Neste estudo avaliamos a ocorrência de fagocitose por parte de alguns tipos celulares presentes na hemolinfa do carrapato bovino B. microplus e a produção de espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune. As técnicas empregadas para avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio foram luminescência amplificada por luminol, oxidação de fenol vermelho, microscopia de fluorescência e fluorimetria com o corante dihidrorrodamina 123 (DHR). Observamos um aumento da luminescência amplificada por luminol quando hemócitos foram incubados na presença de bactérias Micrococcus luteus ou zimosam ou PMA. Esta luminescência foi inibida por superóxido dismutase (SOD) e por catalase (CAT), enzimas antioxidantes que removem superóxido e peróxido de hidrogênio, respectivamente. LPS não elicitou aumento da luminescência dos hemócitos em relação ao controle. Através da oxidação de fenol vermelho em reação inibida por CAT, verificamos aumento nos níveis de H2O2 produzido pelos hemócitos quando estimulados com PMA e Micrococcus luteus, enquanto não houve aumento quando o estímulo foi LPS, corroborando os resultados da luminescência. Usando microscopia de fluorescência para avaliar a produção de ERO pelos hemócitos, encontramos que cerca de 25% dos hemócitos fluorescem com maior intensidade quando estimulados com zimosam, sendo esta fluorescência inibida por CAT. Através de fluorimetria usando DHR observamos um aumento na intensidade de fluorescência dos hemócitos estimulados com PMA em reação inibida por cisteína, substância redutora que remove peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Nosso conjunto de resultados permitem concluir que os hemócitos do carrapato bovino produzem espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune, semelhantemente ao que ocorre em vertebrados e em invertebrados como moluscos, crustáceos e insetos. Este é o primeiro trabalho mostrando produção de ERO pelos hemócitos de aracnídeos. / The phagocytic activity and the reactive oxygen species (ROS) production during immune response of some hemocytes of the cattle tick Boophilus microplus were evaluated in this study. The ROS production was evaluated by luminol amplified luminescence, phenol red oxidation, dyhydrorhodamine (DHR) fluorescence microscopy and fluorimetry. The luminol-amplified luminescence increased when hemocytes were incubated with bacteria (Micrococcus luteus) or zymosam or phorbol 12-miristate 13 acetate (PMA). The superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), antioxidant enzymes that removes superoxide and hydrogen peroxide, respectively, inhibited this luminescence. Lipopolysaccharide (LPS) did not elicit luminescence of hemocytes in relation to controls. The catalase-inhibittable phenol red oxidation assay also showed an increase in the level of hydrogen peroxide produced by hemocytes stimulated with PMA or Micrococcus luteus. LPS did not stimulate the hemocytes, similarly to the observed by luminescence assay's. We also evaluated ROS production by fluorescence microscopy and we found approximately 25% more fluorescent hemocytes when zymosam was used. This fluorescence was inhibited by catalase. In DHR fluorimetry assay we observed an increase in the intensity of fluorescence in PMA stimulated hemocytes. This fluorescence was inhibited by cystein, a reducing agent that removes hydrogen peroxide and peroxinitrite. We conclude that hemocytes of the tick, like other invertebrate such as mollusks, crustaceans and insects and vertebrate, produce reactive oxygen species during the immune response. This is the first report of reactive oxygen species production by arachnid hemocytes.

O carrapato Amblyomma cajennense é o principal vetor da bactéria Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB). Os estágios imaturos destes artrópodes apresentam uma baixa especificidade para os hospedeiros, o que aumentam as chances de parasitismo em humanos. Nos anos de 2011 e 2012, a vigilância epidemiológica da FMB registrou 140 casos confirmados e letalidade de 50 por cento , a maior incidência desde a regulamentação da notificação compulsória no Estado de São Paulo, em 2001. Além disso, estudos indicam uma tendência de aumento de expansão geográfica e de número de casos da doença. A fim de aplicar medidas de controle para a FMB, a determinação de quais são os animais hospedeiros para as fases imaturas do carrapato é importante para identificar as fontes de infecção de bactérias. Entre a literatura científica não havia estudos sobre esse escopo para carrapatos da América do Sul. Neste estudo, uma abordagem para a detecção de hábito alimentar de A. cajennense foi padronizada. Resumidamente, as amostras de sangue foram coletadas a partir das seguintes espécies animais: frango, capivara, codorna, cavalo, cobaia, coelho, cachorro e um camundongo silvestre. Em seguida, o DNA foi extraído a partir destas amostras e, depois, testado para a amplificação por PCR utilizando-se três pares de diferentes oligonucleotídeos iniciadores para mamíferos, três para aves e cinco para os dois grupos de animais, além de oligonucleotídeos iniciadores específicos desenhados para roedores cricetídeos. Os genes alvos 12S rDNA, cyt b e COI resultou em positivo para a detecção de fragmentos de DNA. Por PCR foi testado posteriormente em laboratório repastos de carrapatos. Carrapatos adultos de A. cajennense que foram alimentados em coelhos quando larvas e ninfas tiveram o intestino extraído e processado para o isolamento de DNA que foi submetido à amplificação por PCR. Foi possível identificar a espécie hospedeira em 66,7 por cento dos carrapatos testados. O sequenciamento de DNA e a comparação das sequências consenso com todas as sequências do banco de dados (GenBank) permitiu a identificação em nível de espécie (coelho), com base em 98 por cento de similaridade. / The tick Amblyomma cajennense is the main vector of the bacterium Rickettsia rickettsii, the etiological agent of brazilian spotted fever (BSF). The subadult stages of this arthropod present a low specificity for hosts, which increases the chances of parasitism in humans. In the years of 2011 and 2012, the BSF epidemiological surveillance recorded 140 confirmed cases and 50 per cent case-letality rate, the highest incidence since the regulation of the compulsory notification in the State of São Paulo, in 2001. Furthermore, studies indicate an increase trend for geographical expansion and number of cases of the disease. In order to apply control measures for BSF, the determination of which is the vertebrate hosts for the immature stages of the tick is important to identify the sources of infection of bacteria. Among the scientific literature there was no studies on this scope for ticks of South America. In this study, it was standardized a approach for detection of feeding habits of A. cajennense. Briefly, blood samples were collected from the following animal species: chicken, capybara, quail, horse, guinea pig, rabbit, dog and a wild mouse. Then, DNA was extracted from these samples and afterwards tested for PCR amplification using three different pairs of primers for mammals, three for birds, and five for both groups of animals in addition to a specific designed primers for cricetidae rodents. The target gene 12S rDNA, cyt b and COI resulted in positive for detection of DNA fragments. PCR was tested thereafter on laboratory fed ticks. Adult A. cajennense ticks that were fed on rabbits as larvae and nymphs had the midguts extracted and processed for DNA isolation and underwent PCR amplification. It was possible to identify the host species on 66,7 per cent of tested ticks. The DNA sequencing and comparison of the consensus sequences of all the database sequences (GenBank) allowed the identification at the species level (rabbit), based on 98 per cent similarity.

Orientador: Maria Izabel Camargo Mathias / Coorientador: Patrícia Rosa de Oliveira / Banca: Gervasio Henrique Bechara / Banca: Erik Daemon de Souza Pinto / Resumo: Carrapatos são ectoparasitas obrigatoriamente hematófagos que podem transmitir diversas doenças aos hospedeiros durante o seu processo de alimentação. Ao lesionar mecanicamente o tecido acabam induzindo respostas inflamatórias na pele, local onde se fixam. Na tentativa de minimizar a ação destes sobre os hospedeiros tem-se recorrido ao controle químico por meio da utilização de diversos produtos, dentre estes a selamectina, princípio ativo de muitos acaricidas, inclusive do Revolution® (Pfizer), uma lactona macrocíclica capaz de causar danos neurotóxicos no carrapato. Foi objetivo deste trabalho analisar, por meio de técnicas histológica, histoquímica, detecção da atividade da fosfatase ácida (enzimas hidrolíticas responsáveis pela detecção de morte celular autofágica) e microscopia confocal de varredura a laser, a ocorrência de alterações morfofisiológicas na pele de coelhos hospedeiros expostos à selamectina e infestados por Rhipicephalus sanguineus adultos. Os coelhos (n=12) foram expostos ao produto nas concentrações de 100% (grupo de tratamento I - GTI) e de 80% (grupo de tratamento II - GTII) e posteriormente infestados apresentaram no exame histológico diminuição da espessura da camada córnea do epitélio, o qual sofreu diminuição da quantidade de camadas celulares (adelgaçamento), processo este acompanhado pela formação acentuada de edemas subepidérmicos (com aumento de exudato), o que provocou a desorganização das fibras colágenas do tecido conjuntivo da camada dérmica. Os testes histoquímicos revelaram forte marcação PAS positiva nos folículos pilosos e em algumas regiões da derme e ressíntese de fibras colágenas demonstrada por meio da técnica do tricômico de Mallory. Os resultados obtidos para a detecção da atividade da fosfatase ácida nos indivíduos expostos às... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ticks are ectoparasites obligatorily hematophagous that can transmit various diseases to their hosts during the feeding process. By mechanically injured in the tissue eventually inducing inflammatory responses in the skin where they attach. In an attempt to minimize their action on the host has recourse to chemical control through the use of various acaricides, among these selamectin, the active principle of many acaricides, including the Revolution ® (Pfizer), a macrocyclic lactone capable of causing neurotoxic damage. This study aimed to analyze, using histological techniques, histochemical, detection of acid phosphatase activity (hydrolytic enzymes responsible for the detection of autophagic cell death) and confocal laser scanning, the occurrence of morphophysiological changes in the skin of hosts rabbits exposed to the selamectin and infested by adults of Rhipicephalus sanguineus. The rabbits (n=12) exposed to the product at concentration of 100% (treatment group I - TGI) and 80% (treatment group II - TGII) and infested showed, in histologic examination, a partial and/or complete decrease in the stratum corneum of epithelium, which suffered a decrease in the amount of cell layers with consequent reduction of stratification (thinning) of the epithelium and marked subepidermal edema formation (with increase of exudates) which caused the disorganization of the collagen fibers of the connective tissue of the dermal layer. Histochemical tests showed strong staining PAS positive in hair follicles and in some regions of the dermis, and the resynthesis of collagen fibers has been demonstrated by Mallory trichrome technique. The confocal images corroborate the results of the histological analysis, showing the thinning of the epithelium of the individuals' skin of the treatment groups I and II (TGI and TGII), where this layer... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-09. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:54:19Z : No. of bitstreams: 1 000864292.pdf: 560822 bytes, checksum: 00619648648254d006882132faf2729b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / We investigated the presence of promastigotes of Leishmania spp. by immunohistochemical method in intestines, ovaries and salivary glands of Rhipicephalus sanguineus ticks in dogs. In this study, was used, 66 dogs positive and 33 negative for Leishmania spp. by immunoenzymatic test (ELISA), direct cytological examination and by polymerase chain reaction (PCR). A total of 990 ticks were collected from these 99 dogs, 10 per animal and these were dissected, with further separation of the intestines, ovaries and salivary glands. Slides of these organs were made for the implementation of immunohistochemistry (IHC). Also the real-time PCR was performed in these organs as well as the quantification of that parasite load. For real-time PCR of the guts, ovaries and salivary glands of ticks were detected positivities 93.94%, 46.97% and 27.27%, respectively. The average parasitic loads in the intestine were 9027.90 Leishmania/μL, the ovaries 411.66 Leishmania/μL and salivary glands 305.56 Leishmania/μL. Regarding the readings of IHC slides in 98.48% of the intestines, 13.64% of the ovaries and 7.58% of the salivary glands were positive for Leishmania spp. In view of these results shown by IHC technique, using the lipofosfoglicano primary antibody (LPG), we consider the possibility of the presence of promastigotes of Leishmania spp. in R. sanguineus organs / FAPESP: 2011/51113-4

Orientador: Maria Izabel Camargo Mathias / Banca: Celeste Paola D'Alessandro / Banca: Bruno Rodrigues Sampieri / Banca: Caio Márcio de Oliveira Monteiro / Banca: Fabio Rau Akashi Hernandes / Resumo: Os carrapatos de corpo duro (Acari: Ixodidae) contam com 724 espécies descritas, sendo 120 espécies registradas oficialmente na região neotropical. No entanto, na Colômbia o registro e distribuição das espécies da família Ixodidae é escasso e pouco se sabe sobre a interação destes ectoparasitas com as diferentes espécies de Rickettsia na região, deixando uma lacuna em estudos e em conhecimento ixodológico e zoonótico no país. Desta forma, o presente trabalho buscou: a) realizar o levantamento e identificação de espécies de carrapatos duros associados a hospedeiros domésticos em regiões da Colômbia, utilizando caracteres morfológicos externos e marcadores moleculares; b) aferir a existência de caracteres morfohistológicos do sistema reprodutor masculino de carrapatos do gênero Amblyomma e c) verificar a ocorrência de bactérias Rickettsia spp. em carrapatos duros em regiões da Colômbia. Durante o período de agosto de 2014 e maio de 2016, foram coletados 1.745 carrapatos diretamente de hospedeiros domésticos e em ativa alimentação, em 17 municípios de 10 departamentos da Colômbia. Os indivíduos coletados foram identificados com base em sua morfologia externa e preparados para aplicação de técnicas de microscopia, bem como técnicas de análise molecular dos genes ITS2, citocromo oxidase I (COI) e 16S rDNA. Os resultados encontrados permitiram o registro de três gêneros e oito espécies de carrapatos duros nas áreas de estudo, sendo registrada pela primeira vez a espécie Amblyomma m... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Hard-bodied ticks (Acari: Ixodidae) comprise 724 known species, with 120 species officially registered for the Neotropical region. However, in Colombia, species registry and distribution for the family Ixodidae is scarce, and little is known of the interaction of these ectoparasites with the different Rickettsia species in the region, leading to gaps regarding the ixodological and zoonotic study and knowledge in the country. In this context, this study aimed to: a) establish and identification hard-bodied ticks associated with domestic hosts in various regions of Colombia, using external morphological characters and molecular markers; b) assess the existence of morphohistological characters of the male reproductive system of Amblyomma ticks; and c) verify the occurrence of Rickettsia spp. in hard-bodied ticks in various regions of Colombia. During August of 2014 and May of 2016, 1745 ticks were collected actively feeding on domestic hosts in 17 municipalities of 10 departments of Colombia. The specimens were identified based on their external morphology and prepared for microscopy, as well as for molecular analyses of genes ITS2, cytochrome oxidase I (COI) and 16S rDNA. The results show the presence of three genera and eight hard-bodied tick species in the municipalities studied, including the first register of the species Amblyomma mixtum for Colombia. In addition, we report an unprecedented case of gynandromorphism in A. mixtum, which also constitutes the first report for t... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JosivaniaSP_TESE.pdf: 2216086 bytes, checksum: 4328c3795e67888b55db8e1be380a936 (MD5) Previous issue date: 2015-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Small wild mammals, including rodents and marsupials, have ecological and epidemiological importance for being prey and predators in ecological chains, hosts of ecto and endoparasites and pathogens reservoirs. In Northeast Brazil, only a few studies have evaluated the diversity of ectoparasites and their hosts in the Caatinga biome. This study aimed to identify the hosts and their ectoparasites, with morphometric analysis and chaetotaxy and to determine the rates of parasitic Prevalence, Abundance and Medium Intensity of ectoparasites collected from rodents and marsupials, proceeding from the Experimental Station Rafael Fernandes, Rio Grande do Norte, Brazil, at the Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA). The animals were captured between January 2014 and February 2015, in a fragment of 26 hectares, divided into six equally spaced transects (20m). Tomahawk and Sherman traps were distributed in six consecutive nights of each month and in 100 capture stations. The captured animals were identified by morphology and submitted to ectoparasites collection. All the collected ectoparasites were classified based on morphometric characters, chaetotaxy and taxonomic keys, as well as DNA extraction, PCR and sequencing of the amplified products. 78 small mammals were captured, from which 69 were classified as Didelphimorphia order: Gracilinanus agilis (Burmeister, 1854) and Monodelphis domestica (Wagner, 1842); and nine Rodentia: Wiedomys Hershkovitz, 1959, Thrichomys Trouessart, 1880 and Rattus norvegicus Berkenhout, 1769. It was collected ectoparasites identified as: Amblyomma (Koch, 1844), Amblyomma parvum, Aragão 1908, Amblyomma auricularium (Conil, 1878), Ornithodoros mimon Kohls, Clifford e Jones 1969, Ornithodoros Kohls, Clifford e Jones 1837, Quadraseta Brennan, 1970, Eutrombicula Ewing, 1938, Metachiroecius Fain, 1996, Aeromychirus Fain, 1976, Amlistrophorus Fain, 1981, Radfordia Ewing, 1938, Listropsoralges aff. similis, Ornithonyssus pereirai (Fonseca, 1935), Tur lativentralis (Fonseca 1936), Polyplax spinulosa (Burmeister, 1839) and Eogyropus lenti lenti (Werneck 1936). As for the parasitic rates were noted that for the Ixodidae and Argasidae studied, M. domestica presented higher parasitism values for A. auricularium; G. agilis, O. mimon and Thrichomys sp., to A. parvum and A. auricularium. As for mites, the prevalence was the same in M. domestica and to all its studied Listrophoridae. Also for rodents, it was observerd the same prevalence rate for Laelapidae mites and Polyplacidae lice in the Thrichomys sp. All of those records of small mammals and ectoparasites shown are unprecedented to Mossoró, Rio Grande do Norte. This study supports evidences from the literature that ectoparasites use marsupials and wild rodents as hosts for immature stages. Justifies the importance of maintaining a legal reserve area in the Caatinga biome for preservation of these animals. In addition, this research increases knowledge about the occurrence of Acari, Phthiraptera and its ectoparasitic association with the wildlife in Northeast Brazil / Os pequenos mamíferos silvestres, dentre eles os roedores e marsupiais, apresentam importância ecológica e epidemiológica por serem presas e predadores nas cadeias ecológicas, hospedeiros de ecto e endoparasitos e reservatórios de agentes patogênicos. No Nordeste do Brasil, poucos estudos avaliaram a diversidade de ectoparasitos e seus hospedeiros no bioma Caatinga. Objetivou-se identificar os hospedeiros e seus ectoparasitos, realizar morfometria e quetotaxia e determinar os índices parasitários de Prevalência, Abundância e Intensidade Média dos ectoparasitos coletados de roedores e marsupiais, procedentes da Estação Experimental Rafael Fernandes da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA). Capturou-se animais de janeiro de 2014 a fevereiro de 2015, em um fragmento de 26 hectares da Estação, divididos em seis transectos equidistantes (20m). Foram distribuídas armadilhas Tomahawk e Sherman em seis noites consecutivas de cada mês e em cem estações de captura. Os animais capturados foram identificados pela morfologia e submetidos à coleta dos ectoparasitos. Estes foram classificados com base em caracteres morfométricos, quetotaxia e chaves taxonômicas, além de extração de DNA, PCR e sequenciamento dos produtos amplificados. Foram capturados 78 pequenos mamíferos, dos quais 69 foram classificados na ordem Didelphimorphia: Gracilinanus agilis (Burmeister, 1854) e Monodelphis domestica (Wagner, 1842); e nove Rodentia: Wiedomys Hershkovitz, 1959, Thrichomys Trouessart, 1880 e Rattus norvegicus Berkenhout, 1769. Coletou-se ectoparasitos identificados como: Amblyomma (Koch, 1844), Amblyomma parvum Aragão, 1908, Amblyomma auricularium (Conil, 1878), Ornithodoros mimon Kohls, Clifford e Jones, 1969, Ornithodoros Kohls, Clifford e Jones 1837, Quadraseta Brennan, 1970, Eutrombicula Ewing, 1938, Metachiroecius Fain, 1996, Aeromychirus Fain, 1976, Amlistrophorus Fain, 1981, Radfordia Ewing, 1938, Listropsoralges aff. similis, Ornithonyssus pereirai (Fonseca, 1935), Tur lativentralis (Fonseca 1936), Polyplax spinulosa (Burmeister, 1839) e Eogyropus lenti lenti Werneck 1936. Quanto aos índices parasitários, observou-se que para os Ixodidae e Argasidae estudados, M. domestica apresentou maiores valores de parasitismo para A. auricularium; G. agilis, para O. mimon e Thrichomys sp., para A. parvum e A. auricularium. Quanto aos ácaros, a prevalência foi igual em M. domestica e para todos os seus Listrophoridae estudados. Igualmente, para os roedores, observou-se mesmo valor de prevalência para os ácaros Laelapidae e para os piolhos Polyplacidae em Thrichomys sp. Todos os registros dos pequenos mamíferos e ectoparasitos apresentados são inéditos para Mossoró, Rio Grande do Norte. Este estudo corrobora evidências da literatura dos ectoparasitos utilizarem marsupiais e roedores silvestres como hospedeiros em fases imaturas. Justifica a importância da manutenção de uma área de reserva legal no bioma Caatinga para conservação destes animais. Em adição, a presente pesquisa aumenta o conhecimento sobre ocorrência de Acari, Phthiraptera e sua associação ectoparasitária de vida selvagem, no Nordeste do Brasil

Título original: Análise morfofisiológica in vitro da ação de extratos de glândulas salivares de fêmeas de carrapatos Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) sobre a linhagem J774 e macrófagos peritoneais de camundongos BALB/C / Orientador: Maria Izabel Souza Camargo / Banca: Fabiana Alonso Rocha / Banca: Patricia Ucelli Simioni / Resumo: A espécie Rhipicephalus sanguineus s. l., mais conhecida como "carrapato do cão", possui uma grande importância médico-veterinária, não só por espoliar seus hospedeiros, mas também por ser um potencial vetor de agentes patogênicos. O sucesso biológico desses ectoparasitas deve-se à produção de uma saliva complexa produzida pelas glândulas salivares, cujos compostos são capazes de modular o sistema imune inflamatório e hemostático dos hospedeiros. No entanto, mesmo com o conhecimento adquirido sobre o potencial da saliva no sistema imune-inflamatório dos hospedeiros, pouco se estudou sobre os mecanismos de ação dos extratos glandulares nessa resposta, e as alterações morfofisiológicas envolvidas. Desta forma, o presente projeto propôs a análise dos efeitos in vitro de extratos de glândulas salivares de fêmeas de carrapatos R. sanguineus s. l. com 2 e 4 dias de alimentação (EG2 e EG4) sobre macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e células da linhagem J774, observando possíveis variações na atividade e na morfofisiologia destas células em função das diferentes exposições ao extrato. Os resultados demonstraram que apenas a concentração de 4 µg/mL do extrato EG2 apresentou citotoxicidade sobre células da linhagem J774 quando expostas por 48 horas; as concentrações de 4 e 2 µg/mL de ambos os extratos estimularam perfis pró inflamatórios em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c; a concentração de 2 µg/mL no tempo de 48 horas de exposição e 1 µg/mL no de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The species Rhipicephalus sanguineus s. l., better known as "dog tick", has a great medical-veterinary importance, not only for spolling its hosts, but also because it is a potential vector of pathogens. Biological success of these ectoparasites is due to the production of a complex saliva produced by salivary glands, whose compounds are able to modulate the immune system inflammatory and hemostatic properties of the hosts. However, even with the knowledge acquired on the potential of saliva in the immune-inflammatory system of the hosts, little was studied about the mechanisms of action of glandular extracts in this response, and the morphophysiological changes involved. In this way, the present project proposed analysis of the in vitro effects of extracts of salivary glands from female ticks R. sanguineus s. l. with 2 and 4 days of feeding (EG2 and EG4) on peritoneal macrophages of BALB / c mice and J774 cells, noting possible variations in the activity and in the morphophysiology of these cells due to the different exposures to extract. The results demonstrated that only the concentration of 4 μg / mL of the extract EG2 showed cytotoxicity on cells of the J774 lineage when exposed by 48 hours; the concentrations of 4 and 2 μg / mL of both extracts stimulated pro-inflammatory response in peritoneal macrophages of BALB / c mice; the concentration of 2 μg / mL at the 48 hour exposure time and 1 μg / mL at the 24 hour exposure time of the EG2 and concentrations 2 and 1 μg / m... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-28T13:39:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 14234774 bytes, checksum: 47bb074ba73e29750ddfef0ea6c3e59b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T13:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 14234774 bytes, checksum: 47bb074ba73e29750ddfef0ea6c3e59b (MD5) Previous issue date: 2017-02-10 / Recently, R. microplus has extended its distribution to higher altitudes in Colombia. Proper identification of acaricide resistance mechanisms is required, as well as tick- borne diseases diagnosis and vaccine candidates for Babesia bovis and Anaplasma marginale. Patent restrictions and the scholarship funding requirements established three separated, but related, chapters for the DSc thesis. Chapter 1: Detection of genes to synthetic pyrethroids resisntance and Babesia spp. in Rhipicephalus microplus and cattle blood samples from Colombia. Samples of R. microplus (engorged females and larvae) and cattle blood were collected from selected farms in 8 municipalities in Colombia. A PCR screening for mutations on CzEst 9 and IIIS6 genes that confer synthetic pyrethroid resistance showed all tick samples had a heterozygous genotype to CzEst9 and most of the samples had an IIIS6 susceptible genotype. A nested PCR screening for detection of B. bovis rra and B. bigemina rap-1c genes resulted in unexpected bands prevented conclusive evidence. Chapter 2: Transformation process of Pichia pastoris KM71 with the synthetic gene H1Bbo23290 derivative from Babesia bovis RAP-1 protein. The transformation process of Pichia pastoris KM71 with H1Bbo23290 (a promising vaccine candidate against bovine babesiosis) was unsuccessful. Plasmid DNA extraction and subsequent linearization were the major obstacles. Chapter 3: Bovine immune response produced by oMP7, oPM8, and oMP9 Outer Membrane proteins from Anaplasma marginale St. Maries strain in confined experimental immunized animals. OMP7, OMP8, and OMP9 proteins were used to test potential conserved sequences containing CD4 T-cell epitopes. Using in vitro T-cell proliferation assays to test recombinant A. marginale and A. centrale OMP7, OMP8, and OMP9, and their overlapping peptides spanning each protein, conserved immunogenic T-cell epitopes were been identified in some peptides. / Recentemente, R. microplus tem ampliado a sua distribuição a altitudes maiores na Colômbia. A identificação dos mecanismos de resistência a acaricidas é requerida, e também do diagnóstico e dos candidatos a vacina dos patógenos transmitidos Babesia bovis e Anaplasma marginale. Restrições devidas a patentes e requerimentos da bolsa de doutorado estabeleceram três capítulos a tese de DSC. Capitulo 1: Deteção de genes de resistência a piretróides sintéticos e de Babesia spp. em amostras de Rhipicephalus microplus e sangue bovino da Colômbia. Amostras de Rhipicephalus microplus (teleoginas e larvas) e de sangue bovino foram coletadas de fazendas selecionadas em 8 municípios na Colômbia. Uma triagem por PCR procurando mutações nos genes CzEst9 e IIIS6, os quais conferem resistência a piretróides sintéticos, mostrou que todas as amostras de carrapatos foram heterozigóticas para CzEst9 e a maioria mostraram suscetibilidade para IIIS6. Uma triagem por nested PCR para a deteção dos genes rra de Babesia bovis e rap-1c de B- bigemina resultou em bandas adicionais evitando evidência conclusiva. Capitulo 2: Processo de transformação de Pichia pastoris KM71 com o gene sintético H1Bbo23290 derivado da proteína RAP-1 de Babesia bovis. O processo de transformação de Pichia pastoris KM71 com H1Bbo23290 (um candidato vicinal promissório contra a babesiose bovina) não foi bem sucedido. A extração de DNA plasmidial e a sua posterior linharização foram os maiores obstáculos. Capitulo 3: Resposta immune bovina produzida pelas proteínas da membrana externa de Anaplasma marginale OPM7, OMP8, e OMP9 da cepa St. Maries em novilhos experimentais confinados e imunizados. As proteínas OMP7, OMP8, e OMP9 de A. marginale e A. centrale foram usadas para testar a presença de potenciais sequências conservadas. As proteínas recombinates e seus peptídeos superpostos periodicamente foram usados em ensaios de proliferação de células T. Epítopes de células T, imunogênicos e conservados foram identificados.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-19T13:55:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 430274 bytes, checksum: a912ed0418d9449f1aa8723bf53fc623 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-19T13:55:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 430274 bytes, checksum: a912ed0418d9449f1aa8723bf53fc623 (MD5) Previous issue date: 2002-02-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O peptídeo sintético SBm7462 foi avaliado como imunógeno para o controle do carrapato Boophilus microplus em teste misto (estábulo e campo). O estudo se realizou com as doses de 1,0mg e 2,0mg em 30 bovinos da raça holandesa com média de grau de sangue de 91,16% (H/Z), os quais foram mantidos sob o manejo rotineiro no Campo Experimental do Centro Nacional de Pesquisa em Gado de Leite-EMBRAPA/CNPGL em pastos altamente infestados com larvas dessa espécie de carrapato. Os animais foram separados em três grupos: vacinal 2,0mg, vacinal 1,0mg e controle, sendo os grupos vacinais imunizados nos dias 0, 30 e 60 a campo. Foram realizadas a contagem de carrapatos e a coleta de sangue semanalmente, a partir do dia 0. Duas semanas após a terceira inoculação, os animais foram levados para baias individuais e submetidos a uma infestação artificial com um total de 4.500 larvas/animal de B. microplus (amostra “Porto Alegre”). A partir do 19 o dia pós-infestação, foram coletadas as teleóginas desprendidas, contadas, pesadas, identificadas e incubadas em estufa B.O.D. por quinze dias, quando os respectivos ovos foram pesados. A análise da fertilidade desses ovos e a viabilidade das larvas provenientes foram também analisadas. A cinética da produção de anticorpos foi acompanhada através de ELISA, obtendo- se títulos maiores para os grupos vacinais, estatisticamente diferentes do grupo controle (p<0,01). Os parâmetros biológicos foram analisados levando-se em conta o número de teleóginas, peso dos ovos e fertilidade dos ovos. A eficácia foi de 15,8% para a dose de 1,0mg do peptídeo sintético SBm7462 e de 53,29% para 2,0mg, com diferenças estatísticas significativas entre os grupos 1,0mg, 2,0mg e controle (p<0,05). Quanto à avaliação do número de carrapatos a campo, não houve diferença estatística entre os grupos testados. Os resultados obtidos mostram que o peptídeo sintético SBm7462 é uma alternativa viável para o controle do carrapato comum dos bovinos, pela sua eficácia, segurança e baixo custo. / The synthetic peptide SBm7462 was evaluated as immunogen for the control of the tick Boophilus microplus in mixed test (stable and field). The study was done with the quantity of 1,0mg and 2,0mg of the peptide SBm7462 on 30 Holstein female cattles (91,16% H/Z), which were maintained under the routine handling in the experimental field of the Centro Nacional de Pesquisa em Gado de Leite- EMBRAPA/CNPGL on pastures highly infested with larvaes of that tick species. The animals were separate in three groups: vaccinated with 2,0mg, vaccinated with 1,0mg and control, being the vaccinated groups immunized on the days 0, 30 and 60 in field. The count of the adults females ticks and the blood collection were weekly done, starting from the day 0. Two weeks after the third inoculation, the animals were taken to individual stalls and submitted to an artificial infestation with 4.500 larvaes/animal of B. microplus (strain “Porto Alegre”). Starting on the 19 o . day post-infestation, the adult females ticks were collected, counted, identified, weighed and incubated in B.O.D. After 15 days, the respective eggs were weighed. The analysis of the eggs fertility and the viability of the larvaes were also analyzed. The kinetics of the production of antibodies was accompanied through of ELISA, being obtained larger titles for the vaccinated groups with statistic differences to the control group (p < 0,01). The biological parameters were analyzed through of the account the number of adult females ticks, eggs weight and eggs fertility. The efficacy was of 15,8% for the 1,0mg of the synthetic peptide SBm7462 and of 53,29% for the 2,0mg, of the same peptide, with significant statistical differences among the groups 1,0mg, 2,0mg and control (p < 0,05). When compared the number of ticks in field, there was not statistic difference among the tested groups. The obtained results show that the synthetic peptide SBm7462 is a viable alternative for the control of the cattle tick, regarding its efficacy, safety and low cost.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-12-01T15:19:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2159462 bytes, checksum: b0441893ed64ffdb6b2ab859e1b8ffd2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-01T15:19:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2159462 bytes, checksum: b0441893ed64ffdb6b2ab859e1b8ffd2 (MD5) Previous issue date: 2015-04-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O “carrapato do boi” é um parasito que causa danos substanciais na produção de bovinos em áreas tropicais. Embora países como o Brasil tenham progredido em avaliações genéticas para a resistência ao carrapato, essas avaliações normalmente não tem considerado a interação genótipo x ambiente (G*A), o que pode afetar diretamente no ganho genético uma vez que a comparação entre os valores genéticos dos animais é dependente do ambiente. O objetivo desse estudo foi investigar a presença de G*A, utilizando modelos com diferentes pressuposições de variância genética e residual. Foram utilizados 10.673 contagens de carrapatos de 4.363 animais Hereford e Braford e um pedigree que continha 11.967 indivíduos. Nove modelos, sendo dois modelos animais tradicionais (MA) e sete modelos hierárquicos de normas de reação (MHNR) foram investigados. Modelos de um passo e dois passos foram usados para inferir sobre a sensibilidade dos valores genéticos ao ambiente via MHNR. O critério de informação da deviance (DIC) foi utilizado como critério estatístico na escolha do melhor modelo. O modelo de melhor ajuste foi o modelo de normas de reação de um passo com 10 classes de variâncias residuais baseados em percentis das estimativas de grupo de contemporâneos utilizadas como gradiente ambiental. Os modelos de normas de reação de um passo apresentaram as maiores estimativas de variância genética. As estimativas de variância do efeito de ambiente permanente foram, em geral, similares entre os modelos testados e variaram de 0,007 a 0,010. As estimativas de correlações genéticas entre o intercepto e a inclinação para ambos os efeitos variaram de baixa a média magnitude e apresentaram altos desvios padrão o que pode ser um indicativo de independência paramétrica. Estimativas de herdabilidades foram maiores para MHNR em comparação com MA. As estimativas de repetibilidade variaram ao longo do gradiente ambiental (de 0,18 a 0,45), o que implica na importância do efeito de ambiente permanente para a característica de resistência ao carrapato. As médias a posteriori das correlações genéticas ao longo do gradiente ambiental apresentaram um grande platô com valores acima de 0,80 para ambientes de baixa infestação de carrapatos. Os MHNR são uma poderosa ferramenta na identificação e quantificação da G*A além de ser uma alternativa promissora para as avaliações genéticas para resistência ao carrapato em bovinos Hereford e Braford, podendo elevar a eficiência de seleção e progresso genético. Melhores respostas à seleção são também esperadas em MHNR que consideram heterogeneidade de variância residual. Em um segundo estudo, foi incorporada a informação de marcador para comparar a eficiência de modelos animais convencionais e modelos de normas de reação utilizando o procedimento de um passo que combina a informação de marcador a de pedigree e também comparar o desempenho das predições de valores genéticos genômicos (GEBV) obtidos utilizando apenas o fenótipo e a informação de pedigree, como também incorporando a informação de marcador. Quatro diferentes modelos foram testados: dois modelos convencionais (BLUP) e dois de normas de reação de um passo (MNR), sendo um BLUP e um MNR com e sem informação de marcador SNP. Os modelos convencionais apresentaram um pior ajuste em comparação com os modelos de normas de reação. O modelo de normas de reação que incluiu a informação de marcador apresentou estimativa de variância genética inferior ao modelo de normas de reação que não a incluía. Estimativas de herdabilidade e repetibilidade foram, em geral, similares em ambos os modelos e variaram ao longo do gradiente ambiental de 0,07 a 0,46 e 0,20 a 0,60, respectivamente. As correlações genéticas foram notoriamente baixas entre ambientes extremos, o que indica a presença de interação genótipo x ambiente (G*A) para a característica de resistência ao carrapato. As predições de acurácias em um estudo de validação cruzada para os modelos testados foram altas e superiores a 0,55 e 0,59 para os procedimentos de partições “K-means” e partições aleatórias, respectivamente. Esses resultados sugerem que a informação de marcador não contribui para o aumento da acurácia de predição em que estas decrescem à medida que a infestação de carrapatos aumenta e, ou a relação de parentesco entre animais na população de referência e da população de validação diminui. Em um terceiro estudo, os objetivos foram: obter predições de valores genéticos em bovinos Hereford e Braford usando o procedimento de passo único que combina informação de pedigree a de marcador (ssBLUP), estimar os efeitos de marcador das normas de reação associadas com a resistência ao carrapato, bem como identificar genes candidatos derivados dos marcadores SNP mais relevantes. Um modelo de normas de reação de um passo foi ajustado para a estimação dos componentes de (co)variância e parâmetros genéticos. Para estudar os efeitos de marcadores SNP ao longo de diferentes níveis de infestação de carrapato, foram identificados os 1% SNPs mais relevantes em cada nível de infestação de carrapato e apontadas a similaridade entre estes marcadores ao longo dos níveis. Os efeitos genéticos e de ambiente permanente apresentaram significantes inclinações confirmando a presença de G*A. As correlações entre o intercepto e a inclinação foram positivas e de alta (0,52±0,18) e média (0,26±0,15) magnitudes, respectivamente, para os efeitos genéticos e de ambiente permanente. Dos 410 (1%) de SNPs identificados, 75 foram constantemente relevantes em todos os níveis ambientais e indicaram presença de interação SNP x ambiente. Os SNPs mais relevantes estão localizados nos cromossomos 1, 2, 6, 7, 9, 11, 14, 21 e 23 e genes encontrados próximos a esses marcadores apresentaram variadas funções como metabolismo energético, pigmentação do epitélio da retina, integridade e manutenção de células fotorreceptoras e diferenciação celular. / The cattle tick is a parasite that adversely affects livestock performance in tropical areas. Although countries such as Australia and Brazil have provided genetic evaluations for tick resistance, these evaluations have not typically considered genotype by environment interaction (G*E); hence genetic gains could be adversely affected as breedstock comparisons are environmentally- dependent in the presence of G*E, particularly if residual variability is also heterogeneous across environments. The objective of this study was to investigate the existence of G*E based on various models with different assumptions on genetic and residual variability. Data were collected by the Delta G Connection improvement program including 10,673 tick count phenotypes on 4,363 animals. Nine models including two traditional animal models (AM) and seven different hierarchical Bayesian reaction norm models (HBRNM) were investigated. One-step and two-step modeling approaches were used to infer upon G*E. Model choice was based on the deviance criterion information (DIC). The best-fitting model specified heterogeneous residual variances across 10 subclasses as delimited by every decile of the contemporary group estimates of tick count effects. One-step models generally had the highest estimated genetic variances. Estimates of heritabilities were generally higher for HBRNM than AM. Furthermore, one- step models based on heterogeneous residual variances also generally lead to higher heritability estimates, especially in harsh environments. Estimates of repeatability varied along the environmental gradient (range 0.18-0.45) implying that the relative importance of additive and permanent environment effects for tick resistance is environmentally influenced. The posterior means of the genetic correlations across environmental tick infestation surface plot demonstrated a large plateau above 0.80. HBRNM represent powerful tools to infer G*E and account for their effects for genetic evaluations of tick resistance. Additional increases in accuracies on estimated breeding values are also expected based on HBRNM analyses that additionally consider heterogeneity of residual variances across environments. In a second study, we incorporated marker information to compare a conventional genomic- based single step BLUP model with its one-step genomic reaction norm model extension on tick infestation phenotypes and to compare the performance of genomic estimates breeding values (GEBV) predictions obtained from using only phenotypes and phenotypes plus marker information. Four different models were tested: two conventional animal models, and two one-step reaction norm model with and without genomics. The non reaction norm models seem to be poorer fitting in comparison with its one-step extensions. The reaction norm model including marker information presented lower intercept and slope genetic variance estimates in comparison with the models that included the pedigree-based relationship matrix. Heritability and repeatability estimates were, in general, similar for both models and ranged over the environmental gradient (EG) from 0.07 to 0.46 and from 0.20 to 0.60, respectively. Genetic correlations were remarkably low between extreme EG, indicating the presence of G*E for tick resistance. Cross validation estimates were in average 0.66±0.02, 0.67±0.02, 0.67±0.02 and 0.66±0.02 for BLUP, GBLUP, GLRNM and LRNM, respectively, based on K-means partitioning, whereas GLRNM was 0.71±0.01 and tend to better than BLUP (0.67±0.01), GBLUP (0.70±0.01) and LRNM (0.70±0.01) based on random partitioning. However, no statistical significance was reported between GLRNM and LRNM. Our results also suggest that marker information do not lead for higher prediction accuracies which decreased as the tick infestation level increased and as the relationship between animals in training and validation datasets decreased. In third and last study, was aimed to perform genome-enabled predictions for tick resistance in Hereford and Braford cattle by using single step genomic BLUP methodology (ssGBLUP), to estimate marker effects from reaction norms associated with tick resistance as well as to identify candidate genes derived from the most relevant SNP markers. A one-step reaction norm model was fitted to estimate the (co)variance components and genetic parameters. To study SNP effects across different tick infestation (TI) levels, we identified the top 1% of SNPs in each TI and pointed out to the similarity between these markers across the levels. The additive genetic and permanent environment effects showed significant slope confirming the presence of G*E. Correlations between intercept and slope were positive with high (0.52±0.18) and moderate (0.26±0.15) magnitude for genetic and permanent environment effects, respectively. From the top 1% SNPs (410), 75 were consistently relevant across TI and indicated SNP by environment interaction. The most relevant SNPs were located on chromosomes 1, 2, 6, 7, 9, 11, 14, 21 and 23 and the annotated genes closest these markers showed functions related to energy metabolism, retinal pigment epithelium, maintenance and integrity of the photoreceptor cells, and cell differentiation.