La prévalence de l’asthme a doublé dans les pays occidentaux depuis environ 1980. Une croissance alarmante qui fait face aux changements de mode de vie : hygiène (l’exposition à des agents infectieux), alimentation, ou encore pollution. Ces éléments sont des co-facteurs de risque, potentiellement responsables de l’installation de l’asthme ou de son aggravation. Cependant aucun mécanisme clair n’est déterminé à ce jour. Ce travail de thèse s’est focalisé sur le rôle des protagonistes centraux de la réponse immune, les populations lymphoïdes innées et adaptatives, dans l’exacerbation de l’asthme par ces différents co-facteurs. L’obésité est associée à une prévalence accrue d’asthme. Récemment, les cellules lymphoïdes innées (ILC) ont été impliquées dans ces pathologies. L’axe principal de mon travail a été de caractériser la contribution des lymphocytes T comparativement aux ILC dans un modèle murin d’exacerbation de l’asthme induit par des allergènes d’acariens liée à l'obésité. Un régime riche en graisse aboutit à l’exacerbation des caractéristiques de l’asthme, incluant l’hyperréactivité bronchique, la réponse humorale, le recrutement des éosinophiles circulants et tissulaires. Parallèlement à une exacerbation des profils pulmonaires Th2 et Th17, la quantité des ILC2 et ILC3 activées est amplifiée chez les souris asthmatiques obèses et associée à une augmentation de l’expression de l’IL-33, l’IL-1β et une diminution des marqueurs des ILC dans le tissu adipeux viscéral. La déplétion des ILC dans ce modèle a confirmé leur implication dans l’exacerbation de l’asthme chez les souris obèses, notamment via une activation des profils Th2 et Th17. Parallèlement, nous avons évalué l’incidence des HAP, polluants provenant d’échappement diesel, en mesurant les caractéristiques moléculaires de l’asthme sévère. Parmi les cellules mononucléaires du sang activées, les particules d’échappement du diesel (DEP)-HAP et celles du benzo[a]pyrène (B[a]P) induisent une augmentation de la production d’IL-22 plus élevée chez les sujets allergiques asthmatiques (AA), et une diminution de l’IL-17A. Cette production d’IL-22 est majoritairement issue des cellules Th22, et son mécanisme d’induction est principalement dépendant de l’AhR sous l’effet des DEP-HAP contrairement au B[a]P. Enfin, nous avons étudié l’impact des infections. L’activation de NOD1 des cellules dendritiques (DC) humaines, indépendamment de l’allergène, promeut un profil Th2, induit préférentiellement la production de CCL17 chez un patient asthmatique, leur maturation et perturbe la production de CCL22 et de l’IL-10. Chez la souris, l’activation systémique de NOD1 exacerbe l’asthme allergique, via l’augmentation de la réponse pulmonaire de type Th2 dépendamment de CCL17.Dans une autre étude, la costimulation de DC immatures humaines par un allergène de chien et le ligand de TLR3 ou TLR9 accentue la différentiation, l’expression de marqueurs d’activation et la production cytokinique des DC, avec l’induction d’un profil Th22/Th1 chez les sujets saints, contrairement à un profil Th22/Th17/Th2 chez les patients AA. Cette activation spécifique des DC, induite par la costimulation chez un patient AA, provoque la sécrétion d’IL-17A, IL-17F et d’IL-13, ainsi qu’une amplification de la production d’IL-22 par les lymphocytes Th22. Tout ceci suggère que la costimulation par certains allergènes et/ou pathogènes peut induire une réponse Th22 et Th17 chez les sujets asthmatiques, et contribuerait à la sévérité de certains asthmes.L'ensemble de ces travaux ont permis d’établir de nouvelles appréhensions des déterminants potentiels dans l’asthme ainsi que de nouvelles notions des mécanismes moléculaires et cellulaires gouvernant la réponse immune. / The prevalence of asthma has increased twice in Western countries since about 1980. An alarming growth which correlates with lifestyle changes: sanitary conditions (exposure to infectious agents), nutrition, or pollution. These elements are risk co-factors, involved in asthma development or aggravation. However, no clear mechanism is determined to date. This work focused on the role of central players in the immune response, the innate and adaptive lymphoid populations in asthma exacerbation by these different cofactors.Obesity is associated with an increased prevalence of asthma. Recently, the innate lymphoid cells (ILC) were involved in these 2 pathologies. The main focus of my work was to characterize the T cells compared to ILC contribution in a murine model of asthma exacerbation induced by mite allergens linked to obesity. A high fat diet leads to the exacerbation of the main asthma features, including bronchial hyperresponsiveness, humoral response, recruitment of circulating and tissue eosinophils. In parallel to the exacerbation of Th2 and Th17 profiles, the amount of activated ILC2 and ILC3 is amplified in the lung of obese asthmatic mice and associated with increased expression of IL-33, IL-1β and reduced ILC markers in visceral adipose tissue. ILC depletion in this model confirmed their involvement in asthma exacerbation in obese mice, especially through Th2 and Th17 profiles activation.On the other hand, we evaluated the impact of PAH, pollutants from diesel exhaust, by monitoring the molecular characteristics of severe asthma. Among the activated blood mononuclear cells, diesel exhaust particles (DEP)-PAH and those of benzo[a]pyrene (B[a]P) enhance IL-22 production in asthmatic allergic patients (AA), and decrease IL-17A. Th22 cells are the major source of this IL-22 production and its induction mechanism is mainly dependent on AhR under the effect of DEP-PAH contrary to B[a]P.Finally, we investigated the impact of infections. NOD1 priming of human dendritic cells (DC), independently of the allergen presentation, promoted a Th2 polarization profile which involved the production of both CCL17 and CCL22 in nonallergic subjects but only CCL17 in allergic patients. Moreover, NOD1-primed DC from allergic donors exhibited enhanced maturation that led to abnormal CCL22 and IL-10. In mice, systemic NOD1 activation exacerbates allergic asthma, via the increase in pulmonary Th2 response depending on CCL17.In another study, the costimulation of human immature DC, by dog allergen and TLR3 or TLR9 ligands, increases the DC differentiation, expression of activation markers and cytokine production, with the induction of a Th22/Th1 profile in healthy subjects, unlike a Th22/Th17/Th2 profile in AA patients. This specific DC activation, induced by costimulation in AA patients, leads to the IL-17A, IL-17F and IL-13 secretion, as well as the amplification of IL-22 production by Th22 cells. All this suggests that costimulation by certain allergens and/or pathogens can induce Th22 and Th17 response in asthmatic subjects, and may contribute to the severity of some asthma cases.Taken together, the results presented in this work establish new apprehensions of potential asthma determinants, as well as new concepts of molecular and cellular mechanisms underlying the immune response.

L’étude des réseaux protéiques perturbés au cours de l’infection par les petits virus oncogéniques amena, vers la fin des années 80, à la découverte de nombreux régulateurs clés de la division et de la survie cellulaire. Parmi ceux-ci, la protéine E4F1 fût initialement identifiée comme une cible de l’oncoprotéine virale E1A. Originellement identifié comme un facteur de transcription, E4F1 est également une ubiquitine-E3 ligase atypique pour d'autres facteurs de transcription tel que le suppresseur de tumeurs p53. Au travers de ses multiples activités, E4F1 est nécessaire à la prolifération des cellules somatiques et souches, et à la survie des cellules cancéreuses. De plus, les travaux de différents laboratoires dont le mien suggèrent qu’E4F1 se situe au carrefour de plusieurs voies de signalisation qui sont fréquemment altérées au cours de l’oncogenèse, et notamment la voie impliquant le suppresseur de tumeurs p53. Afin d’étudier les fonctions physiologiques in vivo d’E4f1, mon laboratoire d’accueil a développé plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées. La caractérisation de ces modèles a permis de mettre en évidence un rôle majeur d'E4F1 dans l'homéostasie de la peau. Plus précisément, E4F1 régule le pool de cellules souches de l'épiderme au travers de son rôle dans une voie de signalisation qui implique la protéine p53 et deux de ces régulateurs en amont: Arf et Bmi1. Cependant, il semble que les effets d'E4F1 dans le contrôle du maintien des cellules souches s'étendent au delà de son rôle sur cette voie de signalisation. En effet, j'ai récemment pu démontrer qu'E4F1, au travers de ces fonctions transcriptionnelles, régule directement l'expression d'un sous-groupe de gènes impliqués dans la régulation de l'activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH). La PDH est un complexe multimérique situé dans la mitochondrie qui catalyse la décarboxylation du pyruvate (le produit final de la glycolyse) en acétyl coenzyme A (AcCoA), liant ainsi le métabolisme du pyruvate au cycle de Krebs. J’ai pu montrer que l’inactivation d’E4f1 spécifiquement dans l'épiderme conduisait à une diminution importante de l’activité de PDH et à une reprogrammation métabolique de ces cellules. Cette reprogrammation a pour conséquence d'altérer le micro-environnement des cellules souches qui conduit à leur détachement de leur niche et aboutit in fine à une absence du renouvellement de l'épiderme. Cette partie de mes travaux a donc permis d'illustrer pour la première fois l'importance du métabolisme du pyruvate dans l'homéostasie des cellules souches de la peau. Sur la base de ces résultats, je poursuis l'analyse des fonctions d’E4f1 dans l'homéostasie de la peau en étudiant son rôle dans d'autres types cellulaires tels que les mélanocytes. / The multifunctional protein E4F1 is an essential regulator of normal skin homeostasis. During my Phd, I demonstrated that E4f1 inactivation in adult skin results in stem cell autonomous defects causing exhaustion of the epidermal stem cell (ESC) pool. At the molecular level, I identified E4F1 as a new regulator of the pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in keratinocytes, an essential mitochondrial complex that converts pyruvate into Acetyl-CoEnzyme A. Using genetically engineered mouse models, I showed that E4F1-mediated control of PDH activity is required to maintain normal skin homeostasis. Consistently, E4F1 deficiency in basal keratinocytes resulted in deregulated expression of dihydrolipoamide acetlytransferase (Dlat), a gene encoding the E2 subunit of the PDC, and impaired PDH activity. The metabolic reprogramming of E4f1 KO keratinocytes associated with the redirection of the glycolytic flux towards lactate production and increased lactate secretion in their microenvironment, leading to enhanced activity of extra-cellular-matrix remodelling proteases Finally, these defects ended in alterations of the basement membrane, ESC mislocalization and the exhaustion of the ESC pool. In the second part of my thesis, I have evaluated the role of E4F1-mediated control of the PDC in melanocytes and showed that the metabolic activities of E4F1 are important for melanocyte function. Consistently, mice with E4f1-deficient melanocytes exhibited hair graying and skin pigmentation defects. Altogether, my data demonstrate the importance of E4f1-mediated control of pyruvate metabolism for normal skin homeostasis.

Le stress oxydatif joue un rôle majeur dans la mort des cellules neuronales dans diverses conditions neuropathologiques. Cependant, les astrocytes réactifs, en produisant des facteurs neuroprotecteurs et antioxydants, sont capables de protéger les neurones contre le stress oxydatif. De ce fait, la protection des cellules gliales contre les facteurs nocifs, s’avère indispensable pour prévenir les dommages des cellules nerveuses. Les globines du cerveau, en particulier, la neuroglobine (Ngb) et l’hémoglobine (Hb), exprimées dans les cellules nerveuses, jouent un rôle important dans le métabolisme de l’oxygène. Récemment, il a été démontré, que ces protéines exercent des effets neuroprotecteurs dans les modèles expérimentaux de maladies neurodégénératives. Cependant, aucun effet glioprotecteur n’a été rapporté. Les objectifs de ce travail de thèse sont, de mettre en évidence les effets protecteurs de l’Hb et la Ngb dans les astrocytes en culture en présence d’un stress oxydant, et d’élucider les mécanismes intracellulaires mis en jeu. Nous avons démontré que l’Hb et la Ngb sont capables de promouvoir la survie des astrocytes en condition de stress oxydatif, et ce en réduisant significativement la surproduction des ROS, la surexpression des gènes pro-inflammatoires (IL-6, IL-33, iNOS), le dysfonctionnement mitochondrial et la stimulation de l’activité de la caspase-3/7. Nous avons montré aussi que les effets anti-apoptotiques impliquent l’activation des voies de signalisation ERK-MAPK. En outre, nous avons vérifié les effets glioprotecteurs sur un modèle animal de stress oxydatif chronique, les souris KO TP53INP1, ainsi que sur un modèle animal d’hypoxie. / Oxidative stress plays a major role in the death of neuronal cells under various neuropathological conditions. However, reactive astrocytes, by producing neuroprotective and antioxidant factors, are able to protect neurons against oxidative stress. Therefore, protecting glial cells from harmful factors is essential to prevent nerve cell damage. Brain globins, in particular, neuroglobin (Ngb) and hemoglobin (Hb), expressed in neurons and glial cells, play an important role in the metabolism of oxygen. Recently, it has been demonstrated that these proteins exert neuroprotective effects in experimental models of neurodegenerative diseases. However, no glioprotective effect has been reported. The objectives of this thesis work are to demonstrate the protective effects of Hb and Ngb in cultured astrocytes in the presence of oxidative stress and to elucidate the intracellular mechanisms involved. We have demonstrated That Hb and Ngb are able to promote the survival of astrocytes under oxidative stress conditions by significantly reducing over-production of ROS, overexpression of pro-inflammatory genes (IL-6, IL-33, iNOS) Mitochondrial dysfunction and stimulation of caspase-3/7 activity. We have also shown that anti-apoptotic effects involve the activation of ERK-MAPK signaling pathways. In addition, we verified the glioprotective effects on an animal model of chronic oxidative stress, KO mice TP53INP1, as well as on an animal model of hypoxia.

Les cellules solaires organiques sont une technologie très prometteuse grâce à leur faible-coût de fabrication, leur flexibilité et leur légèreté. Actuellement, elles ne sont qu’au stade du prototype à cause de leurs faibles rendements et leur courte durée de vie. L’une des voies les plus étudiées pour améliorer le rendement est la conception de nouveaux matériaux photo-actifs. Lors de cette thèse, deux séries de semi-conducteurs donneurs d’électrons. La première série comprend trois oligomères, chacun composé de trois unités de diketopyrrolopyrrole (DPP) qui est un chromophore très étudié dans la littérature. Ces oligomères ont la particularité d’absorber dans le proche infra-rouge. En intercalant différents groupements donneurs d’électrons entre les DPPs, différentes torsions sont obtenues le long de leur squelette. Ceci a permis d’établir qu’un oligomère plan a une plus grande cristallinité et par conséquent transporte mieux les charges, atteignant une mobilité de trou de 10-3 cm². V-1.s-1. Cependant, cette forte cristallinité entraîne une hétérojonction volumique défavorable et un faible rendement photovoltaïque (<1%). La deuxième série est composée de quatre petites molécules combinant une unité 3,3’-(ethane-1,2-diylidene)bis(indolin-2-one) (EBI) avec différents groupements donneurs d’électrons: thiophène (EBI-T), benzofurane (EBI-BF) and bithiophène (EBI-2T)). Les dérivés EBI ont été testés dans les transistors à effet de champ et dans les cellules solaires en tant que semi-conducteurs donneurs. La meilleure mobilité de trou de 0,021 cm².V-1.s-1 a été mesurée avec EBI-BF grâce à sa conformation plane alors que le PCE maximal de 1.92% est obtenu avec EBI-2T grâce à son large spectre d’absorption et une morphologie adéquate. / Organic solar cells appear as a promising technology within photovoltaic field owing to their low-cost fabrication and their great flexibility enabling a widespread distribution. For now, they are still at the prototype stage due to their limited efficiency and lifetimes. Many efforts were realized in designing new materials as they are involved in every steps of the photovoltaic process and thus they dictate the cell efficiency. Along this thesis, two series of electron-donating semi-conductors were designed and synthesized. The first series consist in three oligomers containing three diketopyrrolopyrrole units, a well-studied chromophore. Those oligomers absorb up to the near infra-red region, a very interesting feature for light harvesting. Through the engineering of electron-rich spacers, various twists were generated in the oligomers backbone. The oligomer showing a coplanar conformation appears to be the most crystalline and thus exhibits the best charge transport properties with a hole mobility of 10-3 cm².V-1.s-1.iiiHowever, bulk heterojunction organic solar cells, this high crystallinity results in an unfavorable morphology and a PCE inferior to 1%. As for the second series, the four small molecules combined 3,3’-(ethane-1,2-diylidene)bis(indolin-2-one) (EBI), an electron deficient unit, and various electron-rich units such as thiophene (EBI-T), benzofuran (EBI-BF) and bithiophene (EBI-2T). Among EBI derivatives, EBI-BF demonstrated the highest hole mobility of 0.021 cm².V-1.s-1 in field effect transistors due to its coplanar conformation. Meanwhile, in bulk heterojunction solar cells, the highest PCE of 1.92% was obtained with EBI-2T:PC61BM blend owing to a more appropriate morphology and the broadest absorption spectrum of EBI-2T.

Durant ce travail de thèse j’ai étudié des mécanismes de contrôle de la réponse inflammatoire qui, lorsqu’ils sont dérégulés, peuvent mener à une pathologie autoimmune/autoinflammatoire sévère, la Polyarthrite Rhumatoïde (PR). J’ai essentiellement analysé deux aspects de ces mécanismes : en premier lieu, j’ai pu participer à la démonstration de l’importance de l’endonucléase DICER (impliquée dans la biogénèse des microARNs - miRs), dans le contexte de la PR, particulièrement au niveau des synoviocytes type fibroblastique (FLS), des cellules résidentes de la cavité synoviale. J’ai aussi initié une étude visant à identifier, in vivo, l’intégralité des transcrits dont l’expression est régulée par des miRs dans les FLS de patients atteints de PR. En plus de fournir une vision globale de la régulation miR-dépendante dans ces cellules, ce travail permettra aussi d’identifier des cibles de miRs d’intérêt dans la PR en s’affranchissant des prédictions bio-informatiques qui peuvent s’avérer incorrectes. Un second axe de mon projet de thèse avait pour objectif de fournir une meilleure description du dialogue intercellulaire dans la cavité articulaire. Pour cela, je me suis plus particulièrement intéressé au rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) dans la physiopathologie de la PR. Ainsi j’ai pu démontrer un rôle protecteur de ces cellules (initialement décrites pour leurs fonctions dans la défense antivirale), dans le contexte de l’arthrite inflammatoire dans plusieurs modèles murins. Ces travaux m’ont permis de proposer une stratégie thérapeutique innovante, basée sur le recrutement articulaire des pDCs. Cette approche, non invasive (par application topique de crème contenant 5% d’imiquimod), s’est montrée efficace aussi bien pour la réduction des symptômes cliniques de l’inflammation que pour l’amélioration des marqueurs biologiques comme l’érosion osseuse. / During my PhD, I studied the mechanisms that control inflammation which, when disturbed, can lead to a severe autoimmune/ auto inflammatory disease, rheumatoid arthritis (RA). My work was focused on the analysis of two aspects in these mechanisms: first, I participated to an analysis of the roles of the endonuclease DICER (involved in the biogenesis of microRNAs – miRs) in the pathogenesis of RA, specifically in fibroblast-like synoviocytes (FLS), which are resident cells of the synovial cavity. I also initiated a study aiming at the identification of the FLS transcriptome which is regulated by miRs in RA patients. This approach will provide an overview of the miR-dependent regulation in these cells and enable the identification of in vivo validated miR-targeted mRNAs in RA. A second axis of my thesis project aimed at providing a better description of the intercellular dialogue in the joint cavity. For this, I was particularly interested in the role of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) in the pathophysiology of RA. I demonstrated a protective role of these cells (initially described for their functions in antiviral defense) in the context of inflammatory arthritis in several mouse models. During this work, I had the opportunity to try an innovative therapeutic strategy based on the recruitment and activation of pDCs in the joints. This noninvasive and painless approach (topical application of cream containing 5% imiquimod) was effective in reducing inflammatory clinical symptoms and also improved biological markers such as bone erosion.

Nous avons montré que l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) est un nouveau marqueur de la cellule souche hématopoïétique et identifie l’émergence de l'hématopoïèse dans tous les sites hématogènes de l’embryon humain. L'ACE fait partie du système rénine-angiotensine (SRA) dont la fonction principale est d'agir sur l'angiotensine I pour former l'angiotensine II (AngII), un puissant vasoconstricteur.De plus, nous montrons que les principaux composants du SRA (les récepteurs AT1 et AT2, l’angiotensinogène et la rénine) sont exprimés dans la même région de l'embryon qui exprime l'ACE, suggérant ainsi l’existence d’un SRA local dans l'embryon précoce. Des tests fonctionnels, conduits in vitro chez l'embryon de la souris, montrent que l’Ang II stimule dans la culture l'émergence des progéniteurs hématopoïétiques, effet qui peut être bloqué par un antagoniste spécifique de l’AT1. Ces observations suggèrent pour la première fois, le rôle direct du SRA dans l’émergence hématopoïétique au cours de l’ontogenèse. De plus, nous mettons en évidence l'existence d'un SRA local dans la moelle osseuse (MO) adulte et nous montrons que les principaux éléments de ce système sont surexprimés dans la MO de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde, aussi bien dans les blastes que dans les cellules stromales. Ces observations suggèrent une contribution du SRA à la dérégulation de la niche observée dans les hémopathies.Ainsi, la présence d’un SRA local dans la niche hématopoïétique intra-embryonnaire et dans la MO chez l’adulte place ce système dans une position stratégique comme acteur important de l’émergence et de la régulation du système sanguin définitif. / We have shown that the angiotensin-converting enzyme (ACE) is a new marker of human hematopoietic stem cells and also identifies emerging hematopoiesis in all hemogenic sites inside the human embryo. ACE is a key component of renin-angiotensin system (RAS) as it catalyses the production of angiotensin II (Ang II) well known for its effect in the control of blood pressure, through AT1 and AT2 receptors.Furthermore, we observe the presence of the main elements of the RAS (AT1, AT2 receptors, angiotensinogen and renin) in the same region of the embryo expressing ACE, meaning that a local RAS exists in the embryo. Functional in vitro analyses, carried out in mouse model, show a stimulatory effect of AngII in the hematopoietic precursors emergence, an effect inhibited by a specific AT1 antagonist. These observations suggest for the first time a direct role of RAS in the emergence of hematopoiesis during ontogeny. In addition, our data indicate the presence of a local RAS inside the adult bone marrow (BM). This system is overexpressed in the BM of acute myeloid leukemia (AML) patients, both in hematopoietic cells and in stromal cells suggesting a RAS contribution to the bone marrow niche deregulation, always observed in these hemopathies.Therefore, the existence of a local RAS in the intraembryonic niche and in the adult bone marrow suggests that this system is an important actor in the emergence and regulation of the definitive blood system.

L’hématopoïèse est le processus de formation des cellules souches hématopoïétiques (CSH); elle est conservée au cours d’évolution. Durant l’hématopoïèse embryonnaire, deux vagues hématopoïétiques se succèdent, la vague primitive et la vague définitive. La vague primitive produit des macrophages, des neutrophiles et des érythrocytes. Au cours de la vague définitive, les CSH émergent du plancher de l’aorte dorsale par une transition endothélio-hématopoïétique ou TEH, dans une région appelée aorte-gonades-mesonephros (AGM).Ces dernières années, des études des organes hématopoïétiques chez les mammifères ont démontré que le microenvironnement joue un rôle crucial dans l’émergence et le devenir des CSH. Pendant ma thèse, je me suis intéressée au rôle du microenvironnement dans la mise en place de l’hématopoïèse définitive chez l’embryon de zebrafish. Dans l’AGM, j’ai caractérisé et évalué la contribution de différents acteurs dont deux populations en particulier, les macrophages et le système neuronal sympathique. Chacune de ces cellules joue un rôle spécifique durant la vague définitive de l’hématopoïèse. Les macrophages mobilisent des CSH de l’AGM afin de permettre leur intravasation et la colonisation des organes hématopoïétiques. Les catécholamines synthétisées par le système neuronal sympathique quant à elles contrôlent la TEH par l’activation des récepteurs beta2b et beta3 dans l’AGM.En conclusion, nous avons démontré que le microenvironnement influence l’hématopoïèse définitive chez le zebrafish par différents mécanismes. Ces travaux ont pour objectif d’améliorer la compréhension du mécanisme de genèse des CSH et potentiellement de permettre un jour la production de CSH in vitro. / Haematopoiesis is the process of haematopoietic stem cell (HSC) generation conserved in all vertebrates. During the embryonic development, two successive waves of haematopoiesis occur – the primitive and the definitive wave. The first one gives rise to erythrocytes, macrophages and neutrophils. During the second one, HSCs emerge from the ventral wall of dorsal aorta (DA) in the aorta-gonads-mesonephros (AGM) region by a process called endothelial-to-haematopoietic transition or EHT.In the last years, several studies performed in mammals have shown that the microenvironment plays a key role in haematopoiesis. During my thesis I have studied the role of the microenvironment in definitive haematopoiesis in the zebrafish embryo. I have described several cell components present in the AGM and evaluated their contribution to the haematopoiesis. I further analysed two of those players: macrophages and sympathetic nervous system. Each of them plays a specific role during the definitive wave of haematopoiesis. Macrophages mobilise nascent HSCs from the AGM to allow their intravasation and colonisation of haematopoietic organs. Catecholamines synthetized by sympathetic nervous system control EHT through the activation of beta2b and beta3 receptors in the AGM.In conclusion, we have shown that the microenvironment can substantially influence the definitive haematopoiesis in the zebrafish by distinct mechanisms. These findings would help to understand the mechanism of HSC generation and potentially to allow in vitro HSC production.

Le cancer du pancréas exocrine est un cancer très agressif associé à un diagnostic tardif et une résistance aux traitements conventionnels. L'identification de nouveaux marqueurs spécifiques est nécessaire afin de développer des outils diagnostiques ainsi que des traitements innovants. La lipase sels biliaires-dépendante pathologique (BSDLp), une glycoforme tumorale de la BSDL, se caractérise par l'apparition d'épitopes glycosylés reconnus par les anticorps monoclonaux J28 et 16D10. Leur expression spécifique par certaines lignées et tissus pancréatiques tumoraux humains nous permet d'envisager leur utilisation comme cible d'immunothérapie anti-tumorale par les cellules dendritiques (DC). Notre objectif est d'explorer la capacité de la BSDLp à induire une immunité cellulaire et d'apporter une preuve de concept de vaccination par les DC dans un modèle expérimental. Chez l'Homme, nous montrons que les DC chargées avec la partie C-terminale de la BSDLpJ28 (C-ter-J28) induisent l'activation des lymphocytes T. Dans le modèle murin, nous mettons en évidence l'expression de l'épitope J28 à la surface des cellules d'adénocarcinome pancréatique Panc02, utilisées pour induire des tumeurs. Nous montrons que la glycoprotéine BSDLpJ28 est immunogène chez la souris C57BL/6J. De plus, les DC chargées avec le C-ter-J28 puis soumises à maturation sont capables d'induire une réponse cellulaire T. Enfin, les DC, chargées et soumises à maturation ou non, testées en traitement prophylactique instaurent une protection substantielle, de longue durée, chez les souris vaccinées. Dans ces conditions, les DC, immatures lors de l'injection, jouent un rôle important dans la protection anti-tumorale. / Pancreatic adenocarcinoma is an aggressive cancer associated to late diagnosis and resistance to conventional treatments. Identification of novel specific markers is necessary to develop diagnostic tools and innovative treatments. Pathological bile salt-dependent lipase (pBSDL), a tumoral glycovariant of BSDL, is characterized by the appearance of glycosylated epitopes recognized by J28 and 16D10 monoclonal antibodies. Their expression specific to some human tumor pancreatic cell lines and tissues led us to consider their use as targets for dendritic cell (DC) antitumor immunotherapy. Our aim is to explore the ability of pBSDL to induce cellular mediated immunity and to provide a proof of concept of DC vaccination in an experimental model. In humans, we show that DC pulsed with C-ter moiety of pBSDL-J28 (C-ter-J28) can induce T-cell activation. In mouse model, we demonstrate the expression of J28 epitope on pancreatic adenocarcinoma Panc02 cells, used to induce tumors in C57Bl/6 mice. We show that glycoprotein pBSDL (pBSDL-J28) is immunogenic in mice. Moreover, DC pulsed with C-ter-J28 and matured, are able to induce T-cell response. Finally, DC pulsed and matured or not, tested in prophylactic treatment provide long-term substantial protection in vaccinated mice. In these conditions, DC, immature at the time of the injection, play an important role in antitumor protection.

Mon travail de thèse s'est intéressé au rôle des protéines Dok-1 et Dok-2 dans l'hématopoïèse physiologique chez la CSH et dans l'hématopoïèse pathologique dans le cas de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC). Ce sont des régulateurs négatifs de la voie de signalisation RAS/MAPK, activée en réponse à des facteurs activant les récepteurs tyrosine kinase. La double inactivation des gènes Dok1 et Dok2 (Dok DKO) cause un syndrome myéloprolifératif assimilé à la forme myéloproliférative (MP) de la LMMC. Les anomalies génétiques de la LMMC identifiées sont nombreuses et souvent non spécifiques. Le gène RAS est cependant retrouvé muté dans 30% des cas de LMMC MP. Nous avons identifié des variants nucléotidiques de DOK1 et DOK2. La mutation DOK2 L238P a fait l'objet d'études fonctionnelles démontrant qu'il s'agit d'un mutant perte de fonction haplo-insuffisant, induisant une augmentation de la prolifération cellulaire, corrélée avec la LMMC MP.J'ai également étudié l'hématopoïèse précoce du modèle murin Dok DKO, me permettant de démontrer que ces protéines sont des régulateurs de la quiescence des CSH et du cycle cellulaire des progéniteurs myéloïdes engagés dans la différenciation.Les protéines Dok-1 et Dok-2 jouent un rôle dans la régulation de la quiescence et la prolifération des CSH et des progéniteurs hématopoïétiques. Leur dérégulation pourrait jouer un rôle dans la pathogenèse de la LMMC, attestant leur fonction de suppresseur de tumeur. Il serait intéressant de lier leur fonction chez la CSH à la LMMC en elle-même et de mieux définir les mécanismes par lesquels les protéines Dok-1 et Dok-2 interviennent dans la leucémogenèse. / My work focused on the roles of Dok-1 and Dok-2 proteins in physiological hematopoiesis in the CSH and pathological hematopoiesis in the case of chronic myelomonocytic leukemia (CMML). They are negative regulators of the RAS/MAPK signaling pathway, activated upon receptor tyrosine kinase (RTK) triggering. Moreover, Dok1 and Dok2 gene ablation (Dok DKO) in mice induces a myeloproliferative syndrome illustrating myeloproliferative (MP) form of CMML. This MP-CMML subtype is primarily characterized by alterations of genes encoding for proteins involved in RAS pathway, found in 30% of MP-CMML cases.We have identified DOK1 and DOK2 nucleotide variants. The DOK2 L238P mutationhas been functionally studied, demonstrating that DOK2 L238P is an haploinsufficient loss of function mutant, inducing increased cell proliferation, correlated to MP-CMML phenotype.I also studied early hematopoiesis in Dok1 / Dok2 double KO (Dok DKO) mice. This model allowed us to demonstrate that Dok-1 and Dok-2 proteins act as switch regulators of HSC between quiescence and cell cycle entry. Moreover, they negatively regulate cell cycle in myeloid committed progenitors.Thus, Dok-1 and Dok-2 proteins appear to play an important role in the regulation of HSC quiescence and proliferation, as well as hematopoietic progenitors. Their deregulation by haploinsufficient mutation may play a role in the pathogenesis of the CMML, attesting to their function as tumor supressors. Finally, it would be interesting to link their function in HSCs to CMML pathogenesis and to further define the mechanisms by which Dok-1 and Dok-2 proteins are involved in leukemogenesis.

L'élimination des cellules tumorales par le système immunitaire repose sur la capacité des cellules dendritiques à correctement présenter l'antigène aux cellules effectrices. Nous avons donc développé une stratégie de vaccination thérapeutique basée sur des lipopolyplexes à ARNm (LPRs) : l'ARNm codant pour l'antigène est associé à un complexe de polylysine histidylée, et incorporé dans un liposome trimannosylé afin de mieux cibler les cellules dendritiques. En effet, les cellules dendritiques expriment largement les lectines de type C, qui sont des récepteurs reconnaissant principalement des résidus mannose. Dans le travail présenté ici, nous montrons que les LPR trimannosylés sont capables de fixer les cellules dendritiques humaines et murines. De manière très intéressante, nous montrons aussi que les LPR trimannosylés injectés chez la souris induisent le recrutement et l'activation de cellules dendritiques dans le ganglion drainant. De plus, quand les LPR trimannosylés vectorisent un ARNm codant pour l'antigène tumoral E7, ils sont capables d'induire une réponse T spécifique d'E7 au niveau systémique. Enfin, les LPRs trimannosylés permettent une réponse thérapeutique lorsqu'ils sont utilisés dans trois différents modèles de tumeurs : le modèle TC1 de carcinome exprimant E7, le modèle B16 de mélanome exprimant MART1 et le modèle EG7 de lymphome exprimant OVA. Cette stratégie apparaît donc prometteuse comme thérapie innovante anti-cancer. / Elimination of cancer cells requires an efficient cytotoxic immune response. In order to obtain such a response, antigens need to be uptaken by dendritic cells (DCs) and correctly presented to effector cells. We developed a strategy based on RNA lipopolyplexes (LPRs): antigenic mRNA is associated with a histidine-polylysine polyplexe and incorporated in a trimannosylated liposome to better target dendritic cells (DCs) in vivo, as DCs express several C-Type lectin receptors that preferentially bind to mannose. Here, we report that trimannosylated LPRs are efficient to target both human and murine DCs. Interestingly, in vivo experiments reveal that trimannosylated LPRs not only target DCs but also induce their recruitment and activation in draining lymph nodes. Furthermore, when combined with mRNA encoding E7 oncoprotein from HPV16, trimannnosylated LPRs trigger specific T-cell response against E7. Finally, when used as therapeutic vaccines in three different tumors models, LPRs promote curative therapeutic responses in E7-expressing TC1 tumor, in OVA-expressing EG7 lymphoma and in MART-1-expressing B16 melanoma, when combined with E7, OVA or MART-1 mRNA, respectively. Altogether, these results comfort us to considerate the use of this strategy for anti-cancer vaccine therapies.