Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-07-21T12:10:16Z No. of bitstreams: 1 2010 - Rafaella Camara Teixeira.pdf: 2127524 bytes, checksum: 2f2281ce314ac38db40bc03d628e7447 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T12:10:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Rafaella Camara Teixeira.pdf: 2127524 bytes, checksum: 2f2281ce314ac38db40bc03d628e7447 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico, CNPq, Brasil. / Cell cultures provide a simplified system of observation that can be particularly useful for studies of intracellular and epicellular microorganisms. The aim of this study was to establish in vitro embryonic cells primary culture of the tick Rhipicephalus sanguineus to cultivate the spirochete Borrelia burgdorferi american strain G39/40. The culture was established from embryonated eggs of engorged females of R. sanguineus to 12 days after the beginning of the oviposition, using the culture medium Leibovitz's L-15B supplemented with 20% of inactivated fetal calf serum, 10% of tryptose phosphate broth, 0.1% fraction V bovine albumin, 1% of glutamine and 0.1% of gentamicin antibiotic, pH 6.8. After the formation of a monolayer, the initial culture medium L-15B was removed from the tubes and replaced by Barbour-Stoenner-Kelly medium (BSK) or BSK with L-15B without antibiotics. Spirochetes previously grown in BSK were counted and inoculated into tubes, with final concentration of approximately 6.2 x 105 spirochetes/mL. B. burgdorferi from the inoculated tubes were countered when the means showed yellow color, indicative of high acidity due to the multiplication of spirochetes. On the third day after the start of primary culture of R. sanguineus embryonic cells, we observed the fixation of cell aggregates on the surface of the bottles. From these clusters, there were several cell types, such as large fibroblast-type cells and structures like vesicles and tubes. In the second week, we observed the appearance of round or flattened epithelial-type cells, and after 21 days of culture, we realized the formation of a monolayer due to the appearance of confluent cells. The L-15B medium proved to be efficient for the development of primary culture of R. sanguineus embryonic cells. There was a great multiplication of spirochetes cultivated with cultured embryonic cells when compared to the initial concentration, as well as the spirochetes grown in the absence of the tick cells, observing an increase of 100 times the number of B. burgdorferi. Seven days after inoculation, the tubes in which we used only the BSK medium, higher concentrations of B. burgdorferi were recovered when compared to the tubes where the medium BSK and Leibovitz's L-15B were used. Regardless of the culture media tested, the final concentration of B. burgdorferi of the tubes with embryonic tick cells was lower than that of seamless embryonic cells. In observation of the culture tubes on microscopy phase contrast, spirochetes were presented adhered to epithelial-type and fibroblast-type tick cells in an epicelular way and with great motility. R. sanguineus embryonic cells grown in BSK medium, with or without B. burgdorferi inoculation, stopped its propagation, showed membrane degeneration and many of them broke away from the surface of the bottle. The cells grown in BSK and L- 15B continued to multiply, many were still intact and attached to the bottle, with the presence of tissues in development, with fewer degenerated and floating cells than those cultivated in BSK. The spirochete B. burgdorferi strain G39/40, adhered, grew, multiplied and showed great motility in cultures of embryonic cells of R. sanguineus tick, using BSK and Leibovitz?s L-15B media. / As culturas celulares oferecem um simplificado sistema de observa??o que pode ser particularmente ?til para estudos de microrganismos intracelulares e epicelulares. O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura prim?ria in vitro de c?lulas embrion?rias do carrapato Rhipicephalus sanguineus para cultivo da espiroqueta Borrelia burgdorferi, cepa americana G39/40. A cultura foi estabelecida a partir de ovos embrionados de f?meas ingurgitadas de R. sanguineus com 12 dias ap?s o ?nicio da postura, utilizando o meio de cultivo Leibovitz?s L- 15B, suplementado com 20% de soro fetal bovino inativado, 10% de caldo triptose fosfato, 0,1% fra??o V de albumina bovina, 1% de glutamina e 0,1% de antibi?tico gentamicina, pH 6,8. Com a forma??o de uma monocamada celular, o meio de cultura inicial L-15B foi retirado dos tubos e trocado por meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) ou BSK com L-15B sem antibi?tico. As espiroquetas previamente cultivadas em BSK foram contadas e inoculadas nos tubos, apresentando concentra??o final de aproximadamente 6,2 x 105 espiroquetas/mL. A contagem de B. burgdorferi dos tubos inoculados foi realizada quando o meio apresentou colora??o amarela, indicativa de elevada acidez devido ? multiplica??o das espiroquetas. No terceiro dia ap?s o in?cio da cultura prim?ria de c?lulas embrion?rias de R. sanguineus, foi poss?vel observar a fixa??o de agregados celulares na superf?cie dos frascos. A partir destes agregados, surgiram diversos tipos celulares, como grandes c?lulas fibroblast?ides e estruturas semelhantes a ves?culas e tubos. Na segunda semana, foi observado o aparecimento das c?lulas epiteli?ides ou redondas e, com 21 dias de cultivo, visualizou-se a forma??o de uma monocamada celular devido ao aspecto confluente das c?lulas. O meio de cultivo L-15B demonstrou ser eficiente para o desenvolvimento da cultura prim?ria de c?lulas embrion?rias de R. sanguineus. Houve grande multiplica??o das espiroquetas cultivadas com c?lulas embrion?rias quando comparada ? concentra??o inicial, assim como das espiroquetas cultivadas na aus?ncia das c?lulas de carrapato, observando-se um aumento em 100 vezes do n?mero de B. burgdorferi. Sete dias ap?s a inocula??o, foram recuperadas maiores concentra??es de B. burgdorferi nos tubos onde se utilizou somente o meio BSK, do que nos tubos onde foi utilizado BSK juntamente com Leibovitz?s L-15B. Independente dos meios de cultivo testados, a concentra??o final de B. burgdorferi dos tubos com c?lulas embrion?rias de carrapato foi menor do que a dos tubos sem c?lulas embrion?rias. Na observa??o dos tubos de cultivo ? microscopia de contraste de fase, as espiroquetas apresentaram-se aderidas ?s c?lulas de carrapato epiteli?ides e fibroblast?ides de maneira epicelular e com grande motilidade. As c?lulas embrion?rias de R. sanguineus cultivadas em meio BSK, com ou sem in?culo de B. burgdorferi, pararam sua multiplica??o, apresentaram degenera??o na membrana e muitas desprenderam-se da superf?cie do frasco. As c?lulas cultivadas em meio BSK e L-15B continuaram a se multiplicar, muitas ainda estavam ?ntegras e aderidas ao frasco, com presen?a de tecidos em desenvolvimento, com menos c?lulas degeneradas e flutuantes que as cultivadas somente em BSK. A espiroqueta B. burgdorferi, cepa G39/40, aderiu, cresceu, multiplicou e apresentou grande motilidade nos cultivos com c?lulas embrion?rias do carrapato R. sanguineus, utilizando meios BSK e Leibovitz?s L-15B.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T14:29:38Z No. of bitstreams: 1 caiomarciodeoliveiramonteiro.pdf: 1857142 bytes, checksum: 6df29461b8db39b06498cf5c935d15f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:38:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 caiomarciodeoliveiramonteiro.pdf: 1857142 bytes, checksum: 6df29461b8db39b06498cf5c935d15f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 caiomarciodeoliveiramonteiro.pdf: 1857142 bytes, checksum: 6df29461b8db39b06498cf5c935d15f1 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Em vista do atual quadro de resistência do carrapato dos bovinos aos carrapaticidas comerciais, somando-se ainda a necessidade de preservação ambiental e de alimentos livres de resíduos, novas alternativas no controle deste artrópode vem ganhando maior atenção. Entre estas podemos destacar a utilização de nematóides entomopatogênicos como promissores agentes de controle biológico de ixodídeos e, desta forma, a Embrapa Gado de Leite vem desenvolvendo uma linha de pesquisa que investiga interações entre este ixodídeo e estes nematóides. Com objetivo de avaliar a eficiência de duas espécies de nematóides no controle do carrapato dos bovinos, o presente trabalho foi dividido em três experimentos que avaliaram o potencial “in vitro” de Heterorhabditis bacteriophora HP88 e Heterorhabditis amazonensis RSC-5 como controladores biológicos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Parasitologia da Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, Minas Gerais. No primeiro experimento foi avaliada a eficiência de diferentes dosagens de juvenis infectantes de H. bacteriophora HP88 no controle do carrapato dos bovinos. A eficácia dos tratamentos foi superior a 90% em todas as concentrações utilizadas, demonstrando que este isolado foi altamente eficaz na redução da prole de R. (B.) microplus em condições de laboratório. No segundo experimento, foi feita a mesma avaliação, xiv entretanto foi empregado o nematóide H. amazonensis RSC-5. Os resultados alcançados com H. amazonensis RSC-5 foram inferiores aos obtidos com H. bacteriophora HP88, sendo que a melhor eficácia foi de 67% no tratamento com 300 NEPs/fêmea. Por ter sido mais eficiente, H. bacteriophora HP88 foi à espécie selecionada para o desenvolvimento do terceiro experimento, que buscou avaliar o efeito de diferentes tempos de exposição de fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus a juvenis infectantes deste nematóide. Os resultados alcançados mostram que tempos de exposição inferiores a 24h não são suficientes para que o nematóide exerça controle eficiente sobre este ixodídeo. Entretanto, a partir de 24h de exposição o percentual de controle foi de 82%, e com 48 e 72h esta eficácia chegou a 100%. Os resultados alcançados no presente estudo demonstram que “in vitro” estes nematóides são eficientes no controle do carrapato dos bovinos, entretanto, ainda é necessária a realização de estudos futuros para investigar o potencial destes agentes de controle biológico em condições de campo e os possíveis impactos que esta utilização possa causar. / Because of the widespread resistance of cattle ticks to commercial carrapaticides and the need to protect the environment and food supply from chemical residues, there is increasing interest in finding new control alternatives. Among these is the use of entomopathogenic nematodes as biological control agents. In this effort, the Embrapa Dairy Cattle Research Center (Embrapa Gado de Leite) has been conducting a line of research investigating the interactions between cattle ticks and these nematodes. The present work examines the efficiency of two nematode species in the control of cattle ticks. We conducted three experiments to evaluate the in vitro potential of Heterorhabditis bacteriophora HP88 and Heterorhabditis amazonensis RSC-5 as biological controls of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. The study was conducted in the Parasitology Laboratory of Embrapa Gado de Leite in Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil. In the first experiment the efficiency was evaluated of different concentrations of infective juveniles of H. bacteriophora HP88 to control the ticks. The efficiency of the treatment was greater than 90% at all the concentrations tested, demonstrating this isolate is highly effective in reducing the reproductive capacity of R. (B.) microplus in laboratory conditions. In the second experiment, the same evaluation was carried out employing different concentrations of the nematode H. amazonensis RSC-5. The results were inferior to those obtained with H. bacteriophora HP88. The best efficacy xvi was 67% in the treatment with 300 EPNs/female. Because it was more efficient, we chose H. bacteriophora HP88 for the third experiment, which evaluated the effect of different exposure times of engorged females of R. (B.) microplus to infective juveniles of this nematode. The results obtained show that exposure times shorter than 24 hours are not sufficient for the nematode to have a significant control effect on this tick. However, with exposure for longer than 24 h the control percentage rose to 82%, and at 48 and 72h it reached 100%. The results obtained in this study show that in vitro these nematodes are efficient in controlling cattle ticks, but further studies are necessary to investigate the of these biological control agents under field conditions and the possible impacts this can cause.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-22T11:15:51Z No. of bitstreams: 1 marcioscoralickgoldner.pdf: 1368658 bytes, checksum: 524048ed973021e443fbeb565aadcf5d (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-06-24T13:12:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marcioscoralickgoldner.pdf: 1368658 bytes, checksum: 524048ed973021e443fbeb565aadcf5d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-24T13:12:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marcioscoralickgoldner.pdf: 1368658 bytes, checksum: 524048ed973021e443fbeb565aadcf5d (MD5) Previous issue date: 2011 / O uso indiscriminado de carrapaticidas sintéticos e o quadro de resistência aos produtos utilizados no mercado impulsionaram novas pesquisas e alternativas ao combate aos parasitos hematófagos. Dentre as alternativas mais promissoras, pode-se evidenciar o uso de substâncias e seus derivados provenientes de plantas com objetivo de implementar de carrapaticidas de origem natural que podem ser menos prejudiciais ao meio ambiente. O presente trabalho teve por objetivo potencializar ‘’in vitro’’ a eficácia carrapaticida do timol frente a larvas de R. (B.) microplus. No primeiro experimento, foram elaboradas três formulações, visando à escolha do preparado com melhor custo-benefício sem que os diferentes componentes das formulações interferissem na eficácia carrapaticida. A formulação de escolha demonstrou a mortalidade de 96,65% das larvas mantendo a eficácia carrapaticida do timol a 2% acima dos limites preconizados pelo Ministério da Agricultura de 95% para produtos comerciais. No segundo experimento, foram testadas, na formulação eleita, as concentrações de 0,25%%, 0,5% e 1% de timol sobre larvas de R. (B.) microplus, sendo que a taxa de mortalidade obtida com 0.25% foi de 94%, demonstrando que mesmo com baixa concentração de timol a eficácia carrapaticida foi considerável. Os resultados alcançados mostram que, in vitro, a eficácia carrapaticida do timol pode ser não somente mantida, como potencializada se for levada em consideração a metodologia de preparo da formulação, bem como características físico-químicas dos seus componentes, visando minimizar perdas do princípio ativo. Entretanto, são necessárias pesquisas futuras para ratificar o potencial acaricida do timol em ambiente de campo, modificando e testando diferentes apresentações. / The indiscriminate use of synthetic acaricides and the picture of resistance to products used in the market spurred new research and alternatives to combat these hematophagous parasites. Among the most promising alternatives, it can be highlight the use of substances and their derivatives from plants, aiming to implement the carrapaticide products of natural origin that may be less harmful to the environment. This study aimed to ''enhance'' the in vitro acaricide efficacy of thymol against the larvae of R. (B.) microplus. In the first experiment, three formulations were prepared, in order to choose the most cost-prepared without any of the different components interfere with the efficacy of insecticide formulations. The formulation of choice showed 96.65% mortality of larvae still remain effective insecticide of the thymol 2% above the limits established by the Ministry of Agriculture of 95% for commercial products. In the second experiment, were tested in the formulation choice, the concentrations of 0.25%, 0.5% and 1% of thymol on larvae of R. (B.) microplus, with a mortality rate of 94% with 0.25% of thymol, demonstrating that even in low concentrations of thymol acaricide efficacy was considerable. The results show that in vitro, acaricide efficacy of thymol can be not only maintained, as increased if it is taken into account the preparation method of the formulation and the physicochemical characteristics of its components in order to minimize losses of active. However, further research is needed to ratify the acaricidal potential of thymol in a field environment, modifying and testing different presentations and to assess its impact on the environment.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_luciano_rocha_fagundes_alves_branco.pdf: 1104758 bytes, checksum: b30cb2cfcf60ed3e4183d926b91986c9 (MD5) Previous issue date: 2012-12-23 / The countryside of Rio Grande do Sul, is in a traditional farm barn, cutting and milk, and in this context, the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, is responsible for numerous losses, by their direct and indirect damages. Nowadays, resistance to acaricides, affects almost all active ingredients on the market, and there is a lack of data on this process in the region under study. The aim of this study was to understand the evolution of the susceptibility of populations Riphicephalus (Boophilus) microplus to active ingredients for use in immersion and sprinkling on the market during the last decade in the region. To do so, 439 samples of properties were analyzed in the region by tick immersion "in vitro" testing at the Veterinary Doctor s Office (CONSULVET) - Bage / RS. We evaluated the following active ingredients: amitraz, cypermethrin + ethion association, deltamethrin, and from the year 2003, a combination cypermethrin + chlorpyrifos + citronellal, yielding the following averages of efficiency: 64.3%, 83.2%, 43.3 and 82.4% respectively. Upon examining the percentages of samples with ≥ 95% efficiency, we obtained the following results: 1st five-year period (2001-2005) = 50.7%, 38.2%, 16.0% and 38.8%, as in 2 ° five-year period (2006-2010) = 24.2%, 41.7%, 4.5% and 48.9% respectively. The study showed that in the countryside of Rio Grande do Sul, there are populations of R. (B.) microplus resistant to all the principles available for application by dipping or spraying is more serious the situation of deltamethrin. It also found that associations of pyrethroid with phosphorated and citronellal are the most indicated formulations in the present, since there was a significant reduction in the efficiency levels of amitraz, over the five-year periods, especially in the last year, which may be due to the use intensity of this principle in the region and the slow selection of resistant populations. It is, therefore, evident the critical situation of tick resistance to acaricides, even in a region where the climate allows only three annual generations of the ectoparasite, and the need for measures that allow the rational and oriented use of acaricides, and management measures and knowledge about the epidemiology of the tick in the region to exert less selection pressure on populations, favoring the life of the active ingredients on the market. / A região da Campanha Gaúcha, constitui-se em um celeiro tradicional da exploração pecuária, de corte e leite, e nesse contexto, o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus , é responsável por inúmeras perdas, por seus danos diretos e indiretos. Nos dias atuais, a resistência aos acaricidas, atinge quase todos os princípios ativos disponíveis no mercado, e existe uma carência de dados relativos a este processo, na região em estudo. O objetivo deste estudo, foi conhecer a evolução da susceptibilidade de populações de Riphicephalus (Boophilus) microplus aos princípios ativos para uso em imersão e aspersão, existentes no mercado, durante a ultima década, na região. Para isto, foram analisadas 439 amostras, de propriedades da região através do teste in vitro de imersão de teleóginas, no Consultório Médico Veterinário (CONSULVET) Bagé/RS. Foram avaliados, os seguintes princípios ativos: amitraz, associação cipermetrina+ethion, deltametrina e apartir do ano de 2003, uma associação ipermetrina+clorpirifós+citronelal, obtendo-se as seguintes médias de eficácia: 64,3%, 83,2%, 43,3 e 82,4% respectivamente. Quando avaliadas as amostras com percentuais de eficácia ≥ 95%, obteve-se os seguintes resultados: 1° qüinqüênio ( 2001-2005 ) = 50,7%, 38,2%, 16,0% e 38,8%, já no 2° qüinqüênio( 2006-2010 ) = 24,2%, 41,7%, 4,5% e 48,9% respectivamente. O estudo demonstrou que na região da Campanha do RS, existem populações de R. (B.) microplus resistentes a todos os princípios disponíveis para aplicação por imersão ou aspersão, sendo mais grave a situação da deltametrina. Também constatou-se que as associações de piretróides com fosforados e citronelal são as formulações mais indicadas na atualidade, uma vez que ocorreu significativa redução dos níveis de eficácia do amitraz, ao longo dos qüinqüênios, sobretudo no último ano, o que pode ser devido ao uso intensivo desse princípio na região e à lenta seleção de populações resistentes. Evidencia-se, assim, a situação crítica de resistência do carrapato a acaricidas, mesmo em uma região onde o clima permite apenas três gerações anuais do ectoparasito , e a necessidade de medidas que permitam o uso racional e orientado dos carrapaticidas, além de medidas de manejo e conhecimento sobre a epidemiologia do carrapato na região, a fim de exercer menor pressão de seleção nas populações, favorecendo a vida útil dos princípios ativos disponíveis no mercado.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-01-23T15:42:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1904321 bytes, checksum: 732f95d1a780441aa7e91d87b6821bdc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T15:42:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1904321 bytes, checksum: 732f95d1a780441aa7e91d87b6821bdc (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi construir um catálogo de genes para o genoma funcional dos órgãos internos do carrapato A. sculptum, bem como, avaliar os padrões de expressão gênica no intestino médio (MDG) e ovários (OVA) frente à condições de não-infecção (MNI e ONI) e infecção por Rickettsia amblyommii (MI e OI). Como primeiro passo, foi realizada a construção de um transcriptome de referência à partir da montagem de 9 transcriptomas (200 milhões de reads) derivados do intestino médio (3), dos ovários (2) e das glândulas salivares (4). O De novo assembly gerou um total de 460,445 contigs, a partir dos quais foram preditas 27.308 CDS expressas em no transcriptome total do A. sculptum. O mapeamento das reads derivadas de cada órgão contra o transcriptoma de referencia permitiu a identificação de 25,569 CDS expressas nos intestinos (MDG), 21,230 CDS expressas em ovários (OVA), enquanto que 10.697 CDS foram derivados dos transcriptomas de glândula salivar (SG). A anotação do transcriptoma de referência (27.308 CDS) permitiu a identificação de 23,228 CDS relacionados a processos housekeeping, enquanto que 2.177 CDS apresentaram sequência de peptídeos (SignalP) e foram anotadas como proteínas secretads.Um total de 261 CDS foram anotadas como elementos transponíveis, 20 CDS foram relacionadas à transcritos virais, enquanto que 1,622 permaneceram sem anotação, sendo anotadas com Unknown. Entre as 29 classes de genes housekeeping, destacam-se aqueles relacionados com Sinal de transdução (3.158 CDS), seguido de 1887 CDS anotadas com os transportadores e 1.523 CDS relacionados maquinaria de transcrição. A avaliação individualizada dos transcriptomas MDG e OVA no tocante a infecção e não infecção por R. amblyommii (infectados vs não infectado) revelou um padrão oposto entre os dois órgãos, com quase todos os processos celulares am MDG superexpressos em resposta à infecção por riquétsia, enquanto a maioria dos processos celular em ovário (OVA) foram down regulados em resposta à infecção por R. amblyommii. Essa down regulação de processes em ovários de carrapatos infectados por rickettsiae corrobora estudos in vitro com outras especíceis de carraátos infectados com Rickettsia spp. o que concorda com outros estudos in vivo com foco ovipostue de carrapatos infectados. com queda das funções fisiológicas da femeas ingurgitada e queda no rendimento da oviposição. Também foi observado up-regulação de proteínas no intestino, em resposta à infecção, sendo essas relacionadas com processes de infecção rickettsial em ́celulas de mamíferos bem como outros invertebrados, tais como actina, complexo Arp 2/3, domínio WASP, proteína tirosina quinase, clatrinas, intergrinas e ontre outras. Estes resultados sugerem que, de forma semelhante à verificada em células de mamíferos e em outras 17 espécies de carrapatos, estas proteínas estar envolvidas durante o processo de infecção do trato intestinal de A. sculptum. No entanto, a down regulação das principais vias metabólicas, maquinaria de replicação e de síntese proteica em ovários em resposta à infecção por Rickettsia (OI contra ONI) indica que esta batéria se constiui uma carga metabólica e fisiológica para os ovários. Alpem de sugerir possível alvos a sere avaliados na interação rickettsia-carrapato, estes resultados também dão suporte à outros estudos e estratégicas para uma melhor compreensão da biologia deste vetor, bem como para o desenvolvimento de estratégias de combate e controle biológico, como vacinas e acaricidas. / The aim of this work was to construct a gene catalogue for the functional genome of internal organs from A. sculptum, as well as, to evaluate the patterns of gene expression from midguts and ovaries against non-infection and Rickettsia amblyommii infection condition. First, we construct a reference transcriptome for A. sculptum internal organs assembling 9 transcriptomes (200 million reads) derived from midguts (3), ovaries (2) and salivary glands (4). The assemble generated 460,445 contigs, of which we identified 27,308 CDS expressed at whole A. sculptum transcriptome. The mapping of the reads derived from each organ against this CDS reference allowed the identification of 25,569 CDS expressed at midguts (MDG), 21,230 CDS expressed at ovaries (OVA) while 10,697 CDS were derived from sialomes (SG). The annotation of the reference transcriptome (27,308 CDS) allowed the identification of 23,228 CDS related to housekeeping processes, 2,177 CDS related presented signal peptide sequence by SignalP analysis, been annotated as Secreted group; 261 CDS were annotated as transposable elements, 20 CDS were reçated to viral transcripts and 1,622 remained without annotation, been classified as unknown sequences. Among the 29 classes related to housekeeping processes, stand out those related to sinal transduction 3,158 CDS, followed by 1,887 related to transporters and 1,523 CDS related to transcription machinery. The individualized evaluation of the MDG and OVA dataset regarding rickettsial infection (infected vs non-infected) reveals an opposite pattern, with almost all midgut processes more abundant in response to rickettsial infection, while most of all ovarian processes were down regulated in response to rickettsial infection, which agrees to other in vivo studies focusing ovipostue of infected ticks. Regarding MDG datasets, we have observed more abundance of host protein related to rickettsial infection processes at mammals and tick cells, such as actin, Arp 2/3 complex, WASP domain, protein tyrosine kinase, clathrins, intergrins and other. These results suggest that, similarly to verified at mammals cells and other tick specie, these proteins could be play a role during the mechanism of infection of A. sculptum midguts by R. amblyommii. However, the down regulation of metabolic pathways, replication and protein synthesis machinery at ovaries in response to rickettsial infection (OI versus ONI) indicates that R. amblyommii play role as a metabolic and physiological burden for ovaries. These results suggest putative candidates proteins for a rickettsial infection mechanism of A. sculptum midguts and give support for further studies and strategies focused on biology control of the tick, as well, a better understanding about the interface A. sculptum – SFG rickettsiae.

O estabelecimento de isolados de Rhipicephalus (B.) microplus resistentes a drogas é um passo fundamental para pesquisas sobre mecanismos de ação das drogas e desenvolvimento de novos acaricidas. Diferentes tratamentos de pressão de seleção foram efetuados sobre uma população de campo com fator de resistência (FR) à ivermectina (IVM) 1,37 visando obter experimentalmente uma cepa resistente. O tratamento das larvas com IVM não resultou em infestações de bezerros. O tratamento das adultas, por duas gerações consecutivas não alterou o valor do FR da população. A este último procedimento foi associado o tratamento do hospedeiro com IVM, resultando em aumento significativo do FR. Infestações utilizando larvas provenientes de posturas de alta eclodibilidade parece ter contribuído ainda mais para o aumento do FR observado na última geração. Em resumo, foi possível estabelecer pela primeira vez, em laboratório, uma cepa resistente à IVM que apresentou um aumento estatisticamente significante do valor do FR da última geração analisada (F10) em relação à inicial (F1). / The establishment of drug resistant Rhipicephalus (B.) microplus isolates is a fundamental step on researches about drugs mechanisms of action and on the development of new acaricides. Different selection treatments were effectuated upon a field population with an ivermectin (IVM) resistant ratio (RR) 1,37 aiming to obtain experimentally a resistant strain. The larval treatments with IVM do not reach calf infestations. The adult treatments, in two consecutive generations do not changed the population RR. To this last protocol was added the IVM host treatment, increasing significantly the RR. Infestations using larvae obtained from the high-eclodibility oviposition seemed to have contributed much more to the RR increase observed on the last generation. Finally, it was possible to establish for the first time, on laboratory, an IVM resistant strain that showed a significantly higher RR value from the last generation (F10) in relation to the first one analyzed (F1).

Orientador: Ricardo Velludo Gomes de Soutello / Resumo: O objetivo do trabalho foi caracterizar um rebanho de 72 novilhas ½ Angus x ½ Nelore, identificando os animais resistentes, resilientes esuscetíveis a endo e ectoparasitas, correlacionando a metilação global do DNA desses animais e o grau de parasitismo, que foi avaliado a partir da contagem de ovos por grama de fezes (OPG), moscas-dos-chifres e carrapatos. Essas contagens foram submetidas a análise de variância (ANOVA) para agrupamento em resistentes, resilientes e suscetíveis pelo teste Scott-Knott (p<0,05) noprograma SISVAR e agrupamento hierárquico no programa GENEs. O conteúdo de metilação foi analisado a partir do DNA extraído do sangue das novilhas, por meio dekit de metilação, e a quantificação feita por leitora de microplacas. Os valores absolutos médios de absorbância dos três grupos foram submetidos à ANOVA e análises pelo Tukey (p<0,05). Observou-se 36,11% de animais resistentes, 52,78% resilientese 11,11% suscetíveisa infecção por helmintos gastrintestinais, com contagens de 86, 392 e 1087 OPG, e 0,238, 0,225 e 0,197 do DNA metilado, respectivamente. Para a infestação por carrapatos, 26,39% dos animais foram classificados como resistentes, 59,72% resilientes e 13,98% suscetíveis, com contagensde 3, 8 e 19 carrapatos e 0,295, 0,216 e 0,151 do DNA metilado, respectivamente. E para a infestação por mosca-dos-chifres observou-se 54,17% de novilhas resistentes e 45,83% suscetíveis, com contagensde 17 e 32 moscas e 0,245 e 0,205 do DNA metilado, respectivamente. Na cla... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the work was to characterize a herd of 72 heifers ½ Angus x ½ Nellore, identifying the resistant, resilient and susceptible animals to endo and ectoparasites, correlating the overall DNA methylation of these animals and the degree of parasitism, which was evaluated from the egg count per gram of feces, horn flies and ticks.These counts were submitted to analysis of variance ANOVA for grouping in resistant, resilient and susceptible by the Scott-Knott test (p <0.05) in SISVAR and hierarchical grouping in the GENEs program. The methylation content was analyzed from the DNA extracted from the blood of the heifers, using a methylation kit and quantification by a microplate reader. The mean absolute values of absorbance of the three groups were submitted to ANOVA and analysis by Tukey (p <0.05). There were 36.11% of resistant animals, 52.78% resilient and 11.11% susceptible to gastrointestinal helminth infection, with counts of 86, 392 and 1087 OPG, and 0.238, 0.225 and 0.197 of methylated DNA, respectively. For tick infestation, 26.39% of the animals were classified as resistant, 59.72% resilient and 13.98% susceptible, with counts of 3, 8 and 19 ticks and 0.295, 0.216 and 0.151 of methylated DNA, respectively. And for the horn fly infestation, 54.17% of resistant and 45.83% susceptible heifers were observed, with counts of 17 and 32 flies and 0.245 and 0.205 of methylated DNA, respectively. In the second classification, 33.33% of the animals were classified as r... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Josineudson Augusto II de Vasconcelos Silva / Banca: Henrique Nunes de Oliveira / Banca: Joslaine Noely dos Santos Gonçalves Cyrillo / Resumo: Estudos recentes sobre mecanismos de resistência dos bovinos aos carrapatos são raros, justificando a necessidade de novos estudos. O couro dos animais é um dos habitats do carrapato, e algumas características do mesmo podem propiciar condições mais ou menos favoráveis para a fixação e desenvolvimento das larvas. O objetivo do trabalho foi estimar parâmetros genéticos para as características espessura do couro (EC) e ganho de peso pós desmama (GPD550) em bovinos Nelore, e verificar as associações de espessura do couro, resistência aos carrapatos e nível de parasitemia por Babesia bovis em fêmeas, Caracu e Nelore, infestadas artificialmente. O banco de dados do programa de melhoramento genético Nelore Qualitas foi utilizado para estimação da herdabilidade das características EC e GPD550 assim como na verificação da associação genética. Os parâmetros genéticos foram estimados por análise bayesiana com uso de modelo multivariado. Outra etapa do projeto foi conduzida com uso de 20 novilhas Nelore e 20 novilhas Caracu, provenientes do Centro de Pesquisa em Pecuária de Corte do Instituto de Zootecnia de forma a possibilitar a verificação da associação da resistência ao carrapato com nível de parasitemia por B. bovis e espessura do couro. As novilhas foram submetidas a três (3) infestações artificiais de carrapatos, em intervalos de 14 dias. A EC foi medida na região posterior à escápula dos animais com uso de paquímetro. Foram realizadas contagens de fêmeas ingurgitadas no intervalo entre o 19º e 23º dia após a infestação e colheitas de sangue no 1o, 7o, 21o, 35o e 49o dia do experimento. As amostras de sangue foram utilizadas para avaliar o nível de parasitemia por B. bovis por meio de reações de PCR quantitativo (qPCR). Análises estatísticas foram executadas com o procedimento MIXED do programa SAS. As estimativas de herdabilidade (h²) das características EC e GPD550 foram... / Abstract: Recent studies about mechanisms of resistance to the tick are rare in cattle, justifying the need for further research. The hide of the animals is one of the tick habitats and some hide features can provide favorable conditions for the establishment and development larval. The aim of this study was to estimate genetic parameters for the skin thickness (ST) and post weaning weight gain (PWG550) of Nellore cattle, and to verify the relationship among skin thickness, tick resistance and parasitaemia level by Babesia bovis in heifers, Caracu and Nellore, that it were artificially infested with ticks. The database of the Nellore Qualitas breeding program was used to estimate the heritability of the ST and PWG550 traits and to verify the genetic association among these traits. Genetics parameters were estimated by bayesian analysis with a multivariate model. Another project phase was developed with 20 Nellore heifers and 20 Caracu heifers, belonging to the Instituto de Zootecnia, in order to allow the study the association of the resistance to tick with parasitaemia level by B. bovis and skin thickness. Heifers were submitted to three (3) ticks' artificial infestations, with 14 days interval. ST was measured in the mid-side area of animals with a double caliper. Engorged females counts were performed in the range of 19th and 23th days after infestation. Blood samples were collected on the 1st, 7th, 21th, 35th and 49th day of the experiment. Blood samples were used to evaluate the parasitaemia level by B. bovis, by quantitative PCR (qPCR) method. Statistical analysis were performed using the MIXED procedure of SAS. Estimates heritability (h²) of the ST and PWG550 traits were 0.12 and 0.29, respectively. Correlation coefficient among the EC and GPD550 traits was 0.17. Nellore showed lower amount of ticks in artificial infestations, however, both groups were efficient to control the B. bovis parasitaemia. The skin thickness group effect was ... / Mestre

A erliquiose monocitotrópica canina é caracterizada como uma infecção persistente, podendo evoluir para doença fatal. Mecanismos imunopatogênicos estão implicados no desenvolvimento da doença, porém não é completamente compreendido o papel da resposta imune celular nas infecções causadas por Ehrlichia canis transmitida pelo carrapato Rhipicephalus sanguineus. A infecção do vetor ocorre somente durante o repasto em cães riquetsêmicos, porém não é reconhecido o nível de riquetsemia infectante durante o curso da infecção nos cães. O objetivo desse estudo foi verificar os níveis de riquetsemia relativa capazes de infectar o vetor (R. sanguineus) durante o curso da erliquiose canina; e avaliar a resposta imune celular induzida por exposição de cães a carrapatos infectados com Ehrlichia canis. Um cão foi utilizado para produção do inoculo e infecção de ninfas de R. sanguineus. Subseqüentemente, os carrapatos adultos infectados, oriundos das ninfas que se alimentaram nos cães infectados, foram utilizados para infecção dos cães dos grupos I (n=3) e II (n=3). Cães do grupo III (n=3) foram inoculados com sangue infectado com E. canis, por via intravenosa. Os grupos IV (n=3) e V (n=3) foram compostos por cães não infectados. Os grupos II e IV foram reinfestados periodicamente com ninfas não infectadas de R. sanguineus. Foram observadas, alterações clínicas como febre, apatia e disorexia nos cães infectados, durante a fase aguda da infecção, porém de forma mais intensa e precoce nos cães infectados por inoculação intravenosa (grupo III). As alterações hematológicas mais evidentes foram redução do número de plaquetas, leve redução na série vermelha e branca. Todos os animais infectados soroconverteram aos 14 dias após inoculação ou infestação com carrapatos infectados (dpi), mantendo títulos entre 10240 e 81920. Os níveis de riquetsemia foram variáveis durante o curso da infecção, persistindo até 364 dpi, porém mais constante na fase aguda da doença. Um pequeno número de carrapatos alimentados nos cães infectados apresentou amplificação de DNA de E. canis, porém foram demonstrados até 308 dpi. Foi observada uma redução na relação CD4:CD8 nos animais infectados, no 28° dpi, mantendo-se de forma mais branda até 252 dpi. Uma maior proporção de linfócitos T CD4+ produtores de IFN-&gamma; e IL-4 foi observada no tempo zero de cães que não adquiriram infecção após infestação com carrapatos infectados. Os níveis séricos de citocinas mostraram de forma mais evidente a elevação de IL-10 e TNF-&alpha; em um cão que desenvolveu doença fatal, podendo indicar a participação de mecanismos imunes na apresentação clínica e na persistência do agente no organismo hospedeiro. / The canine monocytic ehrlichiosis is characterized as a persistent infection, which can develop fatal disease. Immunopathogenic mechanisms are implicated in the development of the disease, however it is not completely understood the role of cellular immune in the infection caused by Ehrlichia canis transmitted by the tick Rhipicephalus sanguineus. The vector becomes infected only while feeding on rickettsemic dogs, however the level of rickettsemia is not recognized during the course of the infection in the dogs. The objective of this study was to verify the level of relative rickettsemia capable to infect the vector (R. sanguineus) during the course of the canine ehrlichiosis; and to evaluate the cellular immune induced in dogs exposed to Ehrlichia canis-infected ticks. A dog was used for production of the inoculum and infection of nymphs of R. sanguineus. Infected adult ticks that had fed as nymphs on the infected dog were used to feed on and transmit the infection to dogs of groups I (n=3) and II (n=3). Group III dogs (n=3) were intravenously inoculated with E. canis-infected dogs. Group IV (n=3) and V (n=3) dogs were the control groups, never exposed to E. canis. Dogs of groups II and IV were reinfested periodically with uninfected R. sanguineus nymphs. Clinical alterations such as fever, apathy and dysorexia were observed in the infected dogs during the acute phase of the infection, however in a more intense and precocious form in the dogs infected by intravenous inoculation (group III). The more evident hematological alterations were reduction of the number of platelets, mild reduction in the red and white cells series. All infected animals soroconverted by 14 days after inoculation or infestation by infected ticks (dpi), showing titers between 10240 and 81920 during the study. The rickettsemia levels were variable during the course of the infection, persisting up to 364 dpi, however more constant in the acute phase of the disease. A small number of ticks that fed on infected dogs presented amplification of E. canis DNA, however they were demonstrated up to 308 dpi. A reduction in the relationship CD4:CD8 in the infected animals was observed in 28th dpi, keeping in a mild form up to 252 dpi. A larger proportion of lymphocytes T CD4+ producing IFN-&gamma; and IL-4 it was observed in the zero time of dogs that did not acquire infection after infestation with infected ticks. The cytokine seric levels showed the elevation in a more evident form of IL-10 and TNF-&alpha; in a dog that developed fatal disease, what could indicate the participation of immune mechanisms in the clinical presentation and in the persistence of the agent in the organism host.

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The main control method against ticks is the use of acaricides, which lead to the emergence of resistant populations, in addition to increasing costs and risk of contamination of meat, milk and environment. Thus, vaccine antigens have been identified and characterized as an alternative to acaricides. Salivary molecules of hematophagous parasites can inhibit responses associated to homeostasis and modulate the host immune system and, therefore, are options in the search for anti-tick vaccines. This work characterized a glycine rich-protein and the paramyosin of R. microplus. Glycine rich-proteins are secreted in tick saliva and are essential in the attachment and blood feeding. Paramyosin is able to evade the host immune system and proved to be an important allergen of mites and vaccine antigen against helminths. The cDNA and amino acid sequences of the R. microplus glycine rich-protein (RmGRP) were identified and analyzed, revealing two distinct portions of the protein (glycine residues presented dispersed in the N-terminal region and in repeated patterns along the C-terminal region). Cloning, expression and purification of RmGRP were performed and the recombinant protein was tested for recognition by sera from naturally and experimentally infested bovines, indicating their antigenicity, but also displaying a high heterogeneity in protein recognition between individuals and among infestations in the same individual. In addition, recombinant RmGRP was recognized by sera from rabbits immunized with saliva and salivary gland from partially and fully engorged females and eggs, but not from sera from rabbits immunized with gut. Expression of the gene encoding RmGRP (rmgrp) in different female tissues and tick development stages was evaluated by qRT-PCR. Gene transcription was found in eggs, larvae, adult males, salivary glands, fat bodies and ovaries of partially and fully engorged females, with the highest expression levels in 1-day-old larvae and salivary glands of fully engorged females. rmgrp was not expressed in 3- and 6-day-old eggs and in guts of partially and fully engorged females, corroborating to the aforementioned result. Effects of RNAm silencing corresponding to RmGRP and RmPRM were evaluated, which resulted in egg laying reduction in the group in which the RmPRM gene was silenced and in the reduction of larval hatching rate in the two groups. Therefore, it is suggested that both proteins are important during larval development, but only RmPRM is required in egg formation and/or laying. Cloning of the coding DNA regions and expression of N-terminal, internal and Cterminal fragments of R. microplus paramyosin (RmPRM) in Escherichia coli and of the complete RmPRM in Pichia pastoris were confirmed by SDS-PAGE and western-blot. From the data obtained, both RmGRP and RmPRM have characteristics that make them possible candidates to compose a cocktail vaccine against R. microplus. / O Rhipicephalus microplus ? um carrapato que infesta preferencialmente bovinos, causando um grande preju?zo ? pecu?ria. O principal m?todo de controle ? o uso de acaricidas, os quais selecionam popula??es resistentes, al?m de aumentar o custo e o risco de contamina??o da carne, do leite e do ambiente. Desta forma, ant?genos vacinais t?m sido identificados e caracterizados como alternativa aos acaricidas. Mol?culas salivares de parasitos hemat?fagos podem inibir respostas associadas ? homeostase e modular o sistema imune do hospedeiro e, portanto, s?o op??es na busca por vacinas anti-carrapato. Neste contexto, este trabalho caracterizou uma prote?na rica em glicinas e a paramiosina do R. microplus. Prote?nas ricas em glicinas s?o secretadas na saliva e s?o essenciais na fixa??o e na alimenta??o do parasito. J? a paramiosina ? capaz de evadir o sistema imune do hospedeiro e mostrou-se um importante alergeno em ?caros e ant?geno vacinal contra helmintos. As sequ?ncias de cDNA e amino?cidos da prote?na rica em glicinas de R. microplus (RmPRG) foram identificadas e analisadas, revelando duas por??es distintas da prote?na (com glicinas isoladas ao longo da regi?o N-terminal e padr?es repetidos contendo glicinas ao longo da regi?o C-terminal). A clonagem, express?o e purifica??o da RmGRP foram realizadas e a prote?na recombinante foi testada quanto ao reconhecimento por soros de bovinos naturalmente e experimentalmente infestados, indicando a sua antigenicidade, mas tamb?m uma alta heterogeneidade no reconhecimento da prote?na entre indiv?duos e entre infesta??es no mesmo indiv?duo. Al?m disso, a RmGRP recombinante foi reconhecida pelos soros de coelhos imunizados com saliva e gl?ndula salivar de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas e ovos, mas n?o por soros de coelhos imunizados com intestino. A express?o do gene codificante para a RmGRP (rmgrp) em diferentes tecidos de f?meas e fases do desenvolvimento do carrapato foi avaliada por qRT-PCR. A transcri??o do gene foi encontrada em ovos, larvas, machos adultos, al?m de gl?ndulas salivares, corpos gordurosos e ov?rios de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, apresentando os maiores n?veis de express?o nas larvas de 1 dia e nas gl?ndulas salivares de f?meas totalmente ingurgitadas. rmgrp n?o foi expresso nos ovos de 3 e 6 dias e no intestino de f?meas parcialmente e totalmente ingurgitadas, corroborando o resultado anterior. Ainda foram avaliados os efeitos do silenciamento do RNAm correspondente ? RmGRP e ? RmPRM, o que resultou na redu??o da taxa de postura de ovos no grupo em que o gene da RmPRM foi silenciado e da eclos?o de larvas em f?meas tratadas nos dois grupos. Portanto, sugere-se que as duas prote?nas s?o importantes durante o desenvolvimento larval, mas s? a RmPRM seja necess?ria na forma??o e/ou postura dos ovos. Tamb?m foi realizada a 8 clonagem da regi?o codificante e express?o dos fragmentos N-terminal, interno e C-terminal da paramiosina de R. microplus (RmPRM) em E. coli e da RmPRM completa em P. pastoris, sendo confirmadas por SDS-PAGE e western-blot. A partir dos dados obtidos, ambas RmGRP e RmPRM apresentam caracter?sticas que fazem delas poss?veis candidatas a comporem uma vacina coquetel contra o R. microplus.