Le tonus myogénique (TM) est la capacité des artères de résistance à se contracter suite à une élévation de la pression intraluminale. Il permet la protection des capillaires contre une augmentation excessive de pression, et régule les débits sanguins locaux. L'implication du TM dans le développement de certaines pathologies fait de lui une cible thérapeutique intéressante. Cela nécessite une identification précise des protagonistes moléculaires. La voie RhoA/Rho-kinase joue un rôle important dans le TM en régulant la sensibilisation au calcium de l'appareil contractile. Nous nous sommes donc particulièrement intéressés à des éléments pouvant moduler ou être modulés par cette voie. Ainsi, nous avons mis en évidence que l'intervention de la voie RhoA/Rho-kinase dans le TM implique tout d'abord une localisation membranaire de RhoA, afin d'interagir avec la cavéoline-1 et d'activer ses effecteurs tels que Rho-kinase. De plus l'activation de RhoA par la pression est régulée par le récepteur Notch3 intervenant ainsi comme un mécanosenseur. Nos travaux montrent aussi le rôle du facteur de réponse au sérum (SRF) dans le TM via la régulation du cytosquelette et de l'activité des canaux mécanosensibles. Pour finir, l'inhibition de l'activité de RhoA, lors d'un traitement avec du Sildénafil, entraine une surexpression de RhoA qui est responsable d'une élévation du TM et d'une hypertension à l'arrêt du traitement. Cette thèse apporte de nouvelles connaissances sur l'implication de RhoA, Notch3 et SRF dans le TM permettant une meilleure compréhension de ce mécanisme. Cela offre de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre les pathologies impliquant des dysfonctions vasculaires.

Les cavéolines et les protéines cavines forment le manteau d'invaginations membranaires appelées cavéoles. Dans le tissu adipeux (TA), ces structures sont très abondantes dans les adipocytes et les cellules endothéliales. Une perte d'expression de cavéoline-1 a pour conséquence une lipoatrophie sévère chez les souris invalidées pour ce gène (Cav1(-/-)), ce qui a conduit à suggérer un rôle important de Cav1 pour le contrôle de la capacité de stockage du TA. Par ailleurs, les souris Cav1(-/-) présentent des défauts vasculaires, phénotype totalement corrigé par une réexpression spécifique de Cav1 au niveau de l'endothélium (souris Cav1 RC). Afin de déterminer les rôles respectifs de la cavéoline-1 adipocytaire et endothéliale dans l'établissement de la lipoatrophie observée chez les souris Cav1(-/-), nous avons comparé les phénotypes adipeux de souris contrôles, Cav1(-/-) et Cav1 RC et établi ainsi le rôle majeur de la cavéoline-1 adipocytaire dans l'apparition de ce phénotype. Pour caractériser les mécanismes impliqués, nous avons surexprimé Cav1 et les cavines dans la lignée adipocytaire 3T3-L1. Nous montrons que ces surexpressions augmentent le nombre de cavéoles à la membrane plasmique des adipocytes. En revanche, seule la surexpression de Cav1 induit la croissance des gouttelettes lipidiques (GL), suggérant que cet effet de Cav1 s'exerce en dehors des cavéoles. En accord, la surexpression de Cav1 exclusivement à la surface des GLs augmente la taille de ces organites dans les adipocytes. Ces résultats démontrent un rôle spécifique de la cavéoline-1 à la surface de la GL, indépendant des cavéoles, dans le contrôle de la capacité de stockage lipidique adipocytaire

La Fibrose Pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie fibroproliférative pour laquelle il n'existe aucun traitement efficace. Les mécanismes à l'origine de cette pathologie sont méconnus et impliquent plusieurs types cellulaires et facteurs de croissance, comme le TGF-β responsable de la différenciation de fibroblastes en myofibroblastes. Pour mieux comprendre ces mécanismes physiopathologiques, nous nous sommes intéressés à l'implication des miARN dans ce processus. Une analyse par puces à ADN de l'ensemble des miARN modulés dans des échantillons pulmonaires de souris, résistantes ou sensibles à la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, nous a permis d'identifier miR-199a-5p comme le meilleur candidat associé à la fibrose pulmonaire mais aussi fibrose rénale et hépatique. J'ai ensuite démontré que l'expression de miR-199a-5p était induite par le TGF-β in vitro, et que sa surexpression ectopique induisait la différenciation des fibroblastes. Une combinaison d'approche in silico et expérimentale, m'a permis d'identifier la Cavéoline-1 (CAV-1) comme cible de ce miARN. La CAV-1 est impliquée dans la dégradation du récepteur TGF-β. Ainsi, l'inhibition de CAV-1 par miR-199a-5p constitue une boucle de rétrocontrôle positif exacerbant la voie TGF-β. De manière intéressante, l'inhibition de miR-199a-5p in vitro régule la différenciation, la prolifération et la migration des fibroblastes pulmonaires par le TGF-β. Par ailleurs, nos résultats précliniques indiquent que l'inhibition de ce miARN diminue les marqueurs de fibrose, permettant d'envisager le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans le traitement de la FPI et d'autres maladies fibroprolifératives.

La Fibrose Pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie fibroproliférative pour laquelle il n’existe aucun traitement efficace. Les mécanismes à l’origine de cette pathologie sont méconnus et impliquent plusieurs types cellulaires et facteurs de croissance, comme le TGF-β responsable de la différenciation de fibroblastes en myofibroblastes. Pour mieux comprendre ces mécanismes physiopathologiques, nous nous sommes intéressés à l’implication des miARN dans ce processus. Une analyse par puces à ADN de l’ensemble des miARN modulés dans des échantillons pulmonaires de souris, résistantes ou sensibles à la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, nous a permis d’identifier miR-199a-5p comme le meilleur candidat associé à la fibrose pulmonaire mais aussi fibrose rénale et hépatique. J’ai ensuite démontré que l’expression de miR-199a-5p était induite par le TGF-β in vitro, et que sa surexpression ectopique induisait la différenciation des fibroblastes. Une combinaison d’approche in silico et expérimentale, m’a permis d’identifier la Cavéoline-1 (CAV-1) comme cible de ce miARN. La CAV-1 est impliquée dans la dégradation du récepteur TGF-β. Ainsi, l’inhibition de CAV-1 par miR-199a-5p constitue une boucle de rétrocontrôle positif exacerbant la voie TGF-β. De manière intéressante, l’inhibition de miR-199a-5p in vitro régule la différenciation, la prolifération et la migration des fibroblastes pulmonaires par le TGF-β. Par ailleurs, nos résultats précliniques indiquent que l’inhibition de ce miARN diminue les marqueurs de fibrose, permettant d’envisager le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans le traitement de la FPI et d’autres maladies fibroprolifératives. / Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a fibroproliferative disease with poor prognosis and for which no effective treatment exists. The mechanisms of this disease remain poorly understood and involve numerous cell types and growth factors such as TGF-β, which leads to the activation of lung fibroblasts into myofibroblasts; the key cell type driving the fibrogenic process. In this context, we focused the involvement of miRNAs in fibrosis process. To identify miRNAs with potential roles in lung fibrogenesis, we performed a genome-wide assessment of miRNA expression in lungs from two different mouse strains known for their distinct susceptibility to lung fibrosis after bleomycin exposure. We identified miR- 199a-5p as the best candidate associated with lung fibrosis but also kidney and liver fibrosis. I observed that miR-199a-5p expression was induced upon TGF-β exposure, and that its ectopic expression was sufficient to promote the pathogenic activation of pulmonary fibroblasts. Using combination of targets miRNA prediction tools and a transcriptomic approach we identified the Caveolin-1 (CAV-1), a critical mediator of pulmonary fibrosis, as a specific target of miR-199a-5p. Thus, we shown that miR-199a-5p is a key effector of TGF-β signaling in lung fibroblasts by regulating CAV1. Interestingly, inhibition of miR-199a-5p in vitro prevents the differentiation, proliferation and migration of fibroblasts after TGF-β stimulation. Finally, our preclinical results indicate that inhibition of this miRNA decreases fibrosis markers. Thus, miR-199a-5p behaves as a major regulator of tissue fibrosis with therapeutic potency for the treatment of IPF and fibroproliferative diseases.

La sonoporation, associant les ultrasons (US) et les microbulles (MB) permet une délivrance localisée des molécules thérapeutiques (e.g., acides nucléiques, molécules chimio-thérapeutiques), avec une efficacité thérapeutique élevée et un faible taux de toxicité. Cependant, les mécanismes impliqués dans le transfert de ces molécules restent jusqu’alors mal connus. Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse ont pour objectif de mettre en évidence l’importance du contact microbulle/cellule et les forces de radiation au cours de la sonoporation et s’intéressent par ailleurs, à l’étude des mécanismes sous-jacents durant le processus de sonoporation ainsi que les conséquences cellulaires (membranaire et intracellulaire) engendrées. Ces études sont réalisées par microscopie électronique, et comparent deux lignées cellulaires U-87 MG et MDA-MB-231. Nous nous intéresserons également aux effets du sérum sur l’efficacité de la sonoporation dans la délivrance de molécules (gènes), mais aussi aux changements du cytosquelette et son implication au cours du processus de sonoporation. / Sonoporation combines ultrasound and microbubbles, and promises a local delivery of therapeutic molecules (i.e., nucleic acids, chemotherapeutic molecules) with a high therapeutic efficacy and a low toxicity level. However, the mechanisms involved in the molecules uptake remain hitherto unclear. The work presented in this thesis manuscript aims to highlighting the processes of action of sonoporation by exploring the importance of microbubble/cell contact and the radiation forces and the study of underlying mechanisms during sonoporation and the generated cellular consequences (membrane and intracellular), by electron microscopy, and by comparing two cell lines U-87 MG and MDA-MB-231. We also explore the serum effects on the efficiency of sonoporation in the delivery of molecules (genes) but also the changes in the cytoskeleton and its involvement during sonoporation.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La production endogène de glucose est une fonction cruciale au maintien de l’homéostasie glucidique dont les 2 dernières étapes sont la production de glucose par la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la sortie du glucose hors de la cellule par le transporteur facilité GLUT2. Les mécanismes dépendants de mouvements membranaires régulant ces deux étapes ont été étudiés. La régulation de la G6Pase par l’AMPc dépend de mouvements membranaires. Cependant les mécanismes moléculaires de cette régulation restaient à caractériser. Nous avons étudié l’hypothèse d’une phosphorylation directe des sous-unités de la G6Pase par la PKA. La PKA est capable d’induire l’activité G6Pase. Cependant, aucune phosphorylation des sous-unités G6Pase n’a pu être mise en évidence par phosphorylation in vitro, mutations dirigées de sites potentiels de phosphorylation ou analyse par spectrométrie de masse. En absence de Glut2, le glucose produit de novo sort des hépatocytes par une voie dépendante de mouvements membranaires, dont le mécanisme moléculaire n’est pas caractérisé. Cette voie vésiculaire n’est pas impliquée dans la sortie du glucose glycogénolytique. À l’inverse, 50% du glucose néoglucogénique sort des hépatocytes par une voie vésiculaire, probablement dépendante de la cavéoline-1. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons montré que la G6Pase se déplace dans la cellule vers la membrane plasmique et co-localise avec une partie de la cavéoline1 cellulaire. Les vésicules composées de cavéoline-1 et contenant la G6Pase pourrait donc constituer un lien entre le réticulum endoplasmique, lieu de production du glucose et la membrane plasmique, lieu de libération du glucose / Endogenous glucose production is a crucial function to maintain glucose homeostasis whose last two steps are glucose production by glucose-6-phosphatase (G6Pase) and glucose output by GLUT2. Regulations of both steps depend on membrane movements. In this work, we characterized the mechanisms of these regulations. Regulation of G6Pase by cAMP depends on membrane movements; however the molecular mechanisms of this regulation still have to be characterized. We hypothesized that PKA directly phosphorylated G6Pase subunits. We showed that PKA was able to enhance G6Pase activity. However, no phosphorylation of G6Pase subunits was evidenced by in vitro phosphorylation, directed mutagenesis of potentiel phosphorylation sites or mass spectrometry. In the absence of Glut2, the gluconeogenic glucose produced by hepatocytes is released through a pathway depending on membrane movements, which has not been characterised yet. This vesicular pathway was not involved in the output of glycogenolytic glucose. However, half of gluconeogenic glucose was released through a vesicular pathway, probably depending on caveolin-1. By confocal microscopy, we showed that G6Pase moved in cells and co-localized in part with cellular caveolin-1. Caveolin-1 vesicles containing G6Pase could thus constitute a link between the endoplasmic reticulum, site of glucose production, and the plasma membrane, site of glucose output

Toutes les actions biologiques de l'hormone de croissance (GH) sont initiées par l'interaction de l'hormone avec un homodimère de son récepteur spécifique (GHR2) présent au niveau de la surface de ses cellules-cibles. Cette association conduit à l'activation de différentes voies de transduction du signal intracellulaire ainsi qu'à l'internalisation du complexe GH-GHR2, notamment au niveau de la mitochondrie. L'objectif de cette étude est de montrer le mécanisme et l'implication de l'internalisation par les cavéoles dans la régulation de l'action de la GH au niveau de la fonction mitochondriale. Nous avons montré l'importance de la boîte 1 du GHR dans la stimulation de l'activité respiratoire globale ; le transport de la GH par la voie des cavéoles dans la mitochondrie ; l'importance de la localisation intramitochondriale de la GH dans la régulation des complexes II et IV de la chaîne respiratoire. Ces résultats suggèrent une nouvelle voie d'action directe de la GH sur la mitochondrie

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La production endogène de glucose est une fonction cruciale au maintien de l'homéostasie glucidique dont les 2 dernières étapes sont la production de glucose par la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la sortie du glucose hors de la cellule par le transporteur facilité GLUT2. Les mécanismes dépendants de mouvements membranaires régulant ces deux étapes ont été étudiés. La régulation de la G6Pase par l'AMPc dépend de mouvements membranaires. Cependant les mécanismes moléculaires de cette régulation restaient à caractériser. Nous avons étudié l'hypothèse d'une phosphorylation directe des sous-unités de la G6Pase par la PKA. La PKA est capable d'induire l'activité G6Pase. Cependant, aucune phosphorylation des sous-unités G6Pase n'a pu être mise en évidence par phosphorylation in vitro, mutations dirigées de sites potentiels de phosphorylation ou analyse par spectrométrie de masse. En absence de Glut2, le glucose produit de novo sort des hépatocytes par une voie dépendante de mouvements membranaires, dont le mécanisme moléculaire n'est pas caractérisé. Cette voie vésiculaire n'est pas impliquée dans la sortie du glucose glycogénolytique. À l'inverse, 50% du glucose néoglucogénique sort des hépatocytes par une voie vésiculaire, probablement dépendante de la cavéoline-1. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons montré que la G6Pase se déplace dans la cellule vers la membrane plasmique et co-localise avec une partie de la cavéoline1 cellulaire. Les vésicules composées de cavéoline-1 et contenant la G6Pase pourrait donc constituer un lien entre le réticulum endoplasmique, lieu de production du glucose et la membrane plasmique, lieu de libération du glucose