Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-09T20:12:20Z No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-17T19:54:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-17T19:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DanielaCarrilhodeJesus.pdf: 5106356 bytes, checksum: 57fd4c08be8f1f54edf8e2e5d3799eae (MD5) Previous issue date: 2018-04-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O conhecimento a respeito de complexas redes de comunicação e interação celular alcançou muitos avanços graças a estudos de fluorescência aplicados à biologia das células. Embora muito progresso tecnológico empregado no imageamento celular tenha sido alcançado, os fluorocromos continuam desempenhando papel central para análises de condições fisiológicas e patológicas. O desenvolvimento de agentes fluorescentes é um processo laborioso que visa a criação de moléculas providas simultaneamente de diversas características favoráveis, tais como, amplos desvios de Stokes, altos coeficientes de extinção molar, permeabilidade a membranas celulares, ausência de citotoxicidade e alta especificidade. Moléculas derivadas do núcleo fluorescente benzotiadiazol (BTD), por apresentarem muitos desses aspectos, encontram várias aplicações no âmbito do imageamento celular. Neste contexto, o presente trabalho inicia uma série de aplicações em modelos biológicos de duas estruturas inéditas derivadas de BTD. O fluoróforo 2,1,3- benzotiadiazol triazol galactose, ou G2, e a molécula 2,1,3- benzotiadiazol triazol xilose, ou X2. Algumas linhagens tratadas com os compostos apresentaram considerável redução de viabilidade celular. Esse fato revelou ação citotóxica dos fluorocromos para determinados tipos de células, o que dificulta aplicações dessas moléculas em células vivas. Contudo os resultados de aplicações em diferentes modelos biológicos fixados foram excelentes para a sonda G2. Esta apresentou alta especificidade, sinal fluorescente intenso e ausência de marcação de fundo. Sabe-se que a recomendação de sondas fluorescentes apenas para material fixado é um aspecto comum a muitos marcadores de referência no mercado. Já o fluoróforo X2 não teve sua especificidade definida pois apresentou possíveis marcações em organelas como complexo de golgi, lisossomos, vesículas do sitema endossomal entre outras. Contudo, a partir de estudos de comarcação com Lysotracker (específico para organelas ácidas), de experimentos em C. elegans e de ensaios utilizando um sistema “baculovírus – células de inseto” foi observada certa preferência do composto por organelas ácidas ou organelas com alta quantidade de membranas, levando-nos também à hipótese de que o X2 possui afinidade por um tipo / um grupo de fosfolipídios. O composto G2 apresenta especificidade para corpúsculos lipídicos. Esta constatação ficou bem determinada através de estudos de comparação ou de colocalização em diferentes modelos, como células de insetos e C. elegans, com os corantes de referência para essas organelas: Oil Red O e BODIPY®. Também demonstramos que esta sonda é eficaz para avaliar dinâmica de lipídios, para isso utilizamos o sistema “baculovírus – células de inseto” em conjunto com o composto G2. Os resultados levaram a hipótese de que o G2 pode marcar um grupo mais seleto entre os lipídios, em comparação ao marcador BODIPY®. Por fim, este trabalho fundamenta a proteção intelectual e posterior divulgação da sonda G2 e ainda traz novos esclarecimentos para melhorias da molécula X2. / The knowledge about cellular communications and complexes networks interactions has been constantly developing thanks to fluorescence studies applied to cell biology. Although a good technological progress has been achieved in cell imaging, fluorochromes continue to play a central role in the analysis of physiological and pathological conditions. The development of fluorescent dyes is a difficult process, which aims create molecules provided simultaneously with several favorable characteristics. This physical or chemical features include wide Stokes shift, high molar extinction coefficients, permeability to cell membranes, absence of cytotoxicity and high specificity. The fluorescent molecule benzothiadiazole (BTD) have been used as a core in the synthesis of fluorophores that usually presents the chemical and physical mentioned characters and have a large of applications in the field of cellular imaging. In this context, the present work initiates a series of applications in biological models of two unpublished structures derived from BTD. The fluorophore 2,1,3-benzothiadiazole triazole galactose, or G2, and the molecule 2,1,3-benzothiadiazole triazole xylose, or X2. Some cell lines treated with the compounds presented considerable reduction of cell viability. This fact revealed cytotoxic action of the fluorochromes for certain cell types, which makes it difficult to apply these molecules to living cells. However, the results of applications in different fixed biological models were excellent for the G2 probe. This showed high specificity, intense fluorescent signal and absence of background. For this reason, the G2 is a fluorophore with potential for commercial application, even if it is only used in fixed materials. But the fluorophore X2 did not have its specificity determined because it showed possible labeling in vesicles of the endosomal system, lysosomes, Golgi complex and other organelles. However, studies of colocalization between X2 and Lysotracker (which one is specific for acidic organelles), experiments in C. elegans and assays using a system "baculovirus - insect cells" revealed a certain preference of the compound by acidic organelles or organelles with a high amount of membranes, leading us to hypothesize that X2 has affinity for a type or a group of phospholipids. The fluorophore G2 has specificity for intracellular lipid droplets. This finding was well determined through comparative studies or fluorescence colocalization in different models, such as insect cells and C. elegans, using the specific dyes for these organelles: Oil Red O and BODIPY®. We also demonstrated that this probe is effective for evaluation of lipid dynamics, for which we use the "baculovirus - insect cells" system together with the compound G2. The results led to the hypothesis that G2 are selecting a group within the lipids, in comparison to the BODIPY® dye. Finally, this work bases the intellectual protection and subsequent disclosure of the G2 probe and still brings new clarifications for improvements of the molecule X2.

FtsZ es una proteína bacteriana esencial en el proceso de división celular. Se localiza en la membrana interna de la célula generando un anillo en la mitad de su eje longitudinal, donde actúa como una proteína de andamiaje reclutando a las demás proteínas del mecanismo de división. Esta estructura denominada “anillo Z” esta compuesta de polímeros de FtsZ, los cuales son capaces de interactuar lateralmente generando sabanas o dobles filamentos. La polimerización se produce por la unión de GTP al monómero de FtsZ. Dentro del filamento, FtsZ adquiere actividad GTPásica, y tras la hidrólisis del GTP el filamento de FtsZ se desestabiliza y desensambla. Los cambios estructurales producidos tras la hidrólisis del GTP pueden explicarse al analizar la estructura de FtsZ, que esta compuesta por dos dominios, el amino que contiene el sitio de unión a nucleótido del tipo Rossman y el carboxilo que presenta un plegamiento de tipo α/β. Ambos interactúan estrechamente por medio de una interfase hidrofóbica generada entre las sabanas plisadas de ambos dominios y la helice H7, la que se encuentra entre ambos dominios. Esta interfase no solo tiene relevancia funcional en el mecanismo de polimerización, sino que también juega un rol estabilizador entre los dominios de FtsZ. Mientras que dominios de una FtsZ de Thermotoga maritima son estables en forma independiente, los dominios de FtsZ de Escherichia coli solo muestran estructura secundaria en presencia de agentes estabilizantes. Con el fin de estudiar la influencia de esta interfase de interacción en la estabilidad de los dominios de FtsZ, se llevaron a cabo simulaciones de dinámica molecular con un método de solvatación implícita. La utilización de este método nos permitió efectuar simulaciones en condiciones nativas y desnaturantes (alta temperatura) de una proteína FtsZ termófila (Methanococcus jannaschii) y una mesófila (Pseudomonas aeruginosa) para las cuales existen estructuras cristalinas disponibles. Las simulaciones mostraron que en condiciones nativas ambas proteínas son estables, sin embargo el dominio de unión a nucleótido de la proteína mesófila muestra una menor estabilidad que el dominio de la proteína termófila. Las diferencias se localizan en las zonas aledañas al lazo T3, involucrado en la unión del nucleótido. La forma general del desplegamiento de la proteína mesófila y termófila es muy similar, observándose solo diferencias en la rapidez con la cual se pierde estructura secundaria, siendo más estable la proteína termófila. Sin embargo, cálculos de estabilidad de los núcleos hidrófobos de la interfase y los dominios, no mostraron diferencias significativas entre los dominios aislados y las proteínas nativas. Los únicos cambios significativos se logran al comparar las estabilidades del dominio carboxilo con el dominio amino, donde este último muestra una mayor estabilidad. En conjunto, los resultados sugieren una relación entre la estabilización de los dominios por medio de la interfase de interacción y la unión del nucleótido con el mecanismo de cambio conformacional de FtsZ.

O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de atividade enzimática da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTPBMr) e da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) em osteoblastos humanos durante o ciclo e a diferenciação celular, correlacionando com os níveis de estresse oxidativo intracelulares. A atividade enzimática das fosfatases foi determinada nos períodos de 6, 18, 24, 48 e 72 horas (ciclo celular) e 7, 14, 21, 28 e 35 dias (diferenciação) utilizando o p-nitrofenilfosfato e na presença do inibidor específico phidroximercuribenzoato (pHMB) para a PTP-BMr, e na presença de tartarato e pHMB para a TRAP. A caracterização da diferenciação celular foi determinada medindo o nível de atividade da fosfatase alcalina e a coloração de Von Kossa. O estresse oxidativo foi determinado através da quantificação da glutationa reduzida e oxidada através dos ensaios de cromatografia líquida de alta performance eletroquímica e DTNB. Durante o ciclo celular a atividade específica (AE) da fosfatases foi fortemente diminuída, especificamente da TRAP e PTP-BMr, sendo praticamente zero após 18 horas da adição de soro, sugerindo que a diminuição na atividade destas enzimas seja necessária para a entrada na fase S. Durante a diferenciação celular observou-se um aumento progressivo da expressão de FALC, TRAP e PTP-BMr nos períodos de 7 e 14 dias, sendo máxima no 21o dia, declinando a seguir. Durante a proliferação, os estados mais reduzidos foram observados nos períodos de 18 e 48 horas e durante a diferenciação o estado mais reduzido foi observado no 21o dia. Desta forma, o presente trabalho mostra que as células da linhagem hFOB 1.19 representam um adequado modelo de estudo para análise da participação de fosfatase no ciclo e diferenciação celular, bem como que as atividades da PTP-BMr e TRAP são claramente moduladas durante o ciclo celular e a diferenciação de osteoblastos humanos, esta última dependente de adequado nível de glutationa reduzida. / Low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) and tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) activity were determined in hFOB 1.19 human osteoblasts cell line during cell proliferation and differentiation. LMW-PTP and TRAP enzymatic activity were determined at 6, 18, 24, 36, 48 and 72 hours after fetal calf serum stimulation of subconfluent cultures and 7, 14, 21, 28 and 35 days after cell confluence and differentiation. The LMW-PTP and TRAP activity were measured using p-nitrophenylphosphate as substrate. The osteogenic potential of hFOB 1.19 cells was studied by measuring alkaline phosphatase activity, and mineralized nodule formation by Von Kossa staining. The oxitative stress was determined by HPLC and DNTB assays. During cell cycle progression, LMW-PTP and TRAP activities were strongly reduced, being almost undetectable after 18h of serum stimulation, while H3-thymidine incorporation progressively increased, suggesting that the decrease in the LMW-PTP and TRAP activities were necessary for entry into the S phase. During osteoblastic differentiation, the activity of LMW-PTP and alkaline phosphatase progressively increased until the 21th day, decreasing thereafter. In conclusion, this work demonstrates that hFOB 1.19 cells constitute a suitable model system for the study of the role played by LMW-PTP and TRAP in cell cycle progression and cell differentiation, and that LMW-PTP and TRAP activities are clearly modulated during osteoblastic proliferation and differentiation in vitro. The activities of these phosphatases during cell differentiation depended on the correct levels of reduced glutathione.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12379_Tese - COVRE L.P. 2018.pdf: 30345373 bytes, checksum: ec3dc8e879b3ba71ae62497eaf04c63e (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / As células natural killer (NK) são fundamentais na resposta imune inata. As funções dessas células são reguladas pela sinalização de receptores de ativação ou inibição. Durante seu desenvolvimento, as células NK podem sofrer uma diferenciação terminal progressiva, que está associada a modificações fenotípicas e deficiências funcionais. Neste trabalho, descrevemos aspectos relacionados a estas características decorrentes do envelhecimento ou induzidas durante a leishmaniose cutânea localizada causada por Leishmania braziliensis. Demonstramos que indivíduos idosos apresentaram um aumento na população de células NK expressando alta frequência do receptor inibitório KLRG1. Essas células possuem perfil de diferenciação terminal e ativam espontaneamente o sensor metabólico denominado proteína quinase ativada por AMP (AMPK). O estímulo através do receptor KLRG1 foi capaz de aumentar a fosforilação de AMPK, impedindo a desfosforilação dessa quinase mediada por PP2C. Além disso, a ativação de AMPK suprimiu a citotoxicidade, a produção de granzima B e de IFN-γ nas células NK. Células com a via KLRG1-AMPK ativa apresentaram reduções da capacidade proliferativa, da expressão da subunidade catalítica da telomerase (TERT) e no comprimento dos telômeros, bem como aumento do dano ao DNA. Todos esses fatores são associados a redução no crescimento celular e ao fenótipo de imunosenescência adquirido durante o envelhecimento. Da mesma forma, pacientes com leishmaniose cutânea localizada demonstraram um aumento do fenótipo maduro de células NK, com expansão da subpopulação CD56dim. Além disso, foram observados a diminuição dos marcadores imaturos NKG2A, CD161 e CD27, seguidos pelo aumento na expressão dos receptores NKG2C, KIR (CD158a) e acúmulo de células terminalmente diferenciadas caracterizadas como KLRG1bright e CD57bright. Células NK de pacientes com LCL apresentaram aumento da citotoxicidade, produção de granzima B e de citocinas inflamatórias quando comparadas com controles saudáveis. No entanto, também apresentaram uma baixa capacidade proliferativa, associada à presença de células KLRG1bright e CD57bright e encurtamento significativo dos telômeros quando comparado aos controles saudáveis. Juntos, nossos dados demonstram que o envelhecimento e a infecção causada por Leishmania podem afetar o fenótipo e a função de células NK, levando ao acúmulo de células terminalmente diferenciadas. Assim, a elucidação dos mecanismos que levam a esse comprometimento, como a via KLRG1 / AMPK, podem ser futuramente explorados como forma de retardar ou mesmo reverter as deficiências observadas nestas populações. Além disso, a identificação desses fatores pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, que irão auxiliar no processo de maturação funcional de células NK e aprimorar a resposta imunológica durante infecções e câncer.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12379_Tese - COVRE L.P. 2018.pdf: 30345373 bytes, checksum: ec3dc8e879b3ba71ae62497eaf04c63e (MD5) Previous issue date: 2018-05-28 / As células natural killer (NK) são fundamentais na resposta imune inata. As funções dessas células são reguladas pela sinalização de receptores de ativação ou inibição. Durante seu desenvolvimento, as células NK podem sofrer uma diferenciação terminal progressiva, que está associada a modificações fenotípicas e deficiências funcionais. Neste trabalho, descrevemos aspectos relacionados a estas características decorrentes do envelhecimento ou induzidas durante a leishmaniose cutânea localizada causada por Leishmania braziliensis. Demonstramos que indivíduos idosos apresentaram um aumento na população de células NK expressando alta frequência do receptor inibitório KLRG1. Essas células possuem perfil de diferenciação terminal e ativam espontaneamente o sensor metabólico denominado proteína quinase ativada por AMP (AMPK). O estímulo através do receptor KLRG1 foi capaz de aumentar a fosforilação de AMPK, impedindo a desfosforilação dessa quinase mediada por PP2C. Além disso, a ativação de AMPK suprimiu a citotoxicidade, a produção de granzima B e de IFN-γ nas células NK. Células com a via KLRG1-AMPK ativa apresentaram reduções da capacidade proliferativa, da expressão da subunidade catalítica da telomerase (TERT) e no comprimento dos telômeros, bem como aumento do dano ao DNA. Todos esses fatores são associados a redução no crescimento celular e ao fenótipo de imunosenescência adquirido durante o envelhecimento. Da mesma forma, pacientes com leishmaniose cutânea localizada demonstraram um aumento do fenótipo maduro de células NK, com expansão da subpopulação CD56dim. Além disso, foram observados a diminuição dos marcadores imaturos NKG2A, CD161 e CD27, seguidos pelo aumento na expressão dos receptores NKG2C, KIR (CD158a) e acúmulo de células terminalmente diferenciadas caracterizadas como KLRG1bright e CD57bright. Células NK de pacientes com LCL apresentaram aumento da citotoxicidade, produção de granzima B e de citocinas inflamatórias quando comparadas com controles saudáveis. No entanto, também apresentaram uma baixa capacidade proliferativa, associada à presença de células KLRG1bright e CD57bright e encurtamento significativo dos telômeros quando comparado aos controles saudáveis. Juntos, nossos dados demonstram que o envelhecimento e a infecção causada por Leishmania podem afetar o fenótipo e a função de células NK, levando ao acúmulo de células terminalmente diferenciadas. Assim, a elucidação dos mecanismos que levam a esse comprometimento, como a via KLRG1 / AMPK, podem ser futuramente explorados como forma de retardar ou mesmo reverter as deficiências observadas nestas populações. Além disso, a identificação desses fatores pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, que irão auxiliar no processo de maturação funcional de células NK e aprimorar a resposta imunológica durante infecções e câncer.

En este curso el alumno basándose en la curiosidad innata del ser humano, adentrará en el conocimiento profundo de la Biología y Bioquímica, a fin de obtener la base necesaria que le permita enfrentar los cursos posteriores que se desarrollarán en los siguientes años de su carrera. El objeto de esta guía es encaminar al alumno, bajo la dirección del Docente, por el mundo biológico desde lo más simple a lo complejo; la guía consta de una parte introductoria, con indicaciones generales a tomar en cuenta en todas las prácticas, y las indicaciones específicas por tema a desarrollar.

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Seminario para optar al grado de Ingeniero Comercial, Mención Economía / Los Autómatas Celulares son un novedoso modelo no convencional de optimización. Este se basa en el funcionamiento de sistemas, en particular, en el contagio de sus células. Una aplicación con poca literatura académica, es la predicción de signos en el mercado inmobiliario, donde en esta investigación se busca estudiar la posible predicción del sentido de las variaciones de los precios de los terrenos, y sobre todo, ver si los resultados son producidos por verdadera predicción del modelo, o por efectos del azar. Si bien los resultados son favorables y alentadores, con niveles de predicción por sobre los estándares, hay que ser cuidadoso con la interpretación de estos por las características particulares que tiene el mercado inmobiliario

Una vez que las histonas son traducidas en los ribosomas, estas sufren una serie de modificaciones post-traduccionales antes de entrar al núcleo. En particular, se han descrito las modificaciones y los complejos que forman las histonas H3 y H4 con distintas chaperonas. En esta cascada de maduración, la primera modificación que se establece es H3K9me1, la cual se genera de manera cotraduccional mediante la metiltransferasa SetDB1 asociada al ribosoma. Sin embargo, sólo el 36% de H3 soluble presenta esta modificación, lo que sugiere la existencia de un mecanismo de regulación, el cual no ha sido descrito hasta la fecha. Utilizando células sincronizadas realizamos un análisis mediante Western Blot para evaluar la presencia de SetDB1, H3 y H3K9me1 en ribosomas provenientes de células enriquecidas en distintas fases del ciclo celular. Logramos determinar que hacia el final de la fase S, hay una mayor presencia de SetDB1 en los ribosomas. En cuanto a H3 y H3K9me1, observamos una acumulación de la proteína y la marca tanto al inicio como al final de la fase S. Por lo tanto, se concluye que existiría un mecanismo de regulación dependiente del ciclo celular para la generación de la marca H3K9me1. Futuros estudios se requerirán para identificar las bases moleculares y el mecanismo de regulación de este proceso / Once histones are translated in the ribosomes, they are post-translationally modified before entering in the nucleus. Previous studies characterized the maturation cascade involved in the establishment of modifications and folding of histones H3 and H4. On this maturation cascade, the first modification imposed is H3K9me1, which occurs cotranslationally by SetDB1, a methyltransferase associated to the ribosome. However, only 36% of the soluble H3 carries this modification, which suggests the existence of a regulation mechanism for the generation of this mark. Using synchronized cells, we performed a Western Blot analysis to assess the presence of SetDB1, H3, and H3K9me1 on ribosomes obtained from cells enriched in different phases of the cell cycle. We found that SetDB1 is enriched on ribosomes at late S phase. We observed an accumulation of H3 and H3K9me1 at early and late S phase. We concluded that there is a cell cycle dependent regulatory mechanism for the generation of H3K9me1. Future studies will be required to identify the molecular basis of this process.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:40:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Com o aumento da demanda por serviços de comunicações móveis, é crescente o interesse no planejamento desse tipo de sistema. Isso vem gerando uma quantidade significativa de novos modelos de predição, porém há muitos ainda por serem validados. Este trabalho apresenta um estudo sobre modelos de predição para o cálculo de campo em uma determinada área de cobertura, com aplicação em macro e microcélulas em diferentes ambientes externos (outdoor). O estudo abrange ainda a descrição matemática dos modelos empírico e semi-empírico de Hata-Cost 231 e Cost 231 Walfisch-Ikegami, respectivamente. Com o objetivo de avaliar o desempenho desses modelos em um ambiente urbano diferente daquele para o qual foram desenvolvidos originalmente, é feita a implementação computacional e os resultados das simulações são comparados com medidas reais de campo. A partir dessa comparação, foi desenvolvido um Novo Modelo de propagação, com resultado satisfatório para a predição do nível médio de sinal próximo do sítio