Factor VIII is a clotting factor found on the intrinsic side of the coagulation cascade. A mutation in the factor VIII gene causes the disease Hemophilia A, for which there is no cure. The most common treatment is administration of recombinant factor VIII. However, this can cause an immune response that renders the treatment ineffective in certain hemophilia patients. For this reason a new treatment, or cure, needs to be developed. Gene editing is one solution to correcting the factor VIII mutation. CRISPR/Cas9 mediated gene editing introduces a double stranded break in the genomic DNA. Where this break occurs repair mechanisms cause insertions and deletions, or if a template oligonucleotide can be provided point mutations could be introduced or corrected. However, to accomplish this goal for editing factor VIII mutations, a way to deliver the components of CRISPR/Cas9 into somatic cells is needed. In this study, I confirmed that the CRISPR/Cas9 system was able to create a mutation in the factor VIII gene in zebrafish. I also showed that the components of CRISPR/Cas9 could be piggybacked by vivo morpholino into a variety of blood cells. This study also confirmed that the vivo morpholino did not interfere with the gRNA binding to the DNA, or Cas9 protein inducing the double stranded break.

Ciltacabtagene autoleucel (cilta-cel) is a Chimeric antigen receptor T-cell therapy with the potential for long-term disease control in heavily pre-treated patients with relapsed/refractory multiple myeloma (RRMM). As cilta-cel was assessed in the single-arm CARTITUDE-1 clinical trial, we used an external cohort of patients from the Therapie Monitor registry fulfilling the CARTITUDE-1 inclusion criteria to evaluate the effectiveness of cilta-cel for overall survival (OS) and time to next treatment (TTNT) vs. real-world clinical practice. Individual patient data allowed us to adjust the comparisons between both cohorts, using the inverse probability of treatment weighting (IPW; average treatment effect in the treated population (ATT) and overlap population (ATO) weights) and multivariable Cox proportional hazards regression. Outcomes were compared in intention-to-treat (HR, IPW-ATT: TTNT: 0.13 (95% CI: 0.07, 0.24); OS: 0.14 (95% CI: 0.07, 0.25); IPW-ATO: TTNT: 0.24 (95% CI: 0.12, 0.49); OS: 0.26 (95% CI: 0.13, 0.54)) and modified intention-to-treat (HR, IPW-ATT: TTNT: 0.24 (95% CI: 0.09, 0.67); OS: 0.26 (95% CI: 0.08, 0.84); IPW-ATO: TTNT: 0.26 (95% CI: 0.11, 0.59); OS: 0.31 (95% CI: 0.12, 0.79)) populations. All the comparisons were statistically significant in favor of cilta-cel. These results highlight cilta-cel’s potential as a novel, effective treatment to address unmet needs in patients with RRMM.

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<p>Mesenchymal stem cells have shown potential for success in gene therapy due to their ability to differentiate and their immunomodulatory properties <em>in vivo</em>. Although they have many inherent characteristics that are suitable for use within gene therapy, genetic modification of these cells is more difficult. Since MSCs are available in limited quantities and cannot be expanded indefinitely, the modification technique must ensure efficient expression of the transgene, a high cell survival rate and an intact ability to differentiate to various cell lineages. We optimized electroporation conditions for the genetic engineering of bone marrow-derived and umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. MSCs engineered using electroporation conditions produced more transgene expression than cells engineered with cationic lipids in bone marrow-derived mesenchymal stem cells, but produced similar amounts in umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. Optimal electroporation conditions also expressed more transgene than polymer based transfection reagent in umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. Cell survival after optimal electroporation conditions was 67% in umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. Most importantly, cells maintained their ability to differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic cell lineages. Electroporating umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells with a Factor IX containing plasmid lead to the FIX protein being expressed for over 12 days <em>in vitro</em>. This optimized electroporation protocol has created a fast, easy, economic and efficient method for genetically modifying mesenchymal stem cells without altering their ability to differentiate.</p> / Master of Applied Science (MASc)

Der adoptive Transfer von T-Zell-Rezeptor (TZR) modifizierten T-Zellen gegen krebsspezifische Antigene ist ein vielversprechender Ansatz in der Immuntherapie. Geeignete Zielmoleküle für diese Therapie sollten wichtig für das Überleben von Krebszellen sein und zudem in ausreichenden Mengen auf der Zelloberfläche exprimiert werden, um von T-Zellen erkannt zu werden. Die Identifizierung dieser Zielmoleküle ist jedoch eine Herausforderung und erfordert eine intensive Charakterisierung, um eine ausreichende Prozessierung und Präsentation auf den Tumorzellen zu validieren. Ziel dieser Arbeit war, HLA-A2-spezifische Neoepitope als Zielmoleküle für adoptive T-Zell-Therapie zu validieren. Dafür wurden erfolgreich Immunantworten in einem humanen transgenen Mausmodell nach Peptidimmunisierung induziert und TZRs mit hoher Affinität isoliert. Trotz einer hohen funktionellen Avidität von H3.3K27M-spezifischen T-Zellen wurde keine Erkennung von Tumorzellen erreicht. Zweitens wurden TZR-transduzierte T-Zellen gegen die häufige Melanommutation Rac1P29S isoliert, welche zytotoxisch gegen Melanomzelllinien waren. Letztlich wurde beobachtetet, dass TZRs mit hoher Affinität gegen gespleißte Kras und Rac2 Epitope, welche durch Proteasom-katalysiertes Peptidspleißen erzeugt wurden, keine Immunantwort gegen endogen exprimierte Mutationen hervorrufen konnten. Daraus lässt sich schließen, dass gespleißte Epitope wahrscheinlich seltener vorkommen als zuvor angenommen und daher möglicherweise irrelevant für die adoptive T-Zelltherapie sind. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Auswahl von Zielmolekülen für die adoptive T-Zell-Therapie mit Hilfe reverser Immunologie auf der Grundlage von Bindungsalgorithmen und der Häufigkeit von Mutationen allein nicht ausreicht. Daher sind vor der Isolierung und Charakterisierung von TZRs zusätzliche Strategien wie z.B. die Analyse des MHC-Immunopeptidoms erforderlich, um die Auswahl geeigneter Zielmoleküle für die T-Zelltherapie zu verbessern. / Adoptive transfer of T cell receptor (TCR)-engineered T cells against tumour-specific neoantigens is a promising approach in cancer immunotherapy. Ideally, targeted antigens are crucial for cancer cell survival and are generated in sufficient amounts to be recognised by T cells. However, the identification of ideal targets remains challenging and requires intensive characterisation to validate sufficient antigen processing and presentation by the tumour cells. This thesis focused on the validation of HLA-A2 binding neoepitopes carrying the recurrent cancer mutations H3.3K27M, Rac1P29S, Rac2P29L or KrasG12V as targets for adoptive T cell therapy. After peptide immunisation, immune responses in a human transgenic mouse model were elicited and high-affinity TCRs successfully isolated. Although H3.3K27M-specific T cells showed high functional avidity, no recognition of cells endogenously expressing mutant H3.3 was achieved. Furthermore, a mechanism to target the common melanoma mutation Rac1P29S with a TCR raised against a heterologous mutation with higher peptide-MHC affinity was described. TCR-transduced T cells induced cytotoxicity against Rac1P29S expressing melanoma cell lines. Lastly, high-affinity TCRs specific for mutant Kras and Rac2 spliced epitopes generated by proteasome-catalysed peptide splicing were successfully isolated, however, TCR-transduced T cells did not induce an immune response against endogenously expressed mutant transgenes. The results indicate that spliced epitopes are probably less abundant than previously estimated and therefore may play a minor role in the generation of targets for adoptive T cell therapy. These data suggest that target selection using a reverse immunology approach based on binding algorithms and frequency of mutations alone is not sufficient. Thus, additional strategies to improve the selection of suitable targets such as the analysis of the MHC immunopeptidome are required prior to TCR isolation and characterisation.

Frühgeburtlichkeit ist eine Pandemie. Im Jahr 2020 wurden schätzungsweise 13,4 Millionen Babys als Frühgeburten, d. h. vor der 37. Schwangerschaftswoche, geboren. Komplikationen bei Frühgeburten sind die häufigste Todesursache bei Kindern unter 5 Jahren (ca. 900 000 Todesfälle im Jahr 2019). Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) ist eine Form der chronischen Lungenerkrankung, von der Neugeborene betroffen sind, vor allem solche, die als Frühgeborene zur Welt kommen und eine Sauerstofftherapie benötigen. Bei der BPD werden die Lungen und die Alveolen geschädigt, was zu Gewebezerstörung (Dysplasie) und Narbenbildung führt. Leider konzentrieren sich die derzeitigen Behandlungen der BPD auf die Bewältigung der Krankheit, da es derzeit keine heilende Therapie gibt. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass mesenchymale Stamm-/Stromzellen (MSCs) in der regenerativen Medizin zur Behandlung verschiedener Lungenerkrankungen eingesetzt werden können. MSCs sind multipotente Zellen, die sich in verschiedene Zelltypen differenzieren und immunmodulatorische, entzündungshemmende, antioxidative und regenerative Eigenschaften besitzen. Sowohl präklinische als auch klinische Studien mit MSCs bei BPD haben erste vielversprechende Ergebnisse gezeigt. Kürzlich zeigten Möbius et al. jedoch widersprüchliche Ergebnisse, indem sie feststellten, dass eine prophylaktische Verabreichung von aus der menschlichen Nabelschnur stammenden MSC (UC-MSCs) eine gestörte Lungenentwicklung bei extrem früh geborenen nicht-menschlichen Primaten (Papio spp.) nicht verhindern konnte, wie es von Studien an anderen Modellorganismen erwartet wurde. Deshalb habe ich mich auf die Suche nach möglichen Erklärungen für diese Beobachtungen gemacht und mich dabei auf die lungeneigenen MSCs (L-MSCs) der Paviane konzentriert. Das primäre Ziel meines Promotionsprojekts war es, eine erste Charakterisierung und einen Vergleich der residenten L-MSCs sowohl von Placebo- als auch von UC-MSC-behandelten Frühgeborenen vorzunehmen. Das zweite Ziel meines Projekts war es, ein robustes und reproduzierbares (direktes) Ko-Kultur-Modell von L-MSCs und HUVECs zu etablieren. Wir haben uns für HUVECs entschieden, da diese Zellen von Neugeborenen stammen und es sich gezeigt hat, dass eine starke und komplexe Interaktion zwischen MSCs und blutgefäßbildenden Endothelzellen vor und während der Bildung von Mikrogefäßen für eine ordnungsgemäße Blut- und Sauerstoffzirkulation in der sich entwickelnden Lunge (Alveolen) besteht. Meine ersten Ergebnisse zeigen, dass es sich bei beiden Gruppen um echte MSCs handelt, da alle sechs (drei aus jeder Gruppe) in der Lage waren, sich an Kunststoff-Zellkulturplatten anzuheften, eine dreistufige Differenzierung in die Adipozyten-, Osteozyten- und Chondrozytenlinien zeigten und die MSC-Markergene CD73 (5'-Nukleotidase), CD90 (Thy-1) und CD105 (Endoglin) exprimierten, die vom ISCT als Mindestkriterien für MSC empfohlen werden. Zusätzlich untersuchte ich ihre CFU-Fähigkeit sowie ihre Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO)-Expression nach IFN-ɣ-Induktion, wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen festgestellt wurden. Es gab jedoch einen Trend bei ihrer CFU-Fähigkeit - L-MSCs aus den mit Placebo behandelten Tieren zeigten eine höhere CFU-Fähigkeit im Vergleich zu ihren Gegenstücken, die fast keine Kolonien bilden konnten. Im Gegensatz dazu wiesen die L-MSCs der UC-MSC-behandelten Tiere nach der IFN-ɣ-Induktion eine höhere Expression von IDO auf als die der Placebo-Tiere. Darüber hinaus wiesen beide Gruppen eine höhere IDO-Expression auf, die als Mindestkriterium für die klinische Anwendung von MSC gilt. Die RNA-Sequenzierung beider Gruppen zeigte unterschiedliche exprimierte Gensätze, z.B. solche, die am Glutathion-Stoffwechsel, an Ribosomen sowie an Glykolyse und Glukoneogenese beteiligt sind. Im zweiten und wichtigsten Teil meines Projekts begann ich mit der Untersuchung und dem Vergleich verschiedener Medien für HUVECs, die auch das Wachstum und die Vermehrung von L-MSCs für direkte Ko-Kultur-Experimente unterstützen würden. Sowohl HUVECs als auch L-MSCs wurden parallel aufgetaut und zunächst in ihrem eigenen bevorzugten Zellkulturmedium kultiviert. Danach wurden sie 72 Stunden lang ko-kultiviert. Nach diesen 3 Tagen wurden die HUVECs mit Hilfe von CD31+-Magnetbeads magnetisch getrennt. Zur Qualitätskontrolle wurde einmal eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um die korrekte Abtrennung der CD31+-Zellen zu bestätigen. Danach wurden mehrere Experimente mit HUVECs durchgeführt, die mit aus der Lunge stammenden MSCs von mit Placebo behandelten Tieren (HUVECs (P)), mit HUVECs, die mit aus der Lunge stammenden MSCs von UC-MSC-behandelten Tieren (HUVECs (T)) kokultiviert wurden, und mit HUVECs ohne Ko-Kultur (HUVECs (Ctr)). Es gab keine signifikanten Unterschiede in ihren Proliferationsraten, CFU-Fähigkeiten, bioenergetischen Profilen und Fähigkeiten zur Röhrenbildung. Es gab jedoch einige sichtbare Trends. So übertrafen die HUVECs (P) beide Gegenspieler leicht in ihren Proliferationsraten und CFU-Fähigkeiten. Darüber hinaus zeigten HUVECs (P) auch besser definierte Fähigkeiten zur Vasculogenese, wenn sie auf einer künstlichen Basalmembran ausgesät wurden, sowie eine höhere Anzahl von Verzweigungen, Maschen, Fläche der Maschen usw. im Vergleich zu beiden Gegenstücken. Es gab jedoch große Diskrepanzen zwischen den Gruppen, was die Individualität der einzelnen Pavianproben unterstreicht. Auch hier ergab die RNA-Sequenzierung statistisch unterschiedlich exprimierte Gene/Gensätze, darunter viele, die am Zellzyklus, der Angiogenese und der IFN-ɣ-Reaktion beteiligt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Ergebnisse die ersten Ergebnisse von M. Möbius und Kollegen widerspiegeln, die keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen bei einer Reihe von funktionellen und strukturellen Lungenparametern feststellen konnten. Unter Berücksichtigung der Einschränkungen meiner Studie, wie der geringen Anzahl von Pavianproben, der unkonventionellen Versuchsplanung aufgrund nicht vorhandener kommerzieller Antikörper, die spezifisch für Paviane sind, sowie der makrovaskulären Endothelzellen aus dem Gewebe von Neugeborenen anstelle von mikrovaskulären Zellen, wie sie in der sich entwickelnden menschlichen Lunge vorhanden sind, ebnen meine Ergebnisse den Weg für weitere Experimente unter Verwendung der nächsten Generation menschlicher kleiner Atemwegsepithelzellen (SAECs) und den Vergleich der Ergebnisse mit HUVECs. Darüber hinaus sind eingehendere (funktionelle) Analysen mit anderen Geweben von Pavianen gerechtfertigt. So haben wir zum Beispiel begonnen, auch mit aus Trachealaspirat (TA-MSCs) gewonnenen MSCs zu arbeiten, da TA-MSCs bei Kindern mit BPD nachweislich stark vertreten sind und als Marker für BPD dienen können. Mit unseren Studien an unserem einzigartigen Modellorganismus der extremen Frühgeburtlichkeit hoffen wir, die (molekularen) pathophysiologischen Mechanismen, die der Entwicklung der BPD zugrunde liegen, besser zu verstehen und den Weg für eine sichere, robuste und wirksame stammzellbasierte Therapie der BPD zu ebnen.

Natural Killer (NK) cellterapi är en lovande kandidat för cancerbehandling på grund av dess förmåga att känna igen och döda cancerceller. Adoptiv överföring av expanderade autologa eller allogena NK-celler har visat sig förbättra patientresultaten, särskilt i fall av akut myeloid leukemi (AML) efter stamcellstransplantation. En stor utmaning förknippad med NK-cellterapi är dock att få en tillräcklig mängd NK-celler för att uppnå meningsfulla terapeutiska resultat. Nuvarande metoder för att expandera NK-celler innebär ofta att T-celler avlägsnas från blodet, eftersom T-celler utgör över 50 % av blodets cellpopulation, medan NK-celler endast utgör cirka 10 %. Strategin för att ta bort T-celler involverar vanligtvis användningen av immunomagnetiska metoder, som kräver utbildad personal, är dyra och kräver god tillverkningssed (GMP) för att säkerställa metodens giltighet. Detta projekt syftade till att ta itu med denna fråga genom att etablera ett samodlingssystem mellan NK- och T-celler för att fungera som en modell för NK-expansion från patientens blod, vilket skulle kunna förbättra effektiviteten av cancerbehandling. Projektet syftade också till att undersöka det metaboliska beteendet (skillnader i näringsbehov och biprodukttolerans) mellan de två celltyperna. De två första experimenten med Jurkat gjordes med användning av en modifierad DMEM/RPMI och RPMI 1640-mediet under varierande glukos- och glutaminmålförhållanden. Resultatet från dessa två experiment visar att det modifierade DMEM/RPMI-mediet stödjer tillväxten av Jurkat-celler. Dessutom var produktionen av biprodukter inklusive laktat och ammoniak lägre i detta medium. Emellertid var glukos och glutamin avgörande för Jurkat-celltillväxt eftersom uppenbar konsumtion observerades under odlingsperioden. Det tredje experimentet syftade till att bedöma den negativa/reducerande effekten av glukos- och glutamintillstånd på Jurkat-celler. Resultaten från detta experiment applicerades sedan på NK-92-cellexpansion (fjärde experimentet). Det femte experimentet involverade samodling av båda celltyperna, med början med ett förhållande på 10% NK-celler till 90% Jurkat-celler, en ny celldiameterbaserad distributionsmetod användes för att förutsäga procentandelen NK-92-celler under samodlingen. Från dag 3 till dag 4 var det en ökning av andelen NK-celler, särskilt inom cellstorleksintervallet där de vanligtvis förekommer (17,4 µm). NK-cellerna utökades från 10 % på dag 0 till 52 % (i tillstånd med 2 mM glukos, 2 mM glutamin) på dag 3 och 45 % i tillstånd med 2 mM (glukos), 0,15 mM glutamin på dag 2. Sammantaget uppnådde denna studie framgångsrikt projektets mål att utveckla en samodlingsmodell genom att studera de enskilda cellinjernas metaboliska beteende. Ytterligare studier behövs för att undersöka effekterna av Interleukin 2 (IL-2) som produceras av Jurkat-celler på NK-celler. Dessutom skulle experiment med fler glukos- och glutaminmålkoncentrationer under längre odlingsperioder erbjuda en mer omfattande förståelse av samodlingssystemet, inklusive dess långsiktiga livskraft och celltillväxten av dessa cellinjer. / Natural Killer (NK) cell therapy is a promising candidate for cancer treatment due to its ability to recognize and kill cancer cells. The adoptive transfer of expanded autologous or allogenic NK cells has shown to improve patient outcomes, especially in cases of Acute Myeloid Leukemia (AML) following stem cell transplantation. However, a major challenge associated with NK cell therapy is obtaining a sufficient amount of NK cells to achieve meaningful therapeutic outcomes. Current methods for expanding NK cells often involve the removal of T cells from the blood, as T cells constitute over 50% of the blood's cell population, while NK cells make up only about 10%. The strategy to remove T cells typically involves the use of immunomagnetic beads, which require trained personnel, are expensive, and necessitate good manufacturing practices (GMP) to ensure the method's validity. This project aimed to address this issue by establishing a coculture system between NK and T cells to serve as a model for NK expansion from the patient blood which could improve the effectiveness of cancer treatment. The project also aimed at investigating the metabolic behavior (differences in nutrient demands and byproduct tolerance) between the two cell types. The first two experiment with Jurkat was done using a modified DMEM/RPMI and the RPMI 1640 media under varying glucose and glutamine target conditions. The result from these two experiments shows that the modified DMEM/RPMI media support the growth of Jurkat cells. In addition, the production of byproducts including lactate and ammonia were lower in this media. However, glucose and glutamine were crucial for Jurkat cells growth as evident consumption was observed during the culture period. The third experiment aimed to assess the negative/reducing impact of glucose and glutamine conditions on Jurkat cells. The findings from this experiment were then applied to NK-92 cells expansion (fourth experiment). The fifth experiment involved coculturing both cell types, starting with a ratio of 10% NK cells to 90% Jurkat cells, a new cell diameter based distribution method was used to predict the percentage of NK-92 cells during the coculture. From day 3 to day 4, there was an increase in the percentage of NK cells, particularly within the cell size range where they typically occur (17,4 µm). The NK cells were expanded from 10% on day 0 to 52% (in condition with 2mM glucose, 2mM glutamine) on day 3 and 45% in condition with 2mM(glucose), 0,15mM glutamine on day 2. Overall, this study successfully achieved the project's aim of developing a coculture model through studying the metabolic behavior of the individual cell lines. However, further studies are needed to investigate the effects of Interleukin 2 (IL-2) produced by Jurkat cells on NK cells. Moreover, conducting experiments with more glucose and glutamine targets concentrations over extended culture periods would offer a more comprehensive understanding of the coculture system, including its long-term viability and the cell growth of these cell lines.

CAR-T-Zell-Therapie ist eine vielversprechende neuartige Behandlungsform für Patienten mit aggressiven B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL). In dieser Arbeit wurde die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie als Alternative zur anti-CD19 CAR-T-Zell-Therapie für die Behandlung von reifen B-NHLs untersucht. CXCR5 ist ein B-Zell-homing Rezeptor, der von reifen B Zellen und follikulären T-Helferzellen (TFH Zellen) exprimiert wird. TFH Zellen wurden als tumor-unterstützend in chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und im follikulären Lymphom (FL) beschrieben. Dieses Expressionsmuster erlaubt es, auf einzigartige Weise zeitgleich die malignen Zellen und die tumorunterstützende Mikroumgebung mithilfe von CAR-T-Zell-Therapie gerichtet gegen einen Chemokinrezeptor anzugreifen. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit waren, dass (1) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet CXCR5 positive reife B-NHL Zelllinien und Patientenproben in vitro eliminierten und eine starke anti-Tumor Reaktivität in einem immundefizienten Xenotransplantationsmausmodell zeigten, (2) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet die tumorunterstützenden TFH Zellen in CLL und FL Patientenproben in vitro erkannten und dass (3) CXCR5 ein sicheres Expressionsprofil zeigte. CXCR5 war stark und häufig auf B-NHL exprimiert und die Expression auf gesundem Gewebe war auf lymphoide Zellen beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie eine neue Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit reifen B-NHL darstellt, indem durch die anti-CXCR5 CAR-T Zellen sowohl der Tumor als auch ein Anteil der tumorunterstützende Mikroumgebung eliminiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Eμ-Tcl1 murine CLL Lymphommodell genutzt um die Auswirkung der Lymphomentwicklung auf die CXCR5+ T Zellen zu untersuchen. Mittels RNA-Einzelzell-Sequenzierung konnte ein profunder Einfluss des Lymphomwachstums auf das T Zell-Kompartiment der Mäuse, denen Eμ-Tcl1 Zellen gespritzt wurden, gezeigt werden. / CAR T cell therapy is a promising new treatment option for patients suffering from aggressive B non-Hodgkin lymphomas (NHLs). In CAR T cell therapy, patient-derived T cells are genetically modified to express a chimeric receptor commonly directed towards a surface antigen expressed by neoplastic cells. In this thesis, anti-CXCR5 CAR T cell therapy was investigated as an alternative to anti-CD19 CAR T cell therapy for the treatment of mature B-NHLs. CXCR5 is a B cell homing receptor expressed by mature B cells and follicular helper T (TFH) cells. TFH cells were described to support the tumor cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and follicular lymphoma (FL). This expression pattern allows simultaneous targeting of the malignant cells and the tumor-supporting microenvironment by CAR T cell therapy against a chemokine receptor in an unprecedented manner. Main findings included that (1) anti-CXCR5 CAR T cells targeted specifically CXCR5 expressing mature B-NHL cell lines and patient samples in vitro and showed strong in vivo anti-tumor reactivity in an immunodeficient xenograft mouse model, (2) anti-CXCR5 CAR T cells targeted tumor-supportive TFH cells derived from CLL and FL patient samples in vitro and (3) CXCR5 showed a safe expression profile. CXCR5 was strongly and frequently expressed by B-NHLs and its expression on healthy tissue was restricted to lymphoid cells. In summary, anti-CXCR5 CAR T cell therapy presents a novel treatment option for patients suffering from mature B-NHLs by eliminating the tumor and part of the tumor-supportive microenvironment. The second part of the project, the Eμ-Tcl1 murine lymphoma model, which mimics human CLL, was used to study the impact of lymphomagenesis on CXCR5+ T cells. Using single cell RNA sequencing, a profound influence of lymphoma growth on the T cell compartment in Eμ-Tcl1 tumor-challenged mice could be shown.

Dogs are useful preclinical models for the translation of cell transplantation therapies from the bench to the bedside. In order for canine models to be utilized for stem cell transplantation research, it is necessary to advance discoveries in the fields of canine stem cell biology and transplantation. The use of side population hematopoietic stem cells (HSCs) has garnered much interest for the purification of mouse HSCs and has been translated to several other species, including human. In order to assess if this method of purification of HSCs could be useful for stem cell therapies in humans, safety and efficacy studies in a large animal model, such as the dog would be required. With this objective in mind, we isolated canine bone marrow-derived side population (SP) stem cells and assessed their multilineage differentiation in vitro and engraftment potential in vivo. Utilizing a pregating strategy to enrich for small, agranular SP cells we were able to enrich for blast cells, expressing the ABCG2 transmembrane pump known to be associated with murine and human SP cells. Canine SP cells were also enriched for C-KIT positive cells and lacked expression of CD34 as identified in other species. The small, agranular SP fraction had high CFU potential after long-term culture with canine bone marrow stromal cells and cytokine supplementation. Yet, canine SP cells demonstrated low-level engraftment within the NOD/SCID-β2m-/- xenotransplantation model as compared to unfractionated canine bone marrow, which was indicative of suboptimal activation of quiescent canine SP cells within the murine bone marrow niche. A second source of transplantable canine stem cells was examined through the derivation of canine embryonic stem cells (cESCs). The cESC lines described herein were determined to have similar pluripotent stem cell characteristics to human embryonic stem cells, in that they were maintained in an undifferentiated state upon extended passaging as determined by their expression of the human stem cell markers, OCT3/4, NANOG, SOX2, SSEA3, SSEA4, TRA1-60, TRA1-81 and alkaline phosphatase. In addition, cESCs could be induced to differentiate to cells of the three germ layers within in vitro embryoid body cultures and adherent differentiation cultures. Importantly, these cESC lines were the first reported to differentiate in vivo within teratomas. One method of transplanting stem cells to canine recipients involves the delivery of donor cells to the yolk sacs of developing fetuses in utero. Utilizing cells labeled with supraparamagnetic particles conjugated to a Dragon Green fluorophore and the intracellular fluorescent dye, CMTMR, donor cells were tracked from the yolk sac injection site to fetal tissues after transplantation in early (day-25) and mid (day-35) gestation canine fetuses. Labeled cells were localized primarily to the fetal liver and developing bone marrow cavities when examined at gestational day 32, and had been redistributed to not only the fetal liver and bone marrow by day 42, but also to nonhematopoietic tissues, including the lungs and hearts. No labeled cells were detected within the yolk sacs of transplanted fetuses at either time point. These studies demonstrated the efficacy of yolk sac in utero transplantation for the delivery of donor cells to fetal tissues. Collectively, these results indicate that canine stem cells with characteristics similar to human can be isolated and their engraftment, proliferation and differentiation may be assessed in future studies utilizing the canine in utero transplantation model employing yolk sac delivery.