragmentos F(ab’)2, capaces de bloquear la unión de rTcCRT y TcS a C1q del complemento humano, representando un posible correlato de las situaciones in vivo
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