Le glioblastome (GBM) est la forme de cancer du cerveau la plus courante et la plus meurtrière. Sa nature diffusive entraine une impossibilité d’élimination complète par chirurgie. Une récidive de la tumeur chez ≥ 90% des patients peut être provoqué par des cellules GBM résiduelles se trouvant près du bord de la cavité de résection. Un implant pouvant libérer de manière durable la protéine SDF-1α, qui se lie aux récepteur CXCR4 à la surface des cellules GBM, peut être utile pour induire le recrutement des cellules GBM résiduelles, permettre leur élimination sélective et finalement réduire la récurrence de la tumeur. Dans ce travail, le SDF-1α a été initialement encapsulé dans des nanoparticules à base d'acide poly-lactique-co-glycolique (PLGA). Une efficacité d'encapsulation élevée (76%) a pu être obtenue en utilisant un processus simple de séparation de phase. Les nanoparticules chargées de SDF-1α ont ensuite été incorporées dans un scaffold à base de chitosan par électrofilage pour obtenir des implants nanofibreux imitant la structure de la matrice extracellulaire du cerveau. Une étude de libération in vitro a révélé que l'implant pouvait fournir une libération prolongée de SDF-1α jusqu'à 35 jours, utile pour établir un gradient de concentration de SDF-1α dans le cerveau et induire une attraction des cellules GBM. Une étude de biocompatibilité in vivo à 7 jours a révélé des signes d'inflammation locale sans aucun signe visible de détérioration clinique chez les sujets animaux. Une étude à 100 jours visant à confirmer l'innocuité in vivo des implants avant de passer aux études d'efficacité dans un modèle de résection GBM approprié est actuellement en cours. / Glioblastoma (GBM) is the most common and lethal form of brain cancer. The diffusive nature of GBM means the neoplastic tissue can not be removed completely by surgery. Often, residual GBM cells can be found close to the border of the resection cavity and these cells can multiply to cause tumor recurrence in ≥90% of GBM patients. An implant that can sustainably release chemoattractant molecules called stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α), which bind selectively to CXCR4 receptors on the surface of GBM cells, may be useful for inducing chemotaxis and recruitment of the residual GBM cells. This may then give access to selective killing of the cells and ultimately reduce tumor recurrence. In this work, SDF-1α was initially encapsulated into poly-lactic-coglycolicacid (PLGA)-based nanoparticles. A high encapsulation efficiency (76%) could be achieved using a simple phase separation process. The SDF-1α-loaded nanoparticles were then incorporated into a chitosan-based scaffold by electrospinning to obtain nanofibrous implants that mimic the brain extracellular matrix structure. In vitro release study revealed that the implant could provide sustainedSDF-1α release for 5 weeks. The gradual SDF-1αrelease will be useful for establishing SDF-1α concentration gradients in the brain, which is critical for the chemotaxis of GBM cells. A 7-day in vivo biocompatibility study revealed evidence of inflammation at the implantation site without any visible signs of clinical deterioration in the animal subjects. A long-term study (100 days) aiming to confirm the in vivo safety of the implants before proceeding to efficacy studies in a suitable GBM resection model is currently underway.

Aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) können sich neben allen anderen Zellen des Immunsystems auch dendritische Zellen (DCs) entwickeln. DCs spielen eine zentrale Rolle sowohl bei der Induktion von Immunantworten als auch bei der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz. Eine Beeinflussung von DCs zur therapeutischen Nutzung wäre wünschenswert, erfordert aber ein noch tieferes Verständnis über deren Entwicklung im humanen Organismus. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung potentieller DC-Vorläuferzellen in humanen lymphatischen Geweben. In Immunfluoreszenzaufnahmen von Thymus, Milz und Tonsillen mit Stammzell-charakterisierenden Markern konnten sowohl die in der Literatur als „Hämatopoetisches Stammzellkompartiment“ beschriebene Zellpopulation als auch weitere Zwischenstufen der Entwicklungsreihe der HSCs detektiert werden. Als Nächstes wurde untersucht, ob die im Gewebe identifizierten CD34+ Zellen in der in vitro Kultur zu DCs differenziert werden konnten. Hierzu wurden zunächst Protokolle etabliert und weiterentwickelt, in denen CD34+ Stammzellen des Nabelschnurbluts zu DCs gereift wurden. In einem anschließenden Schritt wurde das Protokoll mit den besten Ausbeuten an DCs auf Thymuszellen angewendet. Somit gelang es, aus Thymusstammzellen eine DCSubpopulation zu generieren, die aufgrund ihrer Markerexpression den Langerhanszellen ähnelt. Auf ihnen konnten außer Langerin auch andere C-Typ Lektinrezeptoren (Clec9a, DCIR und CD205) detektiert werden. Diese Zellen sind daher interessante Ziele für Untersuchungen zur Antigenbeladung von DCs und deren Präsentation an das adaptive Immunsystem. Zur effektiven Antigenbeladung von DCs werden Antikörper gegen endozytotisch wirksame Oberflächenmoleküle benötigt. Für deren Produktion wurden im weiteren Verlauf der Arbeit His-tragende und Ig-Fusionsproteine von Clec9a, Langerin, Dectin-1 und Dectin-2 produziert, um diese zur Immunisierung und Antikörperproduktion einzusetzen. In Zukunft können diese Antikörper zur Charakterisierung verschiedenster DC-Subpopulationen und außerdem zur Antigenbeladung von DCs herangezogen werden.

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The purpose of this research was to study the synthesis and remodeling of extracellular matrix (ECM) by fibroblasts with special emphasis on the culture environment (media composition and initial ECM composition) and the resulting mechanical integrity of the ECM. This was investigated by culturing fibroblasts for 3 weeks in a variety of culture conditions consisting of collagen gels, fibrin gels, or media permissive to the self-production of ECM (Cell-Derived Matrix), and quantifying the mechanics of the resulting ECM. The mechanical characteristics were related to the biochemistry of the resulting ECM, notably in terms of collagen accumulation and collagen fibril diameters. The ultimate tensile strength (UTS) of the collagen gels and fibrin gels at the end of the 3-week period was 168.5 ± 43.1 kPa and 133.2 ± 10.6 kPa, respectively. The ultimate tensile strength of the cell-derived matrices was 223.2 ± 9 kPa, and up to 697.1 ± 36.1 kPa when cultured in a chemically-defined medium that was developed for the rapid growth of matrix in a more defined environment. Normalizing the strength to collagen density resulted in a UTS / Collagen Density in these groups of 6.4 ± 1.9 kPa/mg/cm3, 25.9 ± 2.4 kPa/mg/cm3, 14.5 ± 1.1 kPa/mg/cm3, and 40.0 ± 1.9 kPa/mg/cm3, respectively. Cells were synthetically more active when they produced their own matrix than when they were placed within gels. The resulting matrix was also significantly stronger when it was self-produced than when the cells rearranged the matrix within gels that corresponded to a significantly larger fraction of non-acid and pepsin extractable collagen. These studies indicate that cell-derived matrices have potential both as in vitro wound healing models and as soft connective tissue substitutes.

Une accélération de la fréquence cardiaque (FC) au repos est observée chez les femmes enceintes. Au dernier trimestre, la FC accélère en moyenne de 15%, ce qui représente un facteur de risque dans le développement d’arythmies de novo ou dans l’exacerbation d’arythmies cardiaques préexistantes. Ceci est dangereux pour la mère ainsi que pour le fœtus. Cependant, les mécanismes responsables de ce changement cardiovasculaire restent peu connus. Notre laboratoire a récemment démontré que la grossesse était associée à une augmentation de la densité du courant pacemaker (If) et du courant calcique de type L (ICaL), ainsi qu’à des changements de l’homéostasie calcique dans les cellules de nœud sinusal (NS) de souris. Sachant que les concentrations plasmatiques en œstrogènes sont significativement augmentées pendant la grossesse et que ces hormones sexuelles féminines ont la capacité de modifier les propriétés électrophysiologiques du cœur, l’hypothèse de ce projet de recherche est que les œstrogènes jouent un rôle important dans l’augmentation de la FC associée à la grossesse et régulent les propriétés électrophysiologiques du NS. Les objectifs de ce projet de recherche sont de déterminer le rôle du 17β-œstradiol (E2) dans l’augmentation de la FC, d’examiner si ces effets sont régulés par les récepteurs aux œstrogènes alpha (ERα) et/ou bêta (ERβ) ainsi que d’évaluer les différents mécanismes de régulation de l’E2 sur l’électrophysiologie du NS. Des souris femelles adultes non-gestantes (2-4 mois) déficientes en ERα (ERKOα) ou en ERβ (ERKOβ) ont reçu un traitement chronique à l’E2 (30 μg deux fois par jour pendant quatre jours) simulant les concentrations plasmatiques en E2 retrouvées en fin de grossesse (23,3 ± 5,0 nM) chez la souris. L’analyse des électrocardiogrammes de surface montrent que la FC des souris ERKOβ (ERKOβ : 511 ± 15 bpm; ERKOβ +E2 : 580 ± 10 bpm, n = 10, p < 0,001) est significativement accélérée suivant le traitement à l’E2. Toutefois, la FC demeure inchangée chez les souris ERKOα (ERKOα : 520 ± 16 bpm; ERKOα +E2 : 530 ± 21 bpm, n = 7, p = 0,114). La méthode du patch-clamp en mode courant-imposé a permis de démontrer une accélération de l’automaticité des cellules du NS des souris ERKOβ suivant le traitement à l’E2, se traduisant par une augmentation de la fréquence des potentiels d’action spontanés (ERKOβ : 284 ± 24 bpm, n = 8; ERKOβ +E2 : 354 ± 23 bpm, n = 15, p = 0,0395) et par une pente de dépolarisation diastolique plus rapide (ERKOβ : 82 ± 12 mV/s, n = 8; ERKOβ +E2 : 140 ± 14 mV/s, n = 15, p < 0,003). En lien avec ces résultats, le patch-clamp en mode voltage-imposé a permis de démontrer que la densité de If est augmentée suivant un traitement à l’E2 (à -90 mV : ERKOβ : -6,6 ± 0,7 pA/pF, n = 12-15; ERKOβ +E2 : -11 ± 1 pA/pF, n = 9-11, p < 0,05). Cependant, If est similaire chez les souris ERKOα traitées ou non à l’E2. De plus, des cardiomyocytes humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites de type nodal (N-hiPSC-CM) ont une accélération de la fréquence des potentiels d’action (CTL : 69 ± 5 bpm, n = 12; +E2 : 99 ± 6 bpm, n = 14, p < 0,001) ainsi qu’une augmentation de la densité de If (à -90 mV : CTL : -0,95 ± 0,14 pA/pF, n = 7-10; +E2 : -1,62 ± 0,17 pA/pF, n = 13-14, p < 0,05) suivant le traitement à l’E2. L’administration d’E2 ne modifie pas la fréquence des transitoires calciques des cellules de NS des souris ERKOα (139 ± 15, n = 13-14; +E2 : 142 ± 14, n = 15-16, p = ns) et ERKOβ (142 ± 11, n = 14-15; +E2 : 147 ± 13, n = 15-16, p = ns). En lien avec ces résultats, le courant ICaL des N-hiPSC-CM est inchangé suivant le traitement d’E2 (à 0 mV : CTL : -14,0 ± 1,3 pA/pF, n = 12-13; +E2 : -14,5 ± 1,4 pA/pF, n = 22, p = ns). En conclusion, l’accélération de l’automaticité cardiaque associée à la grossesse est, entre autres, expliquée par une augmentation de la densité de If, régulée par la voie de signalisation E2-ERα. Cependant, les changements de l’homéostasie calcique observés pendant la grossesse sont indépendants des niveaux élevés en œstrogènes. Les résultats obtenus sur les N-hiPSC-CM concordent avec ce qui est observé dans les cellules de NS de souris, ce qui démontre l’applicabilité humaine des résultats. Notre étude contribue à élucider l’influence de la grossesse et le rôle des hormones sexuelles féminines sur la fonction du NS et l’automaticité cardiaque. Ultimement, notre travail pourrait aider à développer une meilleure gestion des arythmies associées aux fluctuations hormonales féminines et/ou à la grossesse. / An increased heart rate (HR) is observed in pregnant women. In fact, in the last trimester, in average, the HR increases by 15%, which is a known risk factor to developing cardiac arrhythmias or exacerbating pre-existing arrhythmias. This can lead to major consequences for both the mother and fetus. However, the mechanisms underlying this increased HR remain largely unexplored. Our laboratory recently demonstrate that pregnancy is associated with an increased density of the pacemaker current (If) and the L-type calcium current (ICaL) as well as changes in calcium homeostasis of mouse sinoatrial node (SAN) cells. Knowing that estrogens are increased during pregnancy and that these sex hormones can modify cardiac electrophysiological properties, we hypothesized that estrogens play a key role in the pregnancy-induced increased HR and regulate the SAN electrophysiological properties. Our research project aims to determine the role of 17β-estradiol (E2) on the pregnancy-induced increased HR, to determine if these effects are regulated through estrogen receptor alpha (ERα) and/or beta (ERβ) and to study the E2 underlying mechanisms on SAN electrophysiology. Non-pregnant female mice (2-4 months) lacking ERα (ERKOα) or ERβ (ERKOβ) received a chronic E2 treatment (30 μg twice daily for four days) mimicking E2 concentrations found in late pregnancy (23.3 ± 5.0 nM). Surface electrocardiogram analysis showed a significant increased HR in ERKOβ mice (ERKOβ: 511 ± 15 bpm; ERKOβ +E2: 580 ± 10 bpm; n = 10; p<0.001) following E2 administration. However, the HR remains unchanged in ERKOα mice (ERKOα: 520 ± 16 bpm; ERKOα +E2: 530 ± 21 bpm, n = 7, p = 0.114). Following E2 treatment, current-clamp method demonstrates an increase SAN cells automaticity in ERKOβ mice, resulting in an increase in the spontaneous action potential frequency (ERKOβ : 284 ± 24 bpm, n = 8; ERKOβ +E2 : 354 ± 23 bpm, n = 15, p = 0.0395), associated with a steeper diastolic depolarization slope (ERKOβ : 82 ± 12 mV/s, n = 8; ERKOβ +E2 : 140 ± 14 mV/s, n = 15, p < 0.003), a major determinant of cardiac automaticity. In line with these results, voltage-clamp data showed an increased If density in SAN cells of ERKOβ mice treated with E2 (at -90 mV: ERKOβ: -6.6 ± 0.7 pA/pF, n = 12-15; ERKOβ +E2: -11.0 ± 1.3 pA/pF, n = 9-11, p < 0.05). Nevertheless, If density was similar in E2-treated ERKOα mice. E2-treated nodal-like human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (N-hiPSC-CM) also showed an increased spontaneous action potential frequency (CTL : 69 ± 5 bpm, n = 12; +E2 : 99 ± 6 bpm, n = 14, p < 0.001) and If density (at -90 mV: CTL: -0.95 ± 0.14 pA/pF, n = 7-10; +E2: -1.62 ± 0.17 pA/pF, n = 13-14, p < 0.05). Following E2 administration, the rate of calcium transient was similar in SAN cells from ERKOα (139 ± 15, n = 13-14; +E2 : 142 ± 14, n = 15-16, p = ns) and ERKOβ (142 ± 11, n = 14-15; +E2 : 147 ± 13, n = 15-16, p = ns) mice. In line with these results, no modification was seen on ICaL density in E2-treated N-hiPSC-CM (at 0 mV: CTL: -14.0 ± 1.3 pA/pF, n = 12-13; +E2: -14.5 ± 1.4 pA/pF, n = 22, p = ns). In conclusion, the increased cardiac automaticity observed during pregnancy is, in part, explained by an increased If density. This mechanism is mediated by the E2-ERα pathway. In the other hand, calcium homeostasis changes detected during pregnancy appear to be mediated by an E2-independent mechanism. Finally, results obtained on N-hiPSC-CM are consistent with our observations on mouse SAN cells, demonstrating the human applicability of our results. This study provides novel insight on the effects of female sex hormones on the SAN functions. Ultimately, this information can lead to improved management of arrhythmias associated with female hormone fluctuations and/or pregnancy-induced arrhythmias.