Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:10:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 332938.pdf: 2859795 bytes, checksum: 523a3a9e18ae4c8eea7515a8ed33815a (MD5) Previous issue date: 2015 / A deficiência intelectual (DI) é caracterizada por limitações significativas no funcionamento intelectual e no comportamento adaptativo, origina-se antes dos 18 anos de idade e afeta cerca de 1 a 3% da população do Mundo e 1,37% da população brasileira. As causas etiológicas da DI são variadas e de difícil identificação, devido a sua heterogeneidade. Entre as causas genéticas, a variação no número de cópias (CNVs) de trechos do DNA no genoma vem sendo amplamente estudada em distúrbios do desenvolvimento, através da técnica de hibridização comparativa por arrays (CGH array). CNVs são comumente classificadas como benignas (CNVs comum), de significado clínico incerto (raras), potencialmente patogênicas (raras) e patogênicas (raras). O presente estudo teve como objetivo avaliar as CNVs encontradas em indivíduos com DI e distúrbios do desenvolvimento e interpretar a sua contribuição para o aparecimento do fenótipo. Foram analisados 109 resultados de exames de CGH array, realizados pelo Laboratório de Genética Humana Neurogene, em Santa Catarina, com as informações clínicas e fenotípicas fornecidas através do preenchimento de questionários pelos médicos responsáveis pela solicitação dos exames. Houve uma prevalência de dois terços do sexo masculino na população estudada, sendo que os principais fenótipos que levaram a solicitação da investigação foram ADNPM, dismorfias de cabeça e face e DI. Oesclarecimento diagnóstico foi maior para DI severa, DI leve e hiperatividade associada a outros distúrbios. Os indivíduos testados apresentaram um total de 276 CNVs (187 microduplicações e 89 microdeleções); 81,2% benignas, 7,2% de significado incerto, 9,4% patogênicas e 2,2% potencialmente patogênicas. Os cromossomos 18, 19 e 21 apresentaram o menor número de CNVs. Não foi encontrada nenhuma CNV rara nos cromossomos 5, 10, 12, 19, 21 e Y. Seis casos potencialmente patogênicos foram descritos em mais detalhe, um desses casos representa uma deleção em 3 p13-p14.1 de 1.9MB, que confirma que a haploinsuficiência do gene MITF é suficiente para causar surdez congênita. Este estudo vem destacar a importância do CGH array para o diagnóstico de distúrbios do desenvolvimento inclusive para que seja inserido nos programas de saúde pública como um primeiro teste diagnóstico a ser ofertado pelo SUS.<br> / Abstract : Intellectual disability (ID) is characterized by significant limitations in intellectual functioning and in adaptive behavior. It originates before the age of 18, and affects about 1-3% of the world population and about 1.37% of the Brazilian population (CENSO 2010). ID has different levels of severity: mild, moderate, severe or profound, depending on the degree of intellectual impairment combined with adaptive behaviour. The etiological causes of ID are varied and difficult to identify due to clinical and genetic heterogeneity. Among the genetic causes, copy number variation (CNV) of DNA stretches in the genome has been widely studied in developmental disorders. CNVs are commonly classified as benign (common CNVs), of uncertain clinical significance (rare), potentially pathogenic (rare), and pathogenic (rare). This study aims to evaluate the CNVs found in patients with ID and developmental disorders and classify them according to their contribution to the appearance of the phenotype. We analyzed 109 results for CGH array investigation to obtain the phenotype of each individual. We observed: (1) a higher prevalence of males in the population studied, (2) that the major phenotypes observed were developmental delay, dysmorphic face and head and ID, and (3) the higher diagnostic rates were obtained for individuals with severe ID, mild ID, and hyperactivity. An overall of 276 CNVs (187 microduplications and 89 microdeletions) were observed. Ofthese changes 81.2% were benign, 7.2% of uncertain significance, 2.2% potentially pathogenic and 9.4% pathogenic. Chromosomes 18, 19 and 21 had the lowest number of CNVs. Rare CNVs were not observed in chromosomes 5, 10, 12, 19, 21 and Y. Six cases of potentially pathogenic CNVS were studied in more detail, and in one of these cases a deletion of 1.9MB in 3p13-p14.1 was observed, confirming that the haploinsufficiency of the MITF gene is sufficient to cause congenital deafness. This study highlights the importance of the investigation of CNVs in the diagnosis of developmental disorders, underscoring the importance to include array CGH as first investigation for ID in the public health system (SUS).

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T19:26:50Z No. of bitstreams: 1 Cristina Aragao Silva. Produção de camundongos transgênicos para o estudo de terapias celulares..pdf: 2328830 bytes, checksum: 174ad1e8df08de4d7fd4ed21f53e51a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T19:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristina Aragao Silva. Produção de camundongos transgênicos para o estudo de terapias celulares..pdf: 2328830 bytes, checksum: 174ad1e8df08de4d7fd4ed21f53e51a5 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A transferência de genes mediada por vírus, em especial pelos vetores lentivirais, é atualmente reconhecida como um eficiente sistema de transmissão de genes, resultando em altas taxas de animais fundadores carreando o transgene. Menos invasiva para os embriões, mais custo-efetivo e tecnicamente menos exigente, optamos por essa metodologia para gerar camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente verde em diferentes órgãos e tecidos, para subsequente uso em terapia celular. Sob controle de três promotores diferentes, ubiquitina-C, que controla a expressão da proteína nos embriões e em todos os tecidos do camundongo adulto, da alfa-miosina cardíaca, que direciona a expressão no coração, e da FmTie, que controla a expressão apenas em células endoteliais de vasos, os zigotos foram microinjetados no espaço subzonal e transferidos para fêmeas pseudogestantes. Dos 31 animais nascidos, 22 animais (72%) apresentam o transgene integrado em seu genoma. Entretanto, nenhum deles expressou a proteína fluorescente verde. Como a inserção no genoma é aleatória, o efeito de posição frequentemente observado pode afetar a expressão do transgene e de genes endógenos, além de interromper estes últimos – mutagênese insercional – levando ao chamado silenciamento gênico. Desta forma, estudos subsequentes devem ser efetuados a fim de solucionar essa ausência de expressão dos transgenes inseridos no genoma dos camundongos fundadores, viabilizando, consequentemente, todo o processo de desenvolvimento de camundongos transgênicos. / Gene transfer mediated by viruses, in particular by vectors lentivirais, is now recognized as an efficient system of gene transmission, resulting in high rates of founder animals carrying the transgenesis. Less invasive for the embryos, more cost-effective and technically less demanding, we choose this methodology to generate transgenic mice expressing the green fluorescent protein in different organs and tissues for subsequent use in cell therapy. Using three different promoters as control: ubiquitin-C, which controls the expression of the protein in embryos and in all tissues of adult mice; the alpha-cardiac myosin, which directs the expression in the heart, and FmTie, which controls the expression only in endothelial cells of vessels; the zygotes were microinjected in subzonal space and transferred to pseudopregnancy females.22 animals (72%) of 31 animals born, have integrated the transgene in its genome. However, none of them expressed the green fluorescent protein. How the insertion in the genome is random, the effect of position usually observed may affect the expression of the transgene and of the endogenous genes, stopping them - insertional mutagenesis - leading to genic silencing. Subsequent studies should be done to solve this lack of expression of the transgenesis inserted into the genome of founder mice, enabling the whole process of development of transgenic mice.

MAIA, Raimundo Nonato. Concentrações plasmáticas de mepivacaina em pacientes submetidos a cirurgia de terceiros molares. 2008. 84 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-15T13:50:18Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_rnmaia.pdf: 960622 bytes, checksum: 3151a8c63c2672a7ac7e41e3eb98ab16 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-02T16:12:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_rnmaia.pdf: 960622 bytes, checksum: 3151a8c63c2672a7ac7e41e3eb98ab16 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-02T16:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_rnmaia.pdf: 960622 bytes, checksum: 3151a8c63c2672a7ac7e41e3eb98ab16 (MD5) Previous issue date: 2009 / Surgical removal of the third molars in clinical regime making use of local anesthetics plays a great role in the everyday practice of odontology. These drugs are safe when used in the proper way, but they can lead to undesirable outcomes when used in the wrong quantities or concentrations. Based on the knowledge of such principle and on surgical clinical practice, where levels of anesthetic concentration in the blood can reach near-toxic levels, a study measuring the systemic concentration of local anesthetic was made by collecting and analyzing, in equipment of High-performance liquid chromatography (HPLC), blood samples of patients who were submitted to local anesthesia with mepivacaine 2% and adrenaline 1:100000 for the removal of the third molars. The study was relevant because mepivacaine is frequently used in ambulatory surgeries of third molars, making it important to investigate the behavior of plasmatic levels and their possible toxic manifestations. The sample consisted of twenty-six patients of both sexes, subdivided in two groups according to the number of third molars removed: one group had two removed in a single session, the other group had four. Monitoring was done using pulse oxymetre, regular measuring of blood pressure, heart rate, and electrocardiogram in radioscopic, according to the minimum recommendations of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons (D´ERAMO et al, 2003). In the interval of 120 minutes there were collected 10 samples of 4 mL after the injection of local anesthetic, and the quantitative analysis of the plasmatic concentrations of mepivacaine was done in HPLC. The plasmatic levels of mepivacaína in both groups were growing and significant amongst themselves in all the respective intervals of collections of the sanguine samples. After the results were obtained, the values at each corresponding moment for both groups were compared, showing that the averages of the systolic and diastolic pressure of all of the intervals were not significant when compared with the values obtained in the preoperative consultation. According to the results this study it was possible to conclude that the surgery of third molars under local anesthesia, with mepivacaine 2% and adrenaline 1:100000, when respecting the safety margins recommended by the manufacturer, is a safe procedure and that there are no clinical systemic differences to the healthy patient when doses between 108mg (5,4mL) and 216mg (10,8mL) are used. / A remoção cirúrgica dos terceiros molares em regime ambulatorial fazendo uso de anestésicos locais tem grande emprego no dia-a-dia da prática odontológica. Estas são drogas seguras quando usadas da forma recomendada; porém, quando empregadas em quantidade ou concentrações elevadas, poderão resultar em respostas indesejadas. Baseado no conhecimento de tais princípios e na prática da clínica cirúrgica, onde níveis de concentração de anestésico local na corrente sanguínea poderão chegar a valores muito próximos do nível de toxicidade, foi realizado estudo com mensuração da concentração sistêmica de anestésico local, através de coleta e análise, em equipamento de High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), de amostra de sangue de pacientes que foram submetidos a anestesia local com mepivacaína 2% e adrenalina 1:100000 para a remoção dos terceiros molares. O estudo teve sua relevância justificada visto que, para as cirurgias ambulatórias de terceiros molares inclusos, a mepivacaína é utilizada com muita frequência, sendo assim importante investigar o comportamento dos níveis plasmáticos e suas possíveis manifestações tóxicas. A amostra constou de vinte e seis pacientes, de ambos os sexos, subdivididos em dois grupos conforme a cirurgia de dois ou quatro terceiros molares removidos em sessão única, respectivamente, sendo o monitoramento feito com uso de oxímetro de pulso, medidas regulares da pressão arterial, frequência cardíaca e eletrocardiograma em cardioscópio, de acordo com as recomendações mínimas da Associação Americana de Cirurgiões Orais e Maxilofaciais (D’ERAMO et al., 2003). No intervalo de 120 minutos, foram colhidas 10 amostras de 4ml, após injeção do anestésico local, e a análise quantitativa das concentrações plasmáticas de mepivacaína foi realizada em HPLC. Os níveis plasmáticos de mepivacaína em ambos os grupos foram crescentes e significativos entre si em todos os respectivos intervalos de coletas das amostras sanguíneas. Os resultados foram obtidos e comparados os valores nos respectivos momentos correspondentes entre os dois grupos, mostrando que as médias da PA sistólica e diastólica de todos os intervalos não foram significantes quando comparados com os valores obtidos na consulta pré-operatória. De acordo com os resultados deste estudo, foi possível concluir que a cirurgia de terceiros molares sob anestesia local, com mepivacaína 2% e adrenalina 1:100000, quando respeitadas as margens de seguranças recomendadas pelo fabricante, é um procedimento seguro e que não existe diferença clínica sistêmica para o paciente hígido quando no uso de doses de 108mg (5,4ml) e 216mg (10,8ml).

MORAIS, Isabel Cristina Oliveira de. Estudo dos efeitos renais e mecanismos de morte celular induzidos pelo veneno da serpente Bothrops leucurus. 2011. 108 f. : Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortalezae, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-03T12:57:07Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_icomorais.pdf: 1908941 bytes, checksum: 6e1216c48025897967f00d42cddfc10b (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-03T14:12:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_icomorais.pdf: 1908941 bytes, checksum: 6e1216c48025897967f00d42cddfc10b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-03T14:12:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_icomorais.pdf: 1908941 bytes, checksum: 6e1216c48025897967f00d42cddfc10b (MD5) Previous issue date: 2011 / Bothrops venoms consist of complex mixture of active substances, mainly peptides and proteins, which interfere with many physiologic processes. Bothrops species are responsible for more than 20,000 accidents per year in Brazil—90% of all recorded snakebites. The Bothrops leucurus is an important venomous snake that inhabits the northeast of Brazil. The biological effects due envenomation have similar profile to that observed in other Bothrops, ie coagulant activity, hemorrhagic, fibrinolytic, and renal failure in vivo. The aim of this study was to investigate the effects of the Bothrops leucurus venom in the renal perfusion system and in cultured renal tubular cells of the type MDCK (Madin–Darby Canine kidney). Isolated kidneys from Wistar rats weighing 250 to 300g (n=5) were perfused with Krebs-Henseleit solution containing 6% of bovine serum albumin previously dialyzed for 120 minutes. The effects of Bothrops leucurus venom (VBl) (10μg/mL) were studied on the Perfusion Pressure (PP), Renal Vascular Resistance (RVR), Urinary Flow (UF), Glomerular Filtration Rate (GFR) Percentage of Sodium (%TNa+), Potassium (%TK+) and Chloride (%TCl-) Tubular Transport. B. leucurus venom (10 μg/mL) reduction the PP at 90 and 120 min and UF at 60 and 90 min. The glomerular filtration rate decreased at 60 and 90 min. The renal vascular resistance decreased at 120 min. It was also observed a decrease on percentual tubular transport of sodium (%TNa+) at 120 min and of chloride (%TCl-) at 60 and 90 min. MDCK cells were grown in plastic flasks at 37° C in a humidified atmosphere of 5% CO2 – air, with RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum. The treatment with VBl caused decrease in cell viability to the lowest concentration tested with an CI50 of 1.25 μg/mL. Flow cytometry with annexin V and propidium iodide showed that cell death occurred predominantly by necrosis. When apoptosis was analyzed by nuclear staining, it was observed significant increase in the percentage of cell death, VBl 2,5 μg/mL induced 6,8% apoptosis and VBl 1,25 μg/mL caused 5,8% of apoptosis after 24 h of treatment. VBl treatment (1,25 μg/mL) led to significant depolarization of the mitochondrial membrane potential. We found increased expression of genes involved in cell death by apoptosis in the lower concentrations tested. The ion Ca2+ signaling participates in cell death induced by the venom of B. leucurus. These results demonstrate that the venom of B. leucurus altered all the renal parameters assessed in isolated kidney perfusion and was cytotoxic to MDCK cell culture. / Venenos de Bothrops consistem em uma mistura complexa de substâncias ativas, principalmente peptídeos e proteínas, capazes de interferir com muitos processos fisiológicos. Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por mais de 20 mil acidentes por ano no Brasil, que totalizam 90% de todos os acidentes ofídicos registrados. A Bothrops leucurus é uma serpente peçonhenta importante que habita a região nordeste do Brasil. Os efeitos biológicos devido ao envenenamento têm perfil semelhante ao observado em outras Bothrops, ou seja, a atividade coagulante, hemorrágica, fibrinolítica e insuficiência renal in vivo. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do veneno de Bothrops leucurus no sistema de perfusão renal e em culturas de células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby Canine kidney). Rins isolados de ratos Wistar pesando 250 a 300g (n = 5) foram perfundidos com Krebs-Henseleit contendo 6% de albumina sérica bovina previamente dialisadas por 120 minutos. Os efeitos do veneno de Bothrops leucurus (VBl) (10μg/mL) foram estudados sobre o Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), Fluxo Urinário (FU), Pressão de Perfusão (PP), Resistência Vascular Renal (RVR), Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa+), de Potássio (%TK+) e de Cloreto (%TCl-). O veneno de B. leucurus (10 μg / mL) reduziu a PP aos 90 e 120 min e o FU aos 60 e 90 min. O ritmo de filtração glomerular diminuiu aos 60 e 90 min. A resistência vascular renal diminuiu aos 120 min. Observou-se também uma diminuição no percentual de transporte tubular de sódio (% TNA+) aos 120 min e de cloreto (% TCL-) aos 60 e 90 min. Células MDCK foram cultivadas em garrafas plásticas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2, com meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%. O tratamento com VBl causou diminuição da viabilidade celular até na menor concentração testada com um IC50 de 1,25 μg /mL. Citometria de fluxo com anexina V e iodeto de propídio mostrou que a morte celular ocorreu predominantemente por necrose de forma concentração dependente. Quando a apoptose foi analisada através da coloração nuclear, foi observado aumento significativo na porcentagem de morte celular, VBl nas concentrações de 2,5 e 1,5 μg/mL induziu 6,8% e 5,8% de apoptose após 24 horas de tratamento, respectivamente. O tratamento com VBl (1,25 μg/mL) levou a despolarização significativa do potencial de membrana mitocondrial. Nas menores concentrações avaliadas, verificamos aumento de expressão de genes envolvidos na morte celular por apoptose. O íon Ca2+ participa da sinalização da morte celular induzida pelo veneno de B. leucurus. Esses resultados demonstram que o veneno de B. leucurus alterou todos os parâmetros renais avaliados na perfusão de rim isolado e foi citotóxico para cultura de células MDCK.

JIMENEZ, Paula Christine. Estaurosporinas de Eudistoma vannamei : química e bioatividade. 2009. 150 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-05T13:56:11Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_pcjimenez.pdf: 4823327 bytes, checksum: 30cc2a10d42f06a7e0e957451d836479 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-06T12:25:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_pcjimenez.pdf: 4823327 bytes, checksum: 30cc2a10d42f06a7e0e957451d836479 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-06T12:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_pcjimenez.pdf: 4823327 bytes, checksum: 30cc2a10d42f06a7e0e957451d836479 (MD5) Previous issue date: 2009 / Eudistoma vannamei Millar, 1977 is an endemic tunicate from the northeastern Brazilian coast, widely distributed over the rocky beaches of Ceará State. Previously, the crude extract showed an interesting bioactivity profile. Bioassay-guided fractionation yielded a highly cytotoxic 1:1 mixture identified as two novel staurosporine derivatives, 2-hydroxy-7-oxostaurosporine (I) and 3-hydroxy-7-oxostaurosporine (II). IC50 for I/II and staurosporine (STP) were obtained after 72h incubation with various tumor cell lines using the MTT assay and in normal human lymphocytes, by the AlamarBlue assay, where I/II outperformed STP in a 7-fold average. On normal cells, I/II showed to be equally effective as STP and, thus, showed a 25-fold average selectivity towards tumor cells. A kinetic analysis on cell cycle progression, activation of DNA damage and repair pathways and apoptosis induction of HL-60 cells (leukemia), was carried out with 40 or 80ng/mL I/II and accessed by flow cytometry and western blotting. Cell cycle studies indicated that I/II induces a G2-M arrest (at 40ng/mL, 45, 63 and 94% of arrested cells after 24, 48 and 72h treatment, respectively, against 9, 10 and 13% for the non-treated culture). Moreover, 24h-G2/M arrest is sustained and irreversible following removal of stimuli. STP induces 83% G2/M arrest at 200ng/mL after 24h incubation, whilst longer incubation periods provoke a substantial increase in polyploidy. Expression-rate of cell cycle related proteins (Cdk1, Cdk2, cyclin A and cyclin B1) paired with morphological observation of 40ng/mL I/II-treated H/E-stained cells placed on glass slides suggest that arrest is actually occurring at the G2 phase. G2 arrest is merely seen in 80ng/mL I/II-treated cells, while apoptotic features were quite evident. Double-strand breaks evaluated by the neutral comet assay indicates only low scored DNA damage against 24, 48 or 72h 40ng/mL I/II treated cells. However, 80ng/mL I/II-treated cells exhibited higher scored damage. DNA damage proteins (ATM and H2A.X) were expressed in a time- and concentration-dependent manner; while, cycle arrest and repair markers (Chk1, Cdc25C, BRCA1) were activated mostly on 40ng/mL I/II-treated cells. Conversely, PS externalization and activation of effector caspases 3 and 7 and PARP were highly blotted mostly for 80ng/mL I/II-treated cells. I/II induced a clear cytostatic effect on HL-60 cells at the lower concentration, distinguished by persistent cell cycle arrest and low DNA damage; and an objective cytotoxic effect at the higher concentration, motivated by extensive DNA damage and induction of apoptosis. / Eudistoma vannamei (Millar, 1977) é uma ascídia endêmica do litoral do Nordeste brasileiro, largamente encontrado nas praias rochosas do estado do Ceará. Previamente, o extrato bruto apresentou um interessante perfil em termos de bioatividade. O fracionamento bioguiado identificou uma mistura 1:1 altamente citotóxica, contendo dois derivados inéditos de estaurosporina, 2-hidroxi-7-oxoestaurosporina (I) e 3-hidroxi-7-oxoestaurosporina (II). IC50 para I/II e estaurosporina (STP) foram obtidas após 72h de incubação com diversas linhagens de células tumorais, utilizando-se o ensaio do MTT, e em linfócitos humanos normais, através do ensaio de AlamarBlue. I/II superou a citotoxicidade de STP em 7 vezes, em média, para as células tumorais, ao passo que mostrou-se tão ativa quanto frente às células normais. Uma análise cinética sobre a progressão de ciclo celular, ativação de resposta a dano e vias de reparo de DNA, e indução de apoptose de células HL-60 (leucemia) foi conduzida com 40 ou 80ng/mL I/II e acessada por citometria de fluxo e western blotting. Estudos de ciclo celular indicaram que I/II (40ng/mL) induz bloqueio de ciclo celular em G2/M e que este efeito prossegue irreversível mediante a remoção do estímulo. STP (200ng/mL) induziu o bloqueio quase que completo em G2/M após 24h de incubação, enquanto períodos mais longos de incubação provocam um aumento substancial de células poliplóides. A expressão de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular (Cdk1, Cdk2, ciclina A e ciclina B1), associada à observação morfológica de células tratadas com 40ng/mL I/II e coradas com H/E em lâminas de vidro sugere que o bloqueio está ocorrendo, de fato, na fase G2. O bloqueio em G2 foi parcamente observado em células tratadas com 80ng/mL I/II, conquanto características apoptóticas fizeram-se deveras evidentes. A avaliação de dano à fita dupla de DNA através do teste do cometa neutro indica a indução apenas de baixo nível de dano de DNA em células tratadas com 40ng/mL I/II por 24, 48 ou 72h. Entretanto, células tratadas com 80ng/mL I/II exibiram níveis mais elevados de dano. A expressão de proteínas relacionadas a dano de DNA (ATM e H2A.X) deu-se numa forma tempo- e concentração-dependente, enquanto o bloqueio de ciclo e os marcadores de reparo (Chk1, Cdc25C, BRCA1) foram ativados, predominantemente, em células tratadas com 40ng/mL I/II. Inversamente, a externalização de PS e a ativação das caspases efetoras 3 e 7 e de PARP mostraram-se altamente expressos em células tratadas com 80ng/mL I/II mostrou um claro efeito citostático em células HL-60 na menor concentração testada, evidenciado pelo persistente bloqueio de ciclo celular e baixo dano em DNA; e um objetivo efeito citotóxico na concentração maior, motivado pelo extensivo dano em DNA e indução de apoptose.

FERRAZ, Clarissa Perdigão Mello. Estudo in vitro da nefrotoxicidade do veneno total e fração fosfolipase A2 da serpente Bothropoides insularis (AMARAL, 1921). 2012. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-03T13:04:39Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_cpmferraz.pdf: 2722365 bytes, checksum: f1db0c53e9a0ccd82e07f690fb60bc5d (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-03T14:10:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_cpmferraz.pdf: 2722365 bytes, checksum: f1db0c53e9a0ccd82e07f690fb60bc5d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-03T14:10:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_cpmferraz.pdf: 2722365 bytes, checksum: f1db0c53e9a0ccd82e07f690fb60bc5d (MD5) Previous issue date: 2012 / Natural products and their derivatives are currently the most important source of novel therapeutic agents and provide useful tools for studies in physiopathology and pharmacology. Snake venoms display a wide array of pharmacological properties due to their complex combinations of active substances, especially peptides and proteins, capable of interfering with physiological processes. Snakes of the genera Bothrops and Bothropoides accounted for 70% of snake bites reported in Brazil. The Bothropoides insularis (golden lancehead) is endemic to Queimada Grande, an island off the state of São Paulo. Like the venom of other Bothrops species, the venom of B. insularis has coagulant, hemorrhagic and fibrinolytic properties and is known to cause kidney failure in vivo. The objective of the study was to evaluate of whole venom of B. insularis and its phospholipase A2 fraction in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell culture tubes. The cells were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum in plastic vials with an atmosphere containing 5% CO2 at 37°C. Treatment with whole venom reduced cell viability at all the concentrations tested (200, 100, 50, 25, 12.5 and 6.25 mg/mL) and yielded an IC50 of 9 μg/mL. Cell membrane integrity during the process of cell death from whole venom was evaluated by LDH enzyme assay, indicating enzyme release at all concentrations. Flow cytometry with Annexin V-FITC and propidium iodide revealed that cell death at the lowest concentrations (18 and 36 μg/mL) of whole venom occurred predominantly by apoptosis. However, at the highest concentration (72 μg/mL), in addition to death by apoptosis, an increased number of cells in late apoptosis was observed.In the Rhodamine 123 assay the treatment with whole venom (36 μg/mL) induced significant depolarization of the mitochondrial membrane potential. The expression of genes involved in cell death by apoptosis did not show any significant results, when tested with whole venom in 24h. The phospholipase A2 fraction was also submitted to cell viability and membrane integrity assays at several concentrations (200, 100, 50, 25, 12.5 and 6.25 mg/mL), with no significant results in any of the experiments. Taken together, our results indicate that the venom of B. insularis is cytotoxic in MDCK cell culture and that cell death occurs predominantly by apoptosis. / Os produtos naturais e seus derivados têm sido as fontes mais comuns na obtenção de agentes terapêuticas inovadores, além de fornecerem ferramentas para estudos fisiopatológicos e farmacológicos. Os venenos de serpentes exibem uma infinidade de atividades farmacológicas, por serem formados por uma mistura complexa de substâncias ativas, principalmente peptídeos e proteínas, capazes de interferir com muitos processos fisiológicos. As serpentes Bothrops e Bothropoides são responsáveis por 70% dos acidentes ofídicos ocorridos no Brasil. A serpente Bothropoides insularis (jarara ilhoa), é uma espécie endêmica nativa da ilha de Queimada Grande na costa Sul do Estado de São Paulo, seu veneno apresenta características semelhantes aos das outras serpentes do gênero Bothrops, como atividade coagulante, hemorrágica, fibrinolítica e insuficiência renal in vivo. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do veneno total da Bothropoides insularis e sua fração fosfolipase A2 em culturas de células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby canine kidney). Células MDCK foram cultivadas em garrafas plásticas a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2, com meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%. O tratamento com veneno total da B.insularis causou diminuição da viabilidade celular em todas as concentrações (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 mg/mL) estudadas com um IC50 de 9 μg /mL. A integridade da membrana celular foi avaliada pelo método de determinação da enzima lactato desidrogenase, e após a exposição das células ao veneno houve um aumento significativo da enzima. Nos ensaios de citometria de fluxo com anexina V-FITC e iodeto de propídio foi observada a morte celular nas menores concentrações (18 e 36 μg/mL) estudadas com o veneno total e ocorreu predominantemente por apoptose. No entanto na maior concentração (72μg/mL) estudada, foi observado além da morte por apoptose, um aumento de células em apoptose tardia. Nos ensaios com rodamina 123, o tratamento com o veneno total da B.insularis (36 μg/ mL) levou a despolarização significativa do potencial de membrana mitocondrial. Não houve expressão significativa de genes envolvidos na morte celular por apoptose. Ensaios de viabilidade celular e integridade de membrana foram realizados com a fração fosfolipase A2 do veneno da B.insularis, em várias concentrações (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 mg/mL), não apresentado resultados significativos em nenhum dos experimentos. Esses resultados demonstram a citotoxicidade do veneno de B. insularis em culturas de células tubulares renais (MDCK), e sugerem morte celular predominantemente por apoptose.

LIMA, D. J. B. Estudo da atividade anticâncer da marinobufagenina, um bufadienolídeo extraído de anfíbios da espécie Rhinella marina. 2016. 92 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-03-29T11:16:23Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_djblima.pdf: 1352205 bytes, checksum: e38247c17ab1d644502df66d14a1b12c (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-03-29T11:16:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_djblima.pdf: 1352205 bytes, checksum: e38247c17ab1d644502df66d14a1b12c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T11:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_djblima.pdf: 1352205 bytes, checksum: e38247c17ab1d644502df66d14a1b12c (MD5) Previous issue date: 2016-01-22 / Cancer is a complex genetic disease, considered one of the leading causes of death in the world. The use of substances derived from natural products has grown over the years and is an important source for the therapeutic arsenal. Bufadienolides, a group of cardioactive steroids with a 24 carbon structures are commonly found in glands of toads from Bufonidae family. These molecules a have wide range of biological activities, including anti-cancer effects. Bufadienolides have shown anti-proliferative effect on various human cancer cell lines by inducing death and cell cycle arrest. Marinobufagenin, a bufodienolide extracted from Rhinella marina toad especies was chosen to determine its standard cytotoxic and mechanism of action. Despite showing high cytotoxicity in human tumor cells, the sample showed no cytotoxicity to murine strains. In vitro experiments were performed using the PC3 prostate adenocarcinoma lineage. Cells were incubated with different concentrations of marinobufagenin (0.37, 0.75 and 1.5 mM) for 24 hours. The viability of PC3 cells was evaluated by flow cytometry, which showed that the number of cells reduced when incubated with the lowest concentration (0.37 mM) tested. However, no reduction in the percentage of cells with intact membranes was seen. The analysis of phosphatidylserine externalization by flow cytometry also revealed the increase of apoptotic cells at concentrations 0.75 and 1.5 uM. The flow citometry analysis of the nuclear contents, showed the accumulation of cells in G2 / M phase in all tested concentrations. Marinobufagenin did not damage the DNA in either PC3 or PBMC. In addiction, morphological changes were observed, including cytoplasmic shrinkage and perinuclear halo formation. Moreover, modifications on the pattern of cells adesion were also observed in cells treated with the bufadienolide. Despite lack of further studies to confirm its anticancer mechanisms, morphological changes occurred, the cycle-specific behavior and the lack of genotoxicity of Marinobufagenina make it an interesting molecule in the search for new drugs with antitumor potential. / O câncer é uma complexa doença de origem genética, considerada uma das principais causas de morte por doença no mundo. A utilização de substâncias derivadas de produtos naturais tem crescido com o passar dos anos, constituindo uma importante fonte no arsenal terapêutico. Os bufadienolídeos são esteróides cardioativos de 24 carbonos, isolados de extratos de glândulas de sapos da família Bufonidae. Essas moléculas possuem grande variedade de atividades biológicas, incluindo atividade anticâncer. Os bufadienolídeos tem demonstrado comportamento antiproliferativo em várias linhagens de células cancerígenas humanas por induzir morte e parada do ciclo celular. A marinobufagenina, um bufadienolídeo extraído do anfíbio Rhinella marina, foi escolhida para determinamos o seu padrão citotóxico e mecanismo de ação. Apesar de demonstrar alta citotoxicidade em células tumorais humanas, a amostra não apresentou citotoxicidade para linhagens murinas. Experimentos in vitro foram realizados utilizando-se a linhagem de adenocarcinoma de próstata PC3. As células foram tratadas com diferentes concentrações da amostra marinobufagenina (0,37, 0,75 e 1,5 μM) por 24 horas. A viabilidade das células PC3 foi avaliada por citometria de fluxo, mostrou que o número de células reduziu a partir da menor concentração (0,37 μM) testada sem, contudo, haver redução na porcentagem de células com membrana íntegra. A análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo revelou aumento de células com padrão apoptótico nas concentrações 0,75 e 1,5 μM. Já a análise do conteúdo nuclear, nos mostrou acúmulo de células na fase G2/M em todas as concentrações testadas. A marinobufagenina não foi capaz de causar danos ao DNA de PC3 e de CMSP. Observou-se, ainda, uma série de alterações morfológicas e no citoesqueleto de células tratadas com o bufadienolídeo, a exemplo da acentuada retração citoplasmática e formação de halos perinucleares. Além disso, modificações do padrão adesivo das células também foram observadas em células tratadas com o bufadienolídeo. Apesar de necessitar de mais estudos para delinear seu mecanismo de ação anticâncer; as modificações morfológicas, o comportamento ciclo-específico e a ausência de genotoxicidade tornam a Marinobufagenina uma molécula interessante na prospecção de novos fármacos com potencial antitumoral.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-07T03:25:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347991.pdf: 3464947 bytes, checksum: 4b9adce4d95c51c30b0828be864fb06e (MD5) Previous issue date: 2017 / A crista neural (CN) é composta por células heterogêneas e multipotentes, e pode ser dividida em CN cefálica (CNC) e truncal (CNT). As células da CNC originam, in vivo, células neurais e mesenquimais, neste último caso, formando parte do esqueleto craniofacial (condrócitos, osteócitos e odontoblastos) e tecido conjuntivo da face (adipócitos e fibroblastos dermais). As células da CN truncal (CNT), por sua vez, originam in vivo, células gliais e neurônios do sistema nervoso periférico, além de células cromafins do sistema endócrino. Melanócitos são formados por células da CNC e CNT. In vivo, as células da CNT não apresentam a capacidade de se diferenciarem em fenótipos mesenquimais. Entretanto, in vitro, sob estímulo com fatores químicos e físicos, estas células podem se diferenciar em condrócitos, osteócitos e adipócitos. Frente a estas capacidades que as células da CNT apresentam in vitro, avaliamos a utilização de uma matriz sintética e pura chamada PuraMatrix , para cultivo e diferenciação de células da CNT. Inicialmente, testamos e padronizamos anticorpos para marcação de osteócitos (SB-1, SB-2, SB-3 e SB-5) em membros posteriores de embriões de codornas. Em seguida, realizamos culturas de células da CNT com embriões de 18-22 pares de somitos, com meio básico de cultivo e com adição de Fatores de Diferenciação Mesenquimais (FDM) para estimular as células a se diferenciarem em adipócitos e osteócitos. Foram testadas as concentrações de PuraMatrix 0,15%; 0,25%, 0,5% e 1%. Análises fenotípicas de frequência e quantitativas através da técnica de imunocitoquímica e colorações específicas foram realizadas nos 14º e 21º dias de cultivos para todos os fenótipos da CN. As quatro concentrações de PuraMatrix suportaram o cultivo de células da CNT. Entretanto, pelo baixo número de células observado, a concentração de PuraMatrix 1% foi descartada de nossas análises. As concentrações de PuraMatrix 0,15%; 0,25% e 0,5% possibilitaram a diferenciação de células da CNT para células gliais, neurônios, melanócitos, células musculares lisas e condrócitos, tanto em culturas controles quanto estimuladas com FDM. Adipócitos estiveram presentes nas três concentrações quando estimuladas com FDM, e também nas concentrações de PuraMatrix 0,15% e 0,25% na condição controle. Osteócitos foram analisados nas duas concentrações mais baixas de PuraMatrix , onde marcações para SB-3 ocorreram, mas em co-localização com cartilagem, assim como observado in vivo. SB-5 mostrou-se muito específico para osteoblastos/osteócitos e apresentou marcação tanto em cultivos controles quanto tratados. Apenas no 21º dia, houve marcação de alcalina fosfatase e de matriz mineralizada. PuraMatrix abre novas perspectivas para o desenvolvimento de estudos clonais de progenitores da CN e poderá permitir a identificação de novos progenitores com as potencialidades neurais-mesenquimais para CNT. / Abstract : The neural crest (NC) is composed of heterogenous and multipotent cells, and can be divided into cephalic (CNC) and trunkal (TNC) NC. CNC cells originate, in vivo, neural and mesenchymal cells, the last one forming part of the craniofacial skeleton (chondrocytes, osteocytes and odontoblasts) and connective tissue of the face (adipocytes and dermal fibroblasts). The TNC cells, in turn, originated in vivo, glial cells and neurons of the peripheral nervous system, in addition to chromaffin cells of the endocrine system. Melanocytes are formed by CNC and TNC cells. In vivo, TNC cells don?t have the ability to differentiate into mesenquimal phenotypes. However, in vitro, under stimulation with chemical and physical factors, these cells can differentiate into chondrocytes, osteocytes and adipocytes. Faced with these capabilities that TNC cells present in vitro, we evaluated the use of a pure synthetic matrix called PuraMatrix , for TNC cell culture and differentiation. Initially, we tested and standardized antibodies for marking osteocytes (SB-1, SB-2, SB-3 and SB-5) on hind limbs of quail embryos. Then, we performed cell cultures of TNC cells with embryos of 18-22 pairs of somites, with basic culture medium and with addition of Mesenchymal Differentiation Factors (MDF) to stimulate the cells to differentiate into adipocytes and osteocytes. The concentrations of PuraMatrix 0.15%; 0.25%, 0.5% and 1% were tested. Frequency and quantitative phenotypic analyzes using the immunocytochemistry technique and specific staining were performed on the 14th and 21st day of cultures for all NC phenotypes. The four concentrations of PuraMatrix supported the cultivation of CNT cells. However, due to the low number of cells observed, the concentration of PuraMatrix 1% was discarded from the analyzes. The concentrations of PuraMatrix 0.15%; 0.25% and 0.5% allowed the differentiation of TNC cells into glial cells, neurons, melanocytes, smooth muscle cells and chondrocytes in both control and MDF stimulated cultures. Adipocytes were present in the three concentrations when stimulated with MDF, and also in the concentrations of PuraMatrix 0.15% and 0.25% in the control condition. Osteocytes were analyzed for the two lowest concentrations of PuraMatrix , where SB-3 marker occurred with co-localization with cartilage as well as observed in vivo. SB-5 showed to be very specific for osteoblasts/osteocytes and showed labeling in both control and treated cultures. On day 21 only, there was marking of alkaline phosphatase and mineralized matrix. PuraMatrix opens new perspectives for the development of clonal studies of NC progenitors and may allow the identification of new progenitors with the neural-mesenchymal potentialities for TNC.

Memoria para optar el título de Bioquímico / La presencia de asimetrías neuroanatómicas y funcionales en el cerebro de vertebrados es un rasgo ampliamente conservado que juega un papel importante en el comportamiento animal. El desarrollo diferencial de las mitades izquierda y derecha del cerebro se observa desde estados tempranos de la embriogénesis, lo que sugiere una regulación genética. Se ha descrito que la vía de señalización comandada por el factor de crecimiento TGFβ Nodal está involucrada en el establecimiento de asimetría de órganos internos en vertebrados. En pez cebra y medaka, los genes efectores de la vía Nodal, como el factor de transcripción pitx2c, se expresan en forma asimétrica a la izquierda del cerebro, precediendo el desarrollo de asimetrías neuroanatómicas. En pez cebra estas asimetrías incluyen al núcleo habenular y al complejo pineal. Al respecto, se sabe que el núcleo habenular izquierdo es más grande que el núcleo habenular derecho y que el órgano parapineal se localiza en la izquierda del diencéfalo. Estudios preliminares indican que el pez teleósteo medaka presenta un desarrollo de asimetrías neuroanatómicas similares a aquellas del pez cebra. De esta forma pez cebra y medaka son herramientas genéticas que nos permitirán comenzar a descifrar los mecanismos del desarrollo que participan en el establecimiento de las asimetrías neuroanatómicas en vertebrados. El objetivo de esta tesis fue determinar si las asimetrías neuroanatómicas de pez cebra y medaka se correlacionan con diferencias en la tasa de proliferación celular entre las habénulas izquierda y derecha, y si estas diferencias podrían estar controladas por el factor de transcripción pitx2c. Para el primer objetivo se realizaron experimentos de inmunoflurorescencia indirecta contra histona H3 fosforilada. Para el segundo objetivo, se midió la expresión de pitx2c mediante hibridaciones in situ sucesivas. Al respecto, en medaka, el ensayo contra histona H3 fosforilada muestra que existe una diferencia estadísticamente significativa en el número de células en proliferación entre ambas habénulas, a modo que el núcleo izquierdo presenta mayor número de éstas. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una asimetría izquierda/derecha en la tasa de proliferación celular, que es mayor para la mitad izquierda de la habénula. En pez cebra no fue posible realizar este ensayo, debido a que no se logró encontrar un marcador habenular que delimitara esta región en el embrión completo. En esta búsqueda se logró identificar un gen denominado cxcr4b, como un marcador de la zona más anterior de la habénula, donde su expresión muestra una clara tendencia a la asimetría. Por otro lado, se observó que tanto en pez cebra y en medaka, pitx2c se expresa unilateralmente en el epitálamo, específicamente en el lado izquierdo, desde estadios muy tempranos del desarrollo hasta estadios tardíos. La expresión más tardía no había sido descrita y está a favor de un posible papel de pitx2c en la morfogénesis asimétrica cerebral. Finalmente, se pudo establecer una correlación espacial y temporal entre la expresión de pitx2c y las asimetrías en la proliferación celular en la habénula de medaka, ya que los precursores habenulares izquierdos expresan pitx2c en el momento donde se observan las asimetrías en proliferación celular. Estos hallazgos deben ser en el futuro corroborados con experimentos de ganancia y pérdida de función de pitx2c / Neuroanatomical and functional asymmetries of the brain are conserved among vertebrates and play important roles in animal behaviour. Differences between the right and left sides of the brain have been described at early developmental stages, suggesting a genetic regulation of asymmetry. The Nodal pathway is one of many signalling pathways involved in the establishment of organ asymmetry in vertebrates. In zebrafish and medaka, effectors of the Nodal signaling pathway, such as the transcription factor pitx2c, are asymmetrically expressed in the left side of the brain, preceding the development of neuroanatomical asymmetries. Genetic studies in zebrafish have reported asymmetries within the epitalamic habenular nuclei and pineal complex. It is known that the left habenular nucleus is larger than the right nucleus, and that the parapineal organ is located on the left side of the diencephalon. Preliminary data indicate that medaka, a teleost similar to zebrafish, shows a similar pattern of neuroanatomical asymmetries in the brain. Therefore, zebrafish and medaka have emerged as genetic tools that will facilitate our understanding of the developmental basis of brain asymmetry. The aim of this thesis was to investigate whether the development of neuroanatomical asymmetries is associated with a differential rate of cell proliferation between the left and right habenular nuclei in zebrafish and medaka. In this thesis we also investigated whether differences in cell proliferation correlate with asymmetric expression of the transcription factor pitx2c. The first aim was approached using indirect immunofluorescence against phosphorylated histone H3. For the second aim, the pattern of expression of pitx2 was determined through in situ hibridization. The antibody essay against phosphorylated histone H3 in medaka revealed a difference in the number of proliferating cells within the habenulae, the left nucleus showing a larger amount of proliferating cells. These results suggest an asymmetric pattern of cell proliferation, in favor of the left habenular nucleus. It was not possible to perform the same assay in zebrafish due to the lack of an habenular marker that would allow us to circumscribe this region in the whole embryo. In this research, we were able to identify cxcr4b as a marker of the anterior habenular region, where its expression was clearly asymmetric. pitx2c was expressed unilaterally in the left epitalamic region of zebrafish and medaka, from early to late developmental stages. The late expression of pitx2c, which was not described before, supports a possible role of pitx2c during asymmetric morphogenesis of the brain. Finally, a spatial and temporal correlation was established between pitx2c expression and asymmetries in cellular proliferation in the habenulae of medaka. Precursors of the left habenular nucleus express pitx2c at the same time when asymmetries in cell proliferation are observed. These findings must be investigated further using pitx2c gain and loss of function experiments

Autofagia é o processo de degradação de componentes próprios celulares e parece modular senescência e apoptose induzidas por diferentes tipos de injúria, incluindo dano ao DNA. Populacionalmente, autofagia ocorre logo após o dano ao genoma, enquanto senescência é a resposta crônica das células que resistem à morte celular. Até o momento, nenhum trabalho demonstrou o papel da autofagia na senescência de fato, principalmente considerando uma análise integrada com morte celular e a ocorrência destes mecanismos a nível de células únicas. Inicialmente, desenvolvemos uma metodologia para avaliação do tamanho e forma de núcleos de células eucarióticas em cultura, a Análise Morfométrica Nuclear, a qual foi validada para análise de apoptose, senescência e irregularidades nucleares. O segundo objetivo foi avaliar o papel da autofagia na senescência e morte celular induzidas por dano ao DNA em células de glioblastoma, e os mecanismos moleculares por trás desta relação. Para isso, células expressando estavelmente o marcador de autofagia GFP-LC3 foram tratadas com o indutor de dano ao DNA Temozolomida (TMZ), droga de escolha contra glioblastomas, por 3h seguido do replaqueamento em meio livre de droga. TMZ induziu autofagia transiente e ativação de AMPK-ULK1 e p38 MAPK, acompanhado da supressão crônica da via PI3K/Akt/mTOR. O tratamento com TMZ induziu aumento de vários marcadores de senescência celular a longo prazo, cuja cinética foi analisada de maneira integrada e correlativa, bem como aumentou níveis de ROS, os quais mediaram, ao menos parcialmente, a indução de autofagia e senescência. Considerando a relação entre autofagia e senescência, observamos uma correlação negativa forte entre os mecanismos a nível populacional. Por outro lado, a nível de células únicas esta correlação não foi observada. Através do acompanhamento de células únicas nós observamos também uma redução orquestrada da autofagia independente da aquisição de fenótipo senescente. Esta redução ocorreu antes, durante ou após o aumento da área celular que caracteriza senescência celular, mostrando que a redução da autofagia não é necessária para aquisição do fenótipo senescente. Finalmente, a ativação da autofagia aumentou o efeito pró-senescente da TMZ, enquanto a supressão da autofagia induziu apoptose e reduziu a senescência, sugerindo que a autofagia protege as células da morte celular e permite a entrada das células em estado senescente após tratamento com TMZ. Neste sentido, também discutimos aqui a importância da análise completa e integrada das alterações em mecanismos de proliferação e morte celular induzidas pela inibição da autofagia. Em conclusão, autofagia e senescência parecem ser repostas induzidas por um mesmo sinal mas com cinéticas diferentes nas células expostas a dano ao DNA, estabelecendo uma correlação negativa a nível populacional que não se confirma a nível de células únicas. / Autophagy is the process of degradation of own cellular components and appears to modulate senescence and apoptosis induced by different types of injury, including DNA damage. At a population level, autophagy occurs soon after the damage to the genome, while senescence is chronic response of cells that resist to cell death. To date , no study has demonstrated the role of autophagy in senescence indeed, especially considering an integrated analysis with cell death and the occurrence of these mechanisms at the level of single cells. This thesis consists of two main objectives. Initially, we developed a method to evaluate the shape and size of nuclei of eukaryotic cells in culture, called Morphometric Analysis Nuclear, which was validated for the analysis of apoptosis, senescence and nuclear irregularities. The second objective was to evaluate the role of autophagy in senescence and cell death induced by DNA damage in glioblastoma cells, and the molecular mechanisms behind this relationship. For this, cells stably expressing the autophagy marker GFP- LC3 were treated for 3h with the DNA alkylating agent Temozolomide (TMZ), the drug of choice against glioblastomas, followed by replating in drug-free medium. TMZ induced autophagy and transient activation of AMPK-ULK1 axis and p38 MAPK, accompanied by chronic suppression of the PI3K/Akt/mTOR pathway. The treatment with TMZ induced an increase of several markers of cellular senescence at long term, whose kinetics was analyzed and integrated correlative manner. TMZ also increased ROS levels which mediated, at least in part, the induction of senescence and autophagy . Considering the relationship between autophagy and senescence, we observed a strong negative correlation between the mechanisms at the population level. On the other hand, at a single cell level this correlation was not observed. Through the monitoring of single cells we also observed an orchestrated reduction of autophagy, independently of the senescent phenotype acquisition. This reduction occured before, during or after increasing the cell area featuring cellular senescence, showing that the reduction of autophagy is not required for the acquisition of the senescent phenotype. Finally , activation of the autophagy increased pro- senescent effect of TMZ, while autophagy inhibition triggered apoptosis and reduced senescence, suggesting that autophagy protects cells from cell death and allows senescence entry after treatment with TMZ. In this sense, we also discuss here the importance of comprehensive and integrated analysis of changes in mechanisms of proliferation and cell death induced by autophagy inhibition. In conclusion , autophagy and senescence responses appear to be induced by the same signal but with different kinetics after DNA damage, establishing a negative correlation at a population level that is not confirmed at the level of single cells.